Роль низкомолекулярных тиолов в развитии и функционировании эффективных и неэффективных симбиотических клубеньков гороха посевного (Pisum sativum L.)

В обзоре литературы изложены описания развития симбиотического клубенька и иммунитета бобовых растений. Особое внимание уделено роли в этих процессах тиоловых трипептидов GSH и hGSH.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования и условия выращивания. В работе использованы
растения гороха посевного (Pisum sativum L.) линии дикого типа SGE (Kosterin, Rozov, 1993) и симбиотические мутанты из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ, полученные на ее основе: мутант sym40-1 и аллельные мутанты – sym33-2 и sym33-3. Клубеньки мутантной линии sym40-1 характеризуются образованием гипертрофированных инфекционных капель, аномальной морфологической дифференцировкой бактероидов (Tsyganov et al., 1998), повышенным накоплением пероксида водорода, в особенности, вокруг ювенильных бактероидов и преждевременной деградацией симбиотических структур (Цыганова и др., 2009; Serova et al., 2018). Мутантная аллель sym33-2 является строгой, в этих клубеньках не происходит выхода бактерий в цитоплазму растительной клетки (Ovchinnikova et al., 2011). Разветвленная инфекционная нить, с аномально утолщенными стенками, блокируется в клетках наружной коры клубенька. Аллель sym33-3 характеризуются нечетко выраженным фенотипом, в некоторых клетках наблюдается выход бактерий из инфекционных нитей (Tsyganov et al. 1998; Voroshilova et al., 2001).
Растения были инокулированы штаммом клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 (Glenn et al., 1980). В качестве субстрата при выращивании растений был использован вермикулит, дополненный безазотным питательным раствором (Fähraeus, 1957). Растения были выращены в климатических камерах при контролируемых условиях. Сбор клубеньков проводился через одну, две, три, четыре или шесть недель после инокуляции (НПИ) в зависимости от анализа.
Обработка L-бутионин-S,R-сульфоксимином и экзогенным глутатионом.
Растения обрабатывали путем добавления в субстрат 0,1 мM раствора L-бутионин-S,R- сульфоксимина (BSO) или растворов 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH одновременно. Оценку влияния BSO на клубенькообразование, гистологическую организацию клубеньков, экспрессию генов и количество тиолов в корнях проводили через 2 НПИ. В экспериментах с экзогенным GSH для обработки растений использовали растворы двух концентраций – 0,1 мМ и 1 мМ. Анализ гистологической организации клубеньков, экспрессии генов и количества тиолов в корнях проводили также через 2 НПИ.
Молекулярно-генетические методы. Тотальная РНК была выделена из клубеньков и корней с помощью реагента PureZol Isolation Reagent (Bio-Rad) согласно протоколу производителя. ПЦР в режиме реального времени проводилась в автоматическом амплификаторе С1000TM Thermal Cycler, совмещенном с оптическим модулем CFX96TM Real-Time System (Bio-Rad) с использованием iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad).
6
Высокоэффективная жидкостная хроматография, совмещенная с масс- спектрометрическим детектированием. Выделение тиолов осуществляли на основе методики, описанной ранее (Bardarov et al., 2015). Для экстракции использовался 200 мМ дитиотреитол. Анализ экстрактов выполняли с использованием системы для высокоэффективной жидкостной хроматографии поколения LC-20 Prominence (Shimadzu Corporation) в сочетании с гибридным масс-спектрометром с тандемом орбитальной и линейной ионных ловушек LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific) согласно Черновой и др. (2018) с небольшими изменениями.
Световая, флуоресцентная и лазерная конфокальная сканирующая микроскопия. Анализ локализации суберина в клубеньках проводился с помощью методов флуоресцентной микроскопии срезов, окрашенных нейтральным красным по модифицированной методике (Lulai and Morgan, 1992) на микроскопе AxioImagerZ1 (Carl Zeiss). Для выявления GSH срезы клубеньков были инкубированы с первичными поликлональными антителами (Agrisera). В качестве вторичных антител были использованы антитела к IgG, конъюгированные с AlexaFluor 488 (Thermo Fisher Scientific). ДНК ядер и бактерий была окрашена йодидом пропидия. Исследование образцов проводилось с помощью лазерных сканирующих конфокальных микроскопов LSM 510 META и LSM780 (Carl Zeiss).
Статистические методы и программное обеспечение. Статистическая обработка данных проводилась с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) и среды программирования R. Для световой микроскопии было использовано программное обеспечение ZEN 2 core SP1 (Carl Zeiss), для конфокальной микроскопии — ZEN2009 и ZEN2012 (Carl Zeiss).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Проявление защитных реакций в неэффективных симбиотических
клубеньках P. sativum мутантных линий sym40-1 и sym33-3
1.1. Анализ гистохимической локализации отложений суберина в трехнедельных клубеньках P. sativum дикого типа и мутантных линий
sym40-1 и sym33-3
В рамках данной работы была проанализирована локализация суберина в
эффективных и неэффективных клубеньках P. sativum. В клубеньках дикого типа через 3 НПИ отложения суберина были выявлены только в эндодерме, отделяющей слои внутренней и наружной коры клубенька в постмеристематических тканях. Утолщение клеточной стенки у растений выполняет барьерную функцию. Выявленные отложения суберина в эндодерме клубеньков дикого типа в первую очередь необходимы для ограничения доступа кислорода в ткани, где функционирует нитрогеназа, необратимо инактивируемая кислородом (Minchin et al., 2008), а также для защиты от излишней дегидратации, солевого стресса и проникновения патогенов (Schreiber et al., 1999).
Отложение суберина в клеточные стенки также является нормальной реакцией растений на патогенную инфекцию. В результате повышается механическая прочность клеточных стенок, ограничивается проникновение и распространение патогена, приток к нему питательных веществ. В бобово-ризобиальном симбиозе растение контролирует каждый этап инфекции, и в случае нарушения программы развития клубенька происходит ее переключение на защитный ответ. Блок развития симбиотического клубенька после выхода бактерий в растительную цитоплазму, происходящий у мутантной линии sym40-1, приводит к изоляции от остального растения сразу всего клубенька путем суберинизации клубеньковой эндодермы и эндодермы, окружающей сосудистые пучки (рис. 1А–Г). Ранее сходный фенотип был описан для мутанта M. truncatula Mtsym6 (Tirichine et al., 2000) и растений с подавленной экспрессией гена MtHAP2–1 (Combier et al., 2006). Отложение суберина вокруг проводящих пучков, видимо, ограничивает доступ к клубеньку воды и
7

питательных веществ, блокируя его дальнейший рост (Tirichine et al., 2000). Мутантные клубеньки также характеризовались арестом клубеньковой меристемы, что было ассоциировано со смыканием клубеньковой эндодермы. Ген Sym40 – ортолог гена M. truncatula MtEFD, кодирующего транскрипционный фактор, являющийся негативным регулятором в цитокининовом сигнальном каскаде (Tsyganov, Tsyganova, 2020). Мутация в гене Sym40 ведет к многочисленным аномалиям в развитии клубенька, включая ранний арест меристемы (Voroshilova et al., 2009), формирование гипертрофированных инфекционных капель, ярко выраженные защитные реакции (данная работа) и преждевременную деградацию симбиотических структур (Tsyganov et al., 1998; Serova et al., 2018).
