Разработка технологии пробиотического кисломолочного продукта с lactobacillus reuteri lr1

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи диссертации, изложены научная новизна, практическая значимость, положения, выносимые на защиту.
В первой главе представлен анализ научно-технической литературы. Описано влияние пробиотических микроорганизмов и кисломолочных продуктов с их использованием на организм человека. Представлена характеристика рода Lactobacillus и спектр основных пробиотических свойств лактобацилл. Проанализированы аспекты повышения качества заквасок прямого внесения (ЗПВ) в процессе их производства.
На основании литературных данных подтверждена актуальность выбранной темы диссертационной работы и необходимость разработки технологии кисломолочного продукта с пробиотическими свойствами с использованием ЗПВ L.reuteri LR1
Во второй главе «Организация работы, объекты и методы исследований»
приведена организация работы, описаны объекты и методы исследований, представлена схема проведения исследований (рис. 1).
Объектами исследований служили:
– штамм L. reuteri LR1 (GenBank MN994628) из коллекции культур молочнокислых бактерий, пробиотических бактерий и дрожжей Центральной лаборатории микробиологии ФГАНУ «ВНИМИ»;
– закваска прямого внесения L. reuteri LR1;
– кисломолочный продукт «Релакт».
При проведении экспериментальной части исследований были использованы
общепринятые микробиологические, физико-химические, математические и др. методы. Для определения кислотообразующей активности штамма L.reuteri LR1, а также для периодического культивирования в условиях регулируемых параметров процесса был использован прибор параллельных биореакторов фирмы DASGIP (Германия). Для сублимационного высушивания клеток использовали сушилку FreeZone 4.5 Liter Benchtop Freeze Dry Systems (Labcоnco, США). Антагонистическую активность штамма L.reuteri LR1 определяли in vitro по МУ 2.3.2.2789-10 «Методические указания по санитарно- эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов», определение устойчивости штамма L.reuteri LR1 к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом с использованием индикаторных дисков с противомикробными лекарственными средствами по МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Протеолитическую, антиоксидантную и АПФ- ингибирующую активности in vitro в образцах ферментированного L. reuteri LR1 молока определяли спектрофотометрически с использованием микропланшетного фотометра– флуориметра Synergy 2 (BioTek, США).
Протеолитическую активность измеряли при длине волны 340 нм и выражали в L- лейциновых эквивалентах. Антиоксидантную активность (АОА) определяли по отношению к пероксильному радикалу методом ORAC (Oxygen Radical Absorption Capacity – поглощающая способность кислородных радикалов). Для чего регистрировали кинетику убыли интенсивности флуоресценции флуоресцеина при температуре (37±1)oС в течение 50 мин

(длины волн возбуждения и эмиссии 485 и 528 нм соответственно). АОА выражали в мкмоль эквивалентов тролокса на мг белка (мкмоль TЭ/мг).
При определении АПФ–ингибирующей активности регистрировали кинетику возрастания интенсивности флуоресценции при температуре (37±1)°С в течение 15 мин (длина волны возбуждения и эмиссии флуоресценции – 320 и 420 нм соответственно). В качестве субстрата с внутренним тушением флуоресценции использовали о-аминобензоил- фенилаланил-аргинил-лизил(динитрофенил)-пролин. АПФ-ингибирующую активность определяли, как концентрацию белка способную ингибировать АПФ на 50% (IC50) и выражали в мг белка на мл.
Анализ научно-технической литературы
Определение цели и задач Выбор объектов и методов
исследований
исследований
Проведение исследований
Изучение пробиотического потенциала L.reuteri LR1
Разработка питательной среды для накопления клеток L.reuteri LR1
Определение технологических параметров культивирования L.reuteri LR1 на разработанной питательной среде
Определение условий подготовки L.reuteri LR1 к сушке
Сравнительный анализ питательных сред
Определение значения активной кислотности питательной среды
Выбор продолжительности культивирования
Определение состава питательной среды
Выбор температуры культивирования
Выбор состава защитной среды
Определение дозы инокулята
Разработка технологии закваски прямого внесения L. reuteri LR1
Разработка технологии кисломолочного продукта «Релакт»
Выбор варианта получения кисломолочного продукта с использованием L. reuteri LR1
Определение функциональных свойств in vitro и in vivo кисломолочного продукта «Релакт»
Определение рекомендуемого срока годности кисломолочного продукта «Релакт»
Разработка СТО 00419785-045-2019 «Закваска прямого внесения Lactobacillus reuteri LR1» и СТО 00419785-047-2020 «Продукты кисломолочные «Релакт»
Опытно-промышленная выработка кисломолочного продукта «Релакт»
Рисунок 1 – Схема проведения исследований
Пептидный профиль анализировали методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии с масс-спектрометрией ионно-циклотронного резонанса с использованием
системы, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), колонки Reprosil-Pur Basic C18 и ультра-масс-спектрометра LTQ-FT (Thermo Scientific, Waltham, MA, США). Масс-спектрометрический анализ проводили в диапазоне m/z 300-1600 и разрешением R=50000 для m/z 400. Для автоматического поиска по базам данных пептидов использовали программное обеспечение Peaks Studio (Bioinformatics Solutions Inc., США, version 8.5). Для графического представления в цветовой гамме полученных данных пептидного профиля были построены тепловые карты (англ. heatmap) для пептидов β-, αs1-, αs2- и κ- казеинов коровьего молока с использованием веб-приложения для визуализации пептидомных данных Peptigram.
