Синтез редких ω-3 полиненасыщенных жирных кислот и изучение их биохимических свойств

Исследования последних десятилетий показали, что модуляция уровня биосинтеза про- и противовоспалительных метаболитов ПНЖК in vivo, объединенных общим названием оксилипины, является многообещающей стратегией при лечении и профилактике ряда воспалительных патологий. Так, была показана терапевтическая эффективность блокировки метаболизма АА (арахидоновой кислоты) при использовании липидного экстракта зеленогубой мидии из Новой Зеландии (Perna canaliculus), известного под коммерческим названием «Липринол». В отличие от рыбьего жира, богатого преимущественно -3 высшими жирными кислотами, такими как EPA и DHA, «Липринол» содержит SDA (стеаридоновую, (6Z,9Z,12Z,15Z)-октадекатетраеновую) и -3АА (-3 арахидоновую, (8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозатетраеновую) кислоты, на долю которых приходится 12-15% от общего количества ПНЖК состава С18-С22, содержащих не менее 4-х двойных связей. Фактически, эти редкие -3 кислоты состава С18-С20 могут являться предшественниками потенциальных «анти-метаболитов» по отношению к производным арахидоновой кислоты, либо могут действовать совместно с другими компонентами, образуя иммуномодулирующую комбинацию природных соединений. Для получения более глубокого представления о механизмах действия -3АА (8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозатетраеновой (32) и SDA (6Z,9Z,12Z,15Z)-октадекатетраеновой (33) кислот и проведения биохимических исследований была предложена и оптимизирована схема их препаративного синтеза и исследованы свойства полученных соединений в различных ферментативных моделях окисления млекопитающих – ALOX и COX.
1. Оптимизация технологии получения ПНЖК с использованием модельного ряда Z,Z-диеновых кислот с различной длиной углеводородной цепи
Основной структурной особенностью природных полиненасыщенных кислот и их аналогов является наличие определенного сочетания метиленразделенных двойных связей с Z-конфигурацией. В синтезе таких соединений часто применяется, хорошо себя зарекомендовавший и используемый рядом научных школ, полиацетиленовый подход. Ацетиленовая связь служит удобным предшественником Z-двойной связи, а методы, лежащие в основе построения полиацетиленовой цепи (кросс-сочетание пропаргильных или аллильных галогенидов с терминальными ацетиленовыми соединениями), позволяют создать систему двойных связей с одновременным введением функциональных группировок (Схема 1).
Лимитирующей стадией в синтезе ПНЖК, содержащих более 2-х двойных связей, является селективное каталитическое восстановление ацетиленового предшественника с образованием Z-полиена, содержащего систему метиленразделенных двойных связей.
Наиболее широко распространѐнным катализатором, используемым для этого процесса, является катализатор Линдлара, приводящий преимущественно к образованию Z-изомеров (>95%).
Схема 1
Трудности каталитического восстановления метилен разделенных полиинов заключаются главным образом в неспецифической полимеризации полиацетиленовых предшественников, что снижает селективность катализатора, а также приводит к его частичной или даже полной инактивации. Анализ литературы показывает, что использование более доступного катализатора Брауна (P-2Ni) при восстановлении полиацетиленовых систем может приводить к сопоставимым с катализатором Линдлара результатам.
Оптимизация условий синтеза целевых ПНЖК, включая стадию каталитического гидрирования ацетиленовых предшественников, проводилась с использованием предложенного нами модельного ряда жирных кислот с длиной цепи С14, С16 и С17, содержащих четное и нечетное число углеродных атомов: (5Z,8Z)-тетрадекадиеновой 16, (7Z,10Z)-гексадекадиеновой 17 и (11Z,14Z)-гептадекадиеновой 18 кислот (Схема 2).