Рисунок 1. — Гистохимическая локализация отложений суберина в трехнедельных клубеньках P. sativum мутантных линий по генам sym40-1 (А–Г) и sym33-3 (Д– З)
(А–Г) стрелки указывают на эндодерму, * — проводящие пучки, (Д–З) наконечники стрелок и стрелки указывают на инфекционные нити. Срезы окрашены нейтральным красным. (А, В, Д, Ж)
дифференциально- интерференционный контраст, (Б, Г, Е, З) флуоресцентная микроскопия. (А–Б, Д–З) сагиттальные срезы, (В, Г) поперечные срезы, сделанные из средней части клубенька, соответствующей зоне инфекции в клубеньке дикого типа. Масштабная линейка (А–Е) =
200 мкм, (Ж, З) = 20 мкм.
Ранее было показано, что отложение полифенольных веществ также характерно для мутанта M. truncatula по гену MtSym1 (Benaben et al., 1995). Ген P. sativum Sym33 является ортологом гена MtSym1 (MtIPD3) (Tsyganov, Tsyganova, 2020) и кодирует белок IPD3, взаимодействующий с кальций- и кальмодулин-зависимой протеинкиназой (Ovchinnikova et al., 2011), что приводит к активации органогенеза клубенька (Singh et al., 2014). Отложения суберина в клубеньках мутантной линии sym33-3 наблюдались в стенках клеток, через которые проходили инфекционные нити (рис. 1Д–Е), и в утолщенных стенках инфекционных нитей (рис. 1Ж–З). Таким образом, мутация в гене Sym33, являющемся мастер-регуляторным геном клубенькообразования, приводит к остановке процесса
формирования клубенька и суберинизации его клеток, что является примером защитной реакции растения, которое, таким образом, препятствует выходу бактерий из инфекционных нитей.
1.2.Анализ относительной экспрессии генов – молекулярных маркеров защитного ответа в клубеньках P. sativum дикого типа и мутантных линий sym40-1 и sym33-3
Для дальнейшего анализа защитных реакций, протекающих в мутантных клубеньках линий sym40-1 и sym33-3, были проанализированы относительные уровни транскриптов трех молекулярных маркеров защитного ответа: 7RA84 (пероксидаза), HSR203J (маркер реакции гиперчувствительности), и ABR17 (белок, чувствительный к абсцизовой кислоте, PR10.4) (Die et al., 2009; Reguera et al., 2010). Для гена 7RA84 максимальный уровень транскриптов наблюдался через 2 НПИ как в клубеньках дикого типа, так и в мутантных клубеньках. Тем не менее, у мутантных линий sym40-1 и sym33-3 уровни транскриптов были значительно выше, чем у линии дикого типа на каждом сроке анализа. Уровень экспрессии гена 7RA84 вероятно коррелирует с накоплением пероксида водорода в симбиотических клубеньках. В клубеньках дикого типа на сроке 2 НПИ идет рост и ветвление инфекционных нитей. Пероксид водорода в инфекционных нитях недетерминированных клубеньков участвует в перекрестном связывании гликопротеинов матрикса и в его отвердевании, которое, вероятно, необходимо для роста нитей (Wisniewski et al., 2000; Brewin, 2004). Тем не менее, пероксид водорода также является активной формой кислорода и при повышенном накоплении в клетках вызывает окислительный стресс. Таким образом, снижение уровня экспрессии гена 7RA84 на последующих сроках анализа в клубеньках дикого типа, вероятно, является признаком нормального развития симбиотического клубенька и, наоборот, повышенное накопление транскриптов данного гена в неэффективных клубеньках мутантных линий – признаком развития защитных реакций. Так, пероксидаза участвует в лигнификации клеточных стенок путем окислительного воздействия на структурные белки клеточной стенки, таким образом, укрепляя их при поранении или инвазии патогенов (Pérez-de-Luque et al., 2006). Высокая активность гена пероксидазы в клубеньках мутантной линии sym33-3 также может быть связана с активной суберинизацией центральной части клубенька. Кроме того, большинство субстратов пероксидазы – соединения фенольной природы. Окисляясь до хинонов, они обладают сильным окислительным действием (Echevarría-Zomeño et al., 2006). Это может приводить к развитию реакции гиперчувствительности, активирующейся при взаимодействии растения с патогеном. В клубеньках мутантной линии sym40-1 было показано чрезмерное накопление пероксида водорода по сравнению с клубеньками дикого типа (Цыганова и др., 2009), развитие окислительного стресса и деградация симбиотических структур (Serova et al., 2018). Эти данные коррелируют с повышенным уровнем экспрессии гена 7RA84 у мутантной линии sym40-1 по сравнению с линией дикого типа.
Растения способны прерывать распространение патогенов в результате развития реакции гиперчувствительности (Lamb, Dixon, 1997; Hérouart et al., 2002). Реакция гиперчувствительности вовлечена также и в контроль со стороны растения за ходом инфекции при клубенькообразовании, определяя число успешных инфекций (Vasse et al., 1993; Perotto et al., 1994; Gage, 2004). В эффективных азотфиксирующих клубеньках уровень синтеза защитных компонентов относительно невысок и не приводит к инактивации микроорганизмов, а лишь ограничивает их размножение и распространение. В эффективных клубеньках линии дикого типа на всех сроках анализа наблюдался низкий уровень активности гена HSR203J, тогда как повышенный уровень экспрессии данного гена в неэффективных клубеньках мутантных линий свидетельствует о развитии в них защитных реакций. Максимальный уровень экспрессии HSR203J наблюдался в клубеньках
мутантной линии sym40-1, характеризующихся преждевременной деградацией симбиотических структур.
Уровень транскриптов гена ABR17 был значительно выше в клубеньках мутантной линии sym40-1, чем в клубеньках линии дикого типа через 2 и 4 НПИ и не отличался на сроке 6 НПИ. В клубеньках мутантной линии sym33-3 уровень транскриптов гена ABR17 не отличался на сроке 2 НПИ и был выше, чем у линии дикого типа на сроке 4 НПИ. В то же время уровень транскриптов этого гена в клубеньках мутантной линии sym33-3 был значительно ниже, чем у линии дикого типа на сроке 6 НПИ. ABR17, принадлежащий к семейству PR10 белков, синтезируется в тканях P. sativum в ответ на атаку патогена (Amey et al., 2008). ABR17, проявляющий рибонуклеазную активность (Srivastava et al., 2006), может быть вовлечен в контроль бактериальной инфекции и пролиферации (Reguera et al., 2010), а уровень экспрессии этого гена увеличиваться в ответ на восприятие мутантными растениями клубеньковых бактерий не как микросимбионтов, а как патогенов. Наблюдаемый высокий уровень экспрессии этого гена у мутантной линии sym40-1 может быть связан с выходом ризобий в цитоплазму растительных клеток и высоким уровнем продукции сигналов вирулентности. В то же время относительно невысокий уровень транскриптов в клубеньках мутантной линии sym33-3 может быть связан с отсутствием выхода бактерий из «запертых» инфекционных нитей.
Таким образом, нарушения программы развития клубенька в следствие симбиотических мутаций P. sativum sym40-1 и sym33-3 приводят к восприятию полезных ризобий в качестве патогенов и развитию различных защитных ответов у растения.