Рекомендуемые сроки годности определяли по МУК 4.2.1847-04 «Санитарно- эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов».
Обработку результатов, полученных экспериментальных данных осуществляли с помощью пакета программ «Microsoft Office», «Statistica 10.0», OriginPro 8.0 по результатам 3-5 повторностей.
В третьей главе «Изучение пробиотических свойств штамма Lactobacillus reuteri LR1» приведены результаты исследований пробиотических свойств штамма L. reuteri LR1.
Определена in vitro антагонистическая активность штамма L. reuteri LR1 к условно- патогенным микроорганизмам (рис. 2).
9 8 7 6 5 4 3 2
24 48
0 24
48 48 0
0
0
24 48
0 24
24 48
24 48
АБАБАБ
E.coli ATCC 25922 S.aureus ATCC 6538 S.typhimurium ATCC 14038
А – монокультура, Б – сокультивирование с L. reuteri LR1 Рисунок 2 – Антагонистическая активность L. reuteri LR1
Установлено, что при сокультивировании с L. reuteri LR1, содержание тест-штаммов достоверно снижается, и через 24 ч составляет для E. coli АТСС 25922 – 4×104 КОЕ/см3, для S. aureus АТСС 6538 – 6,9×104 КОЕ/см3, а для S. typhimurium АТСС 14028 – 5,25×104 КОЕ/см3. Через 48 ч сокультивирования количество E. coli АТСС 25922 снизилось еще на порядок и составило 7×103 КОЕ/см3, количество клеток S. aureus АТСС 6538 и S. typhimurium АТСС 14028 практически не изменилось и составило 6,6×104 КОЕ/см3 и 5,2×104 КОЕ/см3. Из представленных данных видно, штамм L. reuteri LR1 обладает выраженной антагонистической активностью, которая варьируется в зависимости от используемой тест-культуры и продолжительности сокультивирования штаммов. Наибольшую антагонистическую активность штамм L. reuteri LR1 проявлял по отношению к E. coli АТСС 25922.
Определена чувствительность штамма L. reuteri LR1 к антимикробным препаратам (табл. 1).
Количество клеток тест-штаммов, lg КОЕ/см3

8
Таблица 1 – Устойчивость L. reuteri LR1 к антимикробным препаратам
Антибактериальный препарат
Доза вещества на диске, мкг
Категория чувстви- тельности
Антибактериальный препарат
Доза вещества на диске, мкг
Категория чувстви- тельности
Гентамицин Канамицин Неомицин Амоксициллин Ампициллин Бензилпенициллин Оксациллин Фосфомицин
120 R 30 R 30 I 20 S 10 I 10 R
1 R 200 R
Левофлоксацин 5 R Пефлоксацин 5 R Доксициклин 30 R Тетрациклин 30 R Азитромицин 15 R Линкомицин 15 S Левомицетин 30 S
Выявлено, что штамм L. reuteri LR1 чувствителен к линкомицину, амоксициллину и левомицетину, проявляет промежуточную устойчивость к ампициллину и неомицину, и обладает устойчивостью к остальным изучаемым антимикробным препаратам. Полученные результаты свидетельствуют о том, что штамм L. reuteri LR1 является антибиотикоустойчивым.
Исследована in vitro динамика изменения антиоксидантной, протеолитической, и АПФ – ингибирующей активностей в процессе культивирования L.reuteri LR1 на обезжиренном молоке (табл. 2).
