Роль окситоцина в патогенезе эндометриоз-ассоциированного болевого синдрома и разработка патогенетически обоснованной терапии с применением антагониста окситоциновых рецепторов

Материалы и методы исследования. Диссертация «Роль окситоцина в
патогенезе эндометриоз- ассоциированного болевого синдрома и разработка
патогенетическиобоснованнойтерапиисприменениемантагониста
окситоциновых рецепторов» выполнена в период с 2018 по 2021г. в отделе
гинекологии и эндокринологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (рук. отдела
гинекологии и эндокринологии – проф. РАН, д.м.н., проф. М.И. Ярмолинская).
Дизайн диссертационной работы представлен клинической и экспериментальной
частями.

Привыполненииданной работыбыло обследовано 92 женщины.
Критериями включения в основную группу (n=71) явились: репродуктивный
возраст, овуляторный менструальный цикл, верифицированный интраоперационно
диагноз НГЭ I-IV стадии, подтверждённый гистологическим исследованием,
наличиеболевогосиндрома(больвобласти малого таза,дисменорея,
диспареуния). Критериями включения в контрольную группу (n=21) были:
репродуктивный возраст, овуляторный менструальный цикл, отсутствие болевого
синдромаигинекологическойпатологиинаоснованиидиагностической
лапароскопии. Критериями исключения для обеих групп стали: декомпенсация
хронических соматических заболеваний, острые инфекционные заболевания или
обострение их хронических форм, в том числе воспалительные заболевания
органов малого таза, аутоиммунные заболевания, за исключением заболеваний
щитовидной железы аутоиммунного генеза, прием гормональных препаратов за 3
месяца до оперативного вмешательства по поводу эндометриоза. Все женщины
подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Всем пациенткам было проведено общее физикальное и специальное
гинекологическоеобследование,антропометрия.Оценкаэндометриоз-
ассоциированного болевого синдрома была произведена с помощью нескольких
шкал: визуально-аналоговой шкалы боли (VAS), опросника боли Мак-Гилла
(MPQ), шкалы Бибероглу и Бермана (BBS). Отдельно оценена выраженность
болевого синдрома при менструациях, боли вне менструации и боли при половой
жизни. Оценку психо-эмоционального фона проводили с применением комплекса
шкал: госпитальной шкалы тревоги и депрессии (HADS), шкала тревоги
Спилбергера (STAI), шкалы депрессии Бека (BDI).

Гормональноеисследованиебыловыполненовлаборатории
эндокринологии отдела гинекологии и эндокринологии ФГБНУ «НИИ АГиР им.
Д.О. Отта» (заведующий лабораторией эндокринологии – к.б.н. Н.Н. Ткаченко).
Определениеуровнягормоноввплазмекровиосуществлялось
иммуноферментныманализом.Проводилиоценкусодержанияуровня
фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ) и
антимюллерова гормона (АМГ) на 2-5 дни менструального цикла, а также уровня
прогестерона с 18 по 23 день менструального цикла. Определение уровня
окситоцина в плазме крови проводилось на 2-10-й день менструального цикла с
помощью набора Peninsula Laboratories, LLC, фирмы “Bachem Group” (США).

Морфологические исследования проведены в отделе патоморфологии
ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (зав. патологоанатомическим отделом – к.м.н.
Т.Г. Траль, зав. лаб. иммуногистохимии – д.м.н. Г.Х. Толибова). Гистологическое
исследование эндометрия, эндометриоидных гетеротопий, брюшины, полученных
во время операционной лапароскопии, осуществлялось по стандартной методике.
Иммуногистохимический метод исследования включал: количественную и
качественную оценку экспрессии рецепторов окситоцина с использованием
первичных поликлональных кроличьих антител к рецепторам Anti-Oxcytocin
Receptor [ab 217212] в стандартном разведении (1:200), производства Abcam
(Великобритания). Количественную оценку результатов иммуногистохимической
реакции проводили на микрофотографиях, полученных с помощью системы
фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Olympus
BX46 и программного обеспечения “CellSens 47 Entry”.

