Роль белка PCID2 в транспорте мРНК у Drosophila melanogaster

1. Характеристика PCID2
1.1.В S2 клетках Drosophila melanogaster белок PCID2 имеет три изоформы

Несмотря на то, что белок PCID2 имеет ортологов у всех многоклеточных, включая Mus
musculus, Homo sapiens и Drosophila melanogaster, он изучен мало. Ген pcid2 у Drosophila
melanogaster располагается на 3L хромосоме и содержит один единственный экзон (база
данных «FlyBase» http://flybase.org/). У Drosophila melanogaster с гена pcid2 синтезируется один
единственный транскрипт, в результате чего образуется белок с расчётным молекулярным
весом 45 кДа.
Ранее в нашей лаборатории был выделен комплекс экспорта TREX-2, в состав которого
входит белок PCID2. Нами были получены кроличьи поликлональные антитела к С-концевому
фрагменту PCID2 (Рис. 1А). На вестерн блоте, проведенном для проверки полученных антител,
в отличие от гибридизации с преиммунной сывороткой, при гибридизации с иммунной
сывороткой появлялось три полосы: нижняя, около 42 кДа соответствующая расчётной массе
PCID2 и две, тяжелее расчётной на 5 и 10 кДа (Рис. 1А). Полученные данные отличались от
расчётных, описанных в литературе, где говорится о существовании полипептида PCID2 c
молекулярным весом 45 кДа. В связи с этим возникла необходимость в проверке
специфичности полученных нами антител к белку PCID2.

Г

Рисунок 1 Анализ распределения белка PCID2 по клеточным компартментам.
Вестерн-блот анализ проводился с использованием преиммунной сыворотки кролика (Пи),
иммунной сыворотки (Им) и поликлональных антител против белков PCID2 и IgG кролика, а
также поликлональных антител к Nup 153, Ubiquitin, моноклональных антител к тубулину и
TBP. (А) Аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела специфично распознают
белок PCID2 в клеточном экстракте S2 на вестерн блоте. Полоски нитроцеллюлозной мембраны
были гибридизованы с преимунной сывороткой, иммунной сывороткой и аффинно очищенными
поликлональными антителами к PCID2 (Ат). (Б) Формы белка PCID2 не детектируются на
вестерн блоте при конкурентном связывании антител антигеном. Аффинно очищенные
антитела к PCID2 инкубировали с различными количествами иммунизирующего пептида (100,
300 и 600 мкг) и гибридизовали с полученной смесью нитроцеллюлозные полоски мембраны на
вестерн блоте. (В) На вестерн блоте представлено распределение разных форм PCID2 в
компартментах клеток. Были выделены ядерный (ядро), цитоплазматический (цито) и
мембранный (мемб) экстракты, а затем нанесены на вестерн блот с использованием антител к
PCID2. Для подтверждения чистоты фракционирования те же экстракты на вестерн блоте были
проанализированы с помощью антител к Nup153, tubulin и TBP (панели ниже). (Г) Проводили
иммунопреципитацию из клеточных лизатов за антитела к убиквитину и PCID2. Преципитат
наносили на вестерн блот и анализировали с использованием антител к PCID2, IgG и
убиквитину.

Специфичность антител была подтверждена в экспериментах по конкурентному
связыванию пептидов (Рис. 1Б). Данный эксперимент показывает, какие из белков, видимых как
полосы на вестерн-блоте, антитела к PCID2 связывают специфично, а какие из полос являются
неспецифичным сигналом. В случае предварительного связывания полученных антител с
антигеном мы наблюдали отсутствие, либо значительное истощение полос, соответствующих
предполагаемым формам белка на вестерн блоте. Проверка показала, что все формы белка
PCID2 аффинно узнаются полученными антителами, так как не детектируются на вестерн блоте
при конкурентном связывании антител антигеном.
Убедившись в специфичности полученных антител, было исследовано распределение
PCID2 в клетке. Были получены ядерная, мембранная и цитоплазматическая фракции клеток S2
(Рис. 1В). В ядерной фракции выявлялся белок с молекулярной массой, сходной с расчетной и
соответствующей примерно 42 кДа, тогда как молекулярная масса выявляющегося в
цитоплазматической фракции белка была на 5 кДа больше и соответствовала примерно 47 кДа.
Ядерный экстракт содержал только самую низкомолекулярную форму PCID2 (42 кДа), в то
время как цитоплазматическая фракция содержала среднюю по размеру форму PCID2. В
мембранной фракции кроме двух вышеперечисленных белков выявлялась также более тяжёлая
форма. Она была на 5 кДа выше цитоплазматической формы и присутствовала специфично в
мембранной фракции (Рис. 1В). Мы предположили, что PCID2 мигрирует между ядром и
цитоплазмой клетки и локализуется на ядерной мембране.
Поскольку ген pcid2 не содержит интронов и с него синтезируется только один
транскрипт, кодирующий только один белок, то мы предположили, что остальные формы белка
могут образовываться с помощью его посттрансляционной модификации. При анализе
последовательностибелкаPCID2былиобнаруженывозможныесайтыдляего
убиквитинилирования. Кроме того, при детекции изоформ белка PCID2 при помощи вестерн
блот анализа мы обнаружили смещение полос на геле на 5 и 10 кДа. Это согласуется с
литературными данными о том, что при разделении в денатурирующем полиакриламидном геле
белок Ubiquitin (молекулярной массой 8,5 кДа) может мигрировать cоответственно
молекулярной массе 5,5 кДа. Поэтому было исследовано возможное убиквитинилирование
PCID2. Для этого были проведены реакции иммунопреципитации PCID2 из экстракта S2 клеток
(Рис. 1Г). В то время как антитела против PCID2 распознавали все три изоформы в
преципитате, антитела к белку Ubiquitin распознавали только две более тяжёлые, что
свидетельствовало о их убикивитинилировании (Рис. 1Г).
Таким образом, было показано, что белок PCID2 имеет несколько изоформ,
различающихся по размеру и локализующихся в различных компартментах клетки.
Цитоплазматическая и мембранная формы белка PCID2 образованы путем модификации
убиквитином.

