Роль полиморфных вариантов генов неоангиогенеза, гельобразующего муцина и фермента метаболизма андрогенов в развитии генитального эндометриоза

Материал и методы исследования

В исследование были включены 164 пациентки репродуктивного возраста. Из
них: 85 пациенток с гистологически установленным генитальным эндометриозом
(31,5±12,5 лет) – группа 1, и 79 женщин без эндометриоза – группа 2 (группа
сравнения; пациентки, не имеющие очагов эндометриоза при проведении
лапароскопии), сопоставимых по возрасту с 1-й группой женщин (31,0 ± 11,0 лет).
Все женщины, включенные в исследование, фенотипически являлись
представительницами славянской популяции. Все участницы исследования
длительное время проживали на территории Северо-Западного федерального округа
России. Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на
участие в исследовании.
План и дизайн исследования согласованы и одобрены комиссией по этике
Балтийского федерального университета им. И. Канта: №2 от 02.03.2018.
Диагноз был верифицирован в ходе проведенного хирургического лечения и
подтвержден морфологически. Согласно пересмотренной классификации
Американского Общества Фертильности (R-AFS/АSRM), исходя из суммы баллов,
была установлена степень тяжести эндометриоза.
Был изучен анамнез пациенток, выявлены жалобы и соматическая патология.
Всем пациенткам до хирургического вмешательства проводился общеклинический
и гинекологический бимануальный осмотр, ультразвуковое исследование органов
малого таза на 5-7 день менструального цикла различными доступами
(трансвагинально, трансректально и трансабдоминально). С целью верификации
тяжести процесса проводилась магнитно-резонансная томография органов малого
таза на 5-7 день менструального цикла. Пациенткам с инфильтративными формами
эндометриоза проводилась видеофиброколоноскопия, фиброгастроскопия.
В группу сравнения (группа 2) включены пациентки, у которых в ходе
хирургического вмешательства по поводу подозрения на эндометриоз-
ассоциированное бесплодие, проведения хирургической стерилизации, а также по
экстренным показаниям (апоплексия или перекрут яичника, внематочная
беременность) очаги эндометриоза обнаружены не были.
Во всех группах был отмечен одинаковый возраст наступления менархе 13,0
± 2,0 лет (р>0,05). У пациенток с эндометриозом, как и у женщин без него,
менструальный цикл составлял в среднем 28 дней (25-31 день) (р>0,05). В 97%
случаев менструальный цикл был регулярным, у пациенток с эндометриозом в
42,2% случаев менструации были обильными и длительными (р<0,05), в 8,2% случаев отмечались межменструальные кровотечения (р<0,05). Также пациентки с генитальным эндометриозом отмечали болевой синдром, связанный с менструацией в 77,6 % случаев, 40% женщин отмечали диспареунию, невынашивание беременности встречалось в 7,1 % случаев. У 20,0% пациенток с эндометриозом роды были через естественные родовые пути, с помощью кесарева сечения – у 7,1%, статистически значимые различия не выявлены (p>0,05). Оценка
индекса массы тела (ИМТ) показала, что в основной группе пациенток с
избыточной массой тела было 17% (10 человек), а в группе сравнения – 22% (17
человек); χ2=0,69, p=0,41. Распространённость ожирения была выше среди женщин
без эндометриоза.
Во время лапароскопии у 85,9% пациенток выявлялись эндометриоидные
кисты; у 43,0% женщин они были двусторонними. Распространённость
ретроцервикального эндометриоза составила 15,3%. Частота встречаемости
симптомов среди пациенток с генитальным эндометриозом в зависимости от
степени тяжести эндометриоза представлена в таблице 1. В ходе анализа
гистологических исследований эндометрия у пациенток исследуемых групп было
установлено, что хронический эндометрит обнаруживался в 80,5% случаев в группе
пациенток, страдающих генитальным эндометриозом и в 1,2% – среди группы
сравнения (р = 0,001) (табл. 2).

Таблица 1 – Частота встречаемости основных симптомов у пациенток с генитальным
эндометриозом в зависимости от тяжести заболевания (R-AFS, 1985 г.), абс. (%)

Пациентки с генитальным эндометриозомР*
Показатель
I-II ст.III-IV ст.