Экспериментальная часть была выполнена в виварии ФГБНУ «НИИ АГиР
им. Д.О. Отта» в 2019 г. Экспериментальная модель была выполнена на 24
половозрелых крысах линии Вистар весом 200±50 г. На первом этапе проводились
лапаротомия с подшиванием фрагментов матки на внутреннюю поверхность
переднейбрюшнойстенки.Через14±2дняпроводилилапароскопию,
визуализировали и измеряли сформировавшиеся эндометриоидные имплантаты.
Далее проводилась рандомизация крыс в группы получавших внутрибрюшинно
антагонист окситоциновых рецепторов – Атозибан (Atosiban), Фармидея ООО
(Латвия), в дозировке 0.35 мг/кг/день и физиологический раствор. Терапия
антагонистом окситоциновых рецепторов проводилась в течение 21±3 дней. Затем
выполнялисьаутопсия, оценкаиизмерениеэндометриоидныхочаговс
последующим гистологическим исследованием.

Статистический анализ данных был выполнен с помощью программ
STATISTICA software (StatSoft, Russia) и IBM SPSS Statistics 26. Данные были
представлены в виде медианы и межквартильного диапазона или среднего
значения± стандартное отклонение в соответствии с распределением. Значимость
различий между количественными признаками в двух группах оценивали с
помощью непарного t-критерия Стьюдента. Для описания разных значений
категориальных данных представлены абсолютные частоты и проценты от общего
количества наблюдений. Для сравнения влияния интенсивности болевого
синдрома(восновнойгруппе)понормальнораспределеннымданным
использованы критерии ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ). Для
данных, распределение которых отличаются от нормального, использовались
критерий Манна-Уитни (в случае сравнения 2-х групп) или критерий Краскела-
Уоллиса (в случае 3 групп). Для оценки взаимосвязи между количественными
признаками вычисляли непараметрический коэффициент корреляции Пирсона и
Спирмена в зависимости от нормальности распределения данных. Обработка
категориальных данных проведена с использованием таблиц частот, таблиц
сопряженности, критерия согласия Пирсона (χ2) или точного критерия Фишера.
Применялся расчет отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом
(ДИ) для количественного описания связи факторов риска с развитием
заболевания. Результаты считали значимыми при р <0,05. Для проведения оценки качества(диагностическойэффективности)прогностическоймодели использовался метод построения кривой взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и истинно положительных результатов (ROC-кривой). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КлиническаяхарактеристикабольныхНГЭ.Степень распространенности НГЭ была установлена на основании пересмотренной классификации Американского Общества Репродуктивной Медицины (rASRM). НГЭ I степени выявлен в 14,1% (n=10) случаев; II степень у 16,9% пациенток (n=12); у 43,7% больных верифицирован НГЭ III степени (n=31) и у 25,3% (n=18) диагностирован НГЭ IV степени распространенности. Ведущей жалобой у женщин с НГЭ был болевой синдром, который характеризовался, главным образом дисменореей у 87,3% (n=62) больных, диспареунией у 50,7% (n=36) женщин; диффузная тазовая боль наблюдалась у 42,25% (n=30). При распределении данных по степени интенсивности болевого синдрома (VAS) у больных НГЭ выраженный болевой синдром отмечен у 21% (n=15), умеренный - у 49% (n=35) и слабый - у 30% (n=21). На основании шкалы Бибероглу и Бермана сильная боль была отмечена в 54% (n=38), умеренная - в 40% (n=28) и слабая - в 7% (n=5) случаев. На основании опросника MPQ был определен характерболи(таблица1).Корреляционнаясвязьмеждустепенью распространенностиэндометриозаиинтенсивностьюболевогосиндрома отсутствовала (p>0,05).
Таблица 1 – Результаты опросника боли Мак-Гилла у больных НГЭ
Оценка болевого синдромаРезультат1
Сенсорный аспект6 [4; 10]
Эмоциональный аспект4 [3; 8]
Оценочный аспект2 [2; 3]
Ранговый индекс боли13 [9; 21]
Общее число выбранных слов7,5 [6; 11]
Примечание:1
– Результат представлен в виде медианы и межквартильного
размаха
У всех больных эндометриозом были оценены особенности менструального
цикла. Среди нарушений менструального цикла у женщин с НГЭ наблюдались
межменструальные(перименструальные)кровянистыевыделения,которые
встречались у 66,7% больных, при этом выделения до начала менструаций
отметили 25% женщин, после менструальной реакции – 50%, до и после – 25%. У
всех женщин основной группы отмечался регулярный менструальный цикл.
Достоверных различий по возрасту наступления менархе, продолжительности
менструальных выделений, длительности менструального цикла в основной
группе и группе контроля не выявлено (p>0,05).

Вторым важным клиническим симптомом у больных НГЭ являлось
бесплодие, которое диагностировано у 60,6% (n=43) обследованных пациенток
основной группы, причем первичное бесплодие отмечено в 41,9% случаев (n=18).
Длительность бесплодия у женщин с НГЭ составила 2,0±1,3 года, при этом
длительность первичного бесплодия – в среднем 2,5±1,4 года, вторичного – в
среднем 1,8±0,9 года.