Таблица 2 – Динамика изменения протеолитической, антиоксидантной и АПФ – ингибирующей активностей в процессе культивирования штамма L.reuteri LR1 на обезжиренном молоке
Продолжительность культивирования, ч
Количество клеток L.reuteri LR1, КОЕ/см3
Антиоксидантная активность (ORAC), мкмоль TЭ/мг
АПФ ингибирующая активность, (IC50) мг /см3
Протеолитическая активность, (Эквиваленты L- лейцина), ммоль/дм3
0
1,2×107
216,55±16
12,68± 0,39
3,08±0,37
24
1,9×107
414,61±26
2,63±0,29
2,86±0,34
48
4,5×108
420,88±28
1,45± 0,18
5,48±0,46
72
4×108
422,72±31
1,07± 0,13
6,35±0,76
Установлено, что в первые 24 часа сквашивания молока штаммом L. reuteri LR1 происходит достоверное повышение антиоксидантной (414,61 ± 26 мкмоль ТЭ) и АПФ- ингибирующей активности (IC50 2,63 ± 0,29 мг/см3 на фоне снижения количества эквивалентов L-лейцина (2,86 ± 0,34 ммоль/дм3) по сравнению с исходным молоком. Это обусловлено достаточно низкой протеолитической активностью штамма L. reuteri LR1 в отношении казеиновых белков молока в связи с чем, наблюдается медленный рост клеток L. reuteri LR1. В первые 24 часа культивирования количество клеток L. reuteri LR1 увеличивается с 1,2×107 КОЕ/см3до 1,9×107 КОЕ/см3. В последующие 24 часа культивирования рост клеток L. reuteri LR1 достигает наибольшего значения 4,5×108 КОЕ/см3. При этом через 72 ч наблюдается увеличение АПФ-ингибирующей активности (IC50 1,07 ± 0,13 мг/см3) на фоне повышения количества эквивалентов L-лейцина (6,35 ± 0,76 ммоль/дм3), а антиоксидантная активность остается практически неизменной до конца ферментации и через 72 ч составляет 422,72±31 мкмоль ТЭ.
Чтобы получить более глубокое представление о процессе развития антиоксидантной и АПФ-ингибирующей активностей был определен профиль пептидов. Для иллюстрации закономерностей протеолиза казеиновых фракций все выделенные пептиды были нанесены на карту аминокислотных последовательностей β-, aS1-, aS2 – и κ- казеиновых белков (рис. 3).

Пептид
YQEPVLGPVRGPFPIIV
VKEAMAPK KVLPVPQK VQVTSTAV YPFPGPIPN
Белок предшественник
β-казеин
β-казеин β-казеин κ-казеин β-казеин
Функция пептидов
АПФ-ингибирующая Антимикробная Иммуномодуляторная Антиоксидантная Антиоксидантная Антимикробная АПФ-ингибирующая
Рисунок 3 – Тепловая карта пептидного профиля молока, сквашенного L. reuteri LR1 Интенсивность цвета пропорциональна нормализованной интенсивности ионов белка
пептидов, причем темно-зеленый цвет указывает на высокую интенсивность пептидов, а светло-зеленый-на низкую интенсивность пептидов
По сравнению с контрольным образцом исходного молока в сквашенном молоке на фоне увеличения числа пептидов из β-казеина, снижается количество пептидов из αs1-казеина и αs2-казеина. Что обусловлено достаточно низкой протеолитической активностью штамма L. reuteri LR1 в отношении казеиновых белков молока и, как хорошо видно на тепловой диаграмме, для своего роста и развития клетки L. reuteri LR1 используют пептиды, исходно присутствующие в молоке.
При сравнении пептидов, идентифицированных только в образцах ферментированного L. reuteri LR1 молока, с базой данных Milk Bioactive Peptide Database были обнаружены полные совпадения с биопептидами, функциональные свойства которых ранее были описаны в научной литературе (табл. 3).
Таблица 3 – Некоторые пептиды, обнаруженные в составе белково-пептидной фракции молока, сквашенного L. reuteri LR1, с ранее описанными в литературе биологическими активностями
Таким образом, в результате проведенной детальной характеристики пептидного профиля молока, сквашенного L. reuteri LR1, в его составе идентифицированы биопептиды, отвечающие за антиоксидантные, гипотензивные и антимикробные свойства, что подтверждается наличием соответствующих активностей ферментированного молока в тестах in vitro. Полученные данные доказывают, что штамм L. reuteri LR1 обладает выраженным пробиотическим потенциалом.
В 4 главе «Разработка технологии закваски прямого внесения L. reuteri LR1» приведены результаты исследований по разработке технологии ЗПВ L. reuteri LR1.
При определении оптимального количества компонентов питательной среды для накопления клеток L. reuteri LR1 был разработан предварительный 5-факторный малый центральный композиционный план со следующим диапазоном варьирования ингредиентов: гидролизованное молоко (30 – 100) %, дрожжевой экстракт (0 – 5) %, сахароза (0 – 5) %,

инулин (0 – 1) %, цистеин (0 – 0,5) % (табл. 4). Температура культивирования (37±1)°С, доза инокулята 1%, отбор проб проводили через 16-17 часов культивирования.
