![](https://expert-mik.ru/wp-content/themes/24author/assets/img/work/work-img.png)
Синтез новых носителей лекарственных веществ на основе полисахаридов и фосфолипидов : диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук : 02.00.03
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ……………………………………………………………………………….. 4
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Методы поверхностной полимерной модификации липосомальных носителей как форм доставки лекарственных средств……………………………………. 9
1.1. Классические стелс-липосомы ……………………………………………………………………………………. 10 1.2. Модификация водорастворимыми синтетическими полимерами …………………………………. 13 1.3. Липосомы с полисахаридным покрытием …………………………………………………………………… 20
1.3.1. Физическое покрытие немодифицированными полисахаридами ……………………………. 22 1.3.2. Физическое покрытие модифицированными полисахаридами ……………………………….. 30 1.3.3. Химически сшитые полисахарид-липосомальные системы ……………………………………. 35 1.3.4. Сравнительная характеристика полисахарид-липосомальных систем………………….. 37
Заключение………………………………………………………………………………………………………………………. 39
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНЫХ ПОЛИСАХАРИД- ЛИПОСОМАЛЬНЫХ НОСИТЕЛЕЙ В КАЧЕСТВЕ НАСТРАИВАЕМЫХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ДОСТАВКИ …………………………………….. 40
2.1. Синтез липосомальных носителей………………………………………………………………………………. 43
2.1.1. Оптимизация состава липидной композиции и методики получения монодисперсных липосом ………………………………………………………………………………………………………………………… 43
2.1.2. Синтез вспомогательных липидных компонентов ………………………………………………… 49
2.1.3. Нагрузка липосомальных носителей модельным АФИ …………………………………………… 51 2.2. Синтез модифицированных полисахаридов ………………………………………………………………… 54 2.2.1. Синтез производных хитозана с помощью реакции Уги………………………………………… 54 2.2.2. Синтез амидных производных пектина ………………………………………………………………… 56
2.2.3. Синтез производных на основе полигалакутронилгидразида с помощью реакции Уги
……………………………………………………………………………………………………………………………………… 60 2.2.4. Нагрузка микрогелей модельным АФИ ………………………………………………………………….. 65 2.2.5. Синтез комбинаторных динамических библиотек на полисахаридном скелете …….. 68
2.3. Получение комплексных полисахарид-липосомальных систем и изучение их возможностей…………………………………………………………………………………………………………………… 76
2.3.1. Полисахарид-липосомальные системы на основе производных хитозана ………………. 76
2.3.2. Полисахарид –липосомальные системы на основе производных пектина ………………. 80 2.4. Изучение биологических свойств полученных носителей……………………………………………. 84 2.4.1. Цитотоксичность……………………………………………………………………………………………….. 84 2.4.2. Мукоадгезивные свойства носителей на основе полигалактуронилгидразида ………… 85 2.4.3. Синтез флуоресцентной метки для липидного бислоя…………………………………………… 90 2.4.4. Синтез флуоресцентной метки для полисахаридных покрытий ……………………………. 92
3
2.4.5. Биологическое распределение ……………………………………………………………………………….. 93 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ …………………………………………………………………………………… 98 3.1. Материалы…………………………………………………………………………………………………………………. 98 3.2. Оборудование…………………………………………………………………………………………………………….. 99 3.3. Общие методики ………………………………………………………………………………………………………. 100 3.3.1. Получение липосомальных суспензий …………………………………………………………………… 100 3.3.2. Синтез производных хитозана……………………………………………………………………………. 100 3.3.3. Синтез полигалактуронилгидразидов …………………………………………………………………. 101 3.3.4. Микрогели на основе полигалактуронилгидразида……………………………………………….. 101 3.3.5. Синтез ацилгидразонов и динамических комбинаторных библиотек …………………… 102 3.3.6. Восстановление ацилгидразонов и динамических комбинаторных библиотек ……… 102 3.3.7. Определение степени связывания молекулярной мишени……………………………………… 102 3.3.9. Мукоадгезивность ……………………………………………………………………………………………… 103 3.3.10. Нагрузка и высвобождение АФИ ………………………………………………………………………. 104 3.3.11. Цитотоксичность……………………………………………………………………………………………. 105 3.3.12. Биораспределение……………………………………………………………………………………………… 105 3.3.13. Статистический анализ…………………………………………………………………………………… 107 3.4. Характеристика полученных образцов ……………………………………………………………………… 107 ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………………………………………………. 138 СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ …………………………………………….. 139 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………………………………………… 143
Актуальность и степень разработанности темы исследования
