«Содержание матричной РНК генов, вовлеченных в клеточный гомеостаз человека, в отдаленные сроки после хронического облучения»

Объектом исследования служили образцы периферической крови от 309 жителей прибрежных сел реки Течи, подвергшихся хроническому радиационному воздействию вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов (ЖРО) ПО «Маяк». Внутреннее облучение формировалось за счет радионуклидов, поступивших в организм с речной водой и продуктами местного производства, внешнее γ-излучение было сформировано за счет загрязнения радионуклидами донных отложений и пойменных почв. В качестве основных дозиметрических величин, определяющих меры воздействия ИИ на организм обследованных лиц, являлись дозы облучения ККМ, тимуса и периферических органов иммунной системы.
В группу хронически облученных лиц вошли 163 человека, накопленные дозы облучения ККМ которых находились в диапазоне от 77 до 3510 мГр. Суммарные накопленные дозы облучения ККМ большей доли облученных людей (74,3%) находились в диапазоне промежуточных значений от 100 до 998 мГр. 22% людей (36 человек) получили дозы, превышающие 1000 мГр. Максимальная суммарная доза облучения ККМ составила 3510 мГр. Максимальное значение мощности дозы облучения ККМ имело место в 1951 году, ее среднее значение составило 182±13 мГр/год, наибольшее индивидуальное значение достигало 719 мГр/год. Большинство людей из обследуемой выборки (65,7%) имели накопленные дозы облучения тимуса, не превышающие 100 мГр. Максимальная индивидуальная доза облучения тимуса и периферических органов иммунной системы составила 644 мГр. Среднее значение мощности дозы в период максимального облучения тимуса и периферических органов иммунной системы составило 46±4 мГр/год, максимальное значение составило 321 Гр/год.
Группа сравнения состояла из 146 человек, проживающих в тех же населенных пунктах (в сходных хозяйственно-бытовых условиях), но с накопленными дозами облучения ККМ не превышающими 70 мГр за весь период жизни. Средняя накопленная доза облучения ККМ составляла 15,7±1,4 мГр (диапазон доз 0–67,9 мГр), средняя накопленная доза облучения тимуса и периферических органов иммунной системы равнялась 6±0,8 мГр (диапазон доз 0–33 мГр). Дозиметрические величины были рассчитаны специалистами биофизической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России.
Исследуемые выборки людей были сформированы на основе медико-дозиметрической Базы данных «Человек» ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России. Обследуемые группы включали лиц обоего пола, принадлежавших к этническим группам: (1) тюрки – в основном татары, а также башкиры, (2) славяне – в основном русские, а также украинцы, белорусы. Группа облученных лиц включала
100 женщин (61,4%) и 63 мужчины (38,6%), аналогично группа сравнения включала 101 женщину (69,2%) и 45 мужчин (30,8%). Группа облученных лиц на 47,2% (77 человек) состояла из татар и башкир, 52,8% (86 человек) составляли славянские народы. Группа сравнения состояла на 33,6% (49 человек) из татар и башкир, 66,4% (97 человек) составили славянские народы. Средний возраст в группе облученных лиц равнялся 70,9±0,4 лет (диапазон 60–87 лет), и незначительно отличался от возраста людей, составляющих группу сравнения – 62,4±0,5 лет (диапазон 57–81 год).
Поскольку наличие патологий и других нерадиационных факторов, сопровождающих человека на протяжении их жизни (работа с вредными и опасными условиями, вредные привычки и др.), могут оказывать существенное влияние на экспрессию мРНК генов, был разработан ряд критериев, исключающих из выборки людей: 1. имеющих онкологические, аутоиммунные, хронические заболевания в фазе обострения; 2. принимающих цитостатические, гормональные препараты и антибиотики; 3. проходивших рентгеновское диагностическое облучение в течение 6 предшествующих месяцев до момента взятия крови; 4. имеющих или имевших контакт с генотоксичными химическими агентами в процессе профессиональной деятельности. В соответствии с действующими международными нормами (Хельсинская декларация 1964 г.) у всех пациентов, принимавших участие в данном исследовании, было получено письменное информированное добровольное согласие на взятие образца крови и на дальнейшее его исследование.