2. Эффективные и неэффективные симбиотические клубеньки отличаются по содержанию и соотношению тиолов
2.1. Анализ относительной экспрессии генов биосинтеза тиолов в корнях и клубеньках P. sativum дикого типа и мутантных линий sym40-1, sym33-2 и sym33-3
Была проанализирована экспрессия генов GSH1 (γ-глутамилцистеин синтетаза), GSHS (глутатион синтетаза) и hGSHS (гомоглутатион синтетаза) в 3-недельных неинокулированных (контрольных) корнях и клубеньках всех генотипов. Сравнение контрольных (неинокулированных) корней с клубеньками дикого типа использовалось для выявления изменений, связанных с симбиотическими взаимодействиями. Разница между мутантными клубеньками и клубеньками дикого типа может указывать на участие GSH и hGSH в различных стадиях развития клубеньков или в защитных реакциях, связанных с неэффективным симбиозом.
Уровень мРНК гена GSH1 в клубеньках дикого типа не изменялся по сравнению с контрольными корнями (рис. 2А). В клубеньках мутантов sym40-1, sym33-2 и sym33-3 наблюдалось достоверное увеличение экспрессии GSH1 по сравнению с контрольными корнями и клубеньками дикого типа (рис. 2А).
Уровень экспрессии гена GSHS достоверно увеличивался в клубеньках по сравнению с контрольными корнями у всех генотипов. Уровни мРНК GSHS в клубеньках sym40-1 и sym33-3 были достоверно выше, чем в клубеньках дикого типа. Тогда как в клубеньках sym33-2, блокированных на самой ранней стадии развития среди мутантов, уровень экспрессии был ниже, чем в клубеньках дикого типа. Самый высокий уровень экспрессии GSHS наблюдался в клубеньках мутанта sym40-1 (рис. 2А).
Контрольные корни всех генотипов, кроме sym33-2, характеризовались более высоким уровнем экспрессии гена hGSHS по сравнению с клубеньками. В клубеньках sym33-2 (без выхода бактерий в цитоплазму растительной клетки) поддерживался тот же уровень экспрессии hGSHS, что и в контрольных корнях (рис. 2А).
Рисунок 2. — Относительный уровень экспрессии генов биосинтеза GSH и hGSH в клубеньках и неинокулированных корнях P. sativum дикого типа (ДТ) и мутантных линий sym40-1, sym33-3 и sym33-2
А — трехнедельные неинокулированные корни (контроль) и клубеньки (инокуляция). Б — однонедельные (1 нед) и двухнедельные (2 нед) неинокулированные корни (контроль) и клубеньки (инокуляция). GSH1 – γ-глутамилцистеин синтетаза, GSHS – глутатион синтетаза, hGSHS – гомоглутатион синтетаза. Графики демонстрируют результаты трех независимых экспериментов. А — буквы указывают на достоверные различия (P ≤ 0,05) a, между контрольными корнями мутантных линий и линией дикого типа; b, между мутантными клубеньками и клубеньками дикого типа; c, между клубеньками и контрольными корнями внутри одного генотипа. Б — a, между контрольными корнями дикого типа разного возраста; c, между клубеньками и контрольными корнями в пределах
одной временной точки.
Был проведен анализ уровней экспрессии генов в одно- и двухнедельных корнях и клубеньках растений дикого типа (рис. 2Б). Наблюдалось значительное повышение уровня экспрессии GSHS и небольшое снижение экспрессии hGSHS в однонедельных клубеньках по сравнению с контрольными корнями. В двухнедельных клубеньках поддерживался высокий уровень экспрессии GSHS, тогда как экспрессия hGSHS была значительно снижена по сравнению с контрольными корнями.
Достоверное увеличение уровня экспрессии гена GSHS и снижение уровня экспрессии гена hGSHS в клубеньках всех генотипов и возрастов по сравнению с неинокулированными корнями, за исключением клубеньков мутантной линии sym33-2 (рис. 2), указывает на то, что изменения в активности генов GSHS и hGSHS в тканях корня, вероятно, являются частью программы развития симбиотического клубенька. В клубеньках мутантной линии sym33-2, характеризующихся отсутствием выхода бактерий в растительную цитоплазму, профиль экспрессии генов GSHS и hGSHS больше схож с таковым в неинокулированных корнях. Таким образом, изменения в активности генов биосинтеза GSH и hGSH, по всей видимости, происходят после высвобождения бактерий в цитоплазму растительной клетки в клубеньках.
С другой стороны, уровень экспрессии генов GSH1, GSHS и hGSHS в клубеньках мутантных линий по генам sym40-1 и sym33-3 был выше, чем в клубеньках дикого типа, что
может указывать на изменение в метаболизме тиолов, связанное с защитными реакциями, проявляющимися у этих мутантов. Обработка Arabidopsis thaliana жасмоновой кислотой, являющейся гормоном стресса, приводила к увеличению уровня транскриптов генов GSH1 и GSHS, не влияя на уровень самого GSH (Xiang, Oliver, 1998). Также количество транскриптов этих генов увеличивалось в ответ на патоген-оомицет Phytophthora brassicae (Parisy et al., 2007). В данной работе самым высоким уровнем экспрессии гена GSHS и самым низким содержанием GSH по сравнению с клубеньками дикого типа и мутанта sym33-3 характеризовались клубеньки мутанта sym40-1 (рис. 2А; табл. 1). Таким образом, в клубеньках мутантной линии sym40-1 изменения в экспрессии гена GSHS могут быть вызваны восприятием мутантными растениями клубеньковых бактерий как потенциальных патогенов и являться частью защитного ответа.
2.2.Анализ содержания тиолов в корнях и клубеньках P. sativum дикого типа и мутантных линий sym40-1, sym33-2 и sym33-3
Чтобы оценить корреляцию между изменениями экспрессии генов биосинтеза GSH и hGSH и фактическими уровнями тиолов, было проведено количественное определение низкомолекулярных тиолов в контрольных корнях и клубеньках возрастом 1, 2 и 3 недели (табл. 1).
Концентрация GSH и соотношение GSH : hGSH в клубеньках всех генотипов были значительно выше, чем в контрольных корнях (табл. 1). Однако, у мутанта sym33-2 соотношение GSH : hGSH было самым низким среди клубеньков. В клубеньках sym33-3 уровень GSH был сопоставим с уровнем GSH дикого типа, однако, количество hGSH было выше, что приводило к снижению соотношения GSH : hGSH. Несмотря на самый высокий уровень экспрессии GSHS в клубеньках мутанта sym40-1, количество GSH, как и hGSH, в них были ниже, чем в клубеньках дикого типа и мутанта sym33-3. Тем не менее, соотношение GSH : hGSH было таким же, как в клубеньках мутанта sym33-3, и выше, чем в клубеньках sym33-2. Кроме того, оказалось, что снижение уровня экспрессии гена hGSHS в клубеньках по сравнению с контрольными корнями не приводит к соответствующему уменьшению количества hGSH, фактически, уровень hGSH был выше в клубеньках дикого типа и мутанта sym33-3 по сравнению с контрольными корнями и не изменялся в клубеньках мутантов sym40-1 и sym33-2.
