«Синтез и применение функциональных наноматериалов на основе плазмонных наночастиц для идентификации микроорганизмов и борьбы с бактериальной колонизацией»

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цель и основные задачи исследований, научная новизна и практическая
значимость полученных результатов.
В первой главе приведен обзор научной литературы в области спектроскопии
гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) биологических объектов с использованием плазмонных наночастиц золота и серебра, а также рассмотрены бактерицидные свойства, проявляемые наночастицами золота и серебра.
Во второй главе описаны методы синтеза наночастиц золота, серебра и наноматериалов на основе галлуазита. Также описаны инструментальные методы исследования наноматериалов: просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия, энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия, оптическая спектроскопия в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне, спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния. Отдельные разделы посвящены описанию культивирования микроорганизмов и опытов с ними.
В третьей главе представлены результаты исследований плазмонных наночастиц золота, синтезированных для спектроскопии ГКР и подложек для спектроскопии ГКР на основе полученных наночастиц. В ходе работ с помощью многостадийного цитратного метода синтеза были получены наночастиц золота (п18) диаметром 52,5 ± 4,8 нм (рисунок 1а,б). На основе наночастиц п18 были приготовлены подложки для снятия спектров ГКР путём агрегации наночастиц п18 различными коагулирующими агентами на алюминиевой фольге (рисунок 1в). Наиболее интенсивные спектры модельного аналита родамина 6Ж были зафиксированы при использовании NaCl, HCl и NaBr.
При исследовании подложек для ГКР был обнаружен эффект усиления сигнала КР при воздействии H2O2 на ГКР-подложку из агрегированных наночастиц золота. Было установлено, что обработка подложки ГКР, содержащей краситель родамин 6Ж или кристаллический фиолетовый (КФ) в концентрации 10-6 моль/л небольшим количеством перекиси водорода (концентрацией до 3 масс. %) вызывает увеличение интенсивности спектров ГКР красителей. В ходе исследования было установлено, что при воздействии H2O2 происходит окисление адсорбированного стабилизирующего агента (цитрата), что делает существующие «горячие точки» более доступными для адсорбции красителя, а также возможно образование
Рисунок 1 – а) ПЭМ-изображение наночастиц золота, использованных в экспериментах по спектроскопии ГКР. Масштаб 200 нм; б) ПЭМ-изображение высокого разрешения одиночной наночастицы золота. Масштаб 20 нм; с) СЭМ-изображение ГКР-подложки, приготовленной с наночастицами золота на алюминиевой фольге. Масштаб 5 мкм
дополнительных «горячих точек» в результате снижения коллоидной устойчивости системы.
Это позволяет получить существенное усиление спектров ГКР исследуемых аналитов, если использовать оптимальное количество перекиси водорода, не вызывающее окисление исследуемого аналита.
С помощью H2O2 удалось получить спектр ГКР кристаллического фиолетового (КФ) в концентрации 5·10-9 моль/л, в то время как без использования H2O2 на том же типе ГКР- подложки характерные пики КФ едва видны (рисунок 2а). В случае с родамином 6Ж, с помощью H2O2 удалось получить спектр ГКР родамина 6Ж в концентрации 5·10-9 моль/л, в то время как без использования H2O2 на том же типе ГКР-подложки удалось получить спектр ГКР родамина 6Ж в концентрации только 5·10-8 моль/л (рисунок 2б).
Рисунок 2 – (а) спектр КР кристаллического фиолетового (КФ) (1) и ГКР-спектры КФ при различных концентрациях: (2) 5×10-8 М, (3) 5×10-8 М с обработкой H2O2, (4) 5×10-9 М, (5) 5×10-9 М с обработкой H2O2; (б) спектр КР родамина 6Ж (1) и ГКР-спектры родамина 6Ж при различных концентрациях: (2) 5×10-8 М, (3) 5×10-8 М с обработкой H2O2, (4) 5×10-9 М, (5) 5×10-9 М с обработкой H2O2. Знаком * показан пик валентных колебаний O–O в H2O2
Дешевые и легко масштабируемые подложки для ГКР, приготовленные из наночастиц золота, могут быть использованы для рутинных аналитических задач. Одной из неотъемлемых проблем таких подложек является наличие окисленных восстановителей и стабилизирующих агентов, адсорбированных на поверхности наночастиц. В ходе исследований был обнаружен быстрый и простой метод усиления сигнала ГКР с помощью подложек на основе наночастиц золота, позволяющий детектировать аналиты в концентрациях на порядок ниже предела обнаружения в отсутствие такой обработки.