Таблица 4 – Уровни варьирования независимых факторов
Фактор
Гидролизованное молоко, % Дрожжевой экстракт, % Сахароза, %
Цистеин, %
Переменная Уровни варьирования -10+1
Х1 30 75 100 Х2 0 2,5 5,0 Х3 0 2,5 5 Х4 0 0,25 0,5 Х5 0 0,5 1,0
Инулин, %
На основании разработанного композиционного плана были проведены исследования
по влиянию компонентов питательной среды на накопление L. reuteri LR1. В результате регрессионного анализа получено уравнение регрессии, описывающее зависимость накопления клеток L. reuteri LR1 от исследуемых компонентов, входящих в состав питательной среды:
y = 9,002 + 0,87308×Х2 – 0,69872×Х3 – 3,70255×Х4 + 9,95274×Х5 + 0,07586×Х1×Х4 – 0,08051×Х1×Х5 – 1,98279×Х2×Х5
Влияние фактора «Сахароза» (Х3), на накопление клеток L. reuteri LR1 в питательной среде в виде поверхностей отклика представлены на рис. 5.
«Сахароза» (Х3) = 0%
«Сахароза» (Х3) = 2,5 %
Факторы «Инулин» (Х5) и «Цистеин» (Х4) были установлены на центральных значениях.
Приведенные поверхности отклика зависимости количества клеток от концентрации компонентов в питательной среде при содержании сахарозы от 0 до 5% показывают, что наибольшее накопление L. reuteri LR1 было получено на питательной среде без добавления сахарозы. Также, исходя из обработанных данных, на накопление клеток в процессе культивирования влияет взаимодействие
«Сахароза» (Х3) = 5 %
Рисунок 5 – Количество L. reuteri LR1 в зависимости от концентрации компонентов Х1 и Х2 в питательной среде при различном количестве сахарозы
факторов Цистеин» Цистеин».
«Гидролизованное и «Дрожжевой
молоко- экстракт-

Рисунок 6 – Зависимость количества клеток L. reuteri LR1 от концентрации компонентов «Гидролизованное молоко» (Х1) и «Цистеин» (Х4)
Рисунок 7 – Зависимость количества клеток L. reuteri LR1 от концентрации компонентов «Дрожжевой экстракт» (Х2) и «Цистеин» (Х4)
Определено, что с увеличением содержания цистеина в составе питательной среды, количество клеток L. reuteri LR1 повышается (рис. 6). Компоненты дрожжевой экстракт и цистеин могут быть взаимозаменяемы (рис. 7). Таким образом, было установлено, что добавление цистеина и дрожжевого экстракта в гидролизованное молоко стимулирует развитие L. reuteri LR1, тогда как сахароза подавляет.
В ходе дальнейших исследований была разработана программа для моделирования и расчета состава питательной среды для культивирования пробиотического микроорганизма L. reuteri LR1 и с её использованием усовершенствована питательная среда: гидролизованное молоко – 500 см3/дм3, дрожжевой экстракт – 15 г/дм3, CH3COONa – 5 г/дм3, цистеин – 0,25 г/дм3, KH2PO4 – 2 г/дм3, MgSO4 – 0,2 г/дм3, MnSO4 – 0,05 г/дм3, дистиллированная вода до 1000 см3, позволяющая получить высокое количество клеток L. reuteri LR1 в ЗПВ.
При проведении исследований по влиянию технологических параметров культивирования на накопление L. reuteri LR1 определили зависимость динамики развития L. reuteri LR1 от активной кислотности питательной среды, температуры культивирования, дозы инокулята и продолжительности культивирования.
Сводные данные по изменению количества клеток L. reuteri LR1 в процессе культивирования при температурах 35°С, 37°С и поддержании активной кислотности на уровне 5,8 ед. рН, 6,0 ед. рН, 6,2 ед. рН представлены на рис. 8.