При анализе акушерского анамнеза больных НГЭ было установлено, что у
49% (n=35) пациенток в анамнезе были беременности, в 62,8% (n=22) случаев они
закончились срочными родами. Родоразрешение через естественные родовые пути
было в 68% (n=15) случаев, с помощью операции кесарево сечение у 32% (n=7)
женщин. Самопроизвольный выкидыш до 12 недель беременности наблюдался у
35% (n=25). Следует отметить, что 22,5% (n=16) женщин в анамнезе имели
искусственные аборты. В 38% (n=27) случаев НГЭ сочетался с аденомиозом. В
36,6% (n=26) случаев у больных НГЭ в анамнезе отмечены воспалительными
заболеваниями органов малого таза.

Среди сопутствующей соматической патологии у больных НГЭ ведущее
место занимали доброкачественные заболевания молочных желез, установленные
у 50,7% (n=36) больных, заболевания ЛОР органов наблюдались у 31% (n=22),
заболевания желудочно-кишечного тракта выявлены у 49% (n=35) пациенток.
Заболевания щитовидной железы были выявлены у 29,6% женщин (n=21), в 26,8%
(n=19) случаев были отмечены ранее перенесенные инфекции мочевыводящих
путей. При оценке весо-ростовых показателей было установлено, что у 78,9%
пациенток с НГЭ индекс массы тела (ИМТ) находился в пределах нормальных
значений, дефицит массы тела был определен в 11,3%, избыток массы тела – у 7%
и ожирение 1 степени – у 2,8% больных, среднее значение ИМТ составило
22,49±3,26 кг/м2.

На основании опросника HADS выраженность симптомов тревоги и
депрессии среди пациенток основной группы распределилась таким образом: у
13% (n=9) выявлена клинически выраженная тревога; у 4% (n=3) – клинически
выраженная депрессия (11 баллов и выше); 31% (n=22) пациенток страдали
субклинически выраженной тревогой и 7% (n=5) – субклинически выраженной
депрессией (8-10 баллов); при этом у 27% (n=19) больных значения были на
верхней границе нормы (7 баллов) и у 18% (n=13) пациенток симптомов тревоги и
депрессии выявлено не было. На основании шкалы STAI уровни ситуативной и
личностной тревожности среди женщин основной группы различались. Высокий
уровень личностной тревожности составил 44%, умеренный – 43%, низкий – 13%.
Ситуативная тревожность высокого уровня определена в 51%, умеренного – в
37%, низкого – в 12% случаев. Оценка наличия и уровня депрессии среди
обследуемых женщин проводилась по шкале BDI. Так депрессия была установлена
у 31% женщин с НГЭ (n=22), причем легкая депрессия наблюдалась у 73% (n=16),
умеренная – у 18% (n=4) и выраженная – у 9% (n=2).
Результаты гормонального обследования. Средний уровень ФСГ в группе
больных НГЭ составил 6,4±0,43 МЕ/л; уровень ЛГ – 3,63±0,47 МЕ/л; в
контрольной группе содержание ФСГ составило 5,6±0,48 МЕ/л, а уровень ЛГ в
сыворотке крови был 4,2±0,51 МЕ/л. Статистически значимых различий в уровнях
ФСГ и ЛГ в периферической крови в фолликулярную фазу менструального цикла
у группы женщин с НГЭ и без гинекологической патологии не было выявлено
(p>0,05). Уровень АМГ в сыворотке крови в основной группе был 2 раза ниже, чем
в группе контроля, средние его значения составили в основной группе 1,8 нг/мл, в
группе контроля 4,1 нг/мл (р<0,05). На основании результатов определения уровня прогестерона у пациенток во вторую фазу менструального цикла у всех пациенток был диагностирован овуляторный менструальный цикл. Уровень прогестерона в группе больных НГЭ и в группе контроля составил 33,4±1,3 нмоль/л и 34,2±1,8 нмоль/л соответственно (p>0,05).

Результаты определения уровня окситоцина в плазме крови. Средний
уровень окситоцина в плазме крови в группе больных с НГЭ был достоверно выше
по сравнению с показателями в контрольной группе (45,5±17,6 пг/мл и 28,75±6,7
пг/мл, p<0,01). Была определена прямая корреляционная связь между содержанием OXT и выраженностью болевого синдрома у пациенток основной группы на основании VAS, BBS (рисунок 1). Рисунок 1 - Корреляционная связь между уровнем окситоцина в плазме крови и степенью интенсивности болевого синдрома Не установлено достоверной корреляционной связи между степенью выраженности тревоги и депрессии, оцененной на основании HADS, шкал BDI, STAI, и уровнем окситоцина в плазме крови у пациенток с НГЭ (p>0,05).