(n=9)(n=76)
Дисменорея3 (33,3)63 (82,9)p<0,05 Диспареуния034 (44,7)p<0,001 Дисхезия014 (18,4)p<0,001 Объем менструации: Умеренные6 (66,7)36 (47,4)p<0,001 Обильные3 (33,3)33 (43,4) Межменструальные07 (9,2)p<0,001 кровотечения Примечание: *согласно точному критерию Фишера Критерии включения В настоящее исследование включались женщины репродуктивного возраста (18-45 лет) с диагнозом генитального эндометриоза, верифицированным гистологически.Такжекритериемвключения являлось подписанное информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения Из исследования исключались женщины моложе 18 и старше 45 лет с наличием аллергических и острых воспалительных заболеваний различных локализаций, четко ассоциированных с возбудителями, в том числе гинекологических; экстрагенитальных соматических заболеваний в стадии декомпенсации,онкологических заболеваний, имеющихв анамнезе, наследственные, психические заболеваниями, с наличием алкогольной и наркотической зависимости. Таблица 2 - Распространенность патологии эндометрия в исследуемых группах Пролиферативный/ ПатологияХроническийГиперплазия секреторный эндометрияэндометритэндометрияР* эндометрий Группа сравнения 73 (92,4%)1 (1,2%)5 (6,3%)<0,001 (n=79) Пациентки с генитальным 11 (12,9%)68 (80,5%)6 (7,05%)<0,001 эндометриозом (n=85) Примечание: *согласно точному критерию Фишера Биологический материал (удаленные участки тканей оперированных органов), полученный во время оперативного вмешательства, был фиксирован с помощью 10 % раствора нейтрального формалина в стерильной емкости. Далее материал был промаркирован, и имел направление с указанием паспортных данных пациентки, клинического диагноза, объема хирургического вмешательства, даты забора материала, номера истории болезни, описания исследуемых ткани или органа, а также дополнительных данных (сопутствующая гормональная терапия). После чего был направлен для гистологического исследования в национальный центр клинической морфологической диагностики, (г. Санкт-Петербург, ул. О.Дундича, д. 8, к2, лит. А, директор лаборатории - Воробьев Сергей Леонидович). После доставки материала в патологоанатомическое отделение, врач- патологоанатом проводил макроскопическое описание поступившего материала (органа, ткани). Ткани обезжиривались и заливались парафином для приготовления срезов исследуемых органов и тканей. Срезы толщиной 5 мкм окрашивались по Ван- Гизону и гематоксилин-эозином. Морфологическое исследование полученных препаратов проводили с помощью световой микроскопии при увеличении от 40 до 250. Материаломдлямолекулярно-генетическихииммунологических исследований служила венозная кровь, взятая интраоперационно из локтевой вены; кровь отбирали в вакуумные пробирки Vacuette с активатором образования сгустка для получения сыворотки или ЭДТА для получения плазмы крови. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов венозной крови, стабилизированной ЭДТА, согласно инструкции производителя с использованием коммерческих наборов «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол» Россия). Протокол выделения ДНК: вносили образец и маркировали необходимое количество пробирок объемом 1,5 мл в соответствии с количеством анализируемых проб и дополнительной пробиркой для отрицательного контроля выделения. Во все пробирки (с исключением отрицательного контроля) вносилось по 0,3 мл цельной крови, и затем 0,9 мл лизирующего раствора 1. Методом переворачивания (8-10 раз) содержимое смешивали. Инкубировали смесь 10 минут, далее 2 минуты центрифугировали при скорости 13 000 об/мин. Для лизиса ядерной мембраны лейкоцитов в пробирки типа «эппендорф» добавлялось по 0,3 мл Лизирующего раствора 2 (№2) с перемешиванием на вортексе или пипетированием. Для лизиса клеток смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Осаждали ДНК путем добавления к лизату 100 мкл Осаждающего раствора 1 (№3). Степень очистки препаратов ДНК определяли отношением поглощения света при длине волны 260 и 280 нм (A260/280). Полученные значения находились в диапазоне до 1,6-2,0 усл.