Синтез азоло5,1-с1,2,4триазинов как потенциальных противодиабетических препаратов : диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук : 1.4.3

Актуальность работы. Органический синтез является фундаментальной задачей, совмещающей в себе самостоятельную научную значимость и средства достижения практически полезных результатов. Он включает как задачу создания новых органических соединений с исследованием их свойств и превращений, так и задачу поиска практической применимости новых знаний, в том числе в области разработки новых лекарственных препаратов.
Сахарный диабет является одной из актуальнейших проблем современного здравоохранения. Так, по данным Международной Федерации Диабета, на 2019 год в мире насчитывалось 463 миллиона людей в возрасте от 20 до 79 лет, страдающих сахарным диабетом, а к 2045 году прогнозируется увеличение до 700 миллионов. При этом большинство случаев (более 90%) составляет сахарный диабет 2 типа. В Российской Федерации число случаев сахарного диабета оценивается в 8,3 млн (7,8% от взрослого населения).
Терапия сахарного диабета 2 типа направлена, в первую очередь, на снижение уровня сахара в крови, и включает применение множества препаратов, действующих на различные биологические мишени. В настоящее время применяются такие препараты как метформин, производные сульфонилмочевины, ингибиторы дипептидилпептидазы-4, агонисты рецепторов глюкагоноподобного пептида, ингибиторы α-глюкозидазы, тиазолидиндионы, ингибиторы натрий-глюкозного котранспортера 2 типа. Тем не менее, имеющаяся терапия не всегда позволяет достичь удовлетворительного контроля гликемии (содержания глюкозы в крови), а также необходимо учитывать побочные эффекты препаратов, такие как гипогликемия, увеличение массы тела и другие.
Значительной проблемой остаются осложнения сахарного диабета, развитие которых связано, прежде всего, с процессом неферментативного гликозилирования белков, или гликирования. В ходе гликирования, скорость которого резко увеличивается в условиях гипергликемии, карбонильные группы сахаров вступают в реакцию с аминогруппами белков, что приводит к структурной модификации белков и накоплению конечных продуктов гликирования (КПГ). Накопление КПГ в организме провоцирует многочисленные осложнения, такие как микрососудистые нарушения, нефро-, ретино-, нейропатии, значительно повышающие риск инвалидизации и преждевременной смертности. Более чем у половины больных не удается достичь целевого снижения уровня гликированного гемоглобина даже при удовлетворительном уровне сахара в крови. Селективное ингибирование реакции гликирования представляется перспективной
4
стратегией лечения сахарного диабета, однако на сегодняшний день не существует применяемых в клинической практике препаратов с антигликирующим механизмом действия. Для некоторых препаратов проводились клинические исследования (например, аминогуанидин и пиридоксамин), однако они были прекращены ввиду неэффективности либо нежелательных побочных действий. Это обуславливает актуальность поиска не только новых сахароснижающих препаратов, но и антигликирующих препаратов, непосредственно купирующих развитие осложнений сахарного диабета.
Степень разработанности темы исследования. Конденсированные азолоазины – это обширный класс гетероциклических производных, включающий, в том числе, производные природных пуриновых оснований. Среди азолоазинов было описано множество биологически активных соединений, действующих на те или иные биологические мишени. Многие из описанных азолоазинов обладают противодиабетическим действием: в клинической практике применяются такие сахароснижающие производные азолоазинов, как линаглиптин и анаглиптин, ингибиторы дипептидилпептидазы-4. Наличие азолоазинов, воздействующих и на другие противодиабетические мишени свидетельствует о перспективности поиска новых производных азолоазинов в качестве основы для разработки препаратов для лечения сахарного диабета. В частности, как биологически активные соединения хорошо известны азоло[5,1-c][1,2,4]триазины. Однако противодиабетическое действие азоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов исследовано в меньшей степени, и, таким образом, дальнейшие работы в этом направлении представляют интерес.
Целью работы является направленный синтез конденсированных азоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов, исследование их биологической активности, с целью выявления соединенией, обладающих противодиабетическим действием, и использование их в качестве основы для разработки новых перспективных лекарственных препаратов. Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
– разработка методов направленного синтеза 1,2,4-триазоло- и пиразоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов с использованием новых СН-активных синтонов;
– разработка методов структурной модификации 1,2,4-триазоло- и пиразоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов по функциональным заместителям, исходя из их реакционной способности;
– создание библиотеки соединений для первичных исследований биологической активности in vitro;
– проведение первичных исследований биологической активности in vitro в отношении следующих важных мишеней для лечения сахарного диабета: реакция