Результатыиммуногистохимическогоисследования.Результаты
настоящего исследования показали, что OXTR присутствуют как в эутопическом
эндометрии больных НГЭ, так и в эндометриоидной гетеротопии, в 100% случаев.

Площадь экспрессии ОXTR в эутопическом эндометрии (рисунок 2)
больных НГЭ в пролиферативную фазу менструального цикла была достоверно
больше по сравнению с тем же показателем в контрольной группе (55,5±8,6 и
42,1±5,9 соответственно, p<0,001). Оптическая плотность экспрессии ОXTR в железистом компоненте эндометрия основной группы достоверно выше, чем в контрольной группе (0,09±0,01 и 0,08±0,003, соответственно, p<0,05). аб Рисунок 2 - Экспрессия окситоциновых рецепторов в эутопическом эндометрии: а – основная группа; б – контрольная группа; х200 Статистически значимых отличий между степенью распространенности эндометриоза, площадью экспрессии OXTR в эутопическом эндометрии и эндометриоидных гетеротопиях (рисунок 3) среди пациенток основной группы с различной степенью интенсивности болевого синдрома также не выявлено (p>0,05).
аб

Рисунок 3 – Экспрессия окситоциновых рецепторов в эктопическом эндометрии:
а – эндометриоз I-II стадии; б – эндометриоз III -IV стадии; х200

Результатыисследованиявлиянияингибитораокситоциновых
рецепторов на очаги эндометриоза в хирургически индуцированной модели у
крыс. В эксперимент было включено 24 крысы, которые были распределены на
основную группу (n=12), получавшую антагонист окситоциновых рецепторов
(0,35мг/кг/сутки),иконтрольную(n=12),получавшуюинъекции
физиологическогораствора.Доначалалечениясредниеплощади
эндометриоидных имплантатов были сопоставимы в обеих группах и составили
18,3±2,5 мм2 в основной группе и 17,5±3,5 мм2 в группе контроля. В основной
группе из 22 эндометриоидных гетеротопий в 27,3% случаев была обнаружена
полная резорбция имплантатов, в 68,2% наблюдалось достоверное уменьшение
площади гетеротопий на 62,4±11,2% (рисунок 4).

аб

Рисунок 4 – Сформированный очаг эндометриоза в основной группе:
а- до начала лечения; б- тот же очаг эндометриоза через 21 день применения
ингибитора окситоциновых рецепторов
В контрольной группе в 95,2% случаев было отмечено увеличение размеров
очагов эндометриоза на 29±7,2%.