ед. Генотипирование осуществлялось методом ПЦР с использованием амплификатора LightСycler 480 Instrument II («Roche», Швейцария) и CFX96 («BioRad», США) и наборов для определения полиморфизмов VEGF-A T(-460)C (rs833061), VEGF C(+936)T (rs3025039), CYP11B2 T(-344)C (rs1799998), MUC2 T(- 12150)C (rs10794288), MUC2 C(-15161)T (rs10902088) (компания «Синтол», Россия). Протокол ПЦР состоял из следующих этапов: нагрев реакционной смеси при 95°С - 3 мин и амплификация в течение 40 циклов в следующем режиме: 95°С - 15 сек, 63°С - 40 сек. Концентрацию VEGF-А в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с помощью соответствующих наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест» и автоматического анализатора «Lazurite» (Dynex Technologies Inc., США), согласно инструкциям тест-систем (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Двухплашечный иммуноферментный анализатор «открытого типа» «Lazurite» обеспечивал полный цикл проведения ИФА в микропланшетном формате, включая спектрофотометрическую верификацию вносимых рабочих растворов и обработку результатов. Во все лунки иммунологического планшета вносили по 100 мкл раствора для разведения образцов, затем добавляли по 100 мкл «0 дозы», стандартов, контролей и образцы сыворотки. Планшет инкубировали при 37°С в течение 2 ч (в режиме интенсивного помешивания) с последующим 5- кратным циклом отмывки. После внесения по 100 мкл рабочего раствора конъюгата №1 (антитела к VEGF человека с биотином) во все лунки планшет инкубировали в течение 1 ч. Для удаления несвязанных компонентов проводили 5-кратный цикл отмывки. Далее добавляли в каждую лунку 100 мкл рабочего раствора конъюгата №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена) и инкубировали в течение 30 мин. Субстратный раствор тетраметилбензидина (ТМБ) был внесен в количестве 100 мкл после 5-кратной промывки с последующей инкубацией в течение 30 мин. при температуре 18-25°С (в темноте). Реакция была остановлена добавлением в лунки раствора 0,5 М серной кислоты (стоп-реагент). Референсные значения VEGF-А в сыворотке крови: 40-600 пг/мл. Полученные данные подвергались обработке с помощью пакета статистических программ IBM SPSS Statistics 26 для Windows. Данные из карт регистрации клинических данных пациента и результаты анализов вводились в специальные таблицы, а в дальнейшем подвергались автоматическому анализу. При описании данных и статистических результатов следовали рекомендациям SAMPL [Lang T.A. et al., 2014]. Нормальность распределения численных значений устанавливали на основании расчета W-критерия Шапиро-Уилка (при объеме выборки <50) и критерия Колмогорова-Смирнова (при объеме выборки > 50).
Значения анализируемых показателей каждой группы при соответствии закону
нормального распределения представляли в виде средней арифметической (М) и
стандартного отклонения (σ), в противном случае – в виде медианы (Ме) и
интерквартильногоразмаха(Q25;Q75).Статистическуюзначимость
количественных величин с нормальным распределением оценивали с помощью t-
критерия Стьюдента. Если величина t-критерия была равна 1,96 и больше, то можно
утверждать, что разница показателей не случайна, зависит от определенной
причины, вероятность ошибки выявить несуществующие различия не превышает
5% (р <0,05). Межгрупповые различия количественных величин с распределением, отличным от нормального, определяли с помощью U-критерия Манна-Уитни. Статистическую значимость различий качественных переменных оценивали с помощью критерия χ2 Пирсона. В небольших группах или в случае, когда отдельные частоты были в промежутке от 5 до 20 включительно, для оценки достоверности использовали критерий χ2 с поправкой Йетса. В случае сравнения групп с количеством наблюдений меньше 20 или в случае, когда отдельные частоты были меньше 5, для оценки достоверности использовали точный двусторонний критерий Фишера. Сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов с целью выявления ассоциации с эндометриозом и клинической картиной, а также соответствие выборок равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием метода χ2. Для определения риска заболевания у носителей определенных аллелей и генотипов вычислялось отношение шансов (OR – odds ratio) с 95% доверительным интервалом (95%C.I. – Confedence Interval). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ ассоциаций полиморфных вариантов С(-460)T (rs833061), С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А, С(-15161)Т (rs10902088) и T(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 и C(-344)T (rs1799998)гена CYP11B2 с риском развития генитального эндометриоза и хронического эндометрита Из исследованных полиморфизмов генов VEGF–A, MUC2, CYP11B2, полиморфизмы С(-460)T (rs833061), С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А, Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2, С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 были ассоциированы с риском развития генитального эндометриоза. Исследование полиморфных вариантов гена VEGF-A выявило взаимосвязь генотипа ТТ полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А с пониженным риском развития генитального эндометриоза (табл. 3). Также генотип ТТ и аллель Т полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А были ассоциированы с пониженным риском развития хронического эндометрита (табл. 4). Данный анализ позволяет предположить протективное влияние генотипа ТТ полиморфизма С(- 460)T (rs833061) гена VEGF-А на развитие эндометриоз-ассоциированного бесплодия. Аллель С и генотип СС полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А был ассоциирован с повышенным, а генотип ТТ и аллель Т полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А – с пониженным риском развития генитального эндометриоза (табл. 3). Однако, взаимосвязи полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А с хроническим эндометритом выявлено не было. В исследуемых группах была установлена ассоциация генотипа СС полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с пониженным риском развития генитального эндометриоза (табл. 3). Как основная секретируемая форма муцинов, MUC2 может воздействовать на окружающие ткани, влияя на фертильность, посредством нарушения секреции слизи и восприимчивости эндометрия. Также MUC2 может способствовать инвазии или пролиферации клеток эндометрия [Walther-António M.R.S. et al., 2016; Liu Y. et al., 2018]. Однако взаимосвязи полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с хроническим эндометритом установлено не было. Также нами установлена ассоциация генотипа СС полиморфизма С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 с пониженным риском развития эндометриоза (табл. 3), и напротив, ассоциация генотипа ТТ полиморфизма С(- 344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 с повышенным риском развития генитального эндометриоза (табл. 3) и хронического эндометрита (табл. 4). Таблица 3 - Распределение частот (%) аллелей и генотипов полиморфизмов генов VEGF –A, MUC2, CYP11B2 в исследуемых группах Полиморфизм Распределение частот генотипов и аллелейр, χ2 Группасравнения Пациентки с генитальным (n=79)эндометриозом (n=85) С(-460)TТТ – 31,6ТТ – 16,5р=0,023*, χ2=5,2 (rs833061)ТС – 46,8ТС – 50,6р=0,63, χ2=0,23 гена VEGF-АСС – 21,5СС – 32,9р=0,10, χ2=2,68 Т – 55,1Т – 41,8р=0,08, χ2=2,92 С – 44,9С – 58,2 С(+936)TСС – 40,6СС – 68,2p<0,001*, χ2=12,71 (rs3025039)СТ – 38,0СТ – 30,6р=0,32, χ2=0,99 гена VEGF-АТТ – 21,4ТТ – 1,2p<0,001*, χ2=17,34 С – 59,4Т – 83,5p<0,001*, χ2=10,4 Т – 40,6С – 16,5 С(-15161)TСС – 82,3СС – 69,4р=0,06, χ2=3,68 (rs10902088)СТ – 15,2СТ – 24,7р=0,13, χ2=2,31 гена MUC2ТТ – 2,5ТТ – 5,9р=0,29, χ2=1,13 С – 89,9С – 81,8р=0,036*, χ2=4,39 Т – 10,1Т – 18,2 С(-344)ТСС – 59,5СС – 21,2р=0,001, χ2=25,13 (rs1799998) СТ – 27,8СТ – 41,2р=0,07, χ2=3,21 гена CYP11B2 ТТ – 12,6ТТ – 37,6р=0,01, χ2=13,42 С – 73,4С – 41,8р=0,49, χ2=2,41 Т – 26,6Т – 58,2 Примечание: *- p <0,05 Таблица 4 - Распределение частот (%) аллелей и генотипов полиморфизмов генов VEGF –A, MUC2, CYP11B2 в исследуемых группах ПолиморфизмРаспределение частот генотипов и аллелейр, χ2 ПролиферативныйХронический эндометрий (n= 11)эндометрит (n= 74) С(-460)TТТ – 54,5ТТ – 10,8р=0,001*, χ2=13,31 (rs833061) генаТС – 36,4ТС – 52,7р=0,31, χ2=1,02 VEGF-АСС – 9,1СС – 36,5р=0,07, χ2=3,25 Т – 72,7Т – 37,2р=0,002, χ2=9,96 С – 27,3С – 62,8 С(-344)ТСС – 18,2СС – 21,6р=0,79, χ2=0,07 (rs1799998) гена СТ – 63,6СТ – 37,8р=0,10, χ2=2,63 CYP11B2ТТ – 18,2ТТ – 40,5р=0,15, χ2=2,04 С – 50С – 40,5р=0,40, χ2=0,70 Т – 50Т – 59,5 Примечание: p <0,05 Таким образом, проведенное исследование позволило выявить полиморфные варианты и мутации генов-предикторов эндометриоза и хронического эндометрита. Поиск молекулярно-генетических аспектов развития генитального эндометриоза является важным шагом на пути к разработке новых методов диагностики развития генитального эндометриоза - как изолировано, так и в сочетании с хроническим эндометритом, а также персонифицированных подходов к патогенетической терапии этого заболевания. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов С(-460)T (rs833061), С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А, С(-15161)Т (rs10902088) и T(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 и C(-344)T (rs1799998)гена CYP11B2 с риском развития клинических симптомов, связанных с эндометриозом и эндометриоза яичников Из исследованных полиморфизмов генов VEGF –A, MUC2, CYP11B2, полиморфизмы Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 и С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 были ассоциированы с риском развития клинических симптомов у пациенток с эндометриозом (табл. 5). Исследование полиморфных вариантов гена MUC2 выявило взаимосвязь генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с повышенным риском развития диспареунии у женщин с эндометриозом, а также генотипа ТС полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с пониженным риском развития диспареунии у женщин с эндометриозом. Установлена ассоциация