Соотношение GSH : hGSH было максимальным в клубеньках дикого типа и снижалось в мутантных клубеньках в зависимости от стадии их развития (табл. 1). Однако, каждый из изученных генотипов показал свой композиционный состав тиолов в клубеньках. Наибольшая концентрация GSH среди всех генотипов наблюдалась в клубеньках дикого типа и мутанта sym33-3, hGSH — в клубеньках sym33-3.
Чтобы понять, связаны ли выявленные различия в содержании тиолов со стадией развития клубенька, на которой блокированы мутанты, или с метаболическими изменениями в неэффективных клубеньках, были проанализированы неинокулированные корни и клубеньки дикого типа одно- и двухнедельного возраста (табл. 1). В контрольных корнях соотношение GSH : hGSH было сравнимо с таковым в трехнедельных контрольных корнях (табл. 1). Концентрация GSH и соотношение GSH : hGSH в клубеньках увеличивались через 2 НПИ. Соотношение GSH : hGSH было самым высоким среди всех образцов в двухнедельных клубеньках дикого типа (табл. 1). GSH присутствовал в качестве основного тиола во всех проанализированных образцах.
У Medicago sativa GSH и hGSH присутствовали во всех органах, однако, соотношение GSH : hGSH варьировало в зависимости от органа, оказываясь самым высоким в корневых меристемах и самым низким в полностью дифференцированных органах (зрелые листья и зона растяжения корня). Кроме того, GSH был ассоциирован с активацией клеточного цикла, тогда как hGSH, напротив, был связан с дифференцированными клетками (Pasternak et al., 2014). Таким образом, возможно, что в недетерминированных клубеньках, где имеют место процессы дедифференцировки,
активации клеточного цикла, и функционирует меристема, соотношение GSH : hGSH и его изменения могут являться важным фактором. Действительно, несмотря на то, что GSH был основным тиолом во всех проанализированных образцах, соотношение GSH : hGSH всегда было выше в клубеньках, в которых происходило высвобождение бактерий из инфекционных нитей, чем в неинокулированных корнях. Отношение GSH : hGSH было максимальным в клубеньках дикого типа через 2 НПИ, что указывает на важную роль GSH в функционировании меристемы клубенька и азотфиксирующих клеток и, вероятно, в высвобождении бактерий.
Таблица 1. Относительное содержание и соотношение GSH : hGSH в клубеньках и неинокулированных (контрольных) корнях P. sativum дикого типа и мутантных линий одно- , двух- и трехнедельного возраста
ДТ корни 3 нед.
ДТ клуб. 3 нед. sym40-1 корни 3 нед. sym40-1 клуб. 3 нед. sym33-3 корни 3 нед. sym33-3 клуб. 3 нед. sym33-2 корни 3 нед. sym33-2 клуб. 3 нед.
ДТ корни 1 нед. ДТ клуб. 1 нед. ДТ корни 2 нед. ДТ клуб. 2 нед.
GSH 0,30 ± 0,02 1 ± 0,02 0,24 ± 0,03 0,49 ± 0,05 0,27 ± 0,05 1,05± 0,09 0,30 ± 0,04 0,42 ± 0,02
0,64 ± 0,05 1 ± 0,09 0,43 ± 0,03 1,29 ± 0,18
hGSH 0,14 ± 0,04 0,25 ± 0,01 0,16 ± 0,04 0,17 ± 0,01 0,18 ± 0,05 0,35 ± 0,01 0,22 ± 0,03 0,20 ± 0,01
0,39 ± 0,05 0,41± 0,06 0,25 ± 0,02 0,24 ± 0,06
GSH : hGSH 2,1
4,0
1,5
2,9
1,5
3,0
1,4
2,1
1,6 2,4 1,7 5,4
ДТ — дикий тип; корни — неинокулированные корни; клуб.
Данные представляют собой средние значения ± стандартная
пяти повтороностей. Значения были нормализованы относительно количества GSH (нМ/мг сырого веса) в клубеньках дикого типа через 1 или 3 НПИ.
При этом минимальное содержание обоих тиолов среди клубеньков выявлялось у мутантной линии sym40-1, а максимальное – у мутантной линии sym33-3. Можно предположить, что как снижение, так и увеличение количества тиолов в неэффективных симбиотических клубеньках может являться частью защитных реакций, в зависимости от стадии, на которой было нарушено развитие клубенька и произошло переключение симбиотической программы на защитный ответ.
У мутантной линии sym33-3, где рост инфекционных нитей заблокирован в большинстве клеток клубенька до высвобождения бактерий, накопление GSH и, вероятно hGSH, становится важным для устойчивости к «болезням», как было показано ранее для A. thaliana (Parisy et al., 2007). Это согласуется также с повышенной экспрессией генов 7RA84, Hsr203J, ABR17 и PR-1, PR-10 (рис. 8) в клубеньках мутанта sym33-3 по сравнению с клубеньками дикого типа, суберинизацией стенок инфекционных нитей (рис. 1Д–З) и повышенным отложением неэтерифицированного пектина в стенках инфекционных нитей
— клубеньки; нед. — недели ошибка среднего для четырех-

(Ivanova et al., 2015). Положительный эффект GSH на накопление PR-белков и экспрессию генов, связанных с защитным ответом, был показан ранее (Ball et al., 2004; Gomez et al., 2004). Повышенный уровень экспрессии гена hGSHS по сравнению с клубеньками дикого типа, как и в клубеньках мутанта sym33-3, был также обнаружен в мутантных клубеньках nad1 M. truncatula. Эти клубеньки характеризовались накоплением фенольных соединений, повышенным уровнем пероксида водорода и активацией генов, связанных с защитным ответом, что в итоге приводило к некрозу инфицированных клеток (Wang et al., 2016).
Развитие клубеньков мутанта sym40-1 прекращается после высвобождения бактерий в растительную цитоплазму. Снижение количества обоих тиолов также может являться одним из сценариев развития защитных реакций в симбиотических клубеньках растений. Влияние изменений в количестве GSH и hGSH на защитные реакции растений при биотическом стрессе было показано для некоторых бобовых культур (Baldacci-Cresp et al., 2012; Chen et al., 2020). Тиолы необходим для роста паразитических нематод, которые заражают корни растений и вызывают дифференцировку клеток корня в гигантские клетки, образующие галлы. Метаболизм GSH и hGSH в галлах и неинфицированных корнях различается. Корни M. truncatula со сниженным содержанием тиолов в меньшей степени страдали от паразитических нематод (Baldacci-Cresp et al., 2012). В корнях Glycine max со сниженным содержанием тиолов, наблюдалось развитие реакции гиперчувствительности и гибель клеток, а также накопление пероксида водорода вокруг областей нематодной инфекции (Chen et al., 2020), что напоминает накопление пероксида водорода вокруг ювенильных бактероидов в клубеньках мутантной линии sym40-1 (Цыганова и др., 2009).