1.2.Белок PCID2 колокализуется с NPC в S2 клетках Drosophila melanogaster

Из литературных данных известно, что белок PCID2 курсирует как шаттл из ядра в цитоплазму
в обоих направлениях. В связи с этим PCID2 может постоянно изменять свою локализацию,
пересекая ядерную мембрану. С использованием метода иммуноокрашивания клеток была
визуализирована локализация белка PCID2 в клетках линии S2 (Рис. 2),
Рисунок 2 Распределение белка PCID2 в клетках S2 Drosophila melanogaster
(А) PCID2 присутствует как в ядре, так и в цитоплазме клеток S2 Drosophila melanogaster.
Клетки окрашены аффинно очищенными поликлональными антителами к PCID2. Ядро
окрашено DAPI. (Б) PCID2 колокализуется с NPC. Клетки были окрашены антителами к PCID2
и NPC. (В) PCID2 присутствует как в ядре, так и в цитоплазме клеток S2 Drosophila
melanogaster. Проведена трансфекция клеток при помощи генной конструкции, содержащей
последовательность PCID2, слитой с FLAG эпитопом. Затем клетки были окрашены антителами
к FLAG эпитопу. Ядро окрашено DAPI. Масштабная полоса 10 мкм.

культивируемых в обычных условиях. Было проведено иммуноокрашивание с использованием
поликлональных антител к PCID2 и антител к NPC. Препараты были проанализированы на
флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse TS100 (Рис. 2 А,В), а также на конфокальном
микроскопе Leica TCS SP2 (Рис. 2Б). Для подтверждения специфичности окрашивания белка
PCID2 в клетках была проведена трансфекция клеток S2 полученной генной конструкцией,
содержащей последовательность белка PCID2, слитой с FLAG эпитопом. После чего клетки
окрашивали антителами к FLAG эпитопу (Рис. 2В).
Мы показали, что PCID2 находится как в ядре, так и в цитоплазме клеток, что
согласуется с уже известными данными для других организмов, причем, в цитоплазме его
количествозаметновыше.Важнотакжеотметить,чтонаблюдалосьхарактерное
мелкозернистое распределение белка, что говорит о формировании небольших конгломератов
данного белка внутри клеток. Данное распределение белка не являлось артефактом
окрашивания,таккакиммуноокрашиваниеантителамикFLAGэпитопутакже
демонстрировало мелкозернистый паттерн PCID2 внутри клеток. Совершенно четко
наблюдалось кольцо вокруг ядра, образованное белком PCID2, что говорит о скоплении
данного белка в области ядерной мембраны со стороны цитоплазмы. При совмещении
фотографий распределения PCID2 и NPC было замечено, что PCID2 колокализуется с
комплексами ядерной поры, что является одним из доказательств их ассоциации, ведь именно
через поровые комплексы PCID2 выходит в цитоплазму и попадает обратно в ядро.
Таким образом, мы показали, что распределение белка PCID2 в S2 клетках соответствует
таковому у других организмов. Кроме того, была показана его колокализация с комплексом
ядерной поры.
2. PCID2 в составе ядерного комплекса TREX-2
2.1. ENY2 и Xmas-2 взаимодействуют только с формой PCID2, находящейся в составе
ядерного комплекса

Белок PCID2 в ядрах клеток Drosophila melanogaster находится в составе комплекса
экспорта мРНК TREX-2, в который также входят белки ENY2 и Xmas-2. Ранее мы уже
исследовали комплекс TREX-2 и охарактеризовали тайминг и локализацию взаимодействий
комплекса TREX-2 с мРНК гена β-тубулина 56D. Также в наших предыдущих исследованиях
было показано взаимодействие между белками Drosophila melanogaster Xmas-2 и ENY2 и их
роль в ядерном экспорте мРНК. Однако, предполагаемая причастность комплекса к
последующему экспорту мРНК в цитоплазме осталась неисследованной.
Выделенный в предыдущем исследовании комплекс TREX-2 Drosophila melanogaster
содержал только 42 кДа форму PCID2. Для исследования функций различных изоформ белка, а
также чтобы выявить, какие формы белка взаимодействуют с субъединицами комплекса TREX-
2 на первом этапе, было исследовано распределение компонентов комплекса TREX-2 в S2
клетках с использованием цитоплазматической и ядерной фракций клеточного экстракта и
полученных нами поликлональных антител. Для исследования локализации белков комплекса в
клетке, S2 клетки были фракционированы на две фракции: ядерную и цитоплазматическую.
Оценка эффективности разделения и чистоты фракций была проведена с использованием
вестерн-блот анализа с антителами к ядерному Lamin Dm0 и цитоплазматическому белку β-
Tubulin (Рис. 3Б).

