Совершенствование технологии получения настоек из разного вида лекарственного растительного сырья

Объекты исследования:
– экспериментальные настойки, полученные разными
методами на спирте этиловом разной концентрации из
лекарственного растительного сырья в соотношении 1:10
(боярышника плоды, календулы лекарственной цветки); 1:5
(пустырника трава, валерианы лекарственной корневища с корнями,
эхинацеи пурпурной трава), 1:20 (мяты перечной листья);
– официнальные настойки из того же вида ЛРС;
– водные извлечения из указанного ЛРС, полученные в
соответствии с ГФ РФ, ОФС.1.4.1.0018.15 «Настои и отвары».
Вспомогательные вещества: спирт этиловый 95 % ГФ РФ,
ФС.2.1.0036.15 и разные его концентрации; вода очищенная ГФ РФ,
ФС.2.2.0020.18.
Стандартные образцы: рутин (САS:153-18-4); гиперозид
(САS:482-36-0); кверцетин (САS:117-39-5); кофейная кислота (CAS:
331-39-5), хлорогеновая (CAS:327-97-9) и цикориевая (САS:6537-
80-0) кислоты; ментол (САS:2216-51-5); камфора (САS:76-22-2).
Методы исследования:
Химическиеметоды:качественныереакциина
доминирующие комплексы: флавоноиды, фенольные соединения,
сложные эфиры карбоновых кислот.
Физические методы: определение сухого остатка по ГФ РФ,
ОФС.1.4.1.0019.15 «Настойки» (весы лабораторные электронные
Pioneer «Ohaus Instruments (Shanghai) Co; Ltd», Китай; стерилизатор
суховоздушный модель ГП-10МО Касимов (Россия). содержания
спирта этилового по ГФ РФ, ОФС.1.2.1.0016.15. «Определение
спирта этилового в лекарственных средствах» методом
дистилляции.
Физико-химические методы: спектрофотометрия («Portlab
511», Великобритания); ГХ («Кристаллюкс-4000М», Россия);
ВЭЖХ (ВЭЖХ-ДМД LC-2030C 3D Prominence-I (Shimadzu),
Япония); ТСХ (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ размером 10
х 15 см).
Биологическиеметоды:исследованиебезопасности
экспериментальных и серийных образцов настоек на лабораторных
животных в «остром» опыте; исследование прямого влияния
исследуемых образцов на скорость глутатионредуктазной (ГР),
каталазной (КАТ) и индуцибельной NO синтазы (iNOS) реакций в
условиях опытов in vitro; определение антимикробной активности и
микробиологической чистоты по ГФ РФ, ОФС 1.2.4.0002.18
«Микробиологическая чистота».
Математические методы использовали для расчётов
экономической целесообразности снижения спирта в настойках; а
такжепараметровобобщённойфункцияжелательности
Харрингтона.
Статистическую обработку полученных результатов
проводили в соответствии с ГФ РФ, ОФС.1.1.0013.15
«Статистическаяобработкарезультатовхимического
эксперимента» (статистическая обработка в MS Excel 2019).
Обоснование выбора объекта исследования
Наиболеераспространеннымиивостребованными
настойками на фармацевтическом рынке России являются
боярышника настойка, пустырника настойка, валерианы настойка,
календулы настойка, мяты перечной настойка, эхинацеи настойка
(Бойко Н.Н. с соавт., 2017 г.; Гилёва, О. В., 2018 г.; Егорова К.А. с
соавт., 2014 г.; Токарева М. Г. с соавт., 2019 г.).
Спиртэтиловыйявляетсярастворителеммногих
алкалоидов, гликозидов, эфирных масел, смол и других веществ,
которые в воде растворяются в незначительных количествах.
Однако спирт этиловый высокой концентрации значительно
труднее, чем вода проникает через стенки клеток, превращает белки
и полисахариды в осадки, которые закупоривают стенки клетки, что
приводит к ухудшению диффузии. Поэтому вопрос о возможности
изготовления настоек с индивидуализированным содержанием
спирта без потери качества и фармакологических свойств препарата
требует дальнейшего изучения.
Исследования по оптимизации технологии получения
настоек из различного лекарственного растительного сырья
Полученные результаты показали, что при проведении
экстрагирования ЛРС с концентрацией спирта этилового 40 % – в
полученных настойках содержание доминирующих БАВ по
сравнению с официнальными настойками в среднем в 1,16±0,09 раз
меньше. При снижении концентрации спирта этилового до 20 % –
полученные извлечения не соответствуют по показателю
«Микробиологическая чистота» категории 3Б и категории 2
(календулы настойка). Поэтому эти образцы настоек были
исключены из дальнейших исследований.
Метод дробной мацерации при экстрагировании 70%
спиртом этиловым показал статистически значимое увеличение
содержания доминирующих БАВ и сухого остатка по сравнению с
методами мацерации и перколяции на той же концентрации спирта
этилового. Однако учитывая высокое содержание спирта этилового
в настойках, проведены исследования по его совершенствованию.
В связи, с чем разработан метод модифицированной
дробной мацерации (МДМ), сущность которого заключается в
проведении двухэтапного экстрагирования:
– на первом этапе – спиртом этиловым с концентрацией, как
и в официнальных настойках;
– на втором этапе – водой очищенной комнатной
температуры, в соотношении от 0,73 до 1,11 к спирту этиловому,
что позволяет извлекать из ЛРС остаточные количества БАВ и
спирта этилового.
Количественные показатели экспериментальных настоек
(ЭН) из ЛРС, полученных МДМ представлены в Таблице 1.
Таблица 1 – Количественные показатели настоек (МДМ)
НаименованиеСодержаниеСодержаниеСухой
образцаспирта, %целевых БАВ, % остаток, %
ЭН боярышника165,6±1,00,0053±0,00061,66±0,04
ЭН боярышника237,4±0,60,0057±0,00031,78±0,03
ЭН боярышника317,6±1,00,0043±0,00031,80±0,10
ЭН пустырника165,8±0,90,0224±0,00131,61±0,06
ЭН пустырника237,2±0,50,0286±0,00122,22±0,06
ЭН пустырника321,6±1,30,0152±0,00382,01±0,10
ЭН календулы165,4±1,00,094±0,0043,37±0,14
ЭН календулы237,0±1,10,107±0,0084,45±0,03
ЭН календулы316,8±0,90,074±0,0023,56±0,09
ЭН валерианы168,6±0,60,598±0,0313,13±0,13
ЭН валерианы238,8±0,50,598±0,0405,04±0,12
ЭН мяты182,8±0,03,012±0,0010,72±0,00
ЭН мяты253,8±0,93,026±0,0130,94±0,02
ЭН эхинацеи136,0±0,00,224±0,0002,40±0,00
ЭН эхинацеи217,4±0,60,228±0,0092,63±0,03