3. Анализ иммунолокализации восстановленной формы GSH в трехнедельных клубеньках P. sativum дикого типа и мутантных линий sym40-1, sym33-2 и sym33-3
В клубеньках дикого типа сигнал, ассоциированный с GSH, был обнаружен в цитоплазме меристематических клеток (рис. 3Г–Е), в цитоплазме и ядрах инфицированных клеток в зоне инфекции (рис. 3Ж–И), в цитоплазме и симбиосомах в клетках зоны азотфиксации (рис. 3К–М), в клетках паренхимы клубенька и проводящих пучках (рис. 3А– В). Сигнал отсутствовал или был едва заметен в матриксе инфекционных нитей и капель (рис. 3Ж–И). В клубеньках мутанта sym40-1 метка в основном ассоциировалась с инфицированными клетками (рис. 4А–В), максимум сигнала наблюдался в бактериях, вышедших из инфекционных капель (рис. 4Г–Е), в матриксе инфекционных нитей и в гипертрофированных инфекционных каплях сигнала не наблюдалось (рис. 4Г–Е). В клубеньках мутанта sym33-2 уровень сигнала, ассоциированного с GSH, был невысоким и локализовался в цитоплазме. На мутантных растениях sym33-3 образовывались белые клубеньки с «запертыми» инфекционными нитями без выхода бактерий (рис. 5А–В). В некоторых из этих инфекционных нитей, которые, вероятно, первыми колонизировали клубеньковый примордий, интенсивный сигнал был ассоциирован с бактериями (рис. 5Г– Е). Так как аллель sym33-3 характеризуются нечетко выраженным фенотипом, не все нити оказываются заблокированными и в некоторых клубеньках в определенных клетках происходит выход бактерий. Сигнал не был обнаружен в таких инфекционных нитях, но наблюдался в цитоплазме и ядрах инфицированных клеток (рис. 5Ж–И). Интенсивный сигнал был ассоциирован с вышедшими бактериями (рис. 5К–М).
GSH необходим для деления клеток в кончике корня (Vernoux et al., 2000), и его количество контролирует переход клеток из фазы G1 в фазу S клеточного цикла, что сопровождается перемещением GSH в ядра в фазе G1 (Diaz-Vivancos et al., 2010a, b). В настоящем исследовании метка, ассоциированная с GSH, в большом количестве обнаруживалась в меристеме, а также присутствовала в ядрах инфицированных клеток из зоны инфекции, но не из зоны азотфиксации. По-видимому, GSH может стимулировать меристематическую активность и повторяющиеся раунды эндоредупликации в симбиотических клубеньках.
линейка = 100 мкм (А–В), 10 мкм (Г–М).
Рисунок 3. — Иммунолокализация GSH в трехнедельных клубеньках P. sativum дикого типа
Общий вид клубенька (А–В); клетки меристемы (Г–Е); клетки из зоны поздней инфекции (Ж–И); азотфиксирующая клетка (К–М). Зоны клубенька обозначены римскими цифрами: I — меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, пп — проводящий пучок, м — митоз, я — ядро, стрелка указывает на инфекционную нить, наконечник стрелки — на инфекционную каплю. Наложение зеленого и красного каналов (А, Г, Ж, К), наложение
дифференциально- интерференционного контраста и красного канала (Б, Д, З, Л). Тепловая карта с обозначением распределения интенсивности флуоресцентного сигнала зеленого канала (В, Е, И, М). Зеленый канал — иммунолокализация GSH, красный канал — ДНК ядер и бактерий/бактероидов. Масштабная
Рисунок 4. — Иммунолокализация GSH в трехнедельных клубеньках клубеньках P. sativum мутантной линии sym40-1
Общий вид клубенька (А–В); инфицированные клетки (Г–Е). Зоны клубенька обозначены римскими цифрами: I — меристема, II — зона инфекции, я — ядро, стрелка указывает на инфекционную нить,
наконечник стрелки — на инфекционную каплю, * — вышедшие бактерии. Наложение зеленого и красного каналов (А, Г), наложение дифференциально-интерференционного контраста и красного канала (Б, Д). Тепловая карта с обозначением распределения интенсивности флуоресцентного сигнала зеленого канала (В, Е). Зеленый канал — иммунолокализация GSH, красный канал — ДНК ядер и бактерий/бактероидов. Масштабная линейка = 100 мкм (А–В), 10 мкм (Г–Е).
Рисунок 5. — Иммунолокализация GSH в трехнедельных клубеньках клубеньках P. sativum мутантной линии sym33-3
Общий вид клубенька (А–В); запертые инфекционные нити (Г–Е); инфицированные клетки (Ж–И); клетки с вышедшими бактериями (К– М). I — меристема, я — ядро, стрелка указывает на инфекционную нить, наконечник стрелки — на инфекционную каплю, * — вышедшие бактерии. Наложение зеленого и красного каналов (А, Г, Ж, К), наложение дифференциально
-интерференционного контраста и красного канала (Б, Д, З, Л). Тепловая карта с обозначением распределения интенсивности флуоресцентного сигнала зеленого канала (В, Е, И, М). Зеленый канал — иммунолокализация GSH, красный канал — ДНК ядер и
бактерий/бактероидов. Масштабная линейка = 100 мкм (А—В), 10 мкм (Г–М).
В клубеньках дикого типа наиболее интенсивное мечение было связано со зрелыми бактероидами в клетках зоны азотфиксации, что подтверждает ранее полученные данные (Matamoros et al., 2013). В клубеньках невозможно определить происхождение GSH – растительное или бактериальное. Недавно было показано, что дефицит GSH у Sinorhizobium meliloti 2011 (gshB) не влияет на дифференцировку бактероидов, но запускает процесс раннего старения клубеньков (Yang et al., 2020). Можно сделать вывод, что GSH в бактероидах необходим для их правильного функционирования и азотфиксации.
В клубеньках дикого типа метка, ассоциированная с GSH, не обнаруживалась в инфекционных нитях и каплях. Интенсивное мечение наблюдалось только в «запертых» инфекционных нитях мутантной линии sym33-3 и высвобожденных в растительную цитоплазму бактериях в клубеньках мутантных линий sym40-1 и sym33-3. В клубеньках мутантов sym33 наблюдается деградации бактерий внутри некоторых инфекционных нитей (Цыганова и др., 2019), а в клубеньках мутанта sym40-1 пероксид водорода накапливается вокруг ювенильных бактероидов (Цыганова и др., 2009). Вероятно, ризобии могут использовать GSH для преодоления стресса, вызванного активацией растительных защитных реакций у этих мутантов.
4. Анализ влияния обработки L-бутионин-S,R-сульфоксимином и экзогенным глутатионом на морфологию клубеньков и экспрессию генов в корнях с клубеньками P. sativum дикого типа и мутантных линий
4.1. GSH и hGSH вовлечены в регуляцию экспрессии генов GSH1, GSHS, Cyp15a, TPP, PR1, PR10, NF-YA1 в корнях с клубеньками P. sativum
Было изучено влияние концентрации тиолов на экспрессию некоторых генов в корнях с клубеньками растений необработанных, обработанных 0,1 мМ раствором BSO, или обработанных растворами 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH через 2 НПИ. Был проанализирован уровень экспрессии генов, вовлеченных в развитие клубенька (EFD, NF- YA1), в биосинтез GSH и hGSH (GSH1, GSHS, hGSHS), в защитные реакции растений (PR1, PR10) и старение клубенька (TPP, Cyp15a) (рис. 6А).