Полисахариды и фосфолипидные структуры активно исследуются в качестве потенциальных носителей активных фармацевтических ингредиентов (АФИ), благодаря их природному сродству к биологическим тканям и способности регулировать фармакокинетические показатели препарата. Но их практическое использование имеет ряд ограничений, связанных с низкой стабильностью и недостаточной специфичностью взаимодействий природных молекул. Указанную проблему можно решить, используя возможности химической модификации, настройки поверхности и синтеза комплексных систем. Современные подходы по стабилизации лекарственных носителей гидрофильными синтетическими полимерами и модификации моноклональными антителами приводят к значительной себестоимости препарата и вероятности развития иммунного ответа, что отдаляет такие системы от клинического применения. Поэтому актуальность разработки новых способов модификации и нацеливания современных терапевтических систем, имеющих практический потенциал, непрерывно возрастает с ростом стандартов фармакотерапии. В решении обозначенной задачи инструменты органической химии приобретают новую значимость, позволяя науке приблизить реализацию идеального подхода к лечению заболеваний.
В настоящее время одно из основных направлений развития органической химии заключается в усложнении получаемых структур с использованием одностадийных стратегий. В этом контексте многокомпонентные реакции и методы динамической комбинаторной химии имеют огромный потенциал в синтезе новых биосовместимых биологически активных систем. Проведение таких реакций модификации в водной среде способствует самоорганизации процесса и сборке структур похожих на природные объекты, кроме того соответствует принципам «зеленой химии». Применение полимерных цепей в качестве основы для синтеза открывает еще более широкие возможности для получения носителей адресной доставки лекарственных средств. Реакция Уги позволяет синтезировать продукты с биоразрушаемыми пептидоподбными связями из неаминокислотных исходных реагентов, при этом ускорение данной реакции в водной среде делает выполнимой перекрестную сшивку водорастворимых полимеров с высокой эффективностью. Возможность использования обширного набора стартовых соединений многокомпонентной смеси обеспечивает значительную вариативность поверхности по сродству, амфифильности, заряду, которая важна для химической настройки поверхности под конкретные биологические цели.
5
Современная методология динамической комбинаторной химии представляет еще более комплексный подход к синтезу соединений, обладающих селективностью. Основу данного направления составляют самоорганизующиеся системы, образующиеся в результате обратимого связывания разнообразных строительных блоков под термодинамическим контролем. Такие системы обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционным химическим синтезом, среди них: одновременный синтез целой библиотеки химических соединений различной уровневой организации и отбор наиболее эффективной структуры, в зависимости от целей скрининга. Сложность получаемых систем часто служит препятствием для развития этого перспективного подхода, особенно для динамических комбинаторных библиотек на полимерном скелете, но это в десятки раз дешевле и доступнее биосинтеза антител.
В настоящем исследовании два развивающихся направления органической химии (многокомпонентные реакции и динамическая комбинаторная химия) использованы для решения современных задач медицинской химии и фармакологии, заключающихся в разработке стабильных, биосовместимых, обладающих тканевой селективностью терапевтических систем адресной доставки.
Цель работы
Целью данной работы является синтез комплексных терапевтических систем на основе полисахаридов и фосфолипидов, обладающих настраиваемыми физико-химическими, поверхностными и биологическими свойствами, с использованием вариаций многокомпонентной реакции Уги и подходов динамической комбинаторной химии.
Для реализации поставленной цели были сформулированы ключевые задачи исследования.
Получение монодисперсной липосомальной основы с размерами менее 200 нм:
– синтез стабилизирующих компонентов липосом, влияющих на заряд и
реологические свойства фосфолипидного бислоя;
– отработка оптимальных технологических параметров получения
липосомальных суспензий.
Синтез амидных производных полисахаридов:
– синтез полигалактуронилгидразидов;
– синтез положительно-заряженных производных пектина с четвертичной аммониевой группой.