Рисунок 3 Анализ взаимодействия белковых компонентов комплекса TREX2
Вестерн-блот анализ проводился с использованием поликлональных антител против белков
Xmas-2, ENY2, PCID2 и IgG кролика, а также моноклональных антител к белкам Tubulin и
Lamin. (А) Распределение белковых компонентов комплекса TREX-2 в ядерной и
цитоплазматической фракциях S2 клеток Drosophila melanogaster. Ядерный и
цитоплазматический экстракт наносили на денатурирующий ПААГ и анализировали методом
вестерн блот. (Б) Проверка чистоты разделения фракций на ядерную и цитоплазматическую.
Мембрана гибридизована с антителами к Lamin (ядерный экстракт) и Tubulin
(цитоплазматический экстракт). (В) Компоненты комплекса TREX-2 взаимодействуют с ядерной
формой PCID2. Из общего лизата клеток проводили иммунопреципитацию за антитела к Xmas-
2, ENY2, PCID2. Преципитат наносили на денатурирующий ПААГ и анализировали методом
вестерн блот. Мембраны гибридизованы с антителами к Xmas-2, ENY2, PCID2. В качестве
контроля использовали IgG.

Вестерн-блот анализ показал присутствие белка Xmas-2 в ядерной, но не в
цитоплазматической фракции S2 клеток (Рис. 3А). Аналогичным образом, белок ENY2 был
найден в ядерной фракции, но не в цитоплазме (Рис. 3А). В отличие от других компонентов
комплекса, белок PCID2 был обнаружен в обеих фракциях, причем, в разных фракциях формы
белка PCID2 отличались по размеру, и их соотношение варьировало в зависимости от
клеточной фракции. (Рис. 3А). Таким образом, другие субъединицы комплекса TREX-2
выявляются преимущественно в ядерной фракции S2 клеток.
В связи с результатами, полученными ранее о существовании трёх форм изучаемого
белка, было определено с какой из форм взаимодействуют ENY2 и Xmas-2. Анализ белок-
белковых взаимодействий проводили с использованием метода коиммунопреципитации из
лизатов S2 клеток (Рис. 3В). Реакции иммунопреципитации проводили с использованием
антител к компонентам комплекса TREX-2. В качестве контроля использовали антитела к
иммуноглобулину IgG. После чего анализировали результаты иммунопреципитации методом
вестерн-блот с использованием кроличьих поликлональных антител к PCID2, полученных в
нашей лаборатории. При анализе полученных данных были выявлены взаимодействия между
белком ENY2 и лёгкой формой белка PCID2, а также между белком Xmas-2 и лёгкой формой
белка PCID2. Как показано на Рис. 3В, антитела к белкам Xmas-2 и ENY2 соосаждают PCID2,
однако Xmas-2 и ENY2 взаимодействуют только с его ядерной формой. Взаимодействия белков
Xmas-2, ENY2 не наблюдается с другими формами белка PCID2 в лизате S2 клеток. В
частности, нет взаимодействия со средней формой, которую мы считаем уникальной для
цитоплазмы.
Таким образом, в клетках линии S2 Drosophila melanogaster белки Xmas-2 и ENY2,
находясь в ядре в комплексе с PCID2, взаимодействуют с его лёгкой формой, локализующейся
преимущественно в ядре. И TREX-2 комплекс функционирует в ядре, в то время как белок
PCID2 может впоследствии участвовать в молекулярных событиях в цитоплазме независимо от
своих партнеров Xmas-2 и ENY2.

3. Комплекс и функциональные взаимодействия PCID2 в цитоплазме

3.1. PCID2 состоит в комплексе с белком NudC в цитоплазме клеток Drosophila
melanogaster

Много исследований проведено на тему роли белка PCID2 в ядре, его взаимодействий с
другими белками и участия в работе транспортных комплексов в этом компартменте. Но, в то
же время, роль данного белка в цитоплазме клеток Drosophila melanogaster не ясна. Неизвестно
также, в какие взаимодействия вступает изучаемый белок. По всей видимости, его
взаимодействия в цитоплазме отличны от тех, что PCID2 образует в ядре, так как было
замечено, что находящийся в цитоплазматической фракции PCID2 уже не ассоциирован с
компонентами комплекса TREX-2. Ввиду имеющихся данных было принято решение выделить
комплекс белка PCID2 из цитоплазматической фракции и выявить белки, с которыми он
взаимодействует в цитоплазме.PCID2-содержащий белковый комплекс выделяли из
цитоплазматическойфракцииэмбрионовDrosophilamelanogasterсиспользованием
ионообменной и гельфильтрационной хроматографии последовательно (Рис. 4А). С помощью
вестерн-блот анализа фракций и согласно расчетам по таблице молекулярных весов маркера,
размер белкового комплекса до очистки варьирует в диапазоне от 158 до 230 кДа.