2. Лабораторные методы исследований
Кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак в стерильные вакуумные пробирки Tempus Blood RNA Collection Tubes (Applied Biosystem, США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Выделение РНК осуществлялось с помощью коммерческого набора Tempus Spin RNA Isolation Kit (Applied Biosystem, США) колоночным методом на основе диоксида кремния в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Информация о концентрации и чистоте выделенных образцов РНК была получена с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, США). Чистоту препарата оценивали по значениям поглощения на длинах волн, равных 260 и 280 нм (А260/280). Отношение оптических плотностей, измеренных при A260/280 для очищенной РНК, выделенной из всех образцов крови составило 2,1±0,02. Выход общей РНК составлял от 50 до 90 мкг/мл.
Реакция обратной транскрипции для синтеза комплементарной ДНК проводилась с использованием коммерческого набора реагентов High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Для анализа содержания мРНК генов TP53, MDM2, BCL-2, BAX, CDKN1A, ATM, XPC, hOGG1, STAT3, GATA3, MAPK8, NFkB1 и PADI4 применяли метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с
использованием коммерческих тест-систем, разработанных фирмой ООО «ТестГен» (Россия). Данные ПЦР-РВ анализировали с использованием метода Ливака (2-ΔΔСt).
Анализ частоты TCR-мутантных клеток проводился методом проточной цитофлуометрии. В качестве объекта исследования были использованы ЛПК человека, выделенные на градиенте плотности фиколл-урографина (p=1,077 г/см3) в соответствии со стандартной методикой. Количество проанализированных клеток в одной пробе составляло 30000. Анализ был осуществлен с использованием моноклональных антител CD3-FITC/CD4-PE и IgG1-PE/ IgG1– FITC (BeckmanCoulter, США), на проточном цитофлуориметре «Navios» (Beckman Coulter, США), согласно инструкции фирмы-производителя.
Для анализа интенсивности апоптоза клеток у облученных людей использовали чистую фракцию ЛПК, выделенные на градиенте плотности фиколл-урографина (p=1,077 г/см3) в соответствии со стандартной методикой. Для того что бы максимально полно оценить интенсивность апоптоза ЛПК у обследуемых лиц были использованы два метода. 1. Annexin V – основан на определении уровня белка фосфотидилсерина на внешней поверхности мембраны, который расценивается как маркер ранней стадии апоптотической гибели клетки. Детекцию лимфоцитов, имеющих признаки апоптоза на ранней стадии, проводили с использованием тест- системы FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit производства BD (Beckman Coulter, США) согласно протоколу фирмы производителя. 2. TUNEL (Transferase Mediated dUTP Nick End Labeling) – основан на выявлении 3’-ОН концов молекуле ядерной ДНК, образующихся при её фрагментации в клетках, вступивших в апоптоз (поздняя, необратимая фаза). Определение частоты лимфоцитов, имеющих признаки фрагментации ДНК, проводили использованием тест-системы Apo-Direct Kit (Beckman Coulter, США) согласно протоколу фирмы производителя. Количество проанализированных клеток в одной пробе составляло 30000.
Анализ полученных результатов проводили с использованием пакетов программ Statistica 10.0 и SigmaPlot. Для оценки достоверности различий применялся непараметрический U- критерий Манна-Уитни. Данные в работе представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили). Значимость различий качественных признаков в группах обследованных лиц оценивали при помощи непараметрического критерия χ2 Пирсона с поправкой Йейтса. Взаимосвязи между показателями исследовали методом непараметрического корреляционного анализа с использованием критерия Cпирмена. Силу влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на эти показатели оценивали при помощи факторного дисперсионного анализа с использованием критерия Фишера. С целью исключения ошибки формулировки гипотезы данные считали статистически значимыми при р≤0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Относительная количественная оценка содержания мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, CDKN1A, BCL-2, hOGG1 и XPC у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в широком диапазоне доз
На первом этапе работы методом ПЦР-РВ было проанализировано относительное содержание мРНК генов, вовлеченных в системы клеточного гомеостаза: репарации ДНК, контроля клеточного цикла и апоптоза у жителей прибрежных сел реки Течи, подвергшихся комбинированному внутреннему и внешнему облучению в диапазоне доз от 77 до 3510 мГр. Установлено статистически значимое низкое относительное содержание мРНК антиапоптозного гена BCL-2 и статистически значимое высокое относительное содержание мРНК проапоптотического гена BAX в группе облученных лиц по сравнению с контрольной группой (рисунок 1).