Исходными компонентами в синтезе диеновых кислот 16-18 являлись метиловые эфиры кислот с терминальной тройной связью и длиной углеводородного скелета С6, С8, С12 7-9 и тозилаты пропаргильного типа 4, 6. Тозилат 6 получали из 2-октиновой кислоты 1 через соответствующий ацетиленовый спирт 5. Тозилат 4 был получен из пропаргильного спирта 3. Сочетание тозилата 6 с метиловыми эфирами кислот с терминальной тройной связью состава С6 7 и С8 8, а также тозилата 4 с эфиром С12 9 приводило к образованию ацетиленовых предшественников 10-12, соответственно.
Схема 2
Условия: (а) Et2O, CH2N2; (b) LiAlH4, THF, -5oC; (c) TsCl, KOH, K2CO3; (d) CuI, NaI, K2CO3, DMF, 20oC; (e) H2, P-2 Ni, EtOH или кат. Линдлара и ОФ-ВЭЖХ; (f) LiOH, MeOH-H2O, 20oC.
В рамках проведения поисковых работ был проведен сравнительный анализ условий протекания и выходов целевых соединений в реакции каталитического гидрирования метиловых эфиров 10-12, используемых в качестве модельных соединений, с использованием катализаторов Линдлара и Брауна. Массовую долю катализатора по отношению к субстрату варьировали в диапазоне 100 – 300 массовых %. Наилучшие результаты гидрирования были получены при массовой доле катализатора Линдлара 150% и при проведении реакции в бензоле; для катализатора Брауна – 300 массовых % в этаноле. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ОФ-ВЭЖХ (Рисунок 1).
Анализ продуктов гидрирования показал, что при использовании катализаторов Линдлара и Брауна суммарные доли побочных продуктов так называемого «недогидрирования» (полупродуктов с одной тройной связью) I и «исчерпывающего перегидрирования» (полного восстановления одной тройной связи) III по отношению к доле целевого продукта II оказались сопоставимы (Рисунок 1). При использовании катализатора Линдлара было обнаружено, что конечная смесь содержала 72,0% целевого соединения, при этом на доли продуктов исчерпывающего восстановления одной тройной связи приходилось 26,3%. Напротив, в случае катализатора Брауна содержание целевого соединения составляло 74,2%, при этом доля продукта исчерпывающего восстановления одной тройной связи
понижалась, в сравнении с катализатором Линдлара, до 14,7% (Рисунок 1). Аналогичные данные были получены для соединений 14 и 15.
Рисунок 1. Сравнительный анализ продуктов реакции, полученных при каталитическом гидрировании эфира (13) на катализаторе Брауна (верхняя хроматограмма) и катализаторе Линдлара (нижняя хроматограмма). Хроматограммы реакционной смеси после очистки с использованием колоночной нормально-фазовой флеш-хроматографии.
Наряду с каталитическим гидрированием, еще одной проблемой, является выделение индивидуальных образцов ПНЖК методом препаративной ВЭЖХ, которая связана с потерями целевых соединений за счет их неспецифической сорбции на стационарной фазе. В данной работе был использован ряд коммерчески доступных стационарных фаз: Europrep С18 (Knauer), LiChrosorb С18 (Merck), Luna С18(2) (Phenomenex) (Таблица 1). Выбор сорбентов был обусловлен их основными характеристиками и стоимостью. Так, стационарная фаза колонок Europrep С18 содержит полностью открытые силанольные группы, LiChrosorb С18 – частично связаные силанольные группы, а в Luna С18(2) – свободные силанольные группы, модифицированные триметилсиланом.
Таблица 1. Зависимость сорбции соединения 15 от стационарной фазы колонки.
