Разработка технологии получения рекомбинантных тканевых активаторов плазминогена

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Схема исследования. Диссертационная работа состоит из двух частей,
посвященных разработке технологии получения алтеплазы и тенектеплазы
соответственно. Обе части имеют схожий план исследования,
схематически представленный на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема плана исследования.
Референтные препараты. Актилизе® (алтеплаза) и метализе®
(тенектеплаза), (Берингер Ингельхайм, Германия).
Используемые клоны-продуценты. Клон-продуцент, полученный на
базе клеточной линии CHO-DG44 (ThermoFisher, США), содержащий
плазмиду pBK415 (EUROSCARF, Германия), несущую полноразмерный ген
человеческого ТАП, для биосинтеза алтеплазы. Клон-продуцент,
полученный на базе клеточной линии CHO-М (Selexis, США), содержащий
плазмиду pSURE191 (Selexis, США), несущую мутантный ген
тенектеплазы,длябиосинтезапрепарататенектеплазы.
Последовательности генов ТАП взяты из базы KEGG (Япония),
подтверждены методом масс-спектрометрического анализа референтных
препаратов и синтезированы в компании TopGene Technologies (Канада).
Методы исследований. Культивирование штамма-продуцента
проводилось в микробиореакторах, колбах Эрленмейера, волновом или
вертикальном биореакторах на питательных средах BalanCD CHO Growth
A (Irvine Scientific, США) и SFM4CHO (HyClone, США) с питательными
добавками производства Irvine Scientific (США) и HyClone (США).
Культивирование велось в периодическом режиме, или в режиме перфузии
при помощи перфузионных систем XCell ATF2 и ATF 6 (Repligen, США).
Концентрацию клеток и жизнеспособность определяли методом прямого
подсчета в камере Фукса-Розенталя.
Очистку алтеплазы и тенектеплазы проводили хроматографическими
методами с использованием металл-хелатной, ионообменной, аффинной,
гидрофобной, мультимодальной хроматографии на сорбентах с агарозной
и метакрилатной матрицей производства Cytiva (США), Tosoh (Япония),
ThermoFisher (США), YMC (Япония) на хроматографических системах
AKTA Pure, AKTA Pilot и AKTA Process производства Cytiva (США).
Концентрацию белка определяли фотометрически по поглощению
света с длиной волны 280 нм на спектрофотометре Cary (Varian, США).
Определение содержания сиаловых кислот в белках проводилось
спектрофотометрически резорциноловым методом Свеннерхольма на
спектрофотометре SpectraMax 190 (BioRad, США). Специфическую
активность определяли фотометрически при помощи кинетической
хромогенной тест-системы Human tPA Chromogenic AssaySense Activity
Assay Kit (Assay Pro, США) на спектрофотометре SpectraMax 190 (BioRad,
США) или методом лизиса фибринового сгустка. Чистоту препарата и
содержание одноцепочечной формы определяли методом гель-
фильтрационной ВЭЖХ на колонке TSK-gel G3000 и системе ВЭЖХ
Alliance 2695 (Agilent, США). Содержание остаточных белков клона-
продуцента определяли спектрофотометрически при помощи набора
«Immunoenzymetric Assay for the Measurement of CHO Host Cell Proteins»
(Cygnus Technologies, США) на спектрофотометре SpectraMax 190 (BioRad,
США).СодержаниеостаточнойДНКопределялиметодом
количественного ПЦР в реальном времени при помощи прибора с
флуоресцентной детекцией CFX96 (BioRad, США) и системы ПЦР TaqMan
(Thermo Fisher Scientific, США), в которой при амплификации
специфической последовательности ДНК флуоресцентный зонд
расщепляется под действием ДНК-полимеразы; для детекции ДНК CHO
был использован набор праймеров и зонда для последовательности RepA.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Определение целевых профилей качества разрабатываемых
препаратов
Биофармацевтические препараты имеют множество показателей
качества, которые в разной степени влияют на сопоставимость биоаналога
с оригинальным препаратом. Для препаратов ТАП это тромболитическая
активность, содержание мономера, фрагментов и агрегатов целевого белка,
молекул с разным количеством N-гликанов, с различным содержанием
остатков манноз, фукоз и сиаловых кислот (N-acetylneuraminic acid,
NANA) в гликанах, ОЦ и ДЦ формы полипептида, зарядовых изоформ
ТАП, остаточных белков и ДНК продуцента [EP 9.0, 2020] Клиническая
биоэквивалентность подразумевает отсутствие значимых различий в
профиле безопасности и эффективности двух лекарственных препаратов
[Иванов, 2014]. Определение наиболее критических показателей качества,
влияющих на биоэквивалентность алтеплазы и тенектеплазы по
отношению к референтным препаратам, было проведено при помощи
метода ранжирования рисков [ICH Q9, 2005; CMC Biotech working group,
2009]
Критические продукт-связанные показатели качества ТАП связаны с
их биологической активностью – основным фактором, влияющим на
биоэквивалентность. Такими показателями являются активность и
содержание мономера целевого продукта. Повышенное содержание
сиаловых кислот также может негативно влиять на активность рТАП
[Kliche, 2014].
Сравнение активности гиперсиалированных, умеренно сиалированных
и десиалированных форм тенектеплазы приведено на рисунке 2А. Можно
сделать вывод, что степень сиалирования молекулы тенектеплазы влияет
на ее биологическую активность и является продукт-связанным
критическим показателем качества с максимальной степенью риска.
В отличие от тенектеплазы, при изучении вариантов алтеплазы с
разным сиалированием не было выявлено зависимости активности
алтеплазы от степени сиалирования. (Рисунок 2Б). Вероятно, это связано с
тем, что алтеплаза, являясь продуктом естественного отбора (в отличие от
мутантной формы тенектеплазы), представляет собой более стабильную
структуру. Таким образом, для алтеплазы степень сиалирования не
является критическим показателем качества с максимальной степенью
риска.
Точные количественные показатели, характеризующие структуру
молекулы, но не влияющие напрямую на профили активности и
безопасности, после проведения анализа рисков были признаны менее
значимыми.
Процесс-связанные показатели качества препаратов алтеплазы и
тенектеплазы характеризуют количество и состав примесей различного
характера, и связаны с профилем безопасности и иммуногенности
препарата. Параметры содержания агрегатов целевого белка, а также
белков и ДНК клетки-хозяина характеризуются значимым уровнем риска и
являются критическими.