Уравнение регрессии: y=a+bx+cx2 Коэффициенты уравнения, коэффициенты корреляции:
pH=6.2, 35°C a=7,39; b=0.53; c= – 0.04; r=0.984;
pH=6.0, 35°C a=7,49; b=0.50; c= – 0.04; r=0.98;
pH=5.8, 35°C a=7,45; b=0.52; c= – 0.04; r=0.969;
pH=6.2, 37°C a=7,57; b=0.49; c= – 0.04; r=0.955;
pH=6.0, 37°Ca=7,86; b=0.46; c= – 0.04; r=0.99;
pH=5.8, 37°Ca=7,44; b=0.51; c= – 0.04; r=0.996
Рисунок 8 – Динамика изменения содержания клеток L. reuteri LR1 при различных температурах и значениях активной кислотности

Установлено, что количество L. reuteri LR1 при культивировании при вышеуказанных режимах отличалось незначительно. Однако, наибольшее содержание клеток L. reuteri LR1 было достигнуто при температуре культивирования (37±1)°С, активной кислотности питательной среды 6,2 ед. рН и составило 1,75×109 КОЕ/см3. Также следует отметить, что
наибольшее накопление жизнеспособных клеток L. reuteri LR1 культивирования.
было получено через 8-9 часов
Влияние дозы инокулята на накопление L. reuteri LR1 при температуре (37±1)°С и pH = 6.2 представлены на рис. 9.
Уравнение регрессии: y=a+bx+cx2. Коэффициенты уравнения, коэффициенты корреляции: 3% a=7.61; b=0.36; c= – 0.03; r=0.933; 4% a=7.71; b=0.26; c= – 0.01; r=0.995; 5% a=7.76; b=0.21; c=- 0.01; r=0.963; 6% a=7.71; b=0.41; c=- 0.02; r=0.975; 7% a=7.82; b=0.3; c=- 0.02; r=0.968; 8% a=7.85; b=0.31; c=- 0.02; r=0.959
Рисунок 9 – Влияние дозы инокулята на накопление клеток L. reuteri LR1
При исследовании динамики развития L. reuteri LR1 в зависимости от дозы инокулята выявлено, что наибольшее количество клеток L.reuteri LR1 было получено через 6 – 8 часов культивирования при внесении 6-7% инокулята и составило 2×109 КОЕ/см3.
Предварительно проведенные исследования различных защитных сред показали, что наибольшая выживаемость L. reuteri LR1 отмечена при использовании защитных сред, содержащих в своем составе обезжиренное молоко, сахарозу и уксуснокислый натрий. Для уточнения количества компонентов в составе защитной среды был составлен 3-факторный план эксперимента для смеси с ограничениями, со следующим диапазоном варьирования компонентов: молоко коровье обезжиренное – 0% – 90%, 10%-й раствор сахарозы – 0% – 90%, 35%-й раствор уксуснокислого натрия – 0% – 20% (табл. 5).
Таблица 5 – Уровни варьирования компонентов защитной среды
No защитной среды
Обезжиренное коровье молоко, %
Варьируемые компоненты Сахароза, %
Уксуснокислый натрий, %
1 80 0 20 2 100 0 0 3 0 90 10 4 38 52 10 5 10 90 0 6 0 80 20

Биомассу L. reuteri LR1 смешивали с в соотношении 1:1 с защитными средами, полученную суспензию разливали в стерильные флаконы по 2 см3 и замораживали, высушивали и закладывали на хранение в морозильную камеру при температуре минус (18±2)°С.
Математически обработанные результаты исследований по определению влияния концентрации компонентов защитной среды на выживаемость L. reuteri LR1 представлены на рис. 10.
К=9,34X+10,64Y+10,24Z; r=0.918
Рисунок 10 – Карта линий уровня влияния компонентов защитной среды на
выживаемость L. reuteri LR1
На основании проведенных исследований определен состав защитной среды,
обеспечивающий наибольшую выживаемость клеток L.reuteri LR1 в процессе сублимационного высушивания: обезжиренное молоко – 17,7%, сахароза – 72,8%, уксуснокислый натрий – 9,5%.
В результате дальнейших исследований были получены данные по выживаемости клеток L. reuteri LR1 в процессе хранения ЗПВ L. reuteri LR1 при температуре минус (18±2)°С (рис. 11).
11 10,8 10,6 10,4 10,2 10 9,8 9,6 9,4 9,2 9
01369 Продолжительность хранения, месяц
Рисунок 11 – Выживаемость L. reuteri LR1 в процессе хранения ЗПВ
Установлено, что количество L. reuteri LR1 в процессе хранения снижается и через 6 месяцев, составляет 1,4×1010 КОЕ/см3, а через 9 месяцев хранения количество L. reuteri LR1 составило 9,7×109 КОЕ/см3. Таким образом, проведенные исследования позволили определить состав защитной среды и установить рекомендуемый срок годности ЗПВ L. reuteri LR1.
Количество клеток, lg КОЕ/см3
Согласно нормативной документации количество клеток в ЗПВ молочнокислых бактерий должно быть не менее 1×1010 КОЕ/г. Таким образом, проведенные исследования показали, что рекомендуемый срок годности закваски прямого внесения L. reuteri LR1 при температуре минус (18±2)°С составляет 6 месяцев.
