Совершенствование протеомного метода для качественного определения белкового состава мяса и мясных продуктов

ВВЕДЕНИЕ. Обоснована актуальность, научная новизна, практическая
значимость работы и положения, выносимые на защиту.
ГЛАВА1.ОБЗОРНАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙЛИТЕРАТУРЫ.
Представлен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы,
проанализированы данные о протеомных исследованиях пищевых продуктов,
рассмотрены протеомные методы анализа мясного сырья и продуктов.
ГЛАВА 2. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ.Определеныобъектыисследования,представлены
методологические подходы к проведению исследований по схеме (рисунок 1).
Объектами исследования являлись: образцы мышечной ткани: l. dorsi,
b. femoris, m. brachiocephalicus молодняка (60 сут.) и половозрелых (180 сут.) свиней
породывьетнамскаявислобрюхая(А);модельныефаршевыесистемы:с
содержанием свинина : говядина в соотношении 10,0 : 90,0 %; 1,0 : 99,0 %; 0,1 : 99,9
%; 0,01 : 99,99% (Б); модельные фаршевые системы из свинины: свежие,
замороженные (минус 40 °С), термообработанные (варка до достижения 70–72 °С в
центре образца) (В); стерилизованные кусковые мясные консервы высшего сорта по
ГОСТ 32125-2013: из говядины (ООО «ПК МАМИР», состав: говядина, жир
говяжий, лук репчатый, соль поваренная пищевая, лист лавровый) (Г); из свинины
(ООО «Русская Ресурсная Компания – Сибирь», состав: свинина, лук репчатый, соль
поваренная пищевая, лист лавровый, перец черный) (Д).
В работе использовали стандартные и общепринятые химические, физико-
химические и биохимические методы исследований, биоинформационный анализ
результатов. Преимущественно, работа основывалась на протеомных методах.
Протеомные исследования: одномерный электрофорез (1) по методу Лэммли в
12,5 % ПААГ в присутствии SDS в камере (Helicon, Россия) с использованием
стандарта (Thermo, Латвия); двумерный электрофорез (2) по О’Фарреллу с
использованием камеры (Bio-Rad, США) с помощью изоэлектрофокусирования
(ИЭФ) в стеклянных трубках в первом направлении, электрофорезом в пластине
ПААГ во втором направлении и окрашиванием кумасси G-250 (PanReac, Испания);
компьютерную денситометрию (3) двумерных электрофореграмм во влажном
состоянии, полных/отдельных фрагментов осуществляли с помощью сканера Bio-
5000 plus (Serva, Германия), разрешение 300 ppi, анализ изображений с помощью ПО
ImageMaster ™ 2D Platinum на базе Melanie 8.0 (GE Healthcare and Genebio,
Швейцария); биоинформационный анализ (4) – белковые пятна интерпретировали в
соответствии с БД Swiss-Prot, БД протеомики мышечных органов (Kovaleva et al.,
2013); масс-спектрометрический анализ (5) – с использованием оборудования ЦКП
«Протеом человека»: полученные трипсинолизом пептиды анализировали с
использованием ВЭЖХ системы Ultimate 3000 RSLCnano (Thermo Scientific, США)
соединенной с масс-спектрометром Q-exactive HFX (Thermo Scientific, США) в
режиме положительной ионизации с использование источника NESI (Thermo
Scientific, США). Идентификацию белков проводили при помощи ПО MaxQuant
v.1.6.3.4, поисковый алгоритм Andromeda с использованием БД Uniprot с
ограничением по видовой принадлежности организма (6).
Рисунок 1 – Схема диссертационного исследования.
ГЛАВА3.РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЙ.Дляопределения
оптимального варианта анализа мясного протеома рассмотрены четыре вариации
проведения 2-ДЭ на примере мышц l. dorsi свиньи (рисунок 2). При катодном
варианте ИЭФ наблюдалось хорошее разделение белков с pI от 5 до 6,5 (рисунок 2 А
и В), предположительно β-цепь тропомиозина, α-3-цепь тропомиозина, легкая цепь
миозина-3 и легкая цепь миозина-1/3. В случае анодного варианта ИЭФ (рисунок 2 С
и D) процесс проходит быстрее и выявляется в два раза больше белковых пятен, в
том числе основных структурных мышечных белков, таких как глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназа,группатропонинов,гидроксиацил-3-коэнзимА
дегидрогеназа, бета-енолаза и др.

Рисунок 2 – 2-ДЭ l. dorsi свиньи. Условные обозначения: А, В – катодный вариант, С, D –
анодный вариант.