АБ
Рисунок 2. Варианты сиалирования тенектеплазы (А) и алтеплазы (Б)
и их биологическая активность.
На основании проведённой оценки параметров качества алтеплазы и
тенектеплазы, результатов анализа 4 серий каждого из референтных
препаратов, а также их спецификаций, были определены целевые профили
качества препаратов ТАП и допустимые диапазоны для каждого из
параметров (Таблица 1). Целевой диапазон для критических параметров
качества был дополнительно сужен относительно спецификации
оригинального производителя и принят равным диапазону варьирования
внутри серий референтных препаратов.
Таблица 1 – Целевые профили качества алтеплазы и тенектеплазы
НаименованиеДиапазон значений параметров качества
Лекарственный
показателя,Установленный
препаратСпецифицированный
размерностьдля разработки
СодержаниеТенектеплаза
не менее 95Не менее 96
мономера, %Алтеплаза
Активность, тыс.Тенектеплаза590–730610–710
МЕ/мгАлтеплаза460–670480–650
Содержание ОЦТенектеплаза
не менее 60не менее 60
формы, %Алтеплаза
СодержаниеТенектеплазане более 100Не более 90
белков клетки-
Алтеплазане более 20Не более 16
хозяина, нг/мг
Содержание ДНКТенектеплаза
клетки-хозяина,не более 50не более 50
Алтеплаза
пг/мг
СодержаниеТенектеплаза3,6 ± 0,63,6 ± 0,4
сиаловых кислот,
моль NANA /Алтеплаза2–42–4
моль
Разработка технологии получения алтеплазы
Отбор клона-продуцента алтеплазы. Первичный отбор клона-
продуцента проводился по параметрам продуктивности и активности
алтеплазы. Наиболее продуктивные клоны отбирали для культивирования
в малых биореакторах в периодическом режиме и переводили на
бессывороточную питательную среду. Для адаптации клеток клона-
продуцента к бессывороточной среде выбрана питательная среда
SFM4CHO, позволяющая получить высокую клеточную плотность и
продуктивность при относительно невысокой цене среды.
Разработкатехнологиинепрерывногокультивирования
продуцента алтеплазы. Алтеплаза склонна к образованию агрегатов и
преципитатов в отсутствие стабилизаторов (аргинина, мочевины), и ее
накопление в КЖ в высоких концентрациях может привести к потерям
продукта вследствие преципитации. По этой причине непрерывное
перфузионное культивирование является предпочтительным методом для
культивирования продуцента алтеплазы, так как позволяет сократить
максимальную концентрацию алтеплазы в КЖ, сохраняя высокий
суточный выход продукта.
Для повышения жизнеспособности и продуктивности культуры,
минимизации протеолитической деградации, в том числе образования
двуцепочечной формы, в условиях псевдо-перфузии в колбах Эрленмейера
исследованы варианты культивирования с суточной кратностью перфузии
0,25 и 1 объем биореактора. При этом определяли концентрацию клеток,
жизнеспособность и продуктивность (Рисунок 3).