Анализ уровня экспрессии GSH1 и GSHS показал увеличение количества транскриптов в обработанных раствором BSO корнях с клубеньками у всех генотипов. Недостаток GSH и hGSH в корнях с клубеньками растений дикого типа приводил к повышению уровня экспрессии генов Cyp15a, TPP, PR1, PR10, и к снижению уровня экспрессии гена NF-YA1. Уровень экспрессии гена NF-YA1 также снижался при обработке раствором BSO корней мутантной линии sym33-3. Экспрессия гена hGSHS у этих генотипов не изменялась. В необработанных корнях с клубеньками мутантной лини sym33-3 уровень экспрессии генов PR1 и PR10 был значительно выше, чем в корнях с клубеньками у дикого типа, однако, в ответ на недостаток GSH и hGSH экспрессия этих генов подавлялась. Уровень экспрессии генов Cyp15a и TPP снижался в обработанных растворами BSO и GSH корнях с клубеньками мутантной линии sym33-3 (рис. 6А).
Уровень экспрессии генов GSH1, GSHS, hGSHS, EFD, NF-YA1, PR1, PR10, Cyp15a был также проанализирован в корнях с клубеньками необработанных и обработанных растворами разных концентраций GSH через 2 НПИ (рис. 6Б). Уровень экспрессии генов биосинтеза GSH и hGSH достоверно не изменялся в обработанных корнях с клубеньками растений дикого типа, тогда как уровни экспрессии этих генов были повышены в растениях мутантной линии sym33-3, обработанных обеими концентрациями GSH, за исключением гена hGSHS, чей уровень экспрессии повышался только в ответ на обработку растений 0,1 мМ раствором GSH. Обработка 0,1 мМ раствором GSH приводила к увеличению уровня экспрессии генов EFD и NF-YA1, участвующих в развитии клубеньков, в корнях с клубеньками дикого типа и мутантной линии sym33-3. Обработка 1 мМ раствором GSH приводила к увеличению уровня экспрессии генов защитного ответа, PR1 и PR10, и гена- маркера старения клубеньков Cyp15a в корнях с клубеньками мутантной линии sym33-3, но не у растений дикого типа (рис. 6Б). Эти данные также подтверждают двойную роль GSH и hGSH в регуляции развития клубеньков и защитных реакций у растений P. sativum.
Таким образом, гены GSH1, GSHS, Cyp15a, TPP, PR1, PR10 активировались в ответ на недостаток тиолов в корнях с клубеньками растений дикого типа. В то же время уровень их экспрессии достоверно не изменялся в корнях с клубеньками растений дикого типа, обработанных только GSH, что свидетельствует о том, что экспрессия этих генов реагирует на снижение концентрации тиолов. Тогда как на регуляцию генов биосинтеза GSH и hGSH у мутантной линии sym33-3 влияют как увеличение, так и снижение содержания тиолов и, возможно, соотношение GSH : hGSH. Это различие может быть связано с сигнальным каскадом GSH, ассоциированным с защитными реакциями у мутанта sym33-3. В то же время, для PR-генов и Cyp15a, было показано снижение уровня экспрессии у этого мутанта в ответ на недостаток тиолов, тогда как увеличение уровня их экспрессии происходило только при обработке растений 1 мМ раствором GSH, но не 0,1 мМ GSH. Это указывает на то, что концентрация GSH играет роль в регуляции экспрессии некоторых генов, по крайней мере, в корнях с клубеньками мутантной линии sym33-3. Двойная роль GSH, опосредованная концентрацией, подтверждается тем фактом, что экспрессия гена NF-YA1 снижается в ответ на недостаток тиолов в корнях с клубеньками растений дикого типа и
мутанта sym33-3 и повышается (вместе с геном EFD) в растениях обоих генотипов, обработанных только 0,1 мМ раствором GSH.
А
Рисунок 6. — Тепловые карты относительного
уровня экспрессии генов
В корнях с клубеньками P. sativum дикого типа (ДТ) и мутантных линий sym40-1, sym33-3 и sym33-2, обработанных растворами L-
бутионин-S,R-сульфоксимина (BSO) и глутатиона (GSH) через 2 НПИ (А); в корнях с клубеньками дикого типа и мутантной линии sym33-3, обработанных 0,1 мМ или 1 мМ раствором глутатиона (GSH) через 2 НПИ (Б).
Цветовая шкала отражает значения относительной экспрессии генов, преобразованные по Z для каждого гена. Уровни экспрессии генов сравнивали с использованием двустороннего дисперсионного анализа (P ≤ 0,05).
Б
Таким образом, экспрессия генов GSH1 и GSHS в корнях с клубеньками может активироваться недостатком тиолов, тогда как определенное количество GSH необходимо для нормальной экспрессии гена NF-YA1 и повышения уровня его экспрессии в корнях с клубеньками. Также заманчиво предположить, что изменения в экспрессии PR-генов и Cyp15a могут коррелировать с понижением концентрации hGSH в корнях с клубеньками мутантной линии sym33-3, что может являться косвенным доказательством участия hGSH в регуляции растительных защитных реакций.
4.2. Анализ влияния обработки L-бутионин-S,R-сульфоксимином на клубенькообразование и морфологию клубеньков P. sativum дикого типа и мутантных линий sym40-1, sym33-2 и sym33-3
Анализ с помощью ВЭЖХ показал, что обработка 0,1 мМ раствором BSO приводила как минимум к 94% и 96% снижению количества GSH и hGSH, соответственно, в корнях с клубеньками у растений всех генотипов. У растений дикого типа, обработанных раствором BSO, наблюдалось снижение количества клубеньков на 46% и преждевременная деградация симбиотических структур в основании и центральной части клубеньков, что указывает на индукцию раннего старения (рис. 7В–Г). Растения дикого типа, обработанные растворами 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH, имели такое же количество клубеньков, что и необработанные, а уровни GSH и hGSH в корнях с клубеньками достигали 237% и 88% (от уровня необработанных растений), соответственно. В этих клубеньках не индуцировалось преждевременное разрушение клеток зоны азотфиксации (рис. 7Д–Е), однако, в некоторых клетках были видны следы деградации (рис. 7Е).
Рисунок 7. — Гистологическая организация клубеньков P. sativum дикого типа, обработанных растворами L- бутионин-S,R-сульфоксимина (BSO) и глутатиона (GSH) через 2 недели после инокуляции
I — меристема, II — зона инфекции, III — зона азотфиксации, IV — зона старения; я — ядро; ик — инфицированная клетка; нк — неинфицированная клетка; дик — деградирующая инфицированная клетка. (А, В, Д) общий вид. (Б, Г, Е) инфицированные клетки. (А–Б) необработанные клубеньки (контроль). (В–Г) клубеньки на растениях, обработанных 0,1 мМ раствором BSO. (Д–Е) клубеньки на растениях, обработанных растворами 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH. Наложение дифференциально- интерференционного контраста и красного канала, красный канал — ДНК ядер и бактерий/бактероидов. Масштабная линейка = 100 мкм (А, В, Д), 10 мкм (Б, Г, Е).
У растений мутантной линии sym40-1, обработанных BSO, количество клубеньков уменьшалось только на 26%, и было таким же, как и у необработанных растений, после обработки растворами BSO и GSH. В обработанных BSO клубеньках мутанта sym40-1 микроскопический анализ выявил многочисленные симбиосомы, содержащие несколько бактероидов (рис. 8Б), что не наблюдалось в необработанных (рис. 8А) или обработанных растворами BSO и GSH клубеньках (рис. 8В). В обработанных растворами BSO и GSH корнях с клубеньками мутантной линии sym40-1 уровни GSH и hGSH составляли 103% и 113%, соответственно.