В
Б

Рисунок 4 Очистка белкового PCID2 – содержащего комплекса из обогащенного
цитоплазматического экстракта за пришитые к Protein A сефарозе антитела к белку
PCID2
После каждой стадии хроматографической очистки все фракции наносили на денатурирующий
ПААГ и анализировали методом вестерн блот с использованием антител к PCID2. (A) Схема
последовательности хроматографической очистки эмбрионального цитоплазматического
экстракта. (Б) Иммунопреципитация белкового комплекса из обогащенного эмбрионального
экстракта Drosophila melanogaster за пришитые к Protein A сефарозе антитела к белку PCID2.
Мембрана была гибридизована с антителами против PCID2. В качестве контроля использовали
IgG. Элюировали белок с сефарозы раствором кислого глицина рН 2,7. Цифрами обозначены
номера фракций элюции. Во фракциях элюции присутствует PCID2 и преципитат, антитела
фракции не загрязняют. (Б) Электрофорез преципитата белкового комплекса из обогащенного
эмбрионального цитоплазматического экстракта Drosophila melanogaster. На дорожки нанесен
элюат иммунопреципитации за пришитые к Protein A сефарозе антитела к PCID2 и
обогащенный цитоплазматический экстракт, используемый для иммунопреципитации (Иф). В
качестве контроля использовали результат иммунопреципитации из того же экстракта за
пришитые к сефарозе антитела к IgG. Гель окрашен Coomassie blue R250.

После этого нами была проведена иммунопреципитация белкового комплекса, содержащего
белок PCID2 из обогащенного эмбрионального цитоплазматического экстракта Drosophila
melanogaster за ковалентно пришитые к Protein A сефарозе антитела к белку PCID2 (Рис. 4Б).
Результаты иммунопреципитации были проанализированы на денатурирующем ПААГ с
окрашиванием Coomassie R-250 (Рис. 4В). На данном геле представлено разделение всех
белков, содержащихся в элюате. Чтобы определить белковый состав элюата, все окрашенные
полоски были вырезаны из данного геля и отданы на спектрометрический анализ MALDI-TOF
MS. В результате данного анализа удалось детектировать, что с белком PCID2 связывается
только белок NudC. Причем, данный белок был детектирован в нескольких полосах на геле,
соответствующих молекулярным весам 43, 46, 85, 130 и примерно 200 кДа. Все остальные
полосыбылидетектированыкак бактериальная контаминация.Молекулярная масса
почищенного комплекса PCID2-NudC, определяемая подвижностью на колонке Superdex 200
10/300 GL, выше, чем ожидалось, исходя из суммарной молекулярной массы PCID2 и NudC.
Такой результат привел к предположению, что NudC и PCID2 могут формировать гомо- и
гетеродимеры (см. далее пункт 3.2.2.). Возможно, что по крайней мере две молекулы PCID2 и
NudC могут связываться вместе в клетке или белковом экстракте.
Такимобразом,изцитоплазматическогоэмбриональногоэкстрактаDrosophila
melanogaster нами был очищен PCID2-содержащий белковый комплекс, в котором была
определена ассоциация белков PCID2 и NudC.

3.2. PCID2 и NudC напрямую взаимодействуют друг с другом как в цитоплазме клеток
Drosophila melanogaster, так и в системе in vitro, формируя гомо- или гетеродимеры

3.2.1. PCID2 и NudC взаимодействуют между собой в лизате S2 клеток Drosophila
melanogaster

Дляподтвержденияполученныхвпредыдущемэкспериментеданныхпо
взаимодействию PCID2 и NudC были получены кроличьи поликлональные антитела к белку
NudC (Рис. 5А).
Рисунок 5 NudC специфично взаимодействует с цитоплазматической формой PCID2
(A) Аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела специфично распознают на
вестерн блоте белок NudC в клеточном экстракте. Полоски нитроцеллюлозной мембраны были
гибридизованы с преимунной сывороткой (Пи), иммунной сывороткой (Им) и аффинно
очищенными поликлональными антителами к NudC (Ат). (Б) Коиммунопреципитация из
экстракта S2 клеток была произведена с использованием антител к PCID2 и NudC или
преимунной сыворотки (Пи). Были проанализированы равные количества экстракта (Иф) и
преципитируемых белков. (В) NudC присутствует в цитоплазме клеток S2 Drosophila
melanogaster. Клетки окрашены аффинно очищенными поликлональными антителами к NudC.
Ядро окрашено DAPI. Масштабная полоса 10 мкм.

Антитела были аффинно очищены. Они узнавали белок соответствующей молекулярной
массы в экстракте из S2 клеток. Иммунноокрашивание S2 клеток очищенными антителами к
NudC показало, что данный белок локализуется в цитоплазме (Рис. 5В). Иммунопреципитация
из экстракта S2 клеток показала взаимодействие NudC с цитоплазматической, но не с другими
формами PCID2 (Рис. 5Б).
Таким образом, оба белка связывают друг друга в экстракте и полностью осаждаются на
антителах, связанных с сефарозой, что говорит о том, что большая часть цитоплазматического
PCID2 связана с NudC.