А

Б

Рисунок 3. Сравнение характеристик процесса культивирования
продуцента алтеплазы в условиях суточной перфузии кратностью 0,25 и 1
объем биореактора.
А – зависимость жизнеспособности культуры от продолжительности
культивирования; Б – зависимость содержания ОЦ формы алтеплазы от
продолжительности культивирования.
Увеличение кратности перфузии с 0,25 до 1 от объема
культивирования в сутки позволило увеличить клеточную плотность
культуры с 6·106 кл/мл до 16·106 кл/мл, и примерно в 4 раза увеличить
суточный выход алтеплазы из реактора. При скорости перфузии 1 объем
реактора в сутки жизнеспособность клеток за 13 суток культивирования не
опускалась ниже 90% и на завершающих этапах культивирования
значительно превосходила жизнеспособность при скорости перфузии 0,25
объема культивирования в сутки. Для масштабирования выбранных
условий было проведено культивирование в рабочем объеме 3 л в
вертикальном биореакторе с мешалкой и перфузионной системой XCell
ATF2. Затем процесс был масштабирован до объема 100 л в биореакторе
SUB100 с перфузионной системой XCell ATF6. В масштабированных
процессах динамика концентрации клеток, жизнеспособности и
продуктивности была сравнимой (Таблица 2).
Разработка метода очистки алтеплазы с использованием нового
аффинного сорбента. Основная проблема при очистке алтеплазы –
высокая склонность белка к преципитации при рН выше 4,5 и низкая
растворимость в стандартных буферных растворах, поэтому очистку
алтеплазы вели в присутствии стабилизаторов (0,2–0,4 М аргинин либо 1М
мочевина), а при разработке технологии очистки особое внимание
уделялось отделению олигомеров.
Таблица 2. Сравнение параметров культивационного процесса
продуцента алтеплазы в 3 л и 100 л реакторе.
Объем реактора, л
Параметр
3100

Перфузионное устройствоATF2ATF6

Максимальная концентрация клеток, 106 кл/мл17 ± 216 ± 2

Жизнеспособность в последние (17-е) сутки, %86 ± 584 ± 5

Удельная активность целевого белка, млн МЕ/мг610 ± 40600 ± 40

Пиковая продуктивность алтеплазы, мг/л146 ± 10153 ± 12

Средняя продукция алтеплазы, мг/л72 ± 777 ± 10

Для очистки ТАП компанией Thermo Fisher Scientific совместно с МБЦ
Генериум был разработан пептидный аффинный сорбент на агарозной
матрице CaptureSelect tPA. Лиганд данного сорбента представляет собой
аффинный пептид, созданный на основе вариабельного домена тяжелой
цепи антитела верблюдовых. Для выбора прототипа определяли удельную
динамическую емкость серии прототипов сорбента по отношению к
алтеплазе методом 10% проскока (Рисунок 4). По результатам
эксперимента прототип №1 обладал наибольшей емкостью, и был
использован для создания финального варианта сорбента. Емкость
финального варианта CaptureSelect tPA составила 10 мг/мл.

АБ
Рисунок 4. Сравнение емкости прототипов CaptureSelect tPA в
отношении алтеплазы.
А – типичный вид хроматограммы при оценке емкости сорбентов с
использованием предварительно очищенного материала, метод 10% проскока; Б –
удельные емкости серии прототипов.
Для аффинного сорбента были подобраны условия, оптимальные для
очистки алтеплазы. Был выбран элюирующий буфер с рН 3,5 и высоким
содержанием аргинина (0,4 М), обеспечивающий получение алтеплазы в
активной растворимой форме. Применение промывок, содержащих до 2М
NaCl, до 200 мМ каприлата, до 1М мочевины обеспечило удаление
примесных белков без значительных потерь алтеплазы (Рисунок 5). По
данным SDS PAGE электрофореза можно сделать вывод, что основной
объем примесных белков проходит через сорбент CaptureSelect tPA без
сорбции. Примесные белки, удаляемые при дополнительных промывках,
не детектировались методом электрофореза, поэтому для оценки
эффективности их удаления использовали метод ИФА.