На обработанных раствором BSO растениях мутантной линии sym33-3 наблюдалось снижение количества клубеньков на 98%, на обработанных растворами BSO и GSH – на 50% по сравнению с необработанными растениями. Развитие мутантных клубеньков sym33- 3, обработанных раствором BSO, было нарушено на ранней стадии, вероятно, из-за
остановки развития меристемы, кроме того, инфекционные нити проявляли признаки частой блокировки и образовывали вздутия (рис. 8Д). Такой же эффект на развитие инфекционных нитей наблюдался в клубеньках мутантной линии sym33-2. В корнях с клубеньками, обработанных растворами BSO и GSH количество GSH и hGSH составляло только 38% и 18%, соответственно, от количества тиолов в необработанных растениях. Однако, не было выявлено отличий таких клубеньков от клубеньков на необработанных растениях (рис. 8Г, Е).
Рисунок 8. — Гистологическая организация клубеньков P. sativum мутантных линий sym40-1 и sym33-3, обработанных растворами L- бутионин-S,R- сульфоксимина (BSO) и глутатиона (GSH) через 2 недели после инокуляции
Клетки клубеньков мутантной линии sym40-1 (А–В); общий вид клубеньков мутантной линии sym33-3 (Г–Е). Необработанные клубеньки (А, Г); клубеньки на растениях, обработанных раствором 0,1 мМ раствором BSO (Б, Д); клубеньки на растениях, обработанных растворами 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH (В, Е). я — ядро; ик — инфицированная клетка; наконечник стрелки указывает на инфекционные капли; двойной наконечник — на аномальные симбиосомы, содержащие несколько бактероидов; I — зона меристемы; стрелками обозначена зона распространения заблокированных инфекционных нитей. Наложение дифференциально-интерференционного контраста и красного канала, красный канал — ДНК ядер и бактерий/бактероидов. Масштабная линейка = 10 мкм (А–В), 100 мкм (Г–Е).
Содержание тиолов снижается во время естественного и индуцированного старения в клубеньках G. max (Evans et al., 1999), P. sativum (Groten et al., 2005) и Phaseolus vulgaris (Loscos et al., 2008). В данной работе обработка растений раствором BSO вызвала индукцию раннего старения, проявляющегося в деградации зоны азотфиксации в клубеньках дикого типа и увеличении уровня экспрессии генов, связанных со старением Cyp15a и TPP. Таким образом, GSH и hGSH имеют решающее значение для функционирования азотфиксирующих клеток в клубеньках P. sativum.
Обработанные раствором BSO клубеньки мутантной линии sym40- 1 характеризовались образованием многочисленных симбиосом, содержащих несколько бактероидов, окруженных общей симбиосомной мембраной. Ранее такой тип симбиосом был описан для клубеньков P. sativum мутантной линии sym31 и клубеньков, выращенных в условиях дефицита бора (Borisov et al., 1997; Bolaños et al., 2001). Предполагалось, что этот фенотип может быть связан с модификацией и неправильной локализацией симбиосомной изоформы лектиноподобного гликопротеина NLEC-1 (Dahiya et al., 1998).
Анализ распределения NLEC-1 в клубеньках мутантной линии sym40-1, обработанных раствором BSO, заслуживает дальнейшего изучения.
Блок развития меристемы и специфическое прерывание роста инфекционных нитей наблюдались в клубеньках мутанта sym33-3 с недостатком GSH и hGSH. Эти морфологические изменения могли быть были вызваны подавлением экспрессии гена NF- YA1, так как сходный фенотип наблюдался у мутанта M. truncatula nf-ya1-1 (Laporte et al., 2014). NF-YA1 представляет собой CCAAT box-связывающий фактор транскрипции, необходимый для формирования и функционирования меристемы клубенька, а также контролирующий рост инфекционных нитей и колонизацию тканей клубенька (Combier et al., 2006). Изменение свойств клеточной стенки инфекционной нити может объяснять вздутия и неупорядоченный характер роста инфекционной нити, наблюдаемые у мутанта nf-ya1-1 (Laporte et al., 2014) и в клубеньках мутанта sym33-3 с недостатком GSH и hGSH.
Снижение синтеза тиолов значительно уменьшало количество клубеньков во всех генотипах. Это совпадает с данными, полученными для M. truncatula, где ингибирование синтеза GSH и hGSH уменьшало количество формирующихся клубеньков и боковых корней (Frendo et al., 2005). Эти факты указывают на то, что уменьшение количества клубеньков у обработанных раствором BSO растений всех генотипов могло происходить, по крайней мере частично, из-за нарушения формирования меристемы в тканях корня. Интересно отметить, что на растениях, обработанных растворами 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH, количество клубеньков было таким же, как и на необработанных растениях для всех генотипов, за исключением мутанта sym33-3. Это означает, что в растениях мутантной линии sym33-3 могут существовать дополнительные факторы, регулирующие количество клубеньков. Клубеньки мутанта sym33-3, характеризуются усилением защитных ответов и, вероятно, повышенным синтезом салициловой кислоты – негативного регулятора клубенькообразования (Цыганова, Цыганов, 2018). Это косвенно подтверждается высоким уровнем экспрессии генов PR1 и PR10, которые индуцируются салициловой кислотой, в необработанных растениях мутантной линии sym33-3 и обработанных растворами 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH, по сравнению с другими генотипами. Принимая во внимание, что меристема все-таки формировалась в клубеньках мутантной линии sym33-3, обработанных растворами 0,1 мМ BSO и 0,5 мМ GSH, где уровни GSH и hGSH составляли только 38% и 18% от уровней этих тиолов в необработанных растениях, можно предположить, что определенный минимальный уровень тиолов является существенным для функционирования меристемы, но является недостаточным для восстановления количества клубеньков у данного мутанта.
Таким образом, недостаток тиолов приводит к разрушению азотфиксирующих клеток в клубеньках дикого типа, что может быть доказательством прямой роли GSH и hGSH в поддержании и функционировании инфицированных клеток. В то же время, другие эффекты недостатка этих тиолов, наблюдаемые в мутантных клубеньках, могут указывать на их функции в развитии меристемы, формировании определенного числа клубеньков, росте инфекционных нитей и делении симбиосом.
4.3.Анализ влияния обработки экзогенным глутатионом на морфологию клубеньков P. sativum дикого типа и мутантных линий sym40-1 и sym33-3 Чтобы изучить влияние концентрации тиолов и их соотношения на развитие
клубеньков, корни P. sativum дикого типа и мутантных линий обрабатывали 0,1 мМ или 1 мМ раствором GSH. Обработка растений P. sativum дикого типа 0,1 мМ раствором GSH в течение 2 недель приводила к двукратному увеличению количества GSH и не влияла на количество hGSH в корнях с клубеньками. В то же время обработка раствором 1 мМ GSH вызвала трехкратное увеличение количества обоих тиолов. У мутантной линии sym40-1 обработка 0,1 мМ раствором GSH не влияла на количество GSH, но приводила к 25% увеличению количества hGSH в корнях с клубеньками. Обработка раствором 1 мМ GSH вызывала почти трехкратное увеличение количества обоих тиолов, как и в корнях растений
дикого типа. Корни с клубеньками мутантной линии sym33-3, характеризовались 25% увеличением уровня GSH и 35% снижением количества hGSH после обработки 0,1 мМ раствором GSH, и только 1,5-кратным увеличением количества GSH и двукратным увеличением hGSH после обработки 1 мМ раствором GSH.