В четвёртой главе представлены результаты исследований микроорганизмов различных родов, а также биоплёнок, методом спектроскопии ГКР. В ходе исследования были получены спектры бактерий: Escherichia coli JF-238, Escherichia coli F, Klebsiella pneumoniae GT01-K1, Proteus sp. GT01-P1, Pseudomonas aeruginosa GT01-PA, Staphylococcus aureus GT01- SA; Dietzia maris 367-2; Dietzia maris 367-5; Dietzia maris 4-26, Anammox Candidatus ‘Jettenia ecosi’; Acinetobacter baumanii A01, Micrococcus luteus DSM20030, Bacillus subtilis B-501, Cutibacterium acnes RT5, Kytococcus sp, Bacillus subtilis B-501, Bacillus thuringiensis var.cereus DB6, Bacillus thuringiensis var.cereus B-82, Bacillus mycoides MU-1, Bacillus flexus HB 24(1)-5, Bacillus megatherium HP1.10K2, Bacillus pumilis HP1.9; дрожжей: Saccharomyces cerevisiae DO, Yarrowia lipolytica DSM8218; биоплёнок: Cutibacterium acnes RT5, Kytococcus sp. На примере
исследованных штаммов микроорганизмов, продемонстрирована возможность безмаркерного
обнаружения и идентификации бактерий при помощи спектроскопии ГКР. Этот подход основан на регистрации спектров ГКР бактерий, служащих «отпечатками пальцев», по которым в дальнейшем может быть идентифицирован биологический объект.
Для получения спектров ГКР, суспензию биологического образца наносили на предварительно высушенные на алюминиевой фольге наночастицы золота диаметром 52,5 ± 4,8 нм. Затем осуществляли регистрацию спектров ГКР с использованием лазера с длиной волны 785 нм и 633 нм. Обработка спектральных данных осуществлялась автоматически в среде Matlab (MathWorks Inc., USA) с помощью разработанного алгоритма.
На примере бактерии
Escherichia coli JF-238 рассмотрим
спектр ГКР, полученный с
использованием лазера с длиной волны
излучения 785 нм. Исходя из
литературных данных и собственных
исследований, значительное число
пиков в спектре биологических
объектов принадлежит колебаниям,
относящимся к
никотинамидадениндинуклеотиду
(НАД), флавинадениндинуклеотиду
(ФАД) и их составляющим. В
рассматриваемой бактерии мажорный пик на 725 см-1 соответствует валентным колебаниям кольца аденозина, смещаясь на несколько см-1 относительно спектров сравнения аденина и НАД (рисунок 3). К аденозину также относятся пики на 1350 см-1 и 1450 см-1. Они соответствуют валентным колебаниям связи N7-C5, C8-N7 (1350 см-1) и деформационным изгибным колебаниям связи С2H, валентным колебаниям N1C2 и N3C2. Линия на 660 см-1 соответствует колебаниям пуринового кольца гуанина. Линия на 960 см-1 относится к маятниковым деформационным колебаниям связи NH2 и валентным колебаниям N1C6. Пик никотинамида на 1040-1050 см-1, ввиду пространственных затруднений, слабо выражен в ГКР- спектре НАД и практически не различим в бактериальном спектре. Наличие в бактериальной культуре специфичных молекул может кардинально влиять на итоговый спектр. На рисунке 3 приведён спектр бактерии Escherichia coli F, в составе которой присутствует зелёный флуоресцентный белок (ЗФБ). Присутствие данного соединения в составе бактериального образца вносит в спектр дополнительные пики (в диапазоне 1100-1300 см-1, а также, вероятно, значительно смещает ранее идентифицированные пики для штамма Escherichia coli JF-238 (725 см-1 → 761 см-1, 1350 см-1 → 1410 см-1, 1450 см-1 → 1498 см-1).