Для выявления модификаций белкового состава мяса свиней в процессе роста
проведено исследование мышц различной локализации (l. dorsi, b. femoris и
m. brachiocephalicus)поросят-отъемышей.Фрагментыдвумерных
электрофореграмм, отображающих 18 фракций с показателем Fold> 2, представлены
на рисунке 3.

Рисунок 3 – Фрагменты 2-DE гелей мышечной ткани поросят-отъемышей.
Фракции 1 и 2 (рисунок 3), предположительно, миозиновые легкие цепи
быстрых (MLC1f) и медленных (MLC1s/v) скелетных мышц, достаточно хорошо
проявлялись в l. dorsi. В образцах b. femoris детектировалась только медленная цепь,
а в m. brachiocephalicus – слабовыраженная фракция MLC1s/v. Группа белков в
диапазоне молекулярных масс от 50 кДа до 60 кДа (№ 3–7, рисунок 3) более явно
выражена в мышцах b. femoris, слабее в l. dorsi, а в мышцах m. brachiocephalicus
выявлялась в меньших количествах.
Количество белка № 8 (рисунок 3) триозофосфатизомеразы 1 равномерно
снижалось от l. dorsi до m. brachiocephalicus. Такая же тенденция наблюдалась у
фракций № 13–17, среди которых, предположительно, присутствуют фракции
тропонинов. Белок скелетных мышц тропонин I уже охарактеризован как
потенциальный термостабильный и видоспецифичный биомаркер мышечной ткани
млекопитающих в сыром мясе и мясных продуктах (Zvereva et. al., 2015). Интересное
распределение белковых пятен отмечено у фракций № 9 и № 10. Так, в b. femoris
обнаруживался только белок № 9, и в небольшом количестве присутствовала
фракция № 10 (аденилаткиназа), но при этом в l. dorsi его интенсивность была
больше, чем в мышцах м. brachiocephalicus. Объём пятна № 11 в m. brachiocephalicus
в три раза меньше, чем у l. dorsi и b. femoris. Самое большое значение показателя
Fold отмечено у фракции № 12 (фосфоглицеральмутаза) интенсивность которой на
порядок выше у l. dorsi по сравнению с m. brachiocephalicus и b. femoris. Белок № 18
более выражен в b. femoris, менее интенсивно отмечен в l. dorsi и в небольшом
количестве в m. brachiocephalicus.
При сравнительном электрофоретическом исследовании мышечной ткани
разной локализации половозрелых свиней (рисунок 4) различия в большей степени
обнаружены в минорных белковых фракциях. Группа белков (№ 1–3, рисунок 4) в
области более 70 кДа, такие как альфа-1,4-глюканфосфорилаза, аминоксидаза, актин-
деполимеризующий фактор и белок теплового шока HSP 90-альфа в значительно
большем количестве (Fold> 3,05) обнаруживалась в m. brachiocephalicus. Также,
отмечено преобладание в m. brachiocephalicus белков CFL2b вариант 1 и тропонинов
С быстрых и медленных скелетных мышц, отвечающих за связывание актиновых
филаментов.
Среди структурных мышечных белков значимые отличия выявлены в
фрагментах тропомиозина, миозиновых легких цепей 1 и αβ-кристаллина (№ 4, № 5,
№ 11 на рисунке 4), которые, как минимум, в два раза интенсивнее были
обнаружены в тканях b. femoris. В соответствии с масс-спектрометрической
идентификацией для l. dorsi определяющими фракциями стали № 6, № 10 и № 12,
являющиеся миозиновыми легкими цепями 2, ациредуктон-диоксигеназой и гамма-
актином-2.Интересноотметить,чтокреатинкиназа(субъединицаМ)и
длинноцепочечная 3-кетоацил-КоА-тиолаза выявлялись в минимальных количествах
по сравнению с b. femoris и м. brachiocephalicus. При этом L-лактат дегидрогеназа А
цепь и порин менее интенсивно отмечены в b. femoris (рисунок 4).

Рисунок 4 – Фрагменты 2-DE гелей мышечной ткани половозрелых свиней.
При сопоставлении мышц l. dorsi в процессе роста животного отмечено
увеличение количества белковых фракций за счет увеличения структурных белков
(актина, миозиновых легких цепей, триозофосфатизомеразы, пируваткиназы М,
тропонинов, глицеральдегид-3-фосфатизомеразы, αβ-кристаллина и миоглобинов),
которые у поросят представлены в меньшем количестве, но с большей
концентрацией белка.