LiChrosorb С18 35
Наименьшие потери при выделении целевого соединения 15 были обнаружены в случае использования стационарной фазы Luna С18(2). Таким образом, для очистки и выделения препаративных количеств ПНЖК наиболее подходящими являются стационарные
Стационарная обращенная фаза
Неспецифическая сорбция (массовый %)
Europrep С18
Luna С18(2)
10

фазы с закрытыми силанольными группами. Аналогичные данные были также получены для соединений 13 и 14. Подобная специфика, возможно, обусловлена амфифильным характером молекул 13-15 и/или изменением их пространственной конфигурации в процессе разделения. Препаративное выделение метиловых эфиров 13-15 на обращенной фазе позволило получить целевые соединения с чистотой не менее 98%. По данным 1H-ЯМР-спектроскопии было установлено, что структуры соединений 13-15, полученных каталитическим гидрированием с применением обоих катализаторов, полностью идентичны друг другу (Рисунок 2А).
Рисунок 2. ЯМР-спектры соединения 13. (А)1Н-ЯМР спектры образцов соединения 13, полученных с использованием катализатора Линдлара (верхняя панель) и катализатора Брауна (нижняя панель). (Б) Результаты двумерной J-спектроскопии с селективной рефокусировкой.
Так, исследование образцов 13-15 с применением двумерной J-спектроскопии с селективной рефокусировкой показало, что константа спин-спинового взаимодействия протонов двойных связей в обоих образцах составляет 10,7 Гц и 10,8 Гц (Рисунок 2Б), что соответствует Z-конфигурации системы двойных связей. Таким образом, нами была показана возможность использования катализатора Брауна в реакции каталитического стерео- и региоселективного восстановления производных -3 и -6 полииновых кислот и оптимизированы условия его проведения, а также условия выделения целевых соединений.
2. Редкие омега-3 аналоги ПНЖК и их роль в процессах окислительного метаболизма арахидоновой кислоты под действием липоксигеназ и циклоооксигеназ
2.1. Синтез (8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозатетраеновой и (6Z,9Z,12Z,15Z)-октадека- тетраеновой кислот. Для получения более глубокого представления о механизмах действия SDA и -3АА и проведения биохимических исследований была предложена и отработана схема препаративного синтеза -3АА [(8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозатетраеновой] (32) и SDA [(6Z,9Z,12Z,15Z)-октадекатетраеновой] (33) кислот и исследованы их свойства в различных ферментативных моделях окисления млекопитающих.
11

В основе синтеза -3АА [(8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозатетраеновой] (32) и SDA [(6Z,9Z,12Z,15Z)- октадекатетраеновой] (33) кислот лежит использование впервые полученных тетраацетиленовых предшественников 28 и 29 в качестве промежуточных соединений. Триацетиленовый бромид 26 был получен из соответствующего спирта 24, который, в свою очередь синтезировали кросс-сочетанием коммерчески доступных ацетиленов, содержащих тройную связь в терминальном положении 20 и 22, с пропаргильными галогенидами 19 и 23, соответственно (Схема 3).
Схема 3
Условия: (а) CuI, NaI, K2CO3, DMF, 20oC; (b) CBr4, PPh3, CH2Cl2; (c) H2, P-2 Ni, EtOH или H2, кат. Линдлара и ОФ-ВЭЖХ; (d) LiOH, MeOH-H2O, 20oC.
Метиловые эфиры 8-нониновой (25) и 6-гептиновой (27) кислот использовались в качестве ацетиленовой компоненты на стадиях синтеза. Анализ продуктов стереоселективного гидрирования эфиров 28 и 29 на катализаторе Линдлара в бензоле в присутствии хинолина (соотношение субстрат/катализатор 1:1.5, по массе) или катализаторе Брауна в этаноле в присутствии триэтиламина (соотношение субстрат/катализатор 1:3, по
массе) в условиях, отработанных на примере модельных соединений 13-15, показал образование целевых соединений, а последующая очистка методом ОФ-ВЭЖХ на колонке Luna С18(2) приводила к образованию эфиров -3 кислот с выходами 70% / 72% для соединения 30 и 72% / 74% для соединения 31 при использовании катализаторов Линдлара / Брауна, соответственно.
Эфиры 30 и 31 подвергали последующему омылению с образованием кислот 32 и 33. Структура полученных соединений была подтверждена данными ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.