Средняя площадь эндометриоидных имплантатов в основной группе после
лечения была достоверно меньше, чем в контрольной группе (7,3±1,8 мм 2 и
22,2±1,2 мм2 соответственно, р<0,05). Результаты оценки качества прогностической модели НГЭ. Для оценки диагностической эффективности прогностической модели использовался метод построения кривой взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и истинно положительных результатов (ROC-кривой). Площадь под ROC-кривой (рисунок 5), соответствующей взаимосвязи прогноза НГЭ и уровня окситоцина в плазме крови, составила 0,898±0,032 с 95% ДИ: 0,836-0,96. Полученная модель была статистически значимой (p<0,001). Рисунок 5 - ROC-кривая прогностической модели неинвазивной диагностики наружного генитального эндометриоза Пороговое значение уровня окситоцина составляло 36,1 пг/мл. Уровень окситоцина в плазме крови, равный 36,1 пг/мл или превышающий данное значение,соответствовалпрогнозуналичияНГЭ.Чувствительностьи специфичность метода составили 78,9% и 81% соответственно. ВЫВОДЫ 1.Эндометриоз-ассоциированный болевой синдром характеризуется дисменореей у 87,3%, диспареунией – у 50,7% и диффузной тазовой болью – у 42,3% пациенток. На основании ВАШ выраженный болевой синдром отмечен у 21%, умеренный - у 49% и слабый - у 30% пациенток с НГЭ. Относительно шкалы Бибероглу и Бермана сильная тазовая боль была отмечена в 54%, умеренная - в 40% и слабая - в 7% случаев. При анализе опросника боли Мак-Гилла у женщин с НГЭ отмечен смешанный тип боли. Отмечается отсутствие корреляционной связи между степенью интенсивности болевого синдрома и стадией распространенности НГЭ (p>0,05).
2.Сочетание тревоги и депрессии установлено у 55% пациенток с НГЭ.
На основании госпитальной шкалы тревоги и депрессии клинически выраженная
тревога была выявлена в 13%, клинически выраженная депрессия – в 4%,
субклинически выраженная тревога – в 31% и субклинически выраженная
депрессия – в 7% случаев. При анализе шкалы депрессии Бека у 31% пациенток с
НГЭ была установлена депрессия, причем легкая – в 73%, умеренная – в 18% и
выраженная – в 9% случаев. Личностная и ситуативная тревожность была
диагностирована у 100% женщин с НГЭ. Основываясь на шкале тревоги
Спилбергера, высокий уровень личностной тревожности был определен у 44%,
умеренный уровень – у 43% и низкий – у 13% больных НГЭ; ситуативная
тревожность высокого уровня была выявлена в 51% случаев, умеренного уровня –
в 37% и низкого уровня – в 12% случаев.
3.Уровень окситоцина в плазме крови в пролиферативную фазу цикла у
пациенток с НГЭ достоверно выше, по сравнению с показателями у женщин
контрольной группы (46,78±20,1 пг/мл и 29,58±7,09 пг/мл соответственно, p
<0,05), и имеет положительную корреляционную связь со степенью интенсивности болевого синдрома, оцененной на основании визуально-аналоговой шкалы боли, шкалы Бебероглу и Бермана (r=0,46 и r=0,56 соответственно, p<0,05). 4.Не установлено достоверной корреляционной связи между степенью выраженности тревоги и депрессии, оцененной на основании госпитальной шкалы тревоги и депрессии, шкалы депрессии Бека, шкалы тревоги Спилбергера, и уровнем окситоцина в плазме крови у пациенток основной группы (p>0,05).
5.У пациенток с НГЭ площадь экспрессии рецепторов окситоцина в
эутопическом эндометрии была достоверно больше по сравнению с данным
показателемвэндометриигруппыконтроля(55,5±8,6%и42,1±5,9%
соответственно, p<0,001). Площадь экспрессии окситоциновых рецепторов в эутопическом эндометрии и эндометриоидных гетеротопиях у пациенток основной группы достоверно не различалась (p>0,05).
6.На модели хирургически индуцированного эндометриоза у крыс
линии Вистар после применения антагониста окситоциновых рецепторов (0,35
мг/кг/сутки) в 27,3% случаев наблюдалась полная резорбция эндометриоидных
гетеротопий, в 68,2% отмечено достоверное уменьшение размеров очагов, в 4,5%
очаги были без динамики, что подтверждено результатами гистологического
исследования.
7.На основании определения уровня окситоцина в плазме крови
установленопороговоезначениев36,1пг/мл,превышениекоторого
свидетельствует о наличии у пациентки НГЭ. Чувствительность и специфичность
метода составляют 78,9% и 81% соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Дляобъективнойоценкивыраженностиэндометриоз-
ассоциированногоболевогосиндромаихарактераболирекомендован
комплексный подход с применением визуально-аналоговой шкалы боли, шкалы
Бибероглу и Бермана и опросника боли Мак-Гилла.
2.У пациенток с эндометриоз-ассоциированным болевым синдромом
рекомендовано проводить первичную оценку выраженности тревоги и депрессии
на основании госпитальной шкалы тревоги и депрессии.
3.Учитывая высокие показатели тревоги и депрессии у пациенток с
НГЭ, для более детальной оценки психоэмоционального состояния пациенток с
эндометриоз-ассоциированным болевым синдромом рекомендовано пользоваться
более чувствительными клиническими шкалами, такими как шкала тревоги
Спилбергера,шкаладепрессииБека.ПациентоксНГЭ,укоторых
диагностированы проявления тревоги и депрессии, целесообразно своевременно
направлять на консультацию к психотерапевту.
4.При подозрении на НГЭ у пациенток репродуктивного возраста
рекомендовано определять уровень окситоцина в плазме крови натощак со 2-го по
10-й день менструального цикла. Метод определения уровня окситоцина
характеризуется высокой точностью, может рассматриваться как маркер НГЭ и
использоваться в рутинной клинической практике с целью неинвазивной
диагностики заболевания в дополнение к существующим методам верификации
НГЭ. Согласно данному методу при уровне окситоцина в плазме крови 36,1 пг/мл
и выше диагноз заболевания можно считать подтвержденным.