А

Б
Рисунок 5. Очистка алтеплазы из КЖ на CaptureSelect tPA.
А – Типичный вид хроматогаммы. Б – электрофореграмма фракций, 1 – КЖ, 2 –
проскок, 3,4,5 – промывки, содержащие 2М NaCl, 200 мМ каприлата, 1М мочевины
соответственно, 6 – элюат целевого белка.
Сорбенты, используемые на стадии захвата продукта из КЖ, могут
аккумулировать на себе различные компоненты КЖ вследствие
неспецифических взаимодействий, что в свою очередь может привести к
снижению емкости и падению эффективности очистки, поэтому для
сорбентов первой стадии очистки рекомендуется регенерация и
санитизация с использованием 0,5 – 1 М NaOH. Так как CaptureSelect tPA
представляет собой пептидный сорбент, его санитизация растворами
щелочей может привести к разрушению лиганда, поэтому было принято
решение не использовать CaptureSelect tPA как сорбент стадии захвата, а
применить его на последующих этапах очистки.
В качестве стадии захвата было решено использовать цинк-хелатную
хроматографию, подобно методике, описанной в патенте RU2500817C1.
IMAC-сефарозу заменили на металлохелатный сорбент с метакрилатной
матрицей EMD Chelate Fractogel (Millipore, США), так как было показано,
что метакрилат связывает меньше неспецифических примесей, чем
сефароза. При использовании метакрилатного сорбента, в отличие от
сефарозного, окраски сорбента компонентами питательной среды не
наблюдалось, а содержание примесных белков при тех же условиях
проведения хроматографии снизилось в 4 раза. Алтеплаза обладает
высоким сродством к хелатированному иону цинка и прочно связывается с
сорбентом (по-видимому, присутствуют не только координационные, но и
иные неспецифические взаимодействия), что позволяет использовать
высокоселективные промывки, содержащие до 2М NaCl или до 0,1 М
имидазола. Разработанная альтернативная схема элюции целевого белка
градиентом от 0 до 1 М NaCl при рН 4,0 в присутствии 1М мочевины
также позволила сократить содержание примесей элюате: часть белков
продуцента остается связанными с ионами цинка и элюируется только при
регенерации сорбента раствором ЭДТА (рисунок 6).
Применение цинк-хелатной и аффиннной хроматографии не снижало
содержание ДНК в достаточной степени (Таблица 4), и полупродукт после
перечисленных стадий очистки содержал количество ДНК, превышающее
установленную норму (Таблица 1). Для удаления остаточной ДНК
продуцента была разработана дополнительная стадия очистки на основе
распространенной, недорогой и обладающей высокой емкостью Q-
сефарозы (Cytiva). Проведение хроматографии в режиме проскока при рН
7,2 позволило снизить содержание ДНК в препарате на порядок и достичь
определенного для разработки уровня.
Перевод алтеплазы в буфер ГЛФ проводили на катионообменном
сорбенте Eshmuno S (Millipore). Сорбция проводилась при рН 4,0 в буфере,
содержащем 1 М мочевину, а элюция – непосредственно буфером ГЛФ
(0,4 М аргинин, рН 7,2); рН и проводимость элюата Eshmuno S позволили
проводить фильтрацию через Q-сефарозу без предварительной подготовки
образца.
Для обеспечения противовирусной безопасности процесса были
добавлены стадии вирусной инактивации при пониженном рН после
стадии CaptureSelect tPA (эффективна против оболочечных вирусов) и
нанофильтрации субстанции алтеплазы в буфере ГЛФ.
Таким образом, создана технология очистки алтеплазы, состоящая из
шести стадий: цинк-хелатная хроматография на EMD Chelate Fractogel,
аффинная хроматография на CaptureSelect tPA, инактивация вирусов в
элюате CaptureSelect tPA при пониженном рН, перевод в буфер ГЛФ на
катионообменном сорбенте Eshmuno S, анионообменная фильтрация на Q-
сефарозе и нанофильтрация. Динамика выхода активного белка и удаления
примесей в процессе очистки тенектеплазы приведена в таблице 3 и на
рисунке 7.

А

Б
Рисунок 6. Очистка алтеплазы на сорбенте EMD Chelate Fractogel
(Millipore).
А – типичный вид хроматограммы (1 – проскок, 2 – промывка 0,1 М
имидазолом, 3 – целевая фракция, 4 – регенерация растворами 0,2 М ЭДТА
и 0,5 М NaOH), Б – электрофореграмма фракций (1 – КЖ, 2 – проскок, 3 –
промывка, 4 – целевая фракция).
Таблица 3. Динамика выхода активного белка и удаления примесей в
процессе очистки алтеплазы.
ВыходСодержаниеСодержание
Содержание
белка,мономерабелков СНО,
СтадияДНК, пг/мг
млн МЕ/лалтеплазы, ГФ-нг/мг
алтеплазы
КЖВЭЖХалтеплазы
КЖ4385–90%1000–150080–120
Металл-хелатная
4191–95%300–60050–70
хроматография
Аффинная
3796–98%6–1050–70
хроматография
Катионообменная
3496–98%6–1050–70
хроматография
Анионообменная
3296–98%6–105–10
хроматография