В данной главе представлены результаты экспериментальных исследований регистрации ГКР-спектров микроорганизмов Cutibacterium acnes и Kytococcus sp., образующих биопленки. Для регистрации ГКР-спектров использовали интактную биомассу биопленок, биомассу после экстракции матрицы и матрицу биопленок. В спектрах ГКР изученных биопленок зафиксировано несколько мажорных пиков (рисунок 4). Спектры выделенных микроорганизмов в значительной степени совпадают со спектрами
Рисунок 3 – спектры аденина, НАД, Escherichia coli JF-238 и Escherichia coli F
соответствующих биопленок и существенно отличаются от спектров матрикса. При этом
матрикс биопленок также имеет характеристичные пики, обусловленные, вероятно, внеклеточными белками и нуклеиновыми кислотами матрикса. Стоит отметить, что различия в спектрах матрикса также представляются интересными для изучения, поскольку характеризация матрикса является сложной и необходимой задачей при диагностике биопленок и при исследованиях воздействия бактерицидных препаратов на биопленки.
Рисунок 4 – ГКР-спектры биопленок Cutibacterium acnes (а), Kytococcus sp. (б) Спектры биопленок исследованных микроорганизмов заметно отличаются, что позволяет их дифференцировать. В то же время идентификация пиков ГКР спектров не всегда представляется целесообразной, так как реальные образцы биопленок чаще всего представляют собой сообщества различных микроорганизмов. С такой точки зрения более перспективным представляется комплексный анализ спектральных данных в качестве интегральной характеристики биообъекта (по принципу отпечатка пальцев) в совокупности с анализом другими методами исследования, а также накоплением спектральных библиотек
микроорганизмов и органических матриксов.
Одним из эффективных способов преобразования больших объёмов данных и их
визуализации является метод главных компонент. Данный метод хорошо подходит для анализа спектральных данных биологических объектов, так как позволяет достоверно выявить различия между ГКР-спектрами объектов близкого состава. На примере бактерий E. coli и B. subtilis была исследована возможность применения метода главных компонент для преобразования и сравнения спектров бактериальных объектов. Спектры бактерий были успешно зарегистрированы, нормализованы и отфильтрованы от высокочастотных шумов. Нормализованные спектры ГКР бактерий представлены на рисунке 5. Поскольку их непосредственное сравнение затруднено, было произведено преобразование спектров в матричную форму путем автоматического распознавания пиков с последующим уменьшением размерности данных по методу главных компонент. Визуализация сходства и различия спектров после преобразования достигается путем отображения спектров в виде точек в трехмерном подпространстве трех первых главных компонент, так как они описывают различия между спектрами практически полностью (более, чем на 95%). На рисунке 6 показаны спектры бактерий после преобразования. Оси соответствуют главным компонентам, точки – спектрам, эллипсоиды – границам выборок по тройному среднеквадратичному отклонению (СКО) в предположении нормального распределения по всем главным компонентам. В результате сопоставления и интерпретации спектров ГКР исследованных

бактерий было установлено, что различия в спектрах ГКР, выявленные по методу главных
компонент, позволяют надежно различать бактерии разных родов.
Рисунок 5 – спектры ГКР бактерий при возбуждении лазером на длине волны 785 нм, нормализованные по наибольшему пику. 1 – Escherichia coli JF238, 2 – Bacillus subtilis B-501, 3 – Micrococcus luteus DSM20030, 4 – Acinetobacter baumanii A01
Рисунок 6 – отображение полученных ГКР-спектров бактерий в пространстве трех первых главных компонент. ГК1, ГК2, ГК3 – первые три главные компоненты, 1, 2, 3, 4 как на рисунке 5
В рамках продолжения работ по ГКР-спектроскопии биологических объектов
проводилось исследование клады Bacillus cereus. Род Bacillus содержит в себе как довольно
распространенные безвредные микроорганизмы, так и Bacillus anthracis, являющийся
возбудителем сибирской язвы. Распознавание микроорганизмов внутри рода является крайне
актуальной задачей, так как в настоящий момент не существует экспрессных методов,
позволяющих достоверно идентифицировать близкородственны микроорганизмы.
Классический метод 13S рРНК не позволяет решить эту задачу, поэтому для распознавания
близкородственных микроорганизмов требуется более сложный и трудозатратный анализ
генома.
Бактерии рода Bacillus включают ряд близкородственных видов, которые существенно
отличаются по свойствам. Спектры ГКР 7 исследованных бактерий, полученные с
использованием лазера с длиной волны 785 нм, крайне похожи, но имеют некоторые отличия
(рисунок 7а). В случае биологических объектов интенсивность пиков образца существенно
падает после 1200 см-1, что связано с особенностями работы детектора спектрометра, а также
с тем, что используемая подложка при работе на 785 нм лазере значительно больше усиливает
колебания в ближней области. Информации, полученной с использованием только 785 нм
лазера, не хватает для однозначной идентификации спектров ГКР бактерий рода Bacillus, даже
с использованием обработки спектральных данных по методу главных компонент.