На основании проведенных исследований разработан СТО 00419785-045-2019 «Закваска прямого внесения L. reuteri LR1».
В главе 5 «Разработка кисломолочного продукта с использованием закваски прямого внесения L. reuteri LR1» приведены результаты исследований по разработке кисломолочного продукта с использованием закваски прямого внесения L. reuteri LR1. Полученная ЗПВ L. reuteri LR1 была использована при разработке кисломолочного продукта «Релакт». Исследовано влияние факторов роста на развитие клеток L. reuteri LR1 в пастеризованном молоке. В качестве факторов роста были выбраны: дрожжевой экстракт – 2 г/дм3 и сухая питательная среда ГМК-3 – 2 г/дм3 (рис. 12).
7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4
Молоко без факторов роста Молоко+дрожжевой экстракт Молоко+ГМК-3
y = -0,32ln(x) + 6,67 r = 0,956
y = -0,58ln(x) + 6,86 r = 0,982
y = -0,7ln(x) + 6,82 r = 0,985
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Продолжительность культивирования, ч
Рисунок 12 – Влияние различных факторов роста на изменение активной кислотности при сквашивании молока L. reuteri LR1
Отмечено, что использование дрожжевого экстракта и ГМК – 3 положительно влияет на развитие клеток L. reuteri LR1 в молоке. Так, при его культивировании на пастеризованном молоке без факторов роста в течение 24 ч снижение значения активной кислотности составляет 1,14 ед. рН, тогда как при добавлении к молоку ГМК–3 – 1,65 ед. рН, а при добавлении дрожжевого экстракта – 1,9 ед. рН. Характер кривой указывает на стимулирующее воздействие ингредиентов на рост L. reuteri LR1.
Полученные результаты показали, что для стимулирования роста L. reuteri LR1 в молоке могут использоваться исследуемые факторы роста, но наибольшая активность кислотообразования, наилучшее развитие клеток и сокращение лаг-фазы было отмечено при использовании дрожжевого экстракта. Представленные результаты показывают целесообразность использования дрожжевого экстракта, в качестве добавки в молоко, для приготовления КП с использованием чистой культуры L. reuteri LR1.
При разработке технологии вариантов пробиотического КП, обеспечивающей высокое содержание клеток L. reuteri LR1, были выбраны два варианта заквасок: монокультура L. reuteri LR1, и закваска, состоящая из консорциума молочнокислых бактерий ХТС (L. helveticus NK1 и S. thermophilus 159) и L. reuteri LR1. Выбранные культуры не обладают антагонизмом при совместном культивировании. ЗПВ L. reuteri LR1 может вноситься в молоко, подготовленное для заквашивания одновременно с закваской ХТС, или заквашивание осуществляют с использованием закваски ХТС и добавляют ЗПВ L. reuteri LR1 в сгусток после сквашивания. При использовании монокультуры L. reuteri LR1 ЗПВ добавляется в подготовленное для сквашивания молоко с дрожжевым экстрактом (табл. 6). В молоко, подготовленное для сквашивания вносили ЗПВ L. reuteri LR1 в количестве 5×106 КОЕ/см3.
Активная кислотность, ед.рН

15 Таблица 6 – Варианты кисломолочного продукта
Номер образца 1
3
Особенности технологии
ЗПВ L. reuteri LR1 вносится в нормализованное молоко с
дрожжевым экстрактом, подготовленное для сквашивания
ЗПВ L. reuteri LR1 вносится в нормализованное молоко, подготовленное для сквашивания, одновременно с производственной закваской ХТС
Сквашивание проводят с использованием производственной закваски ХТС, а ЗПВ L. reuteri LR1 вносят в полученный сгусток
Сквашивание проводили при температуре (37±2)°С. Продолжительность сквашивания для образца No 1 составила 10 ч, для образца No 2 – 6 ч, для образца No 3 – 6,5 ч.
Для каждого образца КП проводили исследование физико-химических, органолептических и микробиологических характеристик. Результаты исследований содержания клеток молочнокислых и пробиотических культур в образцах КП представлены на рис. 13.
9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5
No No2 No3
L. reuteri LR1 . helveticus NK1 и S. thermophilus 159
L
Рисунок 13 – Содержание L. reuteri LR1 и L. helveticus NK1 + S. thermophilus 159 в образцах КП
Установлено, что после сквашивания в образцах КП количество клеток L. reuteri LR1 составило для образца No 1 – 1×108 КОЕ/см3, для образца No 2 – 8×107 КОЕ/см3, для образца No 3 – 5×106 КОЕ/см3. Наибольшее содержание клеток ХТС (L. helveticus NK1 и S. thermophilus 159) отмечено в образце No 3 и составляет 2,5×108 КОЕ/см3. В образце No 2 количество клеток ХТС (L. helveticus NK1 и S. thermophilus 159) составило 1,1×108 КОЕ/см3.