генотипа СС и аллеля С полиморфизма С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 с повышенным риском развития дисхезии у женщин с эндометриозом (табл. 5). Болевой синдром при эндометриозе обусловлен воспалительной реакцией на имплантацию и развитие эндометриоидной гетеротопии. В свою очередь гельобразующие муцины, вероятнее всего, защищают эктопичный эндометрий от иммунной системы организма. Имплантируясь, эндометриоидная гетеротопия поражает нервные окончания, а также провоцирует образование новых мелких немиелинизированных волокон [Lang T.A. et al., 2014; Benner M. et al., 2018]. В процессе распространения очагов эндометриоза и вовлечения спаечным процессом близлежащих органов, пациентки, страдающие эндометриозом отмечают болевой синдром при коитусе и/или дефекации. Таблица 5 - Распределение частот (%) аллелей и генотипов полиморфизма С Т(- 12150)C (rs10794288) гена MUC2 в зависимости от наличия/отсутствия клинических симптомов в группе женщин с эндометриозом Распределение ПолиморфизмСимптомчастот генотипов и аллелей (%)р, χ2 НаличиеОтсутствие (n=34)(n=51) ТТ - 91,2ТТ – 68,6χ2=5,98, Р=0,015* Т(-12150)C ТС – 8,8ТС – 29,4χ2=5,18, Р=0,02* (rs10794288)Диспареуния СС – 0СС - 2,0χ2=0,67, Р=0,41 гена MUC2 Т – 95,6Т – 83,3 χ2=5,90, Р=0,015* С – 4,4С – 16,7 (n=14)(n=71) χ2=4,72, Р=0,03* CC – 42,9CC – 16,9 С(-344)Тχ2=0,21, Р=0,65 CT – 35,7CT – 42,2 (rs1799998) гена Дисхезияχ2=1,88, Р=0,17 TT – 21,4TT – 40,8 CYP11B2 С - 60,7С – 38 χ2=4,95, Р=0,026* Т - 39,3Т – 62 Примечание: *-p <0,05 При выраженном спаечном процессе формируется выраженная диспареуния за счет фиксации матки в ретропозиции с образованием рубцовых деформаций крестцово-маточных связок [Wu J. et al., 2017]. Гормональный дисбаланс необходим для формирования и прогрессирования эндометриоза, распространение которого способствует формирования воспаления и может влиять на моторику кишечника, вызывая дисхезию [Левкович М.А. и др., 2017]. Из исследованных полиморфизмов генов VEGF –A, MUC2, CYP11B2, полиморфизм С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А был ассоциирован с повышенным риском образования эндометриоза яичников у женщин с эндометриозом. Наличие генотипа СС и аллеля С полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А было ассоциировано с повышенным риском образования эндометриоза яичников у женщин с эндометриозом (табл. 6). Эндометриома – доброкачественное образование яичника, с тонкой капсулой и густым кровянистым содержимым. Капсула эндометриомы характеризуется отсутствиемжелез,содержимоевкистенакапливаетсяпутем менструальноподобной реакции эндометриоидной гетеротопии [Адамян Л.В. и др., 2018]. Имплантируясь в толщу яичника, эндометриоидная гетеротопия требует активного неоангиогенеза [Khan K.N. et al., 2010]. Таким образом, медиаторы ангиогенеза, в частности, VEGF, необходимы для роста и пролиферации участков пораженного эндометрия [Khan K.N. et al., 2010]. Таблица 6 - Распределение частот (%) аллелей и генотипов полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А в зависимости от наличия эндометриоза яичников Распределение Формачастот генотипов и аллелей (%) Полиморфизмр, χ2 эндометриоза НаличиеОтсутствие (n=73)(n=12) ТТ – 15,1ТТ – 25,0χ2=0,74, Р=0,39 С(-460)T ЭндометриозТС – 46,6ТС – 75,0χ2=3,33, Р=0,07 (rs833061) гена яичниковСС – 38,4СС - 0,0χ2=6,86, Р=0,009* VEGF-А Т – 38,4Т – 62,5 χ2=4,94, Р=0,026* С – 61,6С – 37,5 Примечание: *-p <0,05 Таким образом, проведенное исследование позволило выявить полиморфные варианты и мутации генов-предикторов эндометриом и формирования дисхезии и диспареунии при эндометриозе. На наш взгляд, более глубокое понимание особенностей течения этого заболевания является важным шагом на пути к разработке новых методов диагностики и персонифицированных подходов к его патогенетической терапии. Выявление взаимосвязи полиморфных вариантов С(-460)T (rs833061), С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-A с содержанием ангиогенного фактора VEGF-A в сыворотке крови Ткань эндометрия требует кровоснабжения для роста и пролиферации, которое обеспечивается посредством неоангиогенеза [Khan K.N. et al., 2010]. Ангиогенез, являясь важнейшим процессом формирования новых кровеносных сосудов, имеет важное значение не только для физиологических процессов, включая эмбриональное развитие и заживление ран, но и в патологических состояниях, включая хроническое воспаление, рак, болезни сердца и диабетическую ретинопатию и др. [Soriano D. et al., 2012; Cavalcanti V. et al., 2016]. Он играет важную роль в стимуляции активности опухоли, включая ее рост, метастазирование и инвазию [Patel B.G. et al., 2018; Sikora J. et al., 2018]. Многочисленные факторы, включая гипоксию, цитокины и окислительный стресс приводят в повышенной проницаемости сосудистого эндотелия и выходу из сосудистого русла VEGF-A, который действуя на эндотелий, приводит к ослаблению концевых клеток (tip-cells), которые секретируют протеолитические ферменты, разрушая матрикс. Диффундируя в межклеточное пространство, концевые клетки активно пролиферируют, обеспечивая формирование капилляра [Dmowski W.P. et al., 1995; Cavalcanti V. et al., 2016; Czyzyk A. et al., 2017; Адамян Л.