Для того, чтобы получить более подробные спектральные данные в диапазоне сдвигов
от 1200 см-1 до 1800 см-1, были проведены исследования с использованием 633 нм лазера на
спектрометре HORIBA LabRam (рисунок 7б). Попарным объединением данных с 785 нм и 633
нм систем был получен общий массив данных, который также был подвергнут обработке по
методу главных компонент.
Рисунок 7 – спектры гигантского комбинационного рассеяния бактерий рода Bacillus: лазер 785 нм (а), лазер 633 нм (б)
В пятой главе представлены
результаты исследований неразрушающего
метода обнаружения бактериальной
колонизации, основанного на спектроскопии ГКР. Своевременное обнаружение бактериальной колонизации является актуальной задачей для медицины. В основе исследования лежит гипотеза о том, что рост микроорганизмов вблизи поверхности наночастиц золота с адсорбированным на них аналитом, вызовет изменения в количестве данного аналита. Ожидалось, что бактерии будут использовать адсорбированные молекулы в качестве питательного субстрата или разрушать их в процессе метаболизма. Изменения же в количестве аналита на поверхности наночастиц может быть измерено методом спектроскопии ГКР.
В ходе эксперимента (рисунок 9) на стальные пластины наносили дисперсию сферических наночастиц золота диаметром около 52,5 ± 4,8 нм, добавляли соединение репортер: кристаллический фиолетовый, аденин или тиамин. Далее наночастицы коагулировали раствором NaBr. Потом с полученной ГКР-активной подложки регистрировали спектры ГКР. Данные спектры в дальнейшем обозначаются как спектры до микробиологического опыта. Затем в присутствии данных пластин производили культивирование бактерий S. aureus и P. aeruginosa. После этого с пластин снова
Визуализация (рисунок 8)
обработанного массива данных
демонстрирует удовлетворительную
кластеризацию попарно объединённых
спектров. Группы точек, принадлежащих
одним образцам, не перекрываются и
имеют достаточные для различения
векторные расстояния. Это позволяет
сделать вывод о том, что регистрация
спектров ГКР бактерий с применением
разных лазеров обеспечивает наилучшее
разрешение метода идентификации
близкородственных видов бактерий.
Рисунок 8 – анализ по методу главных компонент объединенных данных по спектрам ГКР при возбуждении на длинах волн 633 нм и 785 нм
регистрировали спектры ГКР. В спектрах ГКР каждого аналита были выбраны определённые
пики и определены их высоты в спектрах до и после микробиологического опыта. Были обсчитаны данные трёх повторений опыта, всего для каждого аналита было исследовано 36 ГКР-активных зон. Затем высоты пиков после опыта сопоставлялись с высотами пиков до опыта (рисунок 10).
Рисунок 9 – Обзор эксперимента: подготовка ГКР-субстратов на пластинах (1-2); Получение спектров ГКР перед экспериментом (3); культивирование S. aureus и P. aeruginosa (4-5); Получение спектров ГКР после эксперимента (6); сравнение спектров ГКР до и после эксперимента (7)
Рисунок 10 – ГКР-спектры до (нижний) и после (верхний) микробиологического эксперимента и структурные формулы соединений с указанием колебаний выбранных пиков: кристаллический фиолетовый (а); тиамин (б); аденин (в)
В результате опыта было установлено, что грамположительные бактерии S. aureus не приводят к статистически значимой деструкции репортеров в сравнении с контрольным образцом, который был помещен в культуральную среду без бактерий. В то время как активность грамотрицательных бактерий P. aeruginosa можно отслеживать по ГКР-спектрам кристаллического фиолетового и аденина, но не тиамина (рисунок 11).