Рисунок 7. Электрофореграмма образцов алтеплазы, полученных в
ходе очистки.
1 – КЖ, 2 – металл-хелатная хроматография, проскок, 3 – металл-хелатная
хроматография, целевая фракция, 4 – аффинная хроматография,5 – катионообменная
хроматография, 6 – лекарственная субстанция алтеплазы, 7 – референтный препарат.
Масштабирование методики очистки алтеплазы было проведено
на материале, полученном при культивировании клона-продуцента ТАП в
режиме перфузии в 100 л биореакторе с системой перфузии ATF6, с
кратностью перфузии 1 объем реактора в сутки. Масштабирование
хроматографических стадий осуществлялось с сохранением высот столбов
сорбентов, линейных скоростей потоков и нагрузок на сорбенты. Выход
продукта с использованием разработанной методики составил 58 мг/л КЖ.
Средний выход процесса очистки по отношению к начальному
содержанию в КЖ составил 75%. Сравнение полученного лекарственного
препарата с референтным препаратом показало их сопоставимость по
критическим параметрам качества (таблица 4).
Таблица 4. Сравнение критических показателей качества алтеплазы
производства АО «Генериум» и референтного препарата.
Параметр качества,
АктилизеАлтеплаза (АО
требования Европейской
(Boehringer Ingelheim)«Генериум»)
Фармакопеи 9,0
Содержание мономера,
96,5 ± 1,297,1 ± 1,1
не менее 95%
Содержание одноцепочечной
81,9 ± 10,378,3 ± 8,0
формы, не менее 60%
Активность, 460–670 тыс
565 ± 80560 ± 75
МЕ/мг
Содержание белков СНО, не
6 ± 2,58 ± 4,1
более 20 нг/мг
Разработка технологии получения тенектеплазы
Отбор клонов-продуцентов тенектеплазы. Первоначально отбор
клонов-продуцентов тенектеплазы производился по продуктивности.
Впоследствии было обнаружено, что белок, производимый лидерными
клонами, обладает сниженной фибринолитической активностью и
повышенным сиалированием по сравнению с оригинальным препаратом.
По литературным данным, снижение сиалирования во время
культивирования в биореакторе вызывает повышенная концентрация
аммония [Chen, 2006], стресс, вызванный сниженной концентрацией
кислорода[Lewis,2016]идругиепараметры,снижающие
жизнеспособность культуры и приводящие к выходу сиалидаз из
цитоплазмы клеток в культуральную жидкость [Gramer, 1993]. При
применении описанных методов к процессу культивирования клона-
продуцента тенектеплазы наибольшее снижение степени сиалирования
наблюдалось при добавлении сульфата аммония: степень сиалирования
удалось снизить на 30 %. Удельная активность тенектеплазы при этом
повысилась на 17%, однако осталась ниже приемлемого диапазона.
Получить продуцент высокоактивной тенектеплазы с сиалированием в
требуемом диапазоне (3–4 моль NANA / моль) удалось при повторном
отборе продуцентов по фибринолитической активности продукта,
определявшейся при помощи кинетический хромогенной тест-системы.
Разработкаметодапериодическогокультивирования
тенектеплазы.Клон-продуценттенектеплазыадаптировалик
бессывороточной среде BalanCD CHO Growth A. После перехода к
суспензионному культивированию в периодическом режиме с внесением
питательных добавок (режиму fed-batch) подобрали питательную добавку.
Параллельно было показано, что доля ОЦ формы тенектеплазы падает в
ходе культивирования параллельно с падением жизнеспособности клеток
(Рисунок 8). Было установлено, что для получения продукта с долей ОЦ
формы более 60% жизнеспособность культуры не должна опускаться ниже
90%, оптимальная продолжительность культивирования при этом
составила 8 суток. Вероятно, причина повышения содержания ДЦ формы
заключается в выходе протеаз из лизированных клеток.