Органолептические показатели образцов кисломолочных продуктов представлены в таблице 7.
Таблица 7 – Органолептические показатели образцов КП
No образца
Наименование показателя
Внешний вид и консистенция Вкус и запах Цвет
1
Однородная с нарушенным сгустком, газообразование в виде отдельных глазков, вызванных развитием L.reuteri
Чистый, кисломолочный
Молочно-белый, равномерный по всей массе
2
Однородная с нарушенным сгустком, газообразование в виде отдельных глазков, вызванных развитием L.reuteri
Чистый, кисломолочный
Молочно-белый, равномерный по всей массе
Однородная с нарушенным сгустком Чистый, кисломолочный
Молочно-белый, равномерный по всей массе
Количество клеток, lg КОЕ/см 3
При определении показателей безопасности образцов КП установлено, что все исследуемые образцы по микробиологическим показателям соответствуют требованиям ТР ТС 033/2013 «Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции».
Принципиальная схема технологического процесса производства кисломолочного продукта с пробиотическими свойствами приведена на рисунке 14.
Рисунок 14 – Принципиальная схема технологического процесса производства кисломолочного продукта с пробиотическими свойствами
При определении рекомендуемого срока годности кисломолочного продукта были выработаны по три партии образцов продукта и заложены на хранение при температуре (4±2)°С на 20 суток (предполагаемый срок годности – 15 суток).
В полученном кисломолочном продукте в процессе хранения определяли количество клеток L. reuteri LR1 (рис. 15) и ХТС (L. helveticus NK1 + S. thеrmophilus 159) (рис. 16).

9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5
0 5 10 15 20 Продолжительность хранения, сутки
No1 No 2 No3
Рисунок 15 – Динамика изменения количества L. reuteri LR1 в процессе хранения образцов кисломолочных продуктов
Установлено, что в образце No1 в процессе хранения количество клеток L. reuteri LR1 уменьшилось с 1×108 КОЕ/см3 до 3×106 КОЕ/см3, в образце No 2 – с 8×107 КОЕ/см3 до 2×106 КОЕ/см3. В образце No3 количество клеток L. reuteri LR1 за 20 суток хранения снизилось с 5×106 КОЕ/см3 до 8×105 КОЕ/см3.
9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5
0 5 10 15 20 Продолжительность хранения, сутки
No2 No3
Рисунок 16 – Динамика изменения количества ХТС (L. helveticus NK1 + S. thеrmophilus 159) процессе хранения образцов кисломолочных продуктов
Количество клеток L. helveticus NK1 + S. thеrmophilus 159 в образце No2 сразу после сквашивания данного продукта составляло 1,1×108 КОЕ/см3 и за 20 суток хранения снизилось до 6×107 КОЕ/см3 (рис. 16), а в образце No 3 количество клеток L. helveticus NK1 + S. thеrmophilus 159 за период хранения снизилось с 2,5×108 КОЕ/см3 до 1,1×107 КОЕ/см3.
Остальные микробиологические показатели готового продукта соответствовали нормам, изложенным в ТР ТС 033/2013 на протяжении всего срока хранения. На основании проведенных исследований определены рекомендуемые сроки годности КП. Рекомендуемый срок годности образцов No1 и No2 составляет 15 суток, образца No 3 – 10 суток.
По совокупности полученных данных для исследования функциональных свойств был выбран образец КП No2. Разработанный КП обладает выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам (рис.17).
Количество клеток, lg КОЕ/см3
Количество клеток, lg КОЕ/см3
100 90 80 70 60 50 40
E.coli АТСС 25922
S.aureus ATCC 6538
24 48
S. typhimurium АТСС 14028
Рисунок 17 – Антагонистическая активность разработанного кисломолочного продукта
Степень подавления тест-штаммов варьируется в зависимости от вида тест-штамма и составляет через 24 ч от 54 до 64 %, а через 48 ч от 80 до 92%.
Медико-биологическая оценка разработанного КП, проведенная в условиях однофакторного эксперимента на белых крысах линии Wistar (с исходной массой тела 160±10 г, n=10 в каждой группе), показала его эффективность в плане нормализации состава микробиоты и ряда показателей липидного обмена. Отмечено, что исследуемый КП при введении в рацион (5 мл/сут per os) в течение 30 суток не вызывает отклонений в состоянии здоровья и поведении лабораторных животных spf-категории. У животных всех групп (интакт, контроль и опыт) содержание лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и их распределение по популяциям находились в пределах физиологической нормы. При введении в рацион экспериментальных животных разработанного КП в составе микробиома кишечника крыс
увеличилось содержание бифидо- и лактобактерий, а также нормобиоты крыс (табл. 8).