5
неферментативного гликозилирования белков; ферменты дипептидилпептидаза-4, α- глюкозидаза, гликогенфосфорилаза;
– выбор наиболее перспективного соединения для проведения доклинических исследований. Проведение доклинических исследований выбранного препарата- кандидата, включающих: выбор оптимального пути синтеза, оптимизация синтеза, определение показателей качества фармацевтической субстанции, определения сроков годности фармацевтической субстанции путем ускоренного и долгосрочного хранения.
Научная новизна и теоретическая значимость работы.
Разработаны методы синтеза производных 1,2,4-триазоло- и пиразоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов, содержащих в положении 3 нитро-, карбэтокси-, циано-, бензоильную, морфолин-4-карбонильную, пирролидин-1-карбонильную группы, основанные на взаимодействии солей азолил-5-диазония с СН-активными соединениями. Исследованы не описанные ранее реакции азосочетания с этил-3-морфолино-3-оксопропаноатом и 1,3- диморфолинопропан-1,3-дионом.
Рассмотрены подходы к синтезу новых производных 1,2,4-триазоло- и пиразоло[5,1-c][1,2,4]триазинов, основанные на превращениях функциональных заместителей. Исследованы закономерности гидролиза производных, содержащих этоксикарбонильные группы. Исходя из соответствующих нитрилов разработаны методы синтеза азоло[5,1-c][1,2,4]триазинов, содержащих в положении 3 амидоксимную и трет- бутилкарбомоильную группы, а также тиазолиновый цикл, основанные на реакциях по нитрильной группе. Впервые применена реакция Мицунобу для алкилирования 3- нитропиразоло[5,1-c][1,2,4]триазин-4-онов.
Исследована противодиабетическая активность in vitro производных азоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов, в отношении реакции неферментативного гликозилирования белков, ингибирования дипептидилпептидазы-4, гликогенфосфорилазы, α-глюкозидазы.
Практическая значимость работы.
Разработаны методы синтеза ряда недоступных ранее 1,2,4-триазоло- и пиразоло[5,1-c][1,2,4]триазинов, представляющих интерес в качестве биологически активных соединений. Предложен эффективный одностадийный метод получения натриевых солей 3-цианоазоло[5,1-c][1,2,4]триазин-4-онов из пиридиниевых солей.
Показано, что производные азоло[5,1-c][1,2,4]триазинов являются эффективными антигликирующими соединениями и могут быть использованы для разработки новых противодиабетических лекарственных средств, предназначенных для лечения осложнений сахарного диабета. На основании исследований биологической активности и возможности разработки технологии, для доклинических исследований в качестве антигликирующего