Рисунок 8. Динамика жизнеспособности клеток и содержания ОЦ
формы в процессе культивирования продуцента тенектеплазы в режиме
фед-батч.
Масштабирование периодического метода культивирования
тенектеплазы. Методика культивирования апробирована в реакторе с
осевым перемешиванием объемом 2 литра с сохранением продуктивности
и всех критических показателей качества, а затем масштабирована до
биореактора объемом 100 л. Было обнаружено, что, несмотря на
совпадение показателей клеточной плотности и жизнеспособности,
продуктивность в 100 л реакторе снизилась с 0,5 до 0,3 г/л. Было
предположено, что падение продуктивности является результатом
травмирующего воздействия пузырьков микробарботера на клетки. Для
проверки этой гипотезы на демасштабированной до 2 л модели реактора
былопроведеносравнениепроцессовкультивированиябез
микробарботера, с микробарботером, а также с использованием
микробарботера и добавлением полоксамера в качестве протектора
(Рисунок 9). Ростовые характеристики всех трех процессов были
сравнимы, в то время как продуктивность составила около 0,5 г/л в
процессе без барботажа, 0,3 г/л в процессе с барботажем и около 0,4 г/л в
процессе с микробарботажем и полоксамером, что подтвердило гипотезу о
негативном влиянии микропузырьков на продукцию тенектеплазы,
которое возможно частично нивелировать добавлением полоксамера в
качестве протектора.
Разработка методики очистки тенектеплазы. Тенектеплаза
склонна к олигомеризации и преципитации в водных растворах. Для
стабилизации тенектеплазы в растворы, используемые в ходе очистки
препарата, добавляли мочевину в концентрации 1–2 М или аргинин в
концентрации 0,2–0,4 М.
АБ

В
Рисунок 9. Культивирование продуцента тенектеплазы в
демасштабированной модели столитрового биореактора.
Динамика клеточной плотности (А), жизнеспособности (Б) и продуктивность (В) в
процессах без барботажа (FB12, FB15), с барботажем (FB13, FB16), с барботажем и
добавлением полоксамера (FB14, 17).
На начальном этапе исследований для скрининга условий
культивирования и определения концентрации белка в культуральной
жидкости (КЖ) была разработана простая аналитическая методика очистки
тенектеплазы: первая стадия – захват целевого белка из КЖ, вторая стадия
– перевод белка в буфер ГЛФ (0,4 М аргинин, 0,04% твин 20, рН 7,3). В
качестве сорбента стадии захвата были исследованы аффинный сорбент
(иммобилизованный лизин), гидрофобные и катионообменные сорбенты
(Рисунок 10). Высокий выход продукта (более 90%) наблюдался при
использовании аффинного и гидрофобных сорбентов. Однако, при
использовании аффинного сорбента с иммобилизованным лизином в
качестве первой стадии очистки, помимо сорбции тенектеплазы,
наблюдалось также большое количество неспецифических взаимодействий
сорбента с компонентами КЖ. Это приводило к загрязнению целевой
фракции пигментами и сокращению срока службы сорбента. При
использованиигидрофобнойхроматографиинеспецифических
взаимодействий наблюдалось значительно меньше, поэтому она была
выбрана в качестве стадии захвата для аналитической методики, а затем
для разработки промышленной методики очистки тенектеплазы.
Рисунок 10. Сравнение сорбентов, протестированных для стадии
захвата тенектеплазы.
Для проведения аналитических исследований качества белка
полупродукт тенектеплазы переводили в буфер ГЛФ, для чего
использовали соль-толерантный анионообменный сорбент, связывающий
целевой белок при проводимости исходного образца до 15 мСм/см, что
позволяло наносить элюат со стадии гидрофобной хроматографии без
разбавления.
При разработке промышленной технологии очистки тенектеплазы к
стадии захвата были добавлены стадии, обеспечивающие эффективное
удаление примесных белков и ДНК, а также стадии, направленные на
удаление и инактивацию вирусов. В качестве основной стадии очистки от
примесных белков наиболее эффективна аффинная хроматография. Для
тенектеплазыбылпротестированрядаффинныхсорбентов;
иммобилизованный лизин выбран, как обладающий наибольшей емкостью
по отношению к тенектеплазе (Рисунок 11) и позволяющий снизить
количество примесных белков в препарате тенектеплазы в 70 раз.