.
Рисунок 1 – Распределение относительного содержания мРНК генов BCL-2 и BAX в группе сравнения и группе облученных людей. Уровень значимости p демонстрирует достоверные различия между группами
Поскольку медианные значения показателей в полной степени не могут охарактеризовать распределение индивидуальных значений, была оценена доля хронически облученных людей, имеющих выраженные изменения в относительном содержании мРНК генов BCL-2 и BAX. В группе сравнения были рассчитаны референтные значения относительных содержаний мРНК этих генов, попадающие в 95% ДИ. После был проведен сравнительный анализ частот исследуемых показателей у обследуемых лиц, выходящих за границы референтного интервала.
Полученные данные свидетельствуют о том, что медиана показателей относительного содержания мРНК гена BCL-2 у облученных лиц смещена в область низких значений, в то время как у гена BAX в область высоких значений. В свою очередь, изменение относительных
содержаний мРНК обусловлено умеренным изменением транскрипционной активности генов BCL-2 и BAX во всей группе облученных людей, а не выраженным изменением ее у отельных облученных лиц.
1.1. Корреляционный анализ комбинированных связей относительного содержания мРНК исследуемых генов в группе сравнения и в группе лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию
Анализ комбинированных связей относительного содержания мРНК исследуемых генов был выполнен с использованием метода непараметрической корреляции Спирмена. Согласно полученным данным, в группе сравнения присутствовала слабая положительная связь между относительными уровнями мРНК генов TP53 и MDM2 (S=0,20; p=0,02). В свою очередь, в группе облученных лиц была также зафиксирована умеренная положительная корреляционная связь между относительными уровнями мРНК генов TP53 и MDM2, при этом отмечено, что коэффициент корреляции был в 1,5 раза выше, чем в контрольной группе (S=0,34; p<0,01). В двух исследуемых выборках зафиксирована положительная корреляционная связь относительных содержаний мРНК генов TP53 и OGG1, где сила корреляционной связи между этими генами в группе облученных лиц была выше почти в 2 раза (S=0,44; p<0,01), чем в группе сравнения (S=0,21; p=0,01). В дополнение, в группе облученных лиц регистрируется умеренная положительная корреляционная связь между относительными содержаниями мРНК генов MDM2 и OGG1 (S=0,32; p<0,01) и слабая положительная корреляционная связь между относительными содержаниями мРНК генов ATM и CDKN1A (S=0,16; p=0,05), которые в группе сравнения отсутствовали. Обращает на себя внимание, что в обеих сравниваемых выборках была зафиксирована слабая положительная корреляционная связь между относительными содержаниями мРНК генов BCL-2 и TP53; BCL-2 и MDM2. При этом сила корреляционной связи между относительным содержанием мРНК генов BCL-2 и MDM2 в группе облученных лиц осталась неизменной, тогда как между относительным содержанием между мРНК генов BCL-2 и TP53 она была увеличена и составила S=0,20; p<0,01. Примечательно, что в группе облученных лиц была получена слабая положительная корреляция между относительным содержанием мРНК генов BAX и относительным содержанием мРНК гена TP53 (S=0,16; p=0,04), которая не была зафиксирована в группе сравнения. Таким образом, анализ сравнения комбинаций содержания мРНК исследуемых генов продемонстрировал более сильные связи взаимодействия среди отдельных генов в группе облученных лиц, что может свидетельствовать о жесткой регуляции внутриклеточных процессов. После облучения ответ клетки становится более целенаправленным и характеризуется активацией механизмов репарации ДНК, контроля клеточного цикла, запуска процессов апоптоза. 2. Влияние радиационных факторов на содержание мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGG1 и XPC При анализе относительного содержания мРНК исследуемых генов особое внимание обращают на себя результаты, полученные для подгруппы лиц, имеющих накопленные дозы облучения ККМ более 1044 мГр. Так, количество мРНК гена ATM в этой группе было статистически значимо низким по отношению к группе сравнения (p=0,03) (рисунок 2 (а)). Транскрипционная активность гена CDKN1A была статистически значимо выше в группе лиц с накопленными дозами облучения ККМ от 77 до 485 мГр по сравнению с контрольной группой и группой лиц, облученных в диапазоне высоких доз (1044–3510 мГр) (рисунок 