3.2.2. Взаимодействие белков PCID2 и NudC Drosophila melanogaster в системе in vitro

Результат очистки цитоплазматического комплекса был подтверждён взаимодействием
белков PCID2 и NudC в клеточном лизате. Поскольку PCID2 в цитоплазме убиквитинилирован,
необходимо было выяснить, нужен ли убиквитин для взаимодействия двух белков. Для
выполнения данной задачи был проведён ряд экспериментов, проясняющих детали связывания
данных белков в цитоплазме in vitro. Чтобы выявить белок-белковые взаимодействия, был
использован метод Pull Down. Для этого были экспрессированы и почищены белки PCID2 и
NudC с эпитопами GST и His. Их инкубировали для связывания в следующих комбинациях:
PCID2-GST c NudC-His, NudC-GST c PCID2-His. Образовавшиеся после инкубации комплексы
элюировали буфером для нанесения и анализировали результат при помощи денатурирующего
электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием Coomassie Blue R 250
(Рис. 6 А,Б).
При проверке взаимодействий белковPCID2 и NudC во фракциях элюции
присутствовали полосы, соответствующие по размеру белками PCID2-GST и NudC-His (Рис. 6
А,Б), что подтверждает их взаимодействие между собой. Данный результат был подтверждён
при проведении связывания тех же белков, но теперь с глутатион-сефарозой был связан белок
NudC. И в этом случае во фракции элюции присутствовали полосы, соответствующие по
размеру белкам NudC-GST и PCID2-His. Таким образом, PCID2 и NudC непосредственно
взаимодействуют друг с другом, и для их взаимодействия убиквитин не нужен.
После предположения о количественном составе белков в цитоплазматическом
комплексе было принято решение проверить их способность к гомо и гетеромеризации,
используя метод Pull Down в системе in vitro. Для этого белки инкубировали в следующих
комбинациях PCID2-GST c PCID2-His, NudC-GST c NudC-His (Рис. 6 В,Г).

Д

контроль

Рисунок 6 NudC и PCID2 напрямую взаимодействуют друг с другом и могут формировать
димеры
(A, Б) Рекомбинантный PCID2-GST (или NudC-GST в случае (Б)) и рекомбинантный NudC-His
(или PCID2-His в случае (Б)) взаимодействуют между собой в эксперименте Pull down. (В, Г)
Рекомбинантный NudC-GST (или PCID2-GST в случае (Г)) и рекомбинантный NudC-His (или
PCID2-His в случае (Г)) образуют гомодимеры в эксперименте Pull down. Иммобилизованный
на GST-сефарозе экстракт рекомбинантного PCID2 или NudC с GST-тагом инкубировали с
рекомбинантными PCID2 либо NudC с His-тагом. (Д) Контроль. Рекомбинантные PCID2-His и
NudC-His не взаимодействуют с очищенным белком GST в эксперименте Pull down.

По результатам эксперимента по димеризации в условиях in vitro было показано, что во
фракциях элюции присутствуют обе полосы, соответствующие по размеру белкам PCID2-GST и
PCID2-His. Это говорит о том, что данные белки взаимодействуют друг с другом и способны
образовывать димеры. Также было выявлено образование димеров при взаимодействии белков
NudC-GST и NudC-His.

Таким образом, данный результат может объяснить молекулярную массу очищенного
комплекса PCID2-NudC, рассчитанную по его миграции на Superdex 200 10/300 GL, что
соответствует двум молекулам PCID2 и двум молекулам NudC.

3.3. NudC играет роль в стабилизации PCID2 в цитоплазме

Функциональная роль взаимодействия PCID2-NudC была изучена с помощью метода РНК
интерференции. Была получена двуцепочечная РНК, соответствующая последовательности
мРНК PCID2. Аналогично, также была создана двуцепочечная РНК, соответствующая
последовательности мРНК NudC. Для проведения РНК интерференции двуцепочечную РНК
добавляли к клеткам S2 и инкубировали в течение 6 суток, в соответствии с подобранными
заранее условиями. В контрольные клетки двуцепочечная РНК добавлена не была. Затем клетки
собирали, одну часть лизировали и анализировали лизаты методом вестерн-блот, используя
антитела к PCID2 и NudC (Рис. 7А).

Рисунок 7 NudC необходим для стабилизации PCID2 в цитоплазме
(А) Экстракт контрольных S2 клеток, клеток с нокдауном PCID2 и NudC анализировали при
помощи вестерн блота, мембраны гибридизовали с антителами к РCID2 и NudC. Нокдаун NudC
вызывает исчезновение цитоплазматической формы PCID2 и аккумуляцию PCID2,
ассоциированного с мембраной. В качестве контроля количества белка на дорожке использовали
ламин. (Б) Уровень транскриптов PCID2 и NudC в контроле, при нокдауне PCID2 и при
нокдауне NudC. Уровень экспрессии был нормализован по уровню экспрессии в контроле. (В)
Иммуноокрашивание нормальных клеток S2 и клеток с нокдауном NudC подтверждает сильное
снижение уровня PCID2. Масштабная полоса 10 мкм.

Из второй части собранных клеток выделяли РНК и анализировали количество мРНК
при помощи метода ПЦР в реальном времени. Нокдаун PCID2 не оказал влияния на уровень
белка NudC (Рис. 7A). В то же время нокдаун NudC привел к значительному снижению уровня
PCID2 в клетках и элиминации его цитоплазматической формы (Рис. 7А). Этот результат
показал, что цитоплазматический PCID2 нестабилен, и NudC, возможно опосредованно,
принимает участие в его стабилизации. Интересно, что это также привело к накоплению
мембранно-ассоциированной формы PCID2 (Рис. 7А). Описанный эффект проявился только на
уровне белка, так как нокдаун NudC не приводил к уменьшению количества мРНК PCID2 (Рис.
7Б). В соответствии с этим результатом иммуноокрашивание S2 клеток антителами к PCID2
показало, что при РНК интерференции NudC значительно снижается уровень PCID2 в
цитоплазме (Рис. 7В).
Таким образом, было показано, что взаимодействие с NudC необходимо для
стабилизации PCID2 в цитоплазме.