В случае b. femoris отмечена похожая тенденция увеличения количества белков
за счет декомпозиции фракций при взрослении животного. В большей мере
изменения коснулись миоглобинов, миозиновых легких цепей, тропонинов I,
альдолазы А и белки теплового шока.
При изучении m. brachiocephalicus выявлено, что общее количество белковых
фракций и их концентрация на полученных электрофореграммах по мере роста и
развития животного сокращается. Преимущественно деформации подвергались
белки с молекулярной массой менее 30 кДа и в большей степени белки
актомиозионового комплекса.
Масс-спектрометрическийанализвырезанныхполоссвыраженными
отличиями из одномерной электрофореграммы (рисунок 5) выявил 214 белков, по
большей части, задействованных в клеточных и метаболических процессах,
двигательнойактивностиилокализации.Вмышечнойтканиl. dorsi
идентифицирован белок роста и развития, посредством связывания рецептора
семафорина и хеморепеллентной активности – семафорин-6Б (96,78 кДа). Также
выявлены белки развития в l. dorsi и b. femoris кадгерин-13 (78,23 кДа), кадгерин-7
(87,01 кДа), F-актин-кэпирующая белковая субъединица бета (30,66 кДа) и два
неохарактеризованных белка в 65,60 кДа и 63,88 кДа.

Рисунок 5 – Одномерная электрофореграмма мышц свиней в процессе роста (1 – поросята, 2 –
половозрелые свиньи).
Описанные выше изменения белковых фракций могут отражать интенсивность
процессов роста мышечной ткани у животных. Так, мышечные ткани поросят
характеризуютсявысокойконцентрациейбелковыхфракций,номеньшим
количеством белков, а по мере развития происходит их перераспределение –
концентрация белков снижается, а количество увеличивается. Предположительно,
это можно объяснить тем, что мышцы растущего животного подвергаются большему
воздействию двигательных сил, а механическая передача сигналов через интегрины
способствует синтезу белка. Так как рост и развитие мышечной ткани включает в
себя непосредственно увеличение саркомеров, представляющие собой комплекс
нескольких белков, таких как актин, миозин и тропонины, то соответственно и
количественное содержание этих белков увеличивается в мышечной ткани взрослого
животного.
Наиболее информативной для выявления различных воздействий является l.
dorsi – наиболее мощная мышца позвоночного столба. В ней выявлено максимальное
количество интенсивно окрашенных белковых фракций. Также двумерная карта
функционально активной мышцы b. femoris является не менее информативной, так
как в ней обнаружено большое количество белков. Уже известно, что пептиды,
образующиеся в данной мышце, обладают биологической функциональностью
(некоторые пептиды из белков MLC1, CK, MYO, TNT и MHC7 оказались наиболее
влиятельными).
Врезультатеизучениявозможностипримененияметодадвумерного
электрофореза для оценки состава мясных продуктов на примере модельных фаршей
с заданным количеством сырья были выбраны общие конститутивные фракции для
всех изучаемых образцов, которые представлены на рисунке 6. Подобные
исследования уже проводились другими учеными (Ковалева и др., 2012), но при
более равном соотношении количества сырья (55 % : 45 %; 60 % : 40 %; 70 % : 30 %).
В связи с этим были выбраны более чувствительные пороги определения.
Рисунок 6 – Двумерная электрофореграмма модельных фаршей с различным содержанием
говядины. Условные обозначения модельных фаршей из свиньи с добавлением говядины –
длиннейшая мышца – с процентным соотношением: А – 0,01 : 99,99 %; В – 0,1 : 99,9 %; С – 1,0 :
99,0 %; D – 10,0 : 90,0 %.
Наибольшая концентрация белка исследуемых фракций отмечена в системе с
0,01 % содержанием говядины (рисунок 6 А), наименьшая – у образцов с 10,00 %
содержанием говядины (рисунок 6 D). Среди выявленных конститутивных фракций
наибольшей интенсивностью окрашивания характеризовались белковые пятна:
тропомиозин альфа 1 (33,5 кДа), бета-енолаза (46,0 кДа) креатинкиназой
субъединицей М (41,0 кДа) и тропонином Т скелетномышечным (31,0 кДа),
соответственно.
Количественное содержание фракций миозиновой легкой цепи 1/3 (21,5 кДа) и
бета-енолазы (46,0 кДа) снижалась на 19,52 % и 31,34 % при увеличении доли
говядины в фарше от 0,01 % до 10,00 % соответственно. Данные фракции могут
выступать в качестве кандидатов-биомаркеров при оценке состава мясных
продуктов, поскольку на двумерных электрофореграммах модельных фаршей
отмечена линейная зависимость интенсивности указанных белковых пятен при
изменении количества говядины.