2 (б)). аб вг Рисунок 2 – Распределение относительного содержания мРНК генов ATM (а), CDKN1A (б), BCL-2 (в) и BAX (г) в дозовых подгруппах облученных лиц. Уровень значимости p демонстрирует достоверные различия между группами Корреляционный анализ позволил обнаружить слабые отрицательные связи между относительным содержанием мРНК гена CDKN1A от величин накопленных доз облучения 13 ККМ (S=-0,17; p=0,03) и от показателей мощности дозы облучения ККМ в период максимального воздействия (S=-0,27; p<0,01). Как видно из графиков, представленных на рисунках 3 (а) и 4 (а), при индивидуальной оценке наблюдается высокая вариабельность данных, из за чего форма зависимости не выглядит монотонной, не представляется возможным определить локальный максимум. В связи с этим методом скользящей средней была проведена аппроксимация данных (рисунки 3 (б) и 4 (б)), где каждая точка является усредненным значением для 10–15 показателей. Среднепопулляционные данные, свидетельствуют о монотонном увеличении относительного содержания мРНК гена CDKN1A у лиц с накопленными дозами облучения ККМ до 500 мГр и монотонном снижении относительного содержания этого гена у облученных людей с дозами, превышающих 500 мГр. аб Рисунок 3 – Зависимость изменения относительного содержания мРНК гена CDKN1A от накопленной дозы облучения ККМ, оцененная с использованием регрессионного анализа (а) и методом скользящей средней (б) Примечательно, что форма зависимости при оценке среднепопулляционных показателей влияния мощности дозы облучения ККМ в период максимального воздействия (рисунок 4 (б)), соответствует таковой при исследовании влияния дозы облучения ККМ на относительное содержание мРНК гена CDKN1A (рисунок 3(б)). Показано умеренное увеличение транскрипционной активности этого гена у лиц, облученных с максимальной мощностью дозы ККМ до 100 мГр/год. У лиц, чьи мощности дозы на ККМ превышают 100 мГр/год, наблюдается снижение экспрессии мРНК гена CDKN1A. Такая закономерность вполне логична, поскольку величина накопленных доз облучения ККМ напрямую зависела от величины мощности дозы в период максимального воздействия на ККМ. 14 а б Рисунок 4 – Зависимость изменения относительного содержания мРНК гена CDKN1A от максимальной мощности дозы облучения ККМ, оцененная с использованием регрессионного анализа (а) и методом скользящей средней (б) Следует отметить, что в ходе проведения анализа не было обнаружено статистически значимых особенностей в изменении транскрипционной активности исследуемых генов от дозы и максимальной мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы. 3. Влияние факторов нерадиационной природы на содержание мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGG1 и XPC Поскольку радиационно-индуцированные эффекты развиваются в течение значительного промежутка времени, физиологические изменения в организме, в частности инволюционные процессы, могут оказывать существенную роль в их развитии. В группе сравнения отмечена слабая положительная корреляционная зависимость относительного содержания мРНК гена CDKN1A (S=0,32, p<0,01) и слабая отрицательная корреляционная зависимость относительного содержания мРНК гена BAX (S=-0,22, p<0,01) от возраста людей на время проведения обследования. В группе облученных лиц отмечены статистически значимые слабые отрицательные корреляционные связи относительного содержания мРНК гена MDM2 от возраста лиц на время проведения обследования (S=-0,20; p=0,02) и относительного содержания мРНК гена TP53 от возраста людей на начало хронического радиационного воздействия (S=-0,18, p=0,04). На основании результатов регрессионного анализа было показано, что зависимость содержания мРНК гена BAX и CDKN1A от возраста на время проведения обследования можно описать линейными уравнениями y=1,80-0,01x (R2=0,04; p=0,02) и y=1,30+0,01x (R2=0,1; p<0,01), соответственно. В данном исследовании половая принадлежность людей не влияла на относительное содержание мРНК всех генов, кроме апоптотических BAX и BCL-2. Как в контрольной группе (p<0,01), так и в группе облученных лиц (p=0,01) были отмечены достоверно высокие уровни мРНК гена BAX у мужчин по сравнению с женщинами. Изменение экспрессии гена BCL-2 у мужчин относительно женщин имело противоположный характер. Относительное содержание мРНК гена BCL-2 как у облученных мужчин (p=0,02), так и у мужчин, составляющих группу сравнения, было