6
Синтез полисахаридных микрогелей с помощью реакции Уги:
– синтез микрогелей на основе хитозана;
– синтез микрогелей на основе полигалактуронилгидразида.
Синтез полисахаридных динамических комбинаторных библиотек, обладающих повышенным сродством к низкомолекулярным биологическим мишеням:
– синтез индивидуальных полигалактуронилгидразонов;
– синтез комбинаторных динамических библиотек на полисахаридном скелете;
– переорганизация систем с внесением молекулы-мишени;
– стабилизация полученных рецепторных комплексов путем восстановления двойных связей.
Отработка методики нагрузки терапевтических систем АФИ
Синтез комплексных систем адресной доставки:
– поверхностная постмодификация липосомального носителя путем встраивания гидрофобных радикалов производных полисахарида;
– ковалентная сшивка полисахаридной микрокапсулы на поверхности липосомальных частиц.
Изучение биосовместимости и биологических свойств:
– изучение мукоадгезивных свойств;
– исследование цитотоксичности;
– анализ сродства к тканям в ходе биологического распределения.
Научная новизна
Разработан новый метод синтеза полисахаридных микрогелей с применением внутримолекулярной сшивки бифункционального полигалактуронилгидразида с помощью четырехкомпонентной реакции Уги.
Показано, что использование подхода динамической комбинаторной химии для синтеза динамических библиотек на основе полигалактуронилгидразонов позволяет получить полимеры, обладающие высокой селективностью связывания замещенных аминокислот.
Впервые осуществлена модификация липосомальных носителей производными хитозана и пектина, полученных с помощью реакции Уги.
Проведен синтез полимерных микрокапсул на поверхности сформированных липидных везикул, показана возможность получения композитных липосом с размерами 175-220 нм и низкой полидисперсностью.
7
Разработан метод получения липосом с хорошими мукоадгезивными свойствами с использованием производных полигалактуронилгидразида.
Теоретическая и практическая значимость
Разработан общий подход к синтезу субмикронных носителей лекарственных средств на основе фосфолипидов, пектина и хитозана с использованием методологии многокомпонентной реакции Уги.
В результате исследования предложена мукоадгезивная лекарственная форма для интраназальной доставки противовирусного препарата Триазавирин.
Предложена лекарственная форма для трансбуккальной доставки модельного локального анестетика, обладающая биосовместимостью и мукоадгезивностью.
Разработан новый метод стабилизации липосом, получены образцы липосом стабильные в течение 9 мес.
Методология и методы исследования: В процессе работы использовались стандартные методы органического синтеза. Выделение и очистка продуктов проводилась переосаждением, диализом и гель-фильтрацией. Для подтверждения структуры полученных в результате синтеза соединений использовались современные методы физико-химического анализа: ИК- и ЯМР- спектроскопии. Контроль протекания реакции и определение чистоты полученных веществ осуществляли с помощью качественных реакций на исходные продукты и тонкослойной хроматографией. Анализ физико-химических параметров высокомолекулярных производных проводили методами динамического рассеивания, pH-метрии и измерения динамической вязкости. Безопасность и сродство к тканям оценивалось рядом стандартизированных in vitro и in vivo методов, включающих МТТ-тест, оценку мукоадгезивных свойств и биораспределение.
Достоверность полученных результатов. Структура, чистота и физико-химические параметры были подтверждены с использованием современных валидированных методов анализа, испытания проводились не менее чем в трех параллелях с последующей статистической обработкой (p=0,05).
Личный вклад автора состоит в сборе, анализе и обобщении имеющихся литературных данных по способам химической модификации и адресного нацеливания лекарственных носителей на основе фосфолипидов и полисахаридов, изучении возможностей получения биосовместимых продуктов с помощью многокомпонентных реакций и подходов динамической комбинаторной химии, в формулировании научных гипотез и их проверки в результате проведения химических и биологических экспериментов, обработке, анализе и обобщению полученных спектральных данных и результатов исследований. Автором была выполнена
8
подготовка результатов научной работы к публикации и осуществлена презентация полученных данных на всероссийских и международных конференциях.