3.4. Роль PCID2 в экспорте и транспорте мРНК в ядре и в цитоплазме; взаимодействие
PCID2 с белками Tubulin и Dynactin в цитоплазме клеток S2

Показано, что PCID2 является компонентом комплекса экспорта мРНК TREX-2 в ядре.
Возникла гипотеза, что PCID2 может участвовать в переносе мРНК в цитоплазме. Поскольку
ранее взаимодействие PCID2 с мРНК в экстракте показано не было, было проанализировано
взаимодействие PCID2 с несколькими случайно выбранными мРНК (Ras2 и tubulin 56D) из
ядерного и цитоплазматического экстракта в экспериментах по иммунопреципитации РНК. Как
и предполагалось, PCID2 взаимодействовал с мРНК генов Ras2 и tubulin 56D в ядерном
экстракте (Рис. 8А).

ВГ
Рисунок 8 PCID2 взаимодействует с мРНК, белками Tubulin и Dynactin
Результаты иммунопреципитации мРНК (Ras2 и tubulin 56D), из ядерного (A) и
цитоплазматического (Б) экстрактов S2 клеток были получены с использованием антител к
PCID2 и NudC (IgG использовали в качестве негативного контроля). Результаты РНК
иммунопреципитации представлены в процентах от взятого на связывание количества РНК
(Иф). (В) Антитела к PCID2 копреципитируют тубулин из цитоплазматического экстракта S2
клеток. Были проанализированы равные количества экстракта (Иф) и преципитируемых белков
(Ип). (Г) Антитела к PCID2 копреципитируют динактиновую субъединицу динеин-
динактинового комплекса из цитоплазматического экстракта S2 клеток. Были проанализированы
равные количества экстракта (Иф) и преципитируемых белков (Ип).

Также PCID2 взаимодействовал с этими же мРНК и в цитоплазматическом экстракте
(Рис. 8Б). Аналогичным образом в ядерном экстракте также было проанализировано
взаимодействие с мРНК другого компонента комплекса TREX-2, белка Xmas-2. Надо отметить,
что хотя PCID2 и был ассоциирован с ядерными мРНК, но из-за меньшей доступности PCID2
для антител в комплексе уровень его ассоциации был значительно ниже, чем у Xmas-2 (Рисунок
8А). Также была проверена и способность белка NudC связывать данные мРНК. Оказалось, что
NudC также способен преципитировать некоторое количество мРНК генов Ras2 и tubulin 56D в
цитоплазме, однако, уровень их взаимодействия был значительно ниже, чем у PCID2.
Поскольку NudC связан с системой моторных белков и с цитоскелетом, в частности, с
белками Tubulin и Dynactin, была исследована возможность того, что PCID2 может также
взаимодействовать с этими белками. Чтобы проверить данное предположение, были получены
крысиные поликлональные антитела к Dynactin (p150). Антитела были аффинно очищены и
специфически узнавали белок соответствующей молекулярной массы на вестерн блоте. Затем
были проведены реакции иммунопреципитации из лизата S2 клеток за антитела к белкам
PCID2, Tubulin и Dynactin. Преципитат был проанализирован на вестерн блоте с
использованием антител к этим же белкам. Действительно, оказалось, чтоPCID2
взаимодействует с данными белками (Рис. 8 В,Г). Аналогичные эксперименты были проведены
и в отношении белка NudC, однако, в наших экспериментах он не взаимодействовал с
динактином, хотя их ассоциация была обнаружена в клетках человека.
Таким образом, эксперименты по иммунопреципитации мРНК подтвердили, что PCID2
может быть вовлечен в транспорт мРНК в цитоплазме независимо от комплекса TREX-2.

3.5. PCID2 необходим для общего транспорта мРНК в цитоплазме

Как было показано ранее, РНК интерференция субъединиц Xmas-2 и ENY2 комплекса
TREX-2 вызывает общее нарушение экспорта мРНК из ядра в цитоплазму в S2 клетках.
Изменение распределения мРНК в клетках, которое появляется при РНК интерференции PCID2
и NudC было исследовано при помощи методики FISH с использованием Oligo-dT зонда,
меченного Cy-3 (Рис. 9А).

Рисунок 9 Нокдаун PCID2, Xmas-2 и NudC приводит к нарушению распределения мРНК в
S2 клетках (одиночные клетки)
(А, Б, Г) Распределение мРНК в контрольных клетках и в клетках с нокдауном Xmas-2, PCID2,
NudC; ПолиА-содержащая РНК была визуализирована гибридизацией с Oligo(dT)-Cy3
праймером, ядра были окрашены DAPI (A, Б) Изображения, полученные на флуоресцентном
микроскопе. (А) Продемонстрированы поля с несколькими клетками; (Б) одна репрезентативная
клетка; и (В) количественная оценка уровня флуоресцентного сигнала, выполненная с помощью
программы ImageJ. Показана интенсивность сигнала (ось Y) в каждой точке (ось x). Красные
графики показывают распределение сигнала DAPI, а зеленые – распределение сигнала oligo(dT).
(Г) Изображения конфокальной микроскопии отдельных клеток и количественная оценка
уровня флуоресцентного сигнала в их цитоплазме, выполненная с помощью программы ImageJ.
Масштабная полоса 10 мкм. (Д) Процент клеток с нарушенным в результате нокдауна трафиком
мРНК (верхняя панель). Каждый эксперимент по нокдауну проводился в четырех повторах.
Около 300 клеток исследовали в слепом подсчете в каждом из повторов, и рассчитывали среднее
значение. Эффективность нокдауна исследуемых факторов (уровень соответствующих
транскриптов) показана на нижней панели. Показан уровень каждого транскрипта в клетках с
нокдауном по отношению к контрольным клеткам. Уровень транскрипции был нормализован по
отношению к рибосомальной РНК.