Микроскопический анализ клубеньков дикого типа и мутантной линии sym40-1 после обработки растворами GSH различных концентраций не выявил каких-либо хорошо заметных отличий от необработанных клубеньков. Обработка GSH мутантной линии sym33-3 приводила к образованию структур, подобных инфекционным каплям во многих клетках клубеньков, некоторые из них были гипертрофированы, особенно после обработки 1 мМ раствором GSH (рис. 9А), в некоторых клетках происходил выход бактерий (рис. 9Б). Однако, эти клетки с хаотично расположенными бактероидами отличались по структурной организации от инфицированных клеток дикого типа (рис. 9Б). Обработка корней мутантной линии sym33-2 раствором 1 мМ GSH не изменяла степень инфекции клубеньковых примордиев, но приводила к чрезмерному росту и набуханию инфекционных нитей, которые проявляли признаки частой остановки и формировали вздутия в наружной коре клубенька (рис. 9В–Г). Никаких видимых изменений в гистологической структуре клубеньков мутанта sym33-2 после обработки корней 0,1 мМ раствором GSH по сравнению с необработанными растениями не наблюдалось.
Рисунок 9. — Гистологическая организация клубеньков P. sativum мутантных линий sym33-3 и sym33-2, обработанных 1 мМ раствором глутатиона через 2 недели после инокуляции
Клетки клубенька мутантной линии sym33-3 (А–Б); клетки клубенька мутантной линии sym33-2 (В–Г). я — ядро; ик — инфицированная клетка; стрелка указывает на инфекционные нити, наконечник стрелки – на инфекционные капли. Наложение
дифференциально- интерференционного контраста и красного канала, красный канал — ДНК ядер и бактерий/бактероидов.
Масштабная линейка = 100 мкм.
Клубеньки мутантной линии sym33-3, обработанные 1 мМ раствором GSH, были инфицированы в большей степени, чем клубеньки на необработанных растениях, однако, это сопровождалась усилением экспрессии PR-генов и гена цистеиновой протеазы Cyp15a, а также дезорганизацией бактероидов в инфицированных клетках. Можно сделать вывод, что стимуляция инфекции в этих клубеньках вызывает также и усиление защитных реакций, что впоследствии приведет к деградации инфицированных клеток, как это происходит в клубеньках мутанта sym40-1.
Стоит отметить, что обработка корней с клубеньками мутантов sym33 1 мМ раствором GSH также приводила к нарушениям в развитии инфекционных нитей. Возможным объяснением может быть способность GSH изменять свойства арабиногалактанпротеин экстензинов, локализованных в просвете инфекционных нитей (Bradley et al., 1992). Такие арабиногалактанпротеин экстензины, окружая бактерии в
инфекционных нитях, могут ограничивать их рост, а также регулировать рост самих инфекционных нитей (Wisniewski et al., 2000). Эти данные подтверждают участие GSH в контроле роста инфекционных нитей. GSH в зависимости от концентрации может влиять на уровень экспрессии гена NF-YA1 или напрямую – взаимодействуя с арабиногалактанпротеин экстензинами в матриксе инфекционных нитей. Более того, параллель между эффектами недостатка тиолов и обработки растений 1 мМ раствором GSH подчеркивает неоднозначную роль этого тиола в азотфиксирующем симбиозе и тонкую настройку клеточного ответа в соответствии с фактическим содержанием GSH.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Ризобии могут вступать с бобовыми растениями как в мутуалистические, так и в паразитические взаимоотношения. Поэтому растения должны контролировать все этапы развития клубенька и его функционирования, чтобы избежать нежелательных затрат энергии, отделяя защитные механизмы от процессов деления и дифференцировки клеток. Координация процессов развития и защитных ответов, осуществляемая посредством взаимодействия активных форм кислорода, фитогормонов, GSH/hGSH и окислительно- восстановительного баланса, является необходимой для регуляции такой чувствительной системы, как симбиотический клубенек (Foyer et al., 2009; Foyer, Noctor, 2013; Diaz- Vivancos et al., 2015).
С использованием линии P. sativum дикого типа и симбиотических мутантных линий, блокированных на разных стадиях развития клубенька и характеризующихся проявлением разнообразных защитных ответов, были выявлены функции GSH и hGSH.
Количество GSH и hGSH, а также их соотношение играют роль в восприятии растениями P. sativum ризобий в качестве симбионтов или патогенов. Более высокое соотношение GSH : hGSH в клубеньках по сравнению с корнями, необходимо для развития симбиоза и высвобождения бактерий в растительную клетку. В симбиотическом клубеньке P. sativum GSH участвует в меристематической активности клеток и, вероятно, также в эндоредупликации в инфицированных клетках, росте инфекционных нитей, поддержании азотфиксации в бактероидах и адаптации к стрессовому воздействию у ризобий. GSH и hGSH необходимы для устойчивости азотфиксирующих клеток и вовлечены в защитные реакции растений. Для участия GSH и hGSH в симбиотических взаимодействиях или защитных реакциях, их количество и соотношение в клубеньке должно строго контролироваться.
Дальнейшие исследования необходимы, чтобы окончательно прояснить специфическую роль hGSH в развитии и функционировании симбиотических клубеньков, а также выявить селективное преимущество, обеспечивающееся hGSH для бобовых растений, которое позволило сохранить активность гена hGSHS в процессе эволюции.
ВЫВОДЫ
1. Мутации P. sativum sym33-3 и sym40-1 приводят к восприятию микросимбионта в качестве потенциального патогена, что проявляется в отложении суберина в тканях неэффективных клубеньков и экспрессии генов – маркеров защитных реакций. Стимуляция инфекции в мутантных клубеньках sym33-3 экзогенным GSH вызывает усиление защитных реакций.
2. Изменения в активности генов GSHS и hGSHS и количестве тиолов GSH и hGSH, наблюдаемые после высвобождения бактерий из инфекционных нитей в клубеньках P. sativum, являются частью программы развития симбиотического клубенька.
3. В эффективных клубеньках P. sativum поддерживается более высокое соотношение GSH : hGSH, чем в неэффективных клубеньках и неинокулированных корнях.
4. GSH необходим для функционирования меристемы клубенька P. sativum и бактероидов при эффективном симбиозе.
5. Снижение концентрации GSH и hGSH в корнях P. sativum приводит к уменьшению числа клубеньков и индукции раннего старения в клубеньках дикого типа, проявляющегося в деградации зоны азотфиксации и увеличении уровня экспрессии генов – маркеров старения. В клубеньках мутантной линии sym40-1 недостаток GSH и hGSH приводит к формированию симбиосом, содержащих несколько бактероидов.
6. Как снижение, так и увеличение концентрации тиолов в неэффективных клубеньках P. sativum по сравнению с клубеньками дикого типа, являются частью защитных реакций, проявление которых зависит от стадии, на которой было нарушено развитие клубенька и произошло переключение симбиотической программы на защитный ответ.