2.2. Биологическое действие редких ПНЖК в различных моделях окислительного метаболизма.
2.2.1Модель ALOX5. EPA[(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозапентаеновая кислота]окисляется АLOX5 человека с образованием 5-гидро(перокси)производного в три раза более эффективно, чем АА. Под действием АLOX5 первичный продукт окисления АА, 5-Н(р)ЕТЕ, далее метаболизируется в LTA4 (Рисунок 3). Напротив, подобно ALA и GLA, -3AA [(8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозатетраеновая кислота] (32) и SDA [(6Z,9Z,12Z,15Z)- октадекатетраеновая кислота] (33) не являются субстратами ALOX5 человека, так как у них тоже отсутствует двойная связь в положении C4-C5 (Рисунок 3).
Рисунок 3. Образование сопряженных триенов при инкубации субстрата с рекомбинантным препаратом ALOX5 человека. -3 AA (A) и АА (Б). Присутствие в реакционной смеси продуктов неферментативного гидролиза LTА4 (5S,6R/S- и 5S,12R/S-DiHETE) в Е- конфигурации системы двойных связей (maх=269 нм), образующихся при выделении продуктов ферментативной реакции свидетельствует о LTА4-синтазной активности фермента в реакции с АА.
13

Скорость поглощения кислорода в реакции ALOX5 с АА уменьшалась в присутствии тестируемых соединений концентрационно-зависимым образом в диапазоне концентраций 1- 100 мкг/мл (Рисунок 4). Кислоты 32 и 33 обладали сопоставимым ингибирующим действием (Таблица 2), при этом для соединения 33 был выявлен «смешанный» механизм ингибирования ALOX5 с Ki 79,2±1,2 (R2=0,98) (Рисунок 4Б, правый график). Ингибирование ALOX5 под действием -3AA (32) не описывалось уравнением Михаэлиса-Ментен (Таблица 2).
Рисунок 4. Активность кислот (32) и (33) в ингибировании реакции окисления АА под действием АLOX5. (А) Концентрационно-зависимые кривые ингибирования АLOX5 под действием -3 AA. (Б) Концентрационно-зависимые кривые ингибирования АLOX5 под действием SDA (левый график) и график Лайнуивера – Берка, показывающий зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации ингибитора (правый график).
Далее было исследовано влияние -3AA (32) и SDA (33) на образование продуктов окисления АА  5-HpETE и LTВ4 под действием рекомбинантной ALOX5 человека. В качестве стандарта сравнения была использована ЕРА, являющаяся хорошим субстратом ALOX5. Образование 5-HpETE подавлялось в присутствии кислот 32, 33 и ЕРА в диапазоне концентраций 1-100 мкг/мл и не зависело от структуры кислот. Напротив, EPA обладала несколько более ярко выраженным супрессивным действием на биосинтез LTВ4, чем -3AA и SDA.
Таким образом, -3AA (32) и SDA (33) по способности конкурировать с природным субстратом  АА оказались несколько менее эффективными, чем ЕРА.
2.2.2. Модель ALOX15. С точки зрения эволюционной гипотезы реакционной специфичности ALOX15 млекопитающих можно разделить на две различные группы ортологов: ALOX15 (человек и высшие приматы), окисляющих АА по 15-положению (-6), и ALOX15 нижестоящих по эволюционному развитию млекопитающих (гиббон, собака, кенгуровые прыгуны, опоссум и др.), окисляющих АА по 12-положению (-9). Так, аминокислотные последовательности ALOX15 человека и гориллы идентичны на 92,9%.
Напротив, у эволюционно нижестоящих млекопитающих процент идентичности аминокислотной последовательности по сравнению с ALOX15 человека значительно ниже. ALOX15 ретикулоцитов кролика входит в первую группу и является единственным исключением с точки зрения эволюционной теории позиционной специфичности. Проведенные в рамках данной работы исследования позиционной специфичности с различными ферментными препаратами показали, что это правило сохраняется для большинства -3 и -6 ПНЖК состава С20-С22, тогда как SDA (33) (C18) является исключением и окисляется ALOX15 по -6 положению (Таблица 3).