существенно ниже (p=0,05), чем у женщин. Анализ спонтанного уровня мРНК исследуемых генов между славянами и тюрками внутри каждой группы среди облученных лиц и группы сравнения показал отсутствие статистически значимых различий. Что касается курения, то относительное содержание мРНК гена BAX находилось на более высоком уровне, а относительное содержание мРНК гена BCL-2 было статистически значимо ниже (p<0,01) в подгруппе курящих лиц (p<0,01). Важно отметить, что изменение в относительном содержании мРНК генов BAX и BCL-2 у мужчин и женщин, по большей части может свидетельствовать о вкладе фактора курения, поскольку как в контрольной группе, так и в группе облученных людей среди курильщиков преобладали исключительно мужчины. При исследовании влияния совокупности факторов на уровень мРНК исследуемых генов было отмечено, что на содержание мРНК генов BCL-2 и BAX оказывает фактор курения и пол (F=5,01; p=0,04 и F=10,07; p<0,01, соответственно). Наибольшее влияние на относительное содержание мРНК этих генов оказывал фактор курения F=6,35; p<0,01 для BCL-2 и F=23,54; p<0,01 для BAX. Менее выраженный эффект был получен от половой принадлежности F=4,99; p=0,03 для BCL-2 и F=6,13; p<0,01 для BAX. Влияние дозы облучения ККМ и мощности дозы облучения ККМ было зафиксировано только для гена CDKN1A (F=3,09; p=0,04 и 5,50; p<0,01, соответственно). В очередной раз не было отмечено влияния дозы и мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы Влияние возраста на время проведения обследования было продемонстрировано в случае с относительным содержанием мРНК гена MDM2 на уровне тенденции (F=3,03; p=0,06). Таким образом, на основании полученных данных, можно сделать заключение о том, что в отдаленные сроки после хронического облучения человека, наблюдаемые изменения содержания мРНК генов могут быть обусловлены не только действием ИИ, но могут являться следствием влияния нерадиационных факторов, в частности возраста и курения. 4. Относительная количественная оценка содержания мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGG1, XPC, PADI4, MAPK8, NFkB1, STAT3 и GATA3 у хронически облученных людей с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов в отдаленные сроки Обращает на себя внимание, что в отдаленные сроки после начала хронического радиационного воздействия у облученных людей, независимо от частоты TCR-мутантных ЛПК, регистрируется достоверно низкое относительное содержание мРНК гена STAT3 по сравнению с показателями, полученными в группе сравнения (рисунок 5). Уровень статистической значимости различий показателей между группой сравнения и облученными людьми с нормальной частотой TCR-мутантных лимфоцитов p=0,01, при сопоставлении показателей группы сравнения и группы облученных лиц с повышенной частотой TCR- мутантных ЛПК уровень значимости p=0,0009. В виду того, что степень активации экспрессии STAT3 напрямую зависит от функционального состояния комплекса TCR/CD3, полученные данные могут свидетельствовать о нарушении регуляции передачи сигнала TCR/CD3→STAT3, что в конечном итоге является причиной более выраженного снижения экспрессии STAT3 у облученных людей с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов. Рисунок 5 – Распределение относительного содержания мРНК гена STAT3 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной частотой TCR-мутантных лимфоцитов 17 Отмечено, что у хронически облученных людей с повышенной частотой TCR-мутантных ЛПК наблюдается статистически значимо низкое относительное содержание мРНК гена hOGG1 (p=0,03), чем в группе сравнения (рисунок 6). Поскольку продукт этого гена принимает участие в системе эксцизионной репарации оснований ДНК и направлен на удаление повреждений клеточных структур, возникших в результаты действия АФК, полученные в данном исследовании результаты могут указывать о функциональной несостоятельности этого гена, как одной из причин повышенной частоты генных соматических мутаций. Рисунок 6 – Распределение относительного содержаниям РНК гена OGG1 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной частотой TCR-мутантных лимфоцитов В дополнение, у облученных лиц с повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов отмечено достоверно низкое относительное содержание мРНК гена BCL-2 по сравнению с группой сравнения (p=0,02) и группой облученных лиц с нормальной частотой