Известно, что условия обработки, особенно температура, вызывают каскад
химических и физических изменений, влияющих на белки мяса, включая
денатурацию и агрегацию, сокращение волокон и солюбилизацию коллагена,
реакцию Майяра или окисление. Для определения влияния различных температур на
биохимические изменения в мясных системах, влияющих на пищевые качества
мясных белков, был проведен сравнительный анализ двумерных карт.
Сравнительный анализ двумерных карт фаршевых систем позволил выявить,
что наибольшее количество белковых фракций наблюдалось у нативного (сырого)
фарша. После заморозки отмечено снижение количества белков: не обнаруживался
тропомиозин β-цепь (ТПМ2 33,5 кДа; pI 4,80); снижалась концентрация пятен
карбоангидразы 3 (30,5 кДа; pI 7,55), αβ-кристаллина (20,0 кДа; pI 7,60) и
миозиновой легкой цепи 1 (МЛЦ1 21,0 кДа; pI 4,90). В образце фарша после
тепловой обработки выявлена декомпозиция группы белковых фракцийс
диапазоном молекулярных масс от 65 кДа до 250 кДа, соединения распадались на
наборы пятен одноименных фракций, присутствующих в нативном фарше, а часть
белков не детектировались на 2Д-электрофореграмме: МЛЦ3 (16,8 кДа; pI 4,53),
белок, связывающий жирные кислоты 3 (мышечная изоформа 13,0 кДа; pI 5,60),
аденилаткиназа изоэнзим 1 (23,0 кДа; pI 6,40), альфа субъединица гемоглобина (15,5
кДа; pI 9,15) и другие минорные фракции. Фракция тропомиозина альфа 1 (ТПМ1
33,5 кДа; pI 4,71) сохранялась во всех образцах.
Рисунок 7 – 2ДЭФ фаршей после различной термической обработкой.
После тепловых воздействий (отрицательном и положительном) наблюдалось
деградационное влияние на миозиновые легкие цепи 2 (МЛЦ2 19,0 кДа; pI 4,89).
Схожая картина происходила с фракцией триозофосфатизомеразой 1 (ТПИ1 23,0
кДа; pI 6,80), интенсивно выраженной в сыром фарше. Данная фракция
отсутствовала в образце после заморозки и обнаруживалась в небольшом количестве
после варки. Это связано с тем, что при воздействии отрицательных температур
кристаллы воды разрывают клеточную стенку и вместе с жидкостью теряется часть
белков при размораживании, а в случае варки рвутся некоторые водородные связи,
удерживающие полипептидные цепи в белковой молекуле, инициируя небольшие
структурные изменения.
Миозиновая легкая цепь изоформа 2V (МЛЦ2 2V 18,5 кДа; pI 4,89) явно была
выражена в нативном фарше и полностью отсутствовала в образцах после
термической обработки. Бета-енолаза (ENO3 46,0 кДа; pI 8,10) также интенсивно
проявлялась в сыром фарше, была менее выражена в образцах после варки и в
незначительном количестве наблюдалась после замораживания.
Такие интерпретации могут обеспечить понимание влияния различных
методов обработки пищевых продуктов на биохимические изменения белковых
фракций и акцентировать внимание на биофункциональных и питательных качествах
белков мяса.
Интересно отметить, что фракции миозиновых легких цепей реагировали на
все вышеперечисленные процессы: меняются в процессе роста и в разных частях
туши, а также в процессе переработки, что делает их перспективным универсальным
биомаркером мышечной ткани при различных воздействиях.
Исследованияпоказателейкачествакусковыхмясныхконсервов
первоначально производятся в средней пробе образца. Однако выявлено, что это не
позволяетполучитькачественноеразделениебелковыхкомпонентов.Для
повышения разрешающей способности метода было предложено отделить жировую
составляющую по ГОСТ33741-2015 ипровести исследованияотдельных
компонентов (рисунок 8).

Рисунок 8 – 2ДЭФ мясных кусковых консервов (говядина) и их составляющих. Условные
обозначения: А – средняя проба; Б – мясо и бульон; В – бульон; Г – кусочки мяса; СТ – стандарт
Результаты электрофоретического разделения белков средней пробы образца,
включающего все содержимое консервов (жир, бульон, кусочки мяса) обнаружили в
небольших количествах фрагменты основных мышечных и соединительнотканных
белков говядины, но из-за большого количества жира, который обладает плохой
электропроводностью, электрофореграмма малоинформативна (рисунок 8 А).