Таблица 3. Продукты окисления ПНЖК под действием ортологов ALOX15
Модель окисления ALOX15 млекопитающих
Субстрат
Масс-спектры бис(О-TMS производных) продуктов окисления ПНЖК,
m/z (интенсивность, %)
Положение OH-группы (окисление)
по С-12
по С-15
*молекулярный ион
AA5,8,11,14 EPA5,8,11,14,17 -3AA8,11,14,17 SDA:6,9,12,15 AA5,8,11,14 EPA5,8,11,14,17 -3 AA8,11,14,17 SDA:6,9,12,15
213(100); 353(1.6); 449 (4.2); 464*(0.8) 211(44.1); 353(11.2); 451*(5.6); 211(100); 355(47.5);451 (5.0); 466*(0.4) 171(100); 367 (7.1); 421(3.3); 436*(0.8) 173(100); 364 (7.1); 449(4.1); 464*(0.7) 171(100); 447(3.2); 462*(0.6) 171(100); 366 (47.8); 449(4.2); 464*(0.5) 171(100); 367 (7.5); 421(3.3); 436*(0.7)
12-OH (-9) 12-OH-9) 12-OH-9) 13-OH-6) 15-OH-6) 15-OH-6) 15-OH (-6) 13-OH-6)
15

Влияние -3AA (32) и SDA (33) на образование продукта окисления АА (15-HpETE) было исследовано с использованием ALOX15 ретикулоцитов кролика (-6 окисление) (Рисунок 5).
Влияние -3AA (32) и SDA (33) на образование продукта окисления АА (15-HpETE) было исследовано с использованием ALOX15 ретикулоцитов кролика (-6 окисление) (Рисунок 5). Образование 15-HpETE подавлялось в значительной степени как присутствием -3AA (32), так и EPA, тогда как ингибирующее действие SDA (33) было менее выраженным (Рисунок 5А). Со-инкубация EPA с -3AA (32) и SDA (33) в молярном соотношении 1:1 показала, что присутствие EPA усиливает действие SDA (33), но не оказывает никакого эффекта на -3AA (32) (Рисунок 5Б).
Рисунок 5. Ингибирование биосинтеза 15-HрETE под действием -3 кислот.
Полученные результаты хорошо согласуются с данными проведенных нами кинетических исследований, в которых -3AA (32) оказывается более предпочтительным субстратом ALOX15, чем ее -6 аналог АА (Таблица 4).
Таблица 4. Кинетические параметры окисления ω -3 ПНЖК рекомбинантной ALOX15 кролика.
Субстрат
-3 AA:С208,11,14,17 32
Кинетические параметры
kcat (с-1) KM (мкM) kcat/KM (с-1мкM-1)
22,4 ± 3,0 5,1 ± 1,3 4,37
AA:С205,8,11,14
11,3 ± 0,6
8,2 ± 1,4
1,38
SDA:С206,9,12,15 33
5,6 ± 0,2
242 ± 17
0,02
16

Обладая двойственной позиционной специфичностью, ALOX15 окисляет АА с образованием смеси продуктов -15-НрЕТЕ и 12-НрЕТЕ в соотношении 95:5. В случае с - 3AA (32) единственным обнаруженным нами продуктом, содержащим сопряженный диен, была (8Z,11Z,13E,17Z)-15-гидрокси-8,11,13,17-тетраеновая кислота (Рисунок 6).
Рисунок 6. Хроматограммы ВЭЖХ на обращенной фазе первичных продуктов окисления АА и -3AA (32) под действием АLOX15.