Рисунок 11. Сравнение емкости аффинных сорбентов,
использованных для очистки тенектеплазы.
Для удаления эндотоксинов, вирусов, отрицательно заряженных
белков СНО и остаточной ДНК распространенной практикой является
фильтрация через сильный анионообменный сорбент. Введение
анионообменой хроматографии на Q-сефарозе (Cytiva) в режиме проскока
позволило дополнительно снизить содержание примесных белков в 2 раза
и на порядок снизить содержание примесной ДНК (Таблица 5).
Таблица 5. Динамика выхода активного белка и удаления примесей в
процессе очистки тенектеплазы.
СодержаниеСодержание
ВыходСодержание
мономерабелков СНО,
Стадиябелка, млнДНК, пг/мг
тенектеплазынг/мг
МЕ/л КЖтенектеплазы
, ГФ-ВЭЖХтенектеплазы
КЖ300–35070–90%20000–30000400–600
Гидрофобная
260–29070–90%5000–7000400–600
хроматография
Аффинная
223–24691–95%400–500180–220
хроматография
Q-фильтрация200–22091–95%240–35020–35
Мультимодальная
катионообменная185–20592–96%40–6520–35
хроматография
Анионообменная
146–18097–98%40–653–10
хроматография
Дополнительную очистку от белков клеток СНО проводили при
помощи ионообменной хроматографии. В качестве катионообменного
сорбента первоначально использовали сульфопропил-сефарозу, однако
при скринировании панели хроматографических сорбентов, имеющих
катионообменные свойства, было обнаружено, что сорбция тенектеплазы
на мультимодальном сорбенте c катионообменными и гидрофобными
свойствами возможна в значительно более широком диапазоне рН (до рН
8,0). Данный эффект обусловлен присутствием гидрофобных групп в
составе лиганда и позволяет повысить селективность данной стадии
очистки и удалить в три раза больше примесных белков по сравнению с
хроматографией на обычном катионообменном сорбенте.
Для перевода очищенного полупродукта в буфер готовой
лекарственнойформы(ГЛФ)использовалисоль-толерантный
анионообменный сорбент, позволяющий дополнительно повысить
содержание мономера тенектеплазы. При элюции градиентом аргинина
олигомеры элюировались с колонки позднее целевой фракции, что
позволяло их отделить (Рисунок 12).
Для удаления эндотоксинов, вирусов, отрицательно заряженных
белков СНО и остаточной ДНК распространенной практикой является
фильтрация через сильный анионообменный сорбент. Введение
анионообменой хроматографии на Q-сефарозе (Cytiva) в режиме проскока
позволило дополнительно снизить содержание примесных белков в 2 раза
и на порядок снизить содержание примесной ДНК (Таблица 5).
Рисунок 12. Хроматограмма при очистке тенектеплазы на соль-
толерантном анионообменном сорбенте.
Для обеспечения вирусной безопасности процесса были добавлены
стадии вирусной инактивации и нанофильтрации. Инактивация вирусов
сольвент-детергентным методом эффективна против оболочечных
вирусов; нанофильтрация через фильтр с размером пор 20 нм удаляет
вирусные частицы механически.
Таким образом, была создана технология очистки тенектеплазы,
состоящая из пяти хроматографических стадий: захват из КЖ и
концентрирование на гидрофобном сорбенте, вирусная инактивация,
очистка от олигомерных форм и примесных белков клона-продуцента на
аффинном сорбенте, Q-фильтрация для удаления ДНК продуцента и
возможных вирусов, доочистка на мультимодальном катионообменном
сорбенте, концентрирование и перевод в буфер ГЛФ на соль-толерантном
анионообменном сорбенте. Динамика выхода активного белка и удаления
примесей в процессе очистки тенектеплазы приведена в таблице 5 и на
рисунке 13. Видимые на электрофореграмме примеси удаляются уже на
стадии аффинной хроматографии, и на последующих стадиях очистки
детектируются только методом ИФА.
Масштабирование методики очистки тенектеплазы. Методика
была масштабирована на материале, полученном из 100 л реактора, с
сохранением высот столбов сорбентов, линейных скоростей потоков и
нагрузок на сорбенты. Получено 15 г очищенного препарата тенектеплазы.
Сравнение полученного препарата с референтным показало их
сопоставимость по критическим параметрам качества (Таблица 6).
Рисунок 13. Электрофореграмма образцов тенектеплазы, полученных
в ходе очистки.
1 – культуральная жидкость, 2 – гидрофобная хроматография, проскок, 3 –
гидрофобная хроматография, промывка, 4 – гидрофобная хроматография, элюат, 5 –
аффинная хроматография, проскок, 6 – аффинная хроматография, элюат, 7 – Q-
фильтрация, фильтрат, 8 – мультимодальная хроматорафия, элюат, 9 – соль-
толерантная анионообменная хроматография, элюат, 10 – готовая субстанция
тенектеплазы, 11–13 – Метализе (оригинальный препарат, три различных серии).
Полоса около 55 кДа соответствует ОЦ форме тенектеплазы, полоса около 26 кДа – ДЦ
форме.
Таблица 6. Сравнение критических показателей качества
тенектеплазы производства АО «Генериум» и референтного препарата.
МетализеТенектеплаза
Параметр качества, установленный для
(Берингер(АО
разработки диапазон
Ингельхайм)Генериум)