В. и др., 2019]. Высокие концентрации VEGF постоянно обнаруживаются в перитонеальной жидкости при эндометриозе, и, по-видимому, его уровень коррелирует со стадией заболевания [Ushio-Fukai M. et al., 2008]. Как уже упоминалось ранее, нами была выявлена взаимосвязь генотипа ТТ полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А с пониженным риском развития генитального эндометриоза, а генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма гена неоангиогенеза VEGF-А С(-460)T (rs833061) с пониженным риском развития хронического эндометрита. Полиморфизм С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А находился в неравновесном сцеплении в группах пациенток с эндометриозом и женщин без эндометриоза, что не оказывало влияния на содержание фактора VEGF–A в сыворотке крови. Однако следует отметить, что среди пациенток с генитальным эндометриозом, уровень исследуемого цитокина по всем генотипам локуса С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А оказался значимо ниже такового, чем у женщин, вошедших в группу сравнения. Аллель С и генотип СС полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А был ассоциирован с повышенным, а генотип ТТ и аллель Т полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А с пониженным риском развития генитального эндометриоза. При анализе распределения частот генотипов полиморфного сайта С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А было выявлено, что в группе сравнения, при наличии гетерозиготного генотипа СТ, уровень цитокина VEGF – A был в 1,5 раза выше в сравнении с гомозиготными генотипами (рис. 1). Проведённый иммуноферментный анализ позволил выявить значимое снижение (в 2,5 раза) уровня ангиогенного цитокина VEGF-A в крови у всех пациенток, страдающих эндометриозом (независимо от степени тяжести заболевания), относительно значений группы женщин без эндометриоза. Однако при проведении сравнительного анализа содержания VEGF-A в зависимости от степени тяжести эндометриоза, только у пациенток с IV стадией эндометриоза было отмечено достоверное снижение исследуемого фактора в 4,5 раза по сравнению с аналогичными показателями группы сравнения (p <0,001) (табл. 7). Рисунок 1 - Содержание (пг/мл) VEGF-A в крови женщин группы сравнения с генотипами полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А Таблица 7 - Концентрация цитокинов VEGF-A в сыворотке крови (пг/мл) исследуемых групп (Me (Q1-Q3)) ПоказательГруппаПациентки с генитальным эндометриозом сравненияI-II ст. (n=9)III ст. (n=16) IV ст. (n=60) (n=79) 1234 VEGF-A,341,9371,0213,374,4 пг/мл(187,4-625,0)(234,4-486,2)(168,2-405,3)(56,7-89,8) Р-значение,P1-2=0,98P1-3=0,28P1-4<0,001* различия сP2-3=0,52P2-4<0,001* группамиP3-4<0,001* Примечание: *согласно критерию Манна-Уитни Роль факторов ангиогенеза в патогенезе пролиферативных заболеваний репродуктивной системы является неоспоримой [Dmowski W.P. et al., 1995]. Как было описано выше, наиболее значимым из известных факторов ангиогенеза является VEGF-A, способный не только инициировать митогенную активность и подавлять апоптоз эндотелиальных клеток, но и повышать перфузию сосудов (что изначально было определено как основной механизм его действия) [Patel B.G. et al., 2018; Sikora J. et al., 2018]. Местная гиперэстрогения сопровождается повышением уровня VEGF-A в эндометриальных клетках и усилением процессов неоангиогенеза вокруг эндометриоидной гетеротопии. А также у пациенток с эндометриозом отмечается более высокий уровень VEGF-A в перитонеальной жидкости [Soriano D. et al., 2012], который взаимосвязан со степенью тяжести эндометриоза. VEGF-A посредством неоангиогенеза способствует имплантации эктопического эндометрия [Johnston-MacAnanny E.B. et al., 2010, Soriano D. et al., 2012]. VEGF-A кодируется геном на хромосоме 6p12, который включает кодирующую область размером 14 тысяч пар нуклеотидов из восьми экзонов и демонстрирует альтернативный сплайсинг с образованием семейства белков. Путем активации и образования связей с мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF) VEGF-А влияет на формирование и пролиферацию новых кровеносных сосудов. В 3`- нетранслируемом регионе гена полиморфная позиция в положении С(+ 