Рисунок 11 – Сравнение отношений высот пиков после и до биологического опыта. Кристаллический фиолетовый H 915 после/H 915 до (а);
Аденин H 737 после/H 739 до (б); Тиамин H 756 после/H 756 до (в). Планки погрешностей показывают стандартное отклонение. * – значимо отличается от контроля (Среда), P <0,05 по дисперсионному анализу вероятности (ANOVA) Рисунок 12 – Измерение ГКР-активности подложек после взаимодействия с P. aeruginosa: образец A/Среда сразу после микробиологического эксперимента (чёрный); тот же образец после добавления 3 мкл 10-4 аденина (серый) (а); образец A/ P. aeruginosa сразу после микробиологического эксперимента (чёрный); тот же образец после добавления 3 мкл 10-4 аденина Для подтверждения того, что падение сигнала репортера вызвано именно изменением содержания репортера на наночастицах золота, а не разрушением самой ГКР-подложки бактериями, был проведён дополнительный опыт (рисунок 12). На ГКР-зоны, ранее взаимодействовавшие с бактериями, наносили дополнительное количество репортера. Проведенный ГКР-анализ показал, что интенсивность зарегистрированных спектров существенно повышается. Это говорит о том, что произошло заполнение свободных «горячих точек», репортер с которых был удалён в результате частичной десорбции и взаимодействия с бактериями P. aeruginosa. Разница в увеличении интенсивности при добавлении дополнительных количеств аденина для образцов A/Среда и A/P.aeruginosa позволяет говорить о различном воздействии на образцы в ходе опыта. Существенная потеря интенсивности спектра аденина в образце A/P.aeruginosa после инкубирования вызвана именно снижением количества репортера на поверхности наночастиц золота, а не разрушением ГКР-подложки бактериями, так как при увеличении концентрации репортера уровень сигнала восстанавливается. Таким образом, был разработан неразрушающий метод обнаружения бактериальной колонизации, основанный на спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Продемонстрированный подход можно применять для экспресс-обнаружения бактериальной колонизации путем подбора соответствующих ГКР-репортеров. Подходящие ГКР-репортеры (красители или производные азотистых оснований) должны сильно адсорбироваться на поверхности наночастиц золота и быть подверженными биодеградации интересующими бактериями. Был получен ряд композитов галлуазита и наночастиц золота различных размеров и форм. Галлуазит был модифицирован (3-аминопропил)триэтоксиланом, в результате чего поверхность нанотрубок была покрыта аминогруппами, на которые адсорбировались наночастицы золота. Для нанесения на галлуазит были синтезированы сферические наночастицы золота диаметром 5,1 ± 0,6 нм (ТЦ5.1), 14,5 ± 1,4 нм (Ц14.5), 18,9 ± 1,6 нм (Ц18.9), В шестой главе представлены результаты исследований синтезированных композитов галлуазита с различными сферическими и стержневидными наночастицами золота. наностержни золота длиной 32,2 ± 5,7 нм (AuНС) и нанокластеры золота диаметром 2,7 ± 1,0 нм (AuНК). Стратегия нанесения предварительно синтезированных наночастиц обеспечивает превосходную однородность частиц золота: стандартное отклонение размера наночастиц ниже, чем у большинства известных композитов галлуазит-золото, полученных путем синтеза наночастиц in situ (рисунок 13). Рисунок 13 – Размер и стандартное отклонение образцов золотых наносфер (а) и золотых наностержней (б), нанесенных на поверхность галлуазита в этой работе и синтезированных in situ в литературе, известной на сегодняшний день. Работа 1: Philip A. et al., 2017, DOI: 10.1016/j.clay.2017.03.015; работа 2: Massaro M. et al., 2019, DOI: 10.1002/aoc.4665; работа 3: Fu X. et al., 2014, DOI: 10.1186/1556-276X-9-282; работа 4: et al., 2016, DOI: 10.1039/c6nj02103d; работа 5: 10.1021/acs.langmuir.7b02402; работа 6: 10.1021/acsami.8b17533 Rostamzadeh T. et al., 2017, DOI: Zhang J. et al., 2019 DOI: Zhang S. Размер и форма наночастиц определяют процесс их иммобилизации на амино- модифицированной поверхности галлуазита: мелкие и продолговатые частицы иммобилизуются лучше, в то время как более крупные квазисферические наночастицы золота имеют тенденцию к агломерации отдельно. Чтобы иммобилизовать наночастицы золота на нанотрубках, необходимо оптимизировать pH из-за взаимодействия между стабильными в дисперсии наночастицами и поверхностным зарядом модифицированного (3-аминопропил)триэтоксисиланом (АПТЭС) галлуазита. Оптимальный pH для иммобилизации