Содержание мономера, не менее 95%97,8 ± 1,697,52 ± 1,4
Соотношение одноцепочечной формы, не менее
81,9 ± 9,781,3 ± 8,5
60%
Активность, млн МЕ/мг (0,56–0,76)0,66 ± 0,050,69 ± 0,02
Содержание белков СНО,не более 100 нг/мг70 ± 1555 ± 12

Содержание сиаловых кислот, мол/мол (2,1–3,9)3,6 ± 0,53,2 ± 0,4

Выход тенектеплазы после всех стадий очистки составил 153 мг (51%)
из 1 л КЖ, что близко к значениям, полученным при очистке тенектеплазы
в лабораторном масштабе.
ВЫВОДЫ
1. Для продуцента алтеплазы разработан способ непрерывного
суспензионного культивирования при скорости протока питательной
среды 1 объем реактора/сутки, позволяющий получать препарат алтеплазы
с содержанием одноцепочечной формы не менее 60%.
2. Для продуцента тенектеплазы разработан способ периодического
суспензионного культивирования длительностью 8 суток, позволяющий
получать препарат тенектеплазы с содержанием одноцепочечной формы не
менее 60%.
3. Создана технология очистки алтеплазы, состоящая из четырех
хроматографических стадий: цинк-хелатная хроматография на EMD
Chelate Fractogel, аффинная хроматография на CaptureSelect tPA, перевод в
буфер ГЛФ на катионообменном сорбенте Eshmuno S, анионообменная
фильтрация на Q-сефарозе – позволяющая получать препарат алтеплазы с
содержанием мономера более 96%, содержанием примесных белков менее
12,1 нг/мл, примесной ДНК – менее 10 пг/мг. Выход алтеплазы составляет
75%.
4. Создана технология очистки тенектеплазы, состоящая из пяти
хроматографических стадий: захват из культуральной жидкости и
концентрирование на гидрофобном сорбенте, очистка от олигомерных
форм и примесных белков клона-продуцента на иммобилизованном
лизине, анионообменная фильтрация для удаления ДНК продуцента,
хроматография на мультимодальном катионообменном сорбенте,
концентрирование и перевод в буфер готовой лекарственной формы на
соль-толерантном анионообменном сорбенте, позволяющая получать
препарат тенектеплазы с содержанием мономера более 96%, содержанием
примесных белков менее 67 нг/мг, примесной ДНК – менее 10 пг/мг.
Выход тенектеплазы составляет 45-50%.
5. Проведено масштабирование процессов культивирования и очистки
алтеплазы до биореактора объемом 100 л. Показано, что
производственный процесс позволяет получить за 15 суток непрерывного
процесса культивирования около около 78 г очищенной алтеплазы (1560
доз).
6. Проведено масштабирование процессов культивирования и очистки
тенектеплазы до биореактора объемом 100 л. Показано, что
производственный процесс позволяет получить за 8 суток периодического
процесса культивирования около 15 г тенектеплазы (300 доз).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
Публикации работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Чащинова Д.В., Стратонова Н.В., Лапшин К.Е., Лисов А.С.
Разработка промышленного способа культивирования продуцента
рекомбинантного тканевого активатора плазминогена человека. //
Биотехнология. – 2016. – № 4. – С. 75–80. (SCOPUS)
2. Чащинова Д.В., Шамонов Н.А., Вассарайс Р.А., Кудлай Д.А. Новый
аффинный сорбент для очистки рекомбинантного тканевого активатора
плазминогена. // Биофармацевтический журнал. – 2019. – Т. 11, №2. – С.
37–44. (SCOPUS)
3. Чащинова Д.В., Смолова К.А., Леонов В.С., Кудлай Д.А.
Получение препарата «Тенектеплаза» с высокой активностью. //
Биофармацевтический журнал. – 2019. – Т. 11, № 6. – С. 14–24. (SCOPUS)
4. Чащинова Д.В., Шамонов Н.А., Вассарайс Р.А., Кудлай Д.А.
Разработка высокоэффективной технологии очистки рекомбинантного
тканевого активатора плазминогена. // Биофармацевтический журнал. –
2020. – Т. 12, №2. – С. 32–42. (SCOPUS)
Патенты:
5. Чащинова Д.В., Шамонов Н.А., Вассарайс Р.А., Кудлай Д.А. Метод
получения рекомбинантного ТАП для медицинского применения. Патент
РФ № RU2683950C1, опубликовано 03.04.2019, Бюллетень № 10.

Публикации работ в журналах,
не входящих в перечень рекомендованных ВАК РФ
6. Чащинова Д.В., Стратонова Н.В., Кудлай Д.А. Влияние содержания
сиаловых кислот в гликанах тканевых активаторов плазминогена на их
активность. // Фармацевтическое дело и технология лекарств. – 2020. – №
5. С. 10–17.