TCR-мутантных ЛПК (на уровне тенденции p=0,06), что может указывать на более выраженную активацию апоптоза у лиц с повышенной частотой клеток, мутантных по генам T-клеточного рецептора (рисунок 7). Рисунок 7 – Распределение относительного содержания мРНК гена BCL-2 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной частотой TCR-мутантных лимфоцитов 5. Относительная количественная оценка содержания мРНК генов TP53, MDM2, ATM, BAX, BCL-2, CDKN1A, hOGG1, XPC, PADI4, MAPK8, NFkB1, STAT3 и GATA3 у хронически облученных лиц с повышенной интенсивностью апоптоза ЛПК в отдаленные сроки Процессы обнаружения повреждений клеточных структур плотно и неразрывно связаны с апоптозом клетки, однако в рамках текущего исследования, не было отмечено существенных изменений в содержании мРНК генов репарации ДНК ATM, XPC и OGG1 у облученных жителей прибрежных сел реки Течи с повышенной частотой апоптоза ЛПК в отдаленные сроки. Так же как и не было отмечено изменений экспрессии мРНК генов контроля клеточного цикла TP53 и CDKN1A. Полученные данные в очередной раз подтверждают информацию об изменении экспрессии мРНК гена BCL-2 в отдаленные сроки у облученных лиц, что соответствуют текущим представлениям молекулярной основы радиационно-индуцированной гибели клетки. На рисунке 8 видно, что по отношению к группе сравнения относительное содержание мРНК гена BCL-2 в крови у облучённых лиц как с нормальной интенсивностью раннего апоптоза (p=0,04), так и с повышенной интенсивностью раннего апоптоза (p=0,08 (на уровне тенденции)) было низким. Рисунок 8 – Распределение относительного содержания мРНК гена BCL-2 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК В группе лиц с повышенной частотой апоптоза ЛПК на ранней стадии зафиксировано статистически значимое снижение относительного содержания мРНК гена STAT3, которое отличается почти в 1,5 раза при сравнении с группой сравнения (0,64 отн. ед. против 1,07 отн. ед., p=0,05). Графическое распределение представлено на рисунке 9. Полученные данные представляют интерес, поскольку, снижение содержания мРНК гена STAT3 также было отмечено у облученных людей с повышенной частотой TCR-мутантных клеток. Не исключено, что обследуемые лица с повышенной интенсивностью апоптоза ЛПК могут отличаться наличием других структурных повреждений ДНК. Рисунок 9 – Распределение относительного содержания мРНК гена STAT3 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной интенсивностью апоптоза ЛПК на ранней стадии На рисунке 10 продемонстрировано, что по отношению к группе сравнения (медиана – 0,68 отн. ед.) и группе облученных людей с нормальной интенсивностью раннего апоптоза ЛПК (медиана – 0,72 отн. ед.) относительное содержание мРНК гена PADI4 в крови у облучённых лиц с повышенной интенсивностью раннего апоптоза (медиана – 1,57 отн. ед.) было достоверно повышено более чем в 2 раза. Рисунок 10 – Распределение относительного содержания мРНК гена PADI4 в отдаленные сроки у облученных лиц с разной интенсивностью апоптоза ЛПК на ранней стадии ЗАКЛЮЧЕНИЕ Резюмируя данные настоящего исследования, можно сделать заключение, что у облучённых людей в период реализации отдаленных соматико-стохастических эффектов отмечены особенности в относительном содержании мРНК генов системы гомеостаза клетки. Так, изменение экспрессии мРНК генов BCL-2 и BAX у облученных лиц по сравнению с группой сравнения может свидетельствовать об активации механизма апоптотической гибели клеток крови в отдаленные сроки за счет усиления экспрессии проапоптотических и снижения экспрессии антиапоптических факторов. Корреляционный анализ комбинаций относительного содержания мРНК исследуемых генов демонстрирует более сильное взаимодействие между содержанием мРНК генов TP53, MDM2, BCL-2 и OGG1 у хронически облученных лиц, что указывает на жесткую регуляцию внутриклеточных процессов, в частности активации механизмов репарации окислительных повреждений ДНК и апоптоза. Что касается влияния радиационных факторов, то показано, что для людей, облученных в диапазоне высоких доз на ККМ (1000–3510 мГр), характерны более выраженные изменения в транскриптоме, которые проявляются в достоверном снижении содержания мРНК генов ATM, CDKN1A, BCL-2 и повышении содержания мРНК гена BAX. Полученные результаты согласуются с текущими представлениями радиационно-индуцированной активаций генов CDKN1A и ATM, которые