Анализ ВЭЖХ продуктов вторичного метаболизма ω-3AA (32) под действием ALOX15 кролика (Рисунок 7) показал возможность образования двух сопряженных триенов с массой молекулярного иона m/z 335.05, соответствующей массе дигидрокси производного ω-3AA (32): I–содержащего сопряженный триеновый хромофор с максимумом поглощения при 269 нм, типичный для триенов с конфигурацией (Е,Е,Е), и II – содержащего сопряженный триеновый хромофор с максимумом поглощения при 272 нм, типичный для
триенов с конфигурацией (Е,Z,Е). Исходя из литературных данных можно предположить, что продукт I образуется в результате неферментативного гидролиза 14,15- эпоксипроизводного -3AA (32), тогда как продукт II – результат ферментативного окисления -3AA (32) по двум положениям (Рисунок 7).
Рисунок 7. ВЭЖХ на обращенной фазе продуктов вторичного метаболизма -3AA (32) под действием АLOX15 кролика, без восстановления NaBH4 (левая панель) и восстановленных NaBH4. Вставки вверху: спектры УФ-поглощения, продуктов I и II, содержащих сопряженный триеновый хромофор.
В результате межклеточного метаболизма высшие -3 полиненасыщенные жирные кислоты превращаются в серию медиаторов разрешения воспалительных процессов: резольвины (Rv), протектины (P) и маресины (MaR). Так, DHA может превращаться под действием каскада ферментативных реакций с участием ALOX15 в 10(S),17(S)- дигидроксипроизводное(-6 окисление), в котором система трех сопряженных двойных
связей в E,E,Z-конфигурации находится между гидроксигруппами. Именно этот структурный элемент является критичным с точки зрения функциональности протектина PD1. Напротив, мареcины − сопряженные (E,E,Z)-7(R),14(S)-дигидрокситриены − образуются под действием ALOX15, окисляющих ПНЖК по 12-положению (-9 окисление). В силу того, что -3AA (32) и SDA (33) в модели ALOX15 высших приматов окисляются исключительно по -6 положению, образование PD1-подобных структур на клеточном уровне нельзя исключить, так как в случае -3AA (32) и SDA (33) сохраняются все структурные предпосылки для образования 8,15- или 6,13-дигидрокситриена (Рисунок 7). Полученные выше данные показывают, что подобно арахидоновой кислоте -3AA (32) может подвергаться вторичному метаболизму с образованием 14,15-эпокси производного, который гидролизуется в (E,E,E)- 8,15-дигидрокситриен. Напротив, образования MaR-подобных метаболитов, в случае -3AA (32) и SDA (33), невозможно ввиду отсутствия двойной связи в положении С5-С6 или С3-С4, соответственно.
2.4. Модели COX-12. Действие -3 ПНЖК: -3AA (32) и SDA (33) на метаболизм АА под действием PGH-синтазы-1 (COX-1), еще одного фермента каскада окислительного метаболизма ПНЖК, было изучено с использованием ферментативной модели СОХ-1 быка (чистота коммерческого препарата фермента 95%) (Рисунок 8). Активность СОХ-1 одинаково сильно подавлялась в диапазоне низких концентраций (IC50 = 20 мкг/мл) -3AA (32) и EPA, которая была выбрана в качестве стандарта сравнения.
Рисунок 8. Ингибирование окисления АА под действием СОХ-1 в присутствии -3 жирных кислот.
Интересно отметить, что в диапазоне концентраций до 20 мкг/мл SDA (33) проявила лишь незначительный ингибирующий эффект по отношению к СОХ-1. Смесь SDA (33) с EPA (молярное соотношение 1:1) подавляла активность СОХ-1 больше, чем индивидуальная SDA (33). Напротив, присутствие EPA в смеси с -3AA (32) (молярное соотношение 1:1) не оказывало влияния на активность -3AA (32).