Таблица 8 – Состав микробиома кишечника крыс после (содержание микроорганизмов, lg КОЕ/г сырой массы фецес)
Интактная 8,4±0,3 8,4±0,3 5,0±0,2 7,7±0,2 6,8±0,3 2,3±0,1 Контрольная 8,7±0,4 8,4±0,3 5,2±0,3 7,4±0,4 6,6±0,2 2,3±0,4 Опытная 9,0±0,2 8,6±0,2 5,9±0,5 6,6±0,4 4,9±0,4 Не
обнаруж
энтеробактерий, типичных для включения в их рацион КП
8,3±0,2 8,3±0,2 2,3±0,3 4,5±0,4 8,6±0,1 8,6±0,2 2,3±0,4 3,9±0,3 9,5±0,4 9,0±0,3 Не 3,6±0,2
обнаруж
Группа животных
Проведенный комплекс исследований по изучению функциональных свойств разработанного КП свидетельствует о наличии у него нормализующего эффекта на микробиоту и ряд показателей липидного обмена. При введении в рацион экспериментальных животных разработанного КП в составе микробиоты кишечника крыс увеличилось
Анаэробы Аэробы
Степень подавления роста тест-культур, %
Энтеробактерии
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
S. aureus
Лактобациллы Бифидобактерии
Дрожжи
Плесневые грибы
содержание бифидо- и лактобактерий, а также энтеробактерий, типичных для нормобиоты крыс, в сыворотке крови снижалась концентрация холестерина и триглицеридов.
На основании проведенных исследований разработан СТО 00419785-047-2020 «Продукты кисломолочные «Релакт».
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ:
1. Комплекс проведенных исследований позволил разработать технологию кисломолочного продукта «Релакт» с пробиотическими свойствами с использованием закваски прямого внесения L. reuteri LR1
2. Исследованы in vitro пробиотические свойства L.reuteri LR1. Установлено, штамм L.reuteri LR1 обладает выраженной антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, которая варьируется в зависимости от используемой тест-культуры и продолжительности сокультивирования штаммов. Штамм L. reuteri LR1 чувствителен к линкомицину, амоксициллину и левомицетину, проявляет промежуточную устойчивость к ампициллину и неомицину, и обладает устойчивостью к остальным изучаемым антимикробным препаратам. Определена динамика изменения протеолитической, антиоксидантной и АПФ – ингибирующей активностей в процессе культивирования штамма L.reuteri LR1 на обезжиренном молоке. Охарактеризован пептидный профиль белково-пептидной фракции обезжиренного молока, сквашенного L. reuteri LR1 и идентифицированы пептиды, отвечающие за антиоксидантные, гипотензивные и антимикробные свойства;
3. Разработан состав питательной среды для накопления L.reuteri LR1: гидролизованное молоко – 500 см3/дм3, дрожжевой экстракт – 15 г/дм3, CH3COONa – 5 г/ дм3, цистеин – 0,25 г/дм3, KH2PO4 – 2 г/дм3, MgSO4 – 0,2 г/ дм3, MnSO4 – 0,05 г/ дм3, дистиллированная вода до 1000 мл. Определен состав защитной среды, обеспечивающий наибольшую выживаемость клеток L.reuteri LR1 в процессе сублимационного высушивания: обезжиренное молоко – 17,7%, сахароза – 72,8%, уксуснокислый натрий – 9,5%;
4. Разработана технология ЗПВ L.reuteri LR1. Установлены технологические параметры культивирования L.reuteri LR1: активная кислотность питательной среды – (6,2±0,1) ед. рН, количество инокулята – (6,0±0,5)%; температура культивирования – (37±1)°С; продолжительность культивирования (7,0±0,5) ч.;
5. Разработана технология кисломолочного продукта «Релакт» с пробиотическими свойствами с использованием закваски прямого внесения L. reuteri LR1 и исследованы in vitro и in vivo функциональные свойства разработанного КП;
6. Определены рекомендуемые сроки годности, разработан комплект технической документации СТО 00419785-045-2019 «Закваска прямого внесения L.reuteri LR1» и СТО 00419785-047-2020 «Продукты кисломолочные «Релакт». Проведена опытно- промышленная выработка закваски прямого внесения L.reuteri LR1 и кисломолочного продукта «Релакт» с её использованием.