Метод модифицированной дробной мацерации показал в
ЭН2 тенденцию к увеличению количественного содержания БАВ,
при индивидуализированном содержании спирта в готовом
продукте не менее 35 % (для боярышника, пустырника, календулы,
валерианы настоек), не менее 51 % (для мяты перечной настойки)
и не менее 15 % (для эхинацеи настойки). Все настойки,
полученные методом модифицированной дробной мацерации,
соответствуюткритерию«Микробиологическаячистота».
Вероятно, подобный эффект был достигнут за счёт использовали
спирта этилового в концентрации 95 %, 80 %, 70 % и 40 % на
первом этапе получения настоек, в результате чего проявились
бактерицидные свойства экстрагента.
Присравнительномизучениихроматографического
профиля (ВЭЖХ) настоек, полученных МДМ с официнальными
настойками (ОфН) (дробная мацерация) и водными извлечениями,
установлено, что профиль спектров совпадает у экспериментальных
и официнальных настоек. Интенсивность отклика отдельных БАВ у
водных извлечений ниже, чем у настоек (Рисунки 2 – 19).

Рисунок 2 – Профиль ВЭЖХРисунок 3 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы ЭН боярышника 2хроматограммы ОфН боярышника
Рисунок 4 – Профиль ВЭЖХРисунок 5 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы отварахроматограммы ЭН пустырника2
боярышника

Рисунок 6 – Профиль ВЭЖХРисунок 7 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы ОфН пустырникахроматограммы настоя пустырника

Рисунок 8 – Профиль ВЭЖХРисунок 9 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы ЭН календулы2хроматограммы ОфН календулы

Рисунок 10 – Профиль ВЭЖХРисунок 11 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы настоя календулыхроматограммы ЭН валерианы2
Рисунок 12 – Профиль ВЭЖХРисунок 13 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы ОфН валерианыхроматограммы настоя валерианы

Рисунок 14 – Профиль ВЭЖХРисунок 15 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы ЭН мяты 2хроматограммы ОфН мяты перечной

Рисунок 16 – Профиль ВЭЖХРисунок 17 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы настоя листьевхроматограммы ЭН эхинацеи2
мяты перечной

Рисунок 18 – Профиль ВЭЖХРисунок 19 – Профиль ВЭЖХ
хроматограммы ОфН эхинацеихроматограммы настоя эхинацеи
УФ-спектры водных извлечений, образцов настоек,
полученных методом дробной мацерации на спирте этиловом 70% и
настоек полученных, методом модифицированной дробной
мацерации с индивидуализированным содержанием спирта в
диапазоне от 320 до 550 нм для извлечений из боярышника и
календулы, от 370 до 500 нм для извлечений из пустырника, от 400
до 550 нм для извлечений из валерианы, от 230 до 350 нм для
извлечений из эхинацеи представлены на Рисунке 20.