2.5. Модель COX-22. Одновременно, с исследованиями СОХ-1, действие -3 жирных кислот -3AA (32) и SDA (33) на метаболизм АА было изучено с использованием другой изоформы PGH-синтазы (COX-2 человека), которая индицируется в организме млекопитающих в ответ на провоспалительный стимул. Активность СОХ-2 подавлялась как в присутствии -3AA (32), так и SDA (33) в диапазоне до концентраций 50 мкг/мл (IC50 = 40 мкг/мл), тогда как действие EPA было менее выраженным. Эффективность действия ω-3 ПНЖК уменьшалась в ряду: -3AA = SDA > EPA. Использование смесей EPA с -3AA (32) или SDA (33) (молярное соотношение 1:1) показало, что ПНЖК 32 и 33 усиливают действие EPA при ингибировании СОХ-2. (Рисунок 9).
Рисунок 9. Ингибирование окисления АА под действием СОХ-2 в присутствии -3 жирных кислот.
Помимо своего природного субстрата АА, СОХ-2 способна окислять -3 ПНЖК. Анализ каталитической эффективности окисления kcat/KM тестируемых соединений (Таблица 5) показывает, что -3 ПНЖК 32, 33 и EPA, обладая сопоставимым с АА или даже более высоким сродством (Км) к этому ферменту, окисляются СОХ-2 менее эффективно, чем АА (kcat/КМ = 41,8).
2 Выполнено в Институте биохимии Медицинского университета Charité, г. Берлин (Германия). 20

Таблица 5. Кинетические параметры окисления -3 ПНЖК COX-2 человека
Субстрат
ω-3AA (32) 7,8±1,7
KM, мкг/мл
(kcat/KM) нМ[O2]/ (мкг мин)
25,1
AA
11,7±1,4
41,8
SDA (33)
6,9±1,2
16,1
Полученные экспериментальные данные показывают, что как -3AA (32), так и SDA (33), могут конкурировать с АА в моделях окислительного метаболизма с участием ALOX5 и -3AA (32) − в модели с COX-1. Напротив, ПНЖК 32 и 33 являются хорошими субстратами как для COX-2 человека (со сродством, сравнимым с AA и EPA), так и для ALOX15. При этом, -3AA (32) является предпочтительным субстратом ALOX15 и превосходит свой -6 аналог (АА) по эффективности ферментативного окисления (kcat/KM) в 4 раза. Таким образом, когда избыток -3АА [8,11,14,17] (32) достаточно высок, она может конкурировать с природным субстратом AA [8,11,14] в реакциях с ферментами каскада AA и действовать синергически вместе с EPA, образуя комбинацию биологически активных природных соединений.
Выводы:
1. На модельном ряде: (5Z,8Z)-тетрадекадиеновой, (7Z,10Z)-гексадекадиеновой и новой, не описанной ранее в литературе (11Z,14Z)-гептадекадиеновой кислот, оптимизированы и модифицированы методы полного химического синтеза ПНЖК. Особое внимание уделено стадиям каталитического гидрирования полиацетиленовых предшественников и подобрана оптимальная стационарная фаза для очистки целевых ПНЖК методом ОФ-ВЭЖХ.
2. Показано, что для очистки и выделения препаративных количеств ПНЖК наиболее подходящими являются стационарные фазы с закрытыми силанольными группами типа Luna С18(2).
3. С использованием полиацетиленовой стратегии впервые получены -3AA и SDA в препаративном масштабе в количестве до 10 г.
4. Проведенные биохимические исследования показали, что преимущественно ω-3AA может конкурировать с АА в ферментативных моделях окислительного метаболизма млекопитающих с участием ALOX и СОХ.
5. Показано, что (8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозатетраеновая кислота (ω-3AA) под действием ALOX15 подвергается вторичному метаболизму с образованием 8,15-дигидрокситриенов с различной конфигурацией системы двойных связей, и таким образом, подобно ЕPA и DHA, имеет все необходимые структурные предпосылки для образования биологически активных метаболитов.
6. Полученные данные позволяют предположить, что в основе биологического действия ω-3 AA могут лежать также более глубокие процессы, затрагивающие аспекты ее вторичного и/или межклеточного метаболизма с участием COX-2 и ALOX15, которые требуют дальнейшего изучения.