6
препарата выбран моногидрат натриевой соли 3,8-диэтоксикарбонилпиразоло[5,1-c] [1,2,4]триазин-4-она, (лабораторный шифр АВ-19). Проведены доклинические исследования препарата АВ-19, демонстрирующие возможность выведения данного препарата на клинические исследования.
Методология и методы исследования основаны на анализе литературных данных, направленном органическом синтезе запланированных соединений, анализе зависимости «структура-активность». Строение синтезированных соединений было подтверждено с использованием физических и физико-химических методов, таких как 1Н и 13С ЯМР спектроскопия (включая использование двумерных корреляционных спектров), элементный анализ, а также рентгеноструктурный анализ. Антигликирующую активность определяли in vitro на модели гликирования бычьего сывороточного альбумина глюкозой флуориметрическим методом. Активность в отношении ферментов определяли in vitro спектрофотометрическим методом.
Объекты исследования. Азоло[5,1-c][1,2,4]триазины, замещенные по положениям 1, 3, 7, 8.
Степень достоверности результатов обеспечивалась применением современных методов анализа с использованием сертифицированного оборудования, а также хорошей воспроизводимостью экспериментальных результатов.
Положения, выносимые на защиту:
– разработка методов направленного синтеза 3-R-азоло[5,1-c][1,2,4]триазинов с использованием реакции азосочетания с СН-активными соединениями;
– разработка методов структурной модификации производных азоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов по положениям 1, 3, 8;
– результаты in vitro исследований противодиабетической активности синтезированных соединений;
– результаты доклинических исследований натриевой соли 3,8- диэтоксикарбонилпиразоло[5,1-c][1,2,4]триазин-4-она, моногидрата (АВ-19) как потенциального антигликирующего средства.
Личный вклад автора состоял в подборе и анализе литературных данных, посвященных соединениям азолоазиновой структуры, обладающим противодиабетической активностью, а так же синтезу и свойствам азоло[5,1-c] [1,2,4]триазинов; планировании и проведении синтетических экспериментов, оптимизации методов синтеза, обработке и систематизации полученных результатов, написании и подготовке публикаций.

7
Апробация результатов. Результаты проведенных исследований были представлены в докладах на конференциях всероссийского и международного уровня, в том числе на Российской конференции с международным участием «Экспериментальная и компьютерная биомедицина», посвященной памяти чл.-корр РАН В.С. Мархасина (Екатеринбург, 2016); XX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 2016); Международной конференции «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (2017, 2020); V Всероссийской с международным участием конференции по органической химии (Владикавказ, 2018), 4-й Российской конференции с международным участием «МедХим-Россия 2019» (Екатеринбург, 2019).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в российских и международных рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ и входящих в международные базы данных и системы цитирования Scopus и Web of Science, 4 патента, а также 1 статья и 9 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Работа выполнена в соответствии с планом работ государственного контракта No 14.N08.11.0204, государственного задания Минобрнауки России No 4.6351.2017/8.9, проекта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации No FEUZ- 2020-0058 (Н687.42Б.223/20)
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 162 листах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, литературный обзор (глава 1), обсуждение результатов (глава 2), экспериментальная часть (глава 3), заключение, список цитируемой литературы. Диссертация содержит 25 схем, 56 рисунков и 38 таблиц. Библиографический список содержит 167 ссылок на литературные источники.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность академику Чупахину О.Н. и к.х.н. Котовской С.К. – за постоянное внимание к работе и ценные советы; к.х.н. Ельцову О.С. – за проведение спектроскопических исследований; группе элементного анализа под руководством к.х.н. Баженовой Л.Н. (Институт органического синтеза УРО РАН, г. Екатеринбург); к.х.н. Слепухину П.А. (Институт органического синтеза УРО РАН, г. Екатеринбург) – за проведение рентгеноструктурного анализа; к.х.н. Тумашову А.А. (Институт органического синтеза УРО РАН, г. Екатеринбург) – за проведение ВЭЖХ исследований; к.х.н. Первовой М.Г. (Институт органического синтеза УРО РАН, г. Екатеринбург) – за проведение ГЖХ исследований; Мехаеву А.В. (Институт органического синтеза УРО РАН, г. Екатеринбург) – за проведение термогравиметрических исследований; к.х.н. Коряковой О.В (Институт органического синтеза УРО РАН, г. Екатеринбург) – за запись ИК-спектров; к.х.н. Глазыриной Ю.А.

8
(Уральский Федеральный университет) – за проведение химического анализа препарата АВ-19; исследовательской группе под руководством академика РАН, д.м.н. Спасова А.А. (Волгоградский государственный медицинский университет) – за проведение испытаний in vitro на противодиабетическую активность и проведение доклинических исследований препарата АВ-19.