Чтобы охарактеризовать изменения профилей распределения, мы провели более
детальный анализ препаратов, используя фотографии единичных клеток, сделанные на
флуоресцентном микроскопе (Рис. 9Б), и конфокальные изображения единичных клеток (Рис.
9Г). На фотографии через каждую из клеток был проведен срез и построены профили
интенсивности флуоресценции с использованием программы ImageJ (Рис. 9 В,Г). Чтобы
определить количество клеток с измененным паттерном мРНК, использовали слепой подсчет в
четырёх повторах РНК интерференции для каждого белка. В каждом из повторов на
фотографиях крупных полей исследовали около трехсот клеток (данные не представлены).
Среди них определяли количество клеток с нарушениями распределения мРНК и рассчитывали
среднее значение. На диаграмме (Рис. 9Д, панель сверху) показано процентное соотношение
клеток с нарушениями локализации мРНК при нокдауне белков PCID2, Xmas-2 и NudC
относительно общего количества исследованных клеток. Эффективность нокдауна была
подтверждена при помощи количественной ПЦР (Рис. 9Д, панель снизу).
Как было показано ранее, нокдаун субъединиц Xmas-2 и ENY2, входящих в комплекс
TREX-2, вызывает общий блок экспорта мРНК из ядра в S2 клетках. В клетках с нокдауном
Xmas-2 большая часть мРНК накапливается в ядрах, она не способна проходить через ядерную
пору. Тогда как в контрольных клетках мРНК, обнаруженная с помощью Oligo-dT зонда,
локализована в основном в цитоплазме, и её распределение выглядит равномерным (Рис. 9).
Нокдаун NudC, который привел к элиминации цитоплазматического PCID2, как показано выше,
вызвал нарушение распределения мРНК (Рис. 9).
Однако, в отличие от нокдауна Xmas-2, в клетках с нокдауном NudC мРНК не
накапливалась в ядрах. Вместо этого она в основном концентрировалась в цитоплазме, в
области, близкой к ядерной оболочке (в контрольных клетках мРНК была равномерно
распределена в цитоплазме), что свидетельствует о том, что был нарушен общий
цитоплазматический транспорт мРНК. В данном случае ядерный экспорт мРНК не нарушается,
и мРНК может выходить из ядра. Но в цитоплазме транспорт нарушен, и мРНК скапливается
рядом с ядерной оболочкой, без возможности распределения к местам локализации в
цитоплазме. Подобно нокдауну Xmas-2, нокдаун PCID2 также вызывает общий блок экспорта
ядерной мРНК и накопление мРНК в ядре. Для более точного отображения области, в которой
произошло нарушение транспорта мРНК, был проведён анализ изображений, с использованием
программного обеспечения ImageJ. На Рис. 9В представлены профили интенсивности,
демонстрирующие распределение флуоресценции, соответствующей мРНК, относительно ядра
в одной клетке с нокдауном. Чтобы выяснить, влияет ли нокдаун Xmas-2 или PCID2 на
цитоплазматический трафик мРНК, был проведен анализ распределения мРНК в цитоплазме
клеток, в которых прошел нокдаун, с помощью флуоресцентной количественной оценки
изображений, полученных с помощью конфокального микроскопа (Рис. 9Г).
Графики демонстрируют равномерное распределение мРНК в цитоплазме контрольных клеток.
Распределение мРНК в цитоплазме клеток с нокдауном Xmas-2 было равномерным и сходным с
таковым в контрольных клетках, что указывает на то, что Xmas-2 не участвует в
цитоплазматическом транспорте мРНК. Напротив, клетки с нокдауном NudC демонстрируют
градиентное распределение с максимальным накоплением мРНК вблизи ядерной оболочки.
Важно отметить, что профиль распределения мРНК в цитоплазме клеток, лишенных PCID2,
был градиентным с максимальным накоплением мРНК вблизи ядерной оболочки, что указывает
на то, что PCID2 также участвует в поддержании цитоплазматического транспорта мРНК.
Таким образом, подсчет нормальных клеток и клеток, в которых прошел нокдаун, показал, что
после нокдауна у большого процента клеток нарушался ядерный или цитоплазматический
транспорт мРНК (Рис. 9Д). Сильный эффект, наблюдаемый для распределения мРНК,
указывает на то, что PCID2 необходим для транспорта большинства транскриптов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эволюционно консервативный эукариотический комплекс TREX-2 необходим для
общего экспорта мРНК из ядра. Он взаимодействует с транскрипционным аппаратом и ядерно-
поровым комплексом и связывает транскрипцию с экспортом мРНК. В данном исследовании
было показано, что одна из основных субъединиц комплекса TREX-2, PCID2 (у дрожжей Thp1),
отделяется от комплекса TREX-2 и мигрирует в цитоплазму. Наше исследование согласуется с
результатами работы, которые показали, что PCID2 перемещается между ядром и цитоплазмой.
Можно также предположить, что PCID2 действует как адаптер для других факторов,
определяющихсудьбутранскриптоввклетке.Егобелок-белковыевзаимодействия
опосредованы универсальным PCI доменом, что может определять ассоциацию PCID2 с
различными мишенями. Процесс ремоделинга экспортного комплекса может происходить на
ядерной поре, о чём говорит ассоциация с NPC всех субъединиц комплекса TREX-2, включая и
PCID2 (см. пункт 1.2.). PCID2 образует при этом три различные по молекулярному весу и
локализации в клетке формы. Самая лёгкая форма остается в ядре. PCID2, который
экспортируется из ядра, модифицируется убиквитином и образует цитоплазматическую и еще
более тяжелую мембранную формы. Средняя по молекулярному весу форма локализуется в
цитоплазме, связываясь там с цитоплазматическим белком NudC. Мембранная форма может
представлять собой переходную форму белка PCID2, связанную с комплексом ядерной поры и
существующую только на ядерной мембране. Так как в данном исследовании не было выявлено
никаких взаимодействий с участием данной формы, то проводилось исследование функций
средней по молекулярному весу цитоплазматической формы белка PCID2. Сложный, связанный
с ядерной порой процесс убиквитинилирования и деубиквитинилирования PCID2, вероятно,
является механизмом, который отделяет PCID2 от TREX-2 и приводит к его взаимодействию с
NudC. В данной работе показано, что взаимодействие NudC и PCID2 является прямым и
достаточно сильным, так как оба белка истощают друг друга из экстракта в экспериментах по
коиммунопреципитации. NudC участвует в стабилизации цитоплазматической формы PCID2,
что коррелирует с его шаперонной активностью и наличием высококонсервативного домена
p23, отвечающего за эту функцию. Аналогично PCID2, NudC был обнаружен в различных
организмах от S. pombe до человека, что позволяет предположить, что их взаимодействие
может быть общим механизмом. В работе предположен вероятный вариант стехиометрии для
количества молекул в составе цитоплазматического комплекса PCID2-NudC, было показано,
что данные белки способны формировать гомодимеры. В ядре PCID2 был ассоциирован с
мРНК, участвуя в процессе ядерного экспорта мРНК. В цитоплазме данный белок также
остается ассоциированным с мРНК. Учитывая, что PCID2 содержит домен связывания РНК,
можно предполагать наличие прямого взаимодействия PCID2 и мРНК. Наши данные также
показывают, что в цитоплазме PCID2 взаимодействует с тубулином и моторными белками и
необходим для общего транспорта мРНК. Вероятно, взаимодействие белков PCID2 и NudC с
моторными белками и их способность к гомодимеризации играют важную роль в общем
транспорте мРНК в цитоплазме. Истощение NudC и цитоплазматической формы PCID2
приводит к накоплению агрегатов мРНК в цитоплазме. Согласно полученным данным, PCID2
является белком, который связывает ядерный и цитоплазматический транспорт мРНК,
зависящий от комплекса TREX-2.
Таким образом, в работе были показаны основные функции белка PCID2 в ядре и в
цитоплазме клеток. Выявлен его путь из ядра в цитоплазму и сопутствующие взаимодействия с
мишенями, описана общая картина роли белка PCID2 в транспорте мРНК в клетке (Рис. 10).
Мы показали, что в ядре легкая форма PCID2 в составе комплекса TREX-2 участвует в экспорте
мРНК. После чего комплекс связывается с ядерной порой и субъединицы Xmas-2 и ENY2
диссоциируют от белка PCID2. Затем PCID2 модифицируется убиквитином, выходит в
цитоплазму и взаимодействует там с белком NudC. Находясь в цитоплазме, где он
ассоциирован также и с микротрубочками, PCID2 взаимодействует с моторными белками и
участвуетвобщемтранспортемРНК.