При отдельном электрофоретическом изучении бульона (рисунок 8 В)
выявлено большое количество интенсивно окрашенных высокомолекулярных
фракций с массой более 50 кДа, вероятно, коллагеновых цепей соединительной
ткани, а также митохондриальной аконитазы 2, белков теплового шока, фракций
десмина и пируваткиназы М.
Наиболее информативную картину удалось получить при исследовании
твердой части мясных кусковых консервов (рисунок 8 Г). Выявлено большое
количество белков во всем диапазоне молекулярных масс, включая основные
структурныефракциибета-енолазы,мышечнойкреатинфосфокиназы,
фосфоглицераткиназы1,глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы,группы
тропонинов и миозиновых легких цепей.
Схожая тенденция распределения белковых фракций была получена при
анализедвумерныхэлектрофореграммкусковыхконсервовизсвинины.
Электрофореграмма средней пробы была мало информативна, как и отдельное
изучение бульона. Наибольшее распределение белков выявлено при отдельном
изучениикусочковмяса,достаточнохорошообнаруживалисьбелки-
предшественникиосновныхмышечныхбелковсвиньи(МЛЦ,тропонины,
тропомиозины, бета-енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и др.). Также
высокого разрешения электрофореграммы удалось достичь при совмещенном
изучении бульона и кусочков мяса, более интенсивно проявлялись кислотные белки.
ВЫВОДЫ
1.Результатыанализалитературныхданныхиэкспериментальных
исследований показали, что наиболее информативным вариантом для разделения
белков мышечной ткани с помощью двумерного электрофореза является анодный
вариант, когда изменено направление тока. В качестве инкубирующих растворов
ИЭФ-гелей могут выступать буфер A (5 M мочевина, 2 % SDS, 5 % меркаптоэтанол,
62,5 мМ Tris-HCl, 0,01 % бромфеноловый синий) и выравнивающие буферы (6 М
мочевина, 20 % глицерина, 2 % SDS и 1 % DTT(I)/4 % йодацетамид (II) в 375 мМ
Трис-HCl).Спомощьюденситометрическогоанализагелейподтверждена
эффективность разработанного метода пробоподготовки: при таком варианте
выявляется, как минимум, в два раза больше количество белков и увеличивается
интенсивность их проявления.
2. Сравнительные протеомные исследования мышц поросят-отъемышей и
взрослых животных показали, что в процессе роста и развития происходит
увеличение числа фракций тропонинов, легких миозиновых цепей и белков
актомиозинового комплекса, но при этом происходит снижение их количественного
содержания. Выявленные изменения белковых соединений отражают интенсивность
процессов развития мышечной ткани у животных, способствующие контролю
закономерностей формирования заданных качественных показателей мяса и мясных
продуктов.
3. Посредством двумерного электрофореза выявлены основные группы
модифицируемых мышечных белков модельных фаршевых систем после различных
температурных воздействий. Отрицательная температура (минус 40 °C) приводит к
потерям части структурных белковых соединений (триозофосфатизомеразы 1,
миозиновых легких цепей 2 и тропомиозина β-цепь); тепловая обработка – к
декомпозиции ряда белков с молекулярной массой выше 65 кДа (миозиновые легкие
цепи 2 и миозиновые легкие цепи 3), а часть белков не детектировались на 2Д-
электрофореграмме (МЛЦ3, белок, связывающий жирные кислоты 3 мышечная
изоформа, аденилаткиназа изозим 1, альфа субъединица гемоглобина).
4. Адаптированы условия разделения белковой составляющей для кусковых
мясных консервов; посредством разделения и удаления жировой составляющей
продукта получены их протеомные карты. Для определения общего спектра белков
целесообразно электрофоретическое изучение совмещенно бульона и кусочков мяса.
Изучение компонентов консервов методом двумерного электрофореза позволяет в
отношении бульона проводить сравнительный анализ длинноцепочечных белков; в
отношении мясной составной части – изучить вариации тканевых белков.
5. Разработаны и утверждены методические рекомендации по анализу
результатов одно- и двумерных электрофореграмм, позволяющих интерпретировать
полученные результаты после проведения электрофоретического исследования,
используя информационные ресурсы. Разработан СТО 00419779-000-2021 Консервы
кусковые мясные и мясосодержащие. Методика подготовки проб для проведения 2D
– электрофореза.