может быть определен по наибольшему относительному увеличению оптической плотности на длине волны ППР дисперсии (рисунок 14). Модификация поверхности нанотрубок с помощью АПТЭС снижает отрицательный заряд внешней поверхности галлуазита, тем самым способствуя взаимодействию между галлуазитом и наночастицами. Повышение pH предотвращает агрегацию наночастиц золота, способствуя их осаждению на поверхности нанотрубок галлуазита. Повышение pH способствует диссоциации блокирующих карбоксильных групп цитрата, увеличивает дзета-потенциал и стабилизирует дисперсию наночастиц золота. Сочетание повышенной стабильности наночастиц и изменения дзета-потенциала галлуазита приводит к определённой зависимости степени покрытия галлуазита наночастицами от pH, показанной на рисунке 14д. Максимальная эффективность осаждения наночастиц на поверхность галлуазита может быть объяснена повышенным сродством аминогрупп АПТЭС к наночастицам золота в сочетании с все еще высокой склонностью наночастиц к осаждению на поверхность галлуазита. Рисунок 14 – УФ-видимые спектры нанотрубок галлуазита, покрытых наночастицами золота. (А) Гал-АПТЭС-Ц14.5, (Б) Гал-АПТЭС-Ц 18.9, (В) Гал-АПТЭС-ТЦ5.1; ПЭМ- изображение нанотрубок галлуазита, покрытых наночастицами золота (pH = 9,0, d = 14,5 нм) (столбик, 200 нм); на вставке — сегментированное изображение (фон – желтый, нанотрубки галлуазита – голубые, наночастицы золота – синие) (Г); оптическая плотность образца Ц14,5 в диапазоне 535-545 нм и загрузка поверхности галлуазита наночастицами золота в зависимости от pH смеси, оцененная по ПЭМ-изображениям Нанокластеры золота AuНК сохраняют свои флуоресцентные свойства при иммобилизации на галлуазите. Цитотоксичность полученного флуоресцентного материала была исследована на клетках A549. Композит Гал-АuНК хорошо поглощался клетками и не вызывал выраженного токсического эффекта и видимого повреждения мембраны в диапазоне концентраций 25-50 мкг/мл. Увеличение концентрации нанокомпозита до 100 мкг/мл приводило к массовой гибели клеток через апоптоз (рисунок 15). Такой механизм токсичности, зависящий от концентрации, позволяет использовать композит Гал-АuНК для визуализации галлуазита в биологических объектах, биоимиджинга и терапии рака. Флуоресценция материала может указывать на распределение галлуазита в клетках и органах как in vitro, так и in vivo. Композит, аналогичный описанному выше Гал-АПТЕС-ТЦ5.1, был исследован в качестве материала для фотонагрева. Эксперименты in vitro с одноклеточными организмами Paramecium caudatum выявили сильное подавление жизнеспособности клеток после воздействия лазерного излучения. Хотя средний эффект фотонагрева не превышал 3-4 °С, жизнеспособность клеток снижалась многократно, особенно при импульсном фотовозбуждении. Экспериментальные результаты объясняются пространственной и временно локализованной фотогипертермией вблизи наночастиц золота. Наблюдаемый фотонагрев композита галлуазита с наночастицами золота позволяет использовать данный наноматериал для антибактериальной терапии и таргетной терапии рака. В дисперсий отличие от наночастиц композиты с галлуазитом могут храниться либо в диспергированной, либо в высушенной твердой форме, сохраняя свои функциональные свойства без риска агрегации. Осаждение золотых наночастиц на внешней поверхности нанотрубок обеспечивает желаемые оптические свойства и оставляет возможность использовать люмен трубки для загрузки функциональных веществ, открывая путь для новых диагностических и терапевтических композитов, флуоресцентных маркеров и ГКР-подложек. Наночастицы серебра являются перспективным бактерицидным материалом. Ионы серебра губительны для большинства микроорганизмов, при этом механизм их воздействия специфичен, что позволяет комбинировать воздействие наночастиц серебра и антибиотиков, достигая при этом синергетического эффекта. Однако применение наночастиц серебра в виде дисперсии имеет недостатки. Наночастицы серебра в дисперсии неустойчивы и могут агрегировать под воздействием внешних факторов, что ограничивает их практическое применение. Используя практический опыт, полученный в ходе синтеза композитов галлуазита с наночастицами золота, были синтезированы композиты галлуазита и наночастиц серебра (композиты Гал-Ag, Рисунок 15 – Изображения клеток А549 инкубированных с композитом Гал-AuНК, полученные с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, (живые клетки - синие, мертвые - зеленые). Ферментативная активность (МТТ-тест) и жизнеспособность (LIVE/DEAD тест) клеток А549 в зависимости от концентрации Гал-AuНК золота, В седьмой главе представлены результаты исследований синтезированных композитов галлуазита с наночастицами серебра и фосфорноболибденовой кислотой. Рисунок 16 – ПЭМ фотографии образца галлуазита с наночастицами серебра Гал-Ag рисунок 16). Методология синтеза была схожа с синтезом композита галлуазита с наночастицами золота. Нанотрубки галлуазита модифицировались АПТЭС, после чего на модифицированный галлуазит осаждали предварительно синтезированные наночастицы серебра. Наночастицы серебра диаметром 20,9 ± 2,6 нм были получены восстановлением AgNO3 совместно танином и цитратом натрия. По данным рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии содержание серебра в образце составляет 6 масс. %. Для улучшения антибактериальной активности композитов галлуазита, было решено инкапсулировать внутрь фосфорномолибденовую кислоту H7[P(Mo2O7)6]·nH2O. Фосфорномолибденовая кислота (PMoК) способна понижать pH среды, в которую попадает и сохранять его на таком уровне длительное время. Низкий pH среды не убивает бактерии, но препятствует их размножению. Прежде чем синтезировать композит, сочетающий в себе наночастицы и серебра и PMoК (Гал-Ag-PMoК), был исследован процесс инкапсуляции PMoК в нанотрубки галлуазита. Композит Гал-PMoК состоял из фосфорномолибденовой кислоты, инкапсулированной во внутренний просвет нанотрубки. Поскольку фосфомолибдатные системы имеют тенденцию к гидролизу и, следовательно, нестабильны в водной среде, инкапсуляцию PMoК проводили из этанола. Композит, полученный инкапсуляцией PMoК из этанола, имел голубоватый цвет, который может объясняться образованием соединения смешанной валентности из-за восстановления одного из 12 атомов Mo до Mo+5. Чтобы предотвратить изменение структуры гетерополианиона во время процессов инкапсуляции и дальнейшего контакта полученного композита с водной средой, композит обрабатывали этанольным раствором хлорида кальция при pH < 1 для получения соли PMoК. Детальное исследование композитов проводилось с помощью ПЭМ, в том числе проводился энергодисперсионный анализ (ЭДС). На ПЭМ-изображении образца Гал-PMoК видно потемнение нанотрубок (рисунок 17). Есть основания полагать, что PMoК распределяется как в просвете внутри нанотрубки, так и в межслоевой области. ЭДС-анализ образцов доказывает, что PMoК находится в галлуазите, поскольку количество молибдена в области сканирования составляет 36 масс.% (рисунок 18а). Картирование ЭДС также подтверждает этот вывод. Область с высоким содержанием молибдена повторяет очертания нанотрубок галлуазита (рисунок 17). Рисунок 17 – исследования композита галлуазита с фосфорномолибденовой кислотой: анализ методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭРС) (А), ПЭМ- микрофотография исследованной области; ЭРС-сканирование по элементам (Б), поэлементное картирование (В), С-ПЭМ микрофотография сканируемой области (Г) После изучения режимов инкапсуляции PMoК был проведён синтез композита Гал-Ag-PMoК. ЭДС образцов подтверждает наличие наночастиц серебра и соединений, содержащих молибден (PMoК и/или Ag2MoO4) сканирование показывает, интенсивность сигнала наблюдается в области нанотрубок, но есть слабый сигнал во всей области сканирования. В случае ЭДС сканирования по серебру, основной сигнал приходится на наночастицы серебра, при этом также присутствует слабый сигнал по всей области сканирования с усилением в области нанотрубок. (рисунок 18). ЭДС по молибдену что самая высокая Рисунок 18 – исследования композита галлуазита с фосфорномолибденовой кислотой: анализ методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭРС): микрофотография образца CПЭМ (a), сканирование по Ag (б), сканирование по Al (в), сканирование по Si (г), сканирование по Mo (д), наложение Ag, Al, Si, Mo (е) Заключительным этапом исследований композитов был тест антибактериальной активности. Исследования проводили на бактериальных культурах Staphylococcus aureus (S.aureus), Pseudomonas aeruginosa (P.