Положения и результаты, выносимые на защиту:
синтез и оптимизация липосомальных носителей;
синтез производных хитозана с помощью реакции Уги;
синтез амидных производных пектина;
синтез сшитых микрогелей на основе полигалактуронилгидразида;
синтез динамических комбинаторных библиотек на полисахаридном скелете; получение комплексных полисахарид-липосомальных систем;
нагрузка лекарственных форм модельными АФИ и высвобождение; изучение биологических свойств полученных носителей.
Публикации и апробация работы. Результаты работы опубликованы в 3 статьях в изданиях, рекомендуемых ВАК, в 3 тезисах докладов, входящих в международные базы цитирования, в 1 главе монографии и в 16 других сборниках тезисов докладов.
Основные результаты работы представлены в виде стендовых и устных докладов на 6-ой Международной конференции по наноматериалам «NANOCON 2014» (Брно, Чешская республика, 5-7 ноября 2014 г.), XXV Российской молодежной научной конференции, посвященной 95-летию основания Уральского университета (Екатеринбург, 22-24 апреля 2015 г.), III Международной конференции «Химия в Федеральных Университетах» (Екатеринбург, 1- 4 ноября 2015 г.), I Международной школе-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Биомедицина, материалы и технологии XXI века» (Казань, 25-28 ноября 2015 г.), Зимней конференции молодых ученых по органической химии «WSOC2016» (Красновидово, 16-21 января 2016 г.), XX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 26-30 сентября 2016 г.), Первом русско-немецком междисциплинарном симпозиуме «Nanoscale interdisciplinary research: physics, chemistry, biology, mathematics» (Москва, 25-27 апреля 2017 г.).
Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на 153 страницах и включает 20 схем, 17 таблиц, 47 рисунков. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части и списка литературы из 159 наименований.
По результатам выполненной исследовательской работы можно сделать следующие
выводы.
1. Синтезированы новые производные холина, стабилизирующие липидный бислой,
показано их влияние на размеры и повышение дзета-потенциала полученных липосом.
2. Отработана лабораторная технология формирования липосомальных суспензий
методом экструзии через неорганические мембраны.
3. Осуществлен синтез новых полисахаридных микрогелей на основе хитозана и
полигалактуронилгидразида с помощью реакция Уги, показано влияние исходных реагентов на
распределение частиц по размерам и плотность сшивки.
4. Показано, что полученные микрогели на основе полигалактуронилгидразида являются
удобными носителями для доставки модельного анестетика через слизистые оболочки.
5. Разработан новый способ синтеза динамических комбинаторных библиотек на основе
полигалактуронилгидразонов, обладающих высоким сродством к замещенным аминокислотам.
6. Продемонстрирована высокая эффективность нагрузки липосом гидрофильными
лекарственными веществами, на примере препарата Триазавирин, разработана его новая
лекарственная форма для интраназальной доставки.
7. Впервые предложена методология получения ковалентно сшитой полисахаридной
оболочки на поверхности липосомальных частиц с помощью реакции Уги.
8. Разработан новый метод получения флуоресцентных меток с помощью
трехкомпонентной реакции между изоцианидами, енаминами и изотиоцианатом родамина B.
9. Для разработанных систем лекарственной доставки (микрогелей и композитных
липосом) изучены мукоадгезивность, цитотоксичность и биораспределение. Показано, что
полученные носители относятся к нетоксичным и малотоксичным системам, обладают
повышенными мукоадгезивными свойствами в экспериментах in vitro и сродством к слизистым
тканям и мукоидным секретам in vivo.
Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в расширении используемых
полисахаридов для синтеза производных с помощью реакции Уги, изучении их физических и
химических закономерностей, синтезе динамических комбинаторных библиотек на основе
полигалактуронилгидразонов, обладающих селективностью к высокомолекулярным
биологическим мишеням. В дальнейшем возможно проведение доклинических испытаний
разработанных липосомальных лекарственных форм и разработка новых препаратов, используя
подходы и принципы настоящего исследования.