являются известными индикаторами воздействия генотоксических агентов, в частности ИИ, и проявляют дозовую зависимость. Об этом говорят данные корреляционного и регрессионного анализа, свидетельствующие о снижении содержания мРНК гена CDKN1A от дозы облучения и мощности дозы облучения ККМ в период максимального воздействия. Стоит отметить, что в рамках текущего исследования мы не смогли обнаружить существенного влияния дозы и мощности дозы облучения тимуса и периферических органов иммунной системы в период максимального воздействия на относительное содержание мРНК исследуемых генов. Обращает на себя внимание, что настоящее исследование было проведено на стареющей группе людей (спустя 60–70 лет после начала хронического облучения), где важную роль в развитии эффектов могут играть инволюционные процессы и нерадиационные факторы, способные проявлять синергетический характер. Нами было показано, что у обследованных лиц, составляющих группу сравнения, с возрастом наблюдается снижение содержания мРНК проапоптотического фактора BAX и увеличение содержания мРНК гена CDKN1A, также отмечено снижение содержание гена MDM2 с возрастом на время проведения анализа в группе облученных людей. В свою очередь у курящих людей зафиксированные более выраженная модуляция транскрипционной активности апоптотических генов BCL-2 и BAX. На основании исследования количественной оценки относительного содержания мРНК у хронически облученных жителей прибрежных сел реки Течи, демонстрирующих повышенную частоту TCR-мутантных ЛПК и высокую интенсивность апоптоза ЛПК, были описаны изменения со стороны транскрипционной активности ряда гомеостатических генов. Так, по сравнению с группой сравнения облученные лица с повышенной частотой TCR-мутантных ЛПК достоверно отличались низким относительным снижением мРНК генов OGG1, STAT3 и BCL-2, а облученные лица с высокой интенсивностью апоптоза ЛПК на ранней стадии (стадии обратимых изменений) имели статистически значимые различия в экспрессии мРНК генов BCL-2, STAT3 и PADI4. Таким образом, полученные в рамках настоящего исследования данные, позволяют сделать предположение, что генетические и эпигенетические модификации, возникшие в клетках-предшественниках ККМ и ЛПК, опосредуют нарушение функциональных процессов в клетке и запускают сложные каскады внутриклеточных механизмов, которые не приводят к летальности, но являются причиной накопления и передачи радиационно-индуцированных изменений. В свою очередь нарушение функционирования защитных внутриклеточных систем может служить первостепенной причиной повышения частоты соматических мутаций и модуляции процесса элиминации клеток в облученном организме. ВЫВОДЫ 1. Спустя более 60 лет после начала хронического облучения у жителей прибрежных сел реки Течи с накопленными дозами облучения красного костного мозга, превышающими 77 мГр, в мононуклеарных клетках периферический крови отмечено снижение относительного содержания мРНК гена BCL-2; у лиц с дозами более 522 мГр – повышение относительного содержания мРНК гена BAX; у лиц с дозами более 1044 мГр – снижение относительного содержания мРНК гена ATM. 2. Установлена статистически значимая слабая отрицательная корреляционная связь содержания мРНК гена CDKN1A с дозой облучения красного костного мозга и мощностью дозы облучения красного костного мозга в период максимального воздействия. 3. Курение является фактором, модифицирующим транскрипционную активность генов BCL-2 и BAX. У курящих людей относительное содержание мРНК антиапоптозного гена BCL-2 снижено, а относительное содержание мРНК проапоптозного гена BAX повышено. 4. В отдаленные сроки у хронически облученных жителей прибрежных сел реки Течи со средним значением накопленной дозы облучения красного костного мозга 755±111 мГр и повышенной частотой TCR-мутантных лимфоцитов в периферической крови отмечается статистически значимое снижение относительного содержания мРНК генов hOGG1, BCL-2 и STAT3 по сравнению с необлученными людьми. 5. В отдаленные сроки у хронически облученных лиц со средним значением накопленной дозы на красный костный мозг 577±84 мГр и повышенной интенсивностью апоптоза лимфоцитов периферической крови на ранней стадии регистрируется статистически значимое низкое относительное содержание мРНК генов BCL-2 и STAT3 и высокое относительное содержание мРНК гена PADI4 по сравнению с необлученными людьми.