936)Т влияет на уровень VEGF-А в сыворотке крови [Khan K.N. et al., 2018]. По данным литературы, полиморфизм промоторного региона гена неоангиогенеза VEGF-А в позиции +405G/C (rs2010963) ассоциирован с повышением выработки VEGF-А стимулированными мононуклеарными фагоцитами крови [D’HoogheT.M. et al., 1995]. В ходе изучения зарубежной литературы однозначных сведений об ассоцииации полиморфизма G(-405)C гена VEGF c риском развития генитального эндометриоза обнаружено не было, напротив, сообщались как опровергающие [Kitaya K., 2011], так и подтверждающие взаимосвязь исследования [Soriano D. et al., 2012]. Поскольку генетические полиморфизмы часто различаются среди этнических групп, столь вариабельные результаты влияния SNP на развитие эндометриоза в разных популяциях могут быть ассоциированы с различным генетическим фоном. Проведенное исследование уточнило, что аллель С и генотип СС полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А повышают риск формирования эндометриоза у женщин славянской популяции Северо-Западного федерального округа. При наличии генотипа ТТ полиморфизма С(-460)T (rs833061), генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма С(+936)Т (rs3025039) гена VEGF-А, вероятность формирования эндометриоза, наоборот, снижается. Как уже упоминалось ранее, неоангиогнез создает благоприятные условия для выживания и пролиферации эктопического эндометрия, которая невозможна без усиленной продукции факторов ангиогенеза посредством гиперэстрогении [Park J.H. et al., 2016; Baker J.M. et al., 2018]. Выявленные полиморфные варианты гена неоангиогенеза VEGF-А (полиморфизм С(+936)T (rs3025039), полиморфизм С(- 460)T (rs833061)), ассоциированные с генитальным эндометриозом, вероятно, способствуют усилению образования фактора роста эндотелия сосудов, а также инициацииангиогенезаприэндометриозе.Способствуяимплантации эндометриоидной гетеротопии активный неоангиогенез предрасполагает развитию дисменореи [Sikora J. et al., 2018]. С другой стороны, статистически достоверное повышение частот генотипов полиморфизма гена фермента метаболизма андрогенов С(-344)Т (rs1799998) CYP11B2 у женщин с эндометриозом, вероятно, опосредует дисбаланс ароматации тестостерона, что способствует развитию гиперэстрогении, которая необходима для развития и прогрессирования генитального эндометриоза. В свою очередь, ассоциация полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с генитальным эндометриозом, объясняет защитные механизмы эктопичного эндометрия в отношении окружающей микросреды брюшной полости. Вышеописанные данные позволяют определить влияние молекулярно-генетических особенностей, обусловливающих иммунологические и гормональные нарушения, на развитие эндометриоза (рисунок 2). Эндометрит Ретроградные менстурации ЭктопическийГен CYP11B2 эндометрийTTC, CC C(-344)TC(-344)T (rs179998)(rs179998 ) ИммунологичеВоспаление в скиебрюшной полости нарушенияЭндокринные (дисбаланснарушения цитокинов)Адгезия(гиперэстро гения) ( Имплантация CCМетаплазия T(-12150)C (rs10794288)Пролиферация Активация ангиогенеза Ген MUC2(дисбаланс ангиогенных факторов) Гематогенная и лимфогенная диссеминация эндометрияT, TT C(+936)T (rs30250 39) TTC, CC C(-460)TC(+936)T (rs83306(rs302503 1)9) Ген VEGF-A ЭНДОМЕТРИОЗ Рисунок 2 – Схема, отражающая вклад полиморфных вариантов генов: неоангиогенеза VEGF-А, гельобразующего муцина MUC2 и фермента метаболизма Рисунокандрогенов 2 - Схема, отражающая вклад полиморфных CYP11B2в развитиевариантов генитальногоэндометриоза и генов неоангиогенеза особенностей VEGF-А,его течения. гельобразующегомуцина MUC2 и фермента метаболизма андрогенов Обозначения: CYP11B2в развитие генитального эндометриоза и особенности его течения повышенный Обозначения:рискразвития- поданным собственного эндометриоза - по данным собственного исследованияисследования - по данным литературы - - пониженныйриск пониженный риск развитияразвития- поповышенный -данным литературы риск развития эндометриоза эндометриозаэдометриоза ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучены аллельные варианты полиморфизмов генов неоангиогенеза (С(- 460)T (rs833061), С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А), гельобразующих муцинов (Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2), а также генов метаболизма андрогенов (С(- 344)Т (rs1799998) гена CYP11B2), способствующих развитию гиперэстрогении, оценен уровень фактора ангиогенеза (VEGF –A) в крови, а также его взаимосвязь со степенью тяжести генитального эндометриоза. В ходе работы установлен вклад полиморфных вариантов генов VEGF–A, MUC2, CYP11B2 в риск развития генитального эндометриоза. Полиморфизмы генов