аeruginosa), Escherichia coli (E.coli). Исследовались композиты галлуазита, модицифированного АПТЭС (Гал-АПТЭС); композит галлуазита, AgНЧ, PMoК, полученный без обработки хлоридом кальция (Гал-Ag-PMoК-БО). Контрольным образцом был галлуазит, функционализированный АПТЭС. Для композита Гал- PMoК антибактериальной активности в исследованной области концентраций не обнаружено (рисунок 19), число колониеобразующих единиц (КОЕ) того же порядка, что и в контрольном образце Гал-АПТЭС. Это объясняется тем, что PMoК обладает антибактериальной активностью только в высоких концентрациях. Теперь рассмотрим антибактериальные свойства Гал-Ag. Высокая концентрация Гал-Ag 4 г/л позволяет снизить уровень КОЕ на четыре-пять порядков в зависимости от штамма по сравнению с контролем (Гал-АПТЭС). Опыты с композитом Гал-Ag-PMoК показали, что композит имеет на порядок большую антибактериальную активность по сравнению с другими исследованными образцами. Значения МИК для композита Гал-Ag-PMoК составляют 0,5 г/л для S. aureus и 0,25 г/л для P. аeruginosa и A. baumannii, соответственно, для сравнения: восстановленный оксид графена на основе композита Ag и PMoК, полученный в работе в [Moghayedi M. et al., 2020, DOI: 10.1016/j.mseb.2020.114709] имеет МИК 0,512 г/л по отношению к E.coli. Таким образом, полученный композит Гал-Ag-PMoК имеет высокую антибактериальную активность и может быть использован в качестве бактерицидного материала в различных областях. Рисунок 19 – изучение антибактериальной активности композитов галлуазита по отношению к культурам S. aureus (а), Ps. aeruginosa (б), Ac. baumanii (в) Заключение 1. Описан механизм эффекта усиления сигнала комбинационного рассеяния при воздействии окислителя (H2O2) на ГКР-подложку. Показана возможность использования эффекта усиления сигнала КР при добавлении H2O2 для снижения предела обнаружения аналитов на примере опытов с модельными красителями — кристаллическим фиолетовым и родамином 6Ж. С помощью изученного эффекта усиления сигнала комбинационного рассеяния при воздействии окислителя (H2O2) на ГКР-подложку удалось достичь уменьшения предела обнаружения модельных аналитов с 5·10-8 до 5·10-9 моль/л с использованием дешёвых и простых в изготовлении ГКР-подложек. 2. Разработан комплексный подход для получения и анализа спектров ГКР различных биологических объектов, в том числе, бактериальных биоплёнок. Для увеличения интенсивности ГКР спектров бактерий был успешно использован ранее изученный эффект усиления при помощи перекиси водорода. Решена задача различения семи близкородственных микроорганизмов клады Bacillus cereus благодаря применению метода главных компонент в совокупности с двумя спектральными системами с лазерами с длиной волны 633 нм и 785 нм, а также благодаря применению хромато-масс-спектрометрического анализа состава жирных кислот. 3. Разработан неразрушающий метод обнаружения бактериальной колонизации, основанный на спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Подложки ГКР были приготовлены путем коагуляции наночастиц золота, стабилизированных цитратом, и адсорбции веществ-репортеров. Рост P.aeruginosa был зарегистрирован с использованием ГКР-подложек с предварительно адсорбированным кристаллическим фиолетовым или аденином. Продемонстрированный подход можно применять для экспресс-обнаружения бактериальной колонизации путем подбора соответствующих ГКР-репортеров. 4. Установлены основные закономерности синтеза композитов из галлуазита и наночастиц золота. Продемонстрированная стратегия обеспечивает превосходную однородность частиц золота: стандартное отклонение размера наночастиц ниже, чем у большинства известных композитов галлуазит-золото, полученных путем синтеза наночастиц in situ. Полученные композиты галлуазита и наночастиц золота были применены для исследований гипертермии с использованием наночастиц золота. На примере микроорганизма Paramecium caudatum было установлено, что фотоиндуцированный нагрев наночастиц золота на поверхности галлуазита приводит к гибели испытуемых клеток. Флуоресцентные композиты галлуазита и наночастиц золота были успешно применены для визуализации клеток карциномы легкого человека A549. 5. Разработана методика синтеза бактерицидных композитов из галлуазита и наночастиц серебра с инкапсулированной фосфорномолибденовой кислотой. Композиты проявляют высокую бактерицидную активность по отношению к клинически релевантным штаммам 6. Дальнейшие исследования могут быть направлены на разработку более эффективных ГКР подложек и алгоритмов идентификации микроорганизмов. Отдельного внимания требуют исследования in vivo бактерицидных композитов на основе наночастиц серебра для борьбы с резистентными бактериальными инфекциями.