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
АФИ – активный фармацевтический ингредиент
БАВ – биологически активное вещество
ВБ – внутрибрюшинное введение
ВМ – внутримышечное введение
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ГК – гиалуроновая кислота
ГМ-ЭГЭЦ – гидрофобно-модифицированная этилгидроксиэтилцеллюлоза
ГЭЦ – гидроксиэтилцеллюлоза
ДКБ – динамическая комбинаторная библиотека
ДНК –дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖКТ – желудочно-кишечный тракт
ИК – инфракрасная спектроскопия
миРНК –малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота
МП – метилпальмитат
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
МРТ – магнитно-резонансная томография
МФС – мононуклеарная фагоцитарная система
ПТ – пальмитоиламид триметилэтанаммония йодид
ПЭГ – полиэтиленгликоль
РНК – рибонуклеиновая кислота
СТ – стеароиламид триметилэтанаммония йодид
ТПГС – D-α-токоферил-ПЭГ-1000-сукцинат
УФ – ультрафиолетовая спектроскопия
ХП – пальмитоилхолин хлорид (триметил(2-(пальмитоилокси)этил)аммония хлорид)
ХС – стеароилхолин хлорид (триметил(2-(стеароилокси)этил)аммония хлорид)
ЦПХ – цетилпиридиний хлорид
ЭФР – эпидермальный фактор роста
ЯМР – спектроскопия ядерного магнитного резонанса
AIBN – азо-бис-изобутиронитрил
Chol – холестерин
CTAB – цетилтриметиламмония бромид
DCC – 1,3-дициклогексилкарбодиимид
DCP – дицетилфосфат
DFT – теория функционала плотности
DIEA – N,N-диизопропилэтиламин
DLS – динамическое рассеяние света (фотонная корреляционная спектроскопия)
DOD – 7,10-дигидрокси-8(E)-октадекеновая кислота
DODA – диоктадециламин
DODAB – диоктадецилдиметиламмония бромид
DOPE – 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
DOPE-MCC – 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[4-(n-малеидометил)
циклогексан-карбоксамид]
DOTAP – N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид
DPPC – 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин
DPPE – 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
DPPG – 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфорилглицерол натриевая соль
DSPE – 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
EDC – 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид
EggPC – яичный фосфатидилхолин
ESI-MS – масс-спектрометрия с ионизацией электроспреем
HPMA – поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид
IgM – антитела класса M
MAA – метакриловая кислота
MTT – 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия бромид
Mw – молекулярная масса
NHS – N-гидроксисукцинимид
NIPAAm – N-изопропилакриламид
PAA – пропилакриловая кислота
pAAs – полиаминокислоты
PAcM – поли-N-(акрилоил)морфолин
PBS – фосфатно-солевой буфер
PC – фосфатидилхолин
PDI – индекс полидисперсности
PDMA – поли-N,N-(диметил)акриламид
PE – 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
pNIPAAm – поли-N-(изопропил)акриламид
POPC – 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин
POPE – 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
POX – поли-2-оксазолин
PVP – поливинилпирролидон
SA – стеариламин
SoyPC – соевый фосфатидилхолин
TEA – триэтиламин
THF – тетрагидрофуран
α-Toc – α-токоферола ацетат (3,4-дигидро-2,5,7,8-тетраметил-2-(4,8,12-
триметилтридецил)-2Н-1-бензопиран-6-ола ацетат)
Клеточные линии:
Caco-2 – перевиваемая линия гетерогенных эпителиальных клеток колоректальной
аденокарциномы человека
Сolo-320 – перевиваемая линия клеток колоректальной аденокарциномы человека
HCT116 – перевиваемая линия клеток колоректальной карциномы человека
HeLa – перевиваемая линия клеток из раковой опухоли шейки матки пациентки по имени
Генриетта Лакс
HT-29 – перевиваемая линия клеток аденокарциномы ректосигмоидного отдела толстой
кишки человека
HT29-MTX – перевиваемая линия клеток аденокарциномы ректосигмоидного отдела
толстой кишки человека
MCF-7/ADR – перевиваемая линия клеток рака молочной железы человека с
множественной лекарственной устойчивостью
MDA-MB435 – перевиваемая линия клеток рака молочной железы человека
MG63 – перевиваемая линия клеток остеосаркомы человека
TR146 – перевиваемая линия клеток плоскоклеточной карциномы человека
![](https://expert-mik.ru/wp-content/themes/24author/assets/img/signup-document.png)
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!