неоангиогенезаVEGF-АС(-460)T(rs833061),С(+936)T(rs3025039), гельобразующих муцинов MUC2 Т(-12150)C (rs10794288), ферментов метаболизма андрогенов CYP11B2 С(-344)Т (rs1799998) были ассоциированы с риском развития генитального эндометриоза. Установлена ассоциация генотипа СС и аллеля С полиморфизма гена неоангиогенеза VEGF-А С(+936)T (rs3025039) и генотипа ТТ полиморфизма гена ферментов метаболизма андрогенов CYP11B2 С(-344)Т (rs1799998) с повышенным риском развития генитального эндометриоза (рисунок 2). Установлена ассоциация генотипа ТТ полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А, генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А, генотипа СС полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2, генотипа СС полиморфизма С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 с пониженным риском развития генитального эндометриоза. Выявлена прямая связь генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с повышенным риском развития диспареунии у женщин с эндометриозом, а также генотипа ТС полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с пониженным риском развития диспареунии у женщин с эндометриозом. Установлена ассоциация генотипа СС и аллеля С полиморфизма С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 с повышенным риском развития дисхезии у женщин с эндометриозом. В ходе исследования выявлена ассоциация генотипа СС и аллеля С полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А с повышенным риском образования эндометриом у женщин с эндометриозом. При анализе распределения частот генотипов полиморфного сайта С(+936)T гена VEGF-А было выявлено, что в группе сравнения, при наличии гетерозиготного генотипа СТ, уровень цитокина VEGF-A был в 1,5 раза выше относительно гомозиготныхгенотипов.Проведённыйиммуноферментныйанализу обследованных женщин показал снижение (в 2,5 раза) уровня ангиогенного цитокина VEGF-A в сыворотке крови у пациенток, страдающих эндометриозом в сравнении с группой пациенток без эндометриоза. Очевиден вклад изученных полиморфизмов генов в патогенез эндометриоза, однако, по отдельности, аллельные варианты генов неоангиогенеза (С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А, генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма С(+936)T (rs3025039) гена VEGF-А), ферментов метаболизма андрогенов (С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2), гельобразующих муцинов (Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2), фактора ангиогенеза (VEGF-A) для оценки предрасположенности к эндометриозу, а также прогнозированию течения заболевания и его ответа на комбинированную терапию, недостаточны (рисунок 2). С целью большего понимания патогенетических особенностей течения эндометриоза и индивидуализации прогноза течения и эффективности терапии заболевания, необходим дополнительный анализ ассоциаций полиморфизмов вышеперечисленных генов и уровня фактора ангиогенеза. Резюмируя итоговые данные проведенного исследования, необходимо отметить, что они позволяют определить генетическое детерминирование синтеза факторов неоангиогенеза и стероидогенеза, а также модификацию гельобразующих муцинов, что вносит значимый вклад не только в патогенез эндометриоза, но и способствует развитию резистентности к заболеванию. ВЫВОДЫ 1.Частота встречаемости полиморфных вариантов генов ангиогенеза VEGF-А С(+936)T (rs3025039) (аллеля С и генотипов СС) и фермента метаболизма андрогенов CYP11B2 С(-344)Т (rs1799998) (генотипов ТТ) у женщин с генитальным эндометриозом выше, чем у женщин без эндометриоза. 2.Полиморфные варианты генов VEGF-А С(-460)Т (rs833061) (генотип ТТ), С(+936)Т (rs3025039) (аллель Т и генотип ТТ), MUC2 T(-12150)C (rs10794288) (генотип СС) и CYP11B2 С(-344)Т (rs1799998) (генотип СС) являются протективными в отношении развития генитального эндометриоза. 3.Установлена прямая связь генотипа ТТ и аллеля Т полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с повышенным риском развития диспареунии у женщин с эндометриозом, а также генотипа ТС полиморфизма Т(-12150)C (rs10794288) гена MUC2 с пониженным риском развития диспареунии у женщин с эндометриозом. Генотип СС и аллель С полиморфизма С(-344)Т (rs1799998) гена CYP11B2 предрасполагают к развитию дисхезии у женщин с эндометриозом. 4.Генотип СС и аллель С полиморфизма С(-460)T (rs833061) гена VEGF-А взаимосвязаны с образованием эндометриом у женщин с эндометриозом. 5.Выявлена положительная взаимосвязь генитального эндометриоза с хроническим эндометритом у пациенток Северо-Западного федерального округа России. 6.У пациенток с генитальным эндометриозом по всем генотипам локуса С(- 460)T (rs833061) гена VEGF-А уровень фактора VEGF-А в крови, чем у женщин без эндометриоза.