Рисунок 10 Общая схема, описывающая роль белка PCID2 в транспорте мРНК у
Drosophila melanogaster
ВЫВОДЫ

1)Показано, что в клетках Drosophila melanogaster белок PCID2 может существовать в
трёх формах. В ядре данный белок имеет молекулярный вес 42 кДа, близкий к
рассчетному. В мембранной и цитоплазматической фракциях белок находится в
убиквитинилированной форме и имеет молекулярный вес 52кДа и 47 кДа соответственно.
2)Установлено, что в ядре клеток Drosophila melanogaster легкая (ядерная) форма
белка PCID2 является компонентом экспортного комплекса TREX-2.
3)Показано, что в ядре в составе комплекса экспорта TREX-2 белок PCID2
взаимодействует с мРНК и необходим для экспорта мРНК из ядра в цитоплазму.
4)Определено, что в цитоплазме клеток Drosophila melanogaster белок PCID2
взаимодействует с белком NudC, и это взаимодействие необходимо для стабильности
PCID2 в цитоплазме.
5)Показано, что PCID2 и NudC взаимодействуют друг с другом и способны к
гомодимеризации in vitro.
6)Выявлено, что в цитоплазме клеток S2 Drosophila melanogaster белок PCID2
взаимодействует с мРНК, с моторными белками (динактин) и с цитоскелетом (тубулин), а
нокдаун PCID2 приводит к нарушению распределения мРНК в цитоплазме. Таким
образом, PCID2 участвует в общем транспорте мРНК в цитоплазме.