а)б)

в)г)

д)
Рисунок 20 – УФ-спектры образцов настоек и водных извлечений:
а) из боярышника плодов (1 – ЭН2; 2 – ОфН; 3 – отвара; 4 – СО
рутина); б) пустырника сердечного травы (1– ЭН2; 2 – ОфН; 3 –
настоя; 4 – СО рутина); в) из календулы лекарственной цветков (1 –
ЭН2; 2 – ОфН; 3 – настой; 4 – СО рутина); г) из валерианы
лекарственной корневищ с корнями (1 – ЭН2; 2 – ОфН; 3 – настой);
д) из эхинацеи пурпурной травы (1 – ЭН1; 2 – ОфН, 3 – настой)
Сопоставление УФ-спектров водных извлечений, образцов
настоек, полученных методами дробной мацерации и МДМ с
индивидуализированным содержанием спирта, показало, что
характеры спектров практически совпадают, но имеются различия в
интенсивности с водными извлечениями, что вполне закономерно.
Длядополнительногообоснованиярациональности
использования в технологии настоек метода МДМ, рассчитаны
некоторые показатели экономии экстрагента при получении 1000
флаконов по 25 мл (Таблица 2).
Таблица 2– Результаты расчётов экономии экстрагента
ДробнаяМДМ
НаименованмацерацияРазница,Эконо
ие настойки Конц.Стоим.,Конц.Стоим.,руб.мия,
спирта,руб.спирта,руб.%
%%
Боярышника701563,9870 + вода823,15- 740,8347,37
Пустырника702461,8160+ вода1254,32- 1207,4949,05
Календулы702172,1970+ вода1097,53- 997,5345,91
Валерианы701853,6070+ вода1006,07- 847,5345,72
Мяты
901954,9790+ вода1215,12- 739,8537,85
перечной
Эхинацеи401158,5040+ вода522,63- 635,8754,89

Полученные данные Таблицы 2 свидетельствуют об
экономической целесообразности использования метода МДМ за
счёт снижения расходуемого количества экстрагента в сравнении с
методом дробной мацерации, что дополнительно подтверждает
рациональное использование метода МДМ при получении настоек.
Дляодновременнойоптимизацииполученных
множественных экспериментальных данных многофакторного
эксперимента, с переводом натуральных значений полученных
результатоввбезразмернуюшкалужелательностии
предпочтительности,использованаобобщённаяфункция
желательности Харрингтона. Для удобства визуализации
представления частной функции желательности в работе
использована цветовая шкала, соответствующая общим оценкам
желательности (Таблица 3).
Таблица 3 – Стандартные оценки по шкале желательности
ЖелательностьЧастная функция желательности (d)
Очень хорошо1,00-0,80
Хорошо0,80-0,63
Удовлетворительно0,63-0,37
Плохо0,37-0,20
Очень плохо0,20-0,00

Применяли следующие критерии оценки:
1) содержание спирта этилового (d1) – показатель, имеющий
двусторонние ограничения;
2) содержание БАВ (d2), сумма экстрактивных веществ (d3), время
технологического процесса (d4), стоимость сырья (d5) – показатели с
односторонним ограничением;
3) микробиологическая чистота (d6) содержит только 1
желательный вариант – соответствие категории 3Б, или 2 (1,00
частная функция желательности).
Использование этого сравнительного метода оценки
результатов показало, что для получения настоек боярышника,
пустырника, календулы, валерианы, мяты и эхинацеи наиболее
приемлемым является метод МДМ, так как показатель обобщенной
функции (D) у данных образцов выше, чем у других образцов из
одноименного ЛРС и соответствует или близок к желаемому
значению 0,8. Для образцов настойки боярышника он составляет
0,843, пустырника – 0,824, календулы – 0,825, валерианы – 0,785,
мяты перечной – 0,753, эхинацеи – 0,763. Данные показатели имеют
значения выше, чем значения у одноименных настоек, полученных
другими методами (Таблица 4).

Таблица 4 – Частные функции и обобщённые показатели
желательности экспериментальных (МДМ) и официнальных
образцов настоек (ДМ)

Образецd1d2d3d4d5d6D
ДМБ700,5370,9320,7380,6250,3721,0000,664
МДМБ350,9510,9890,9800,6250,6251,0000,843
ДМП700,9510,8090,7570,6250,3721,0000,717
МДМП350,8710,8900,9470,6250,6821,0000,824
ДМК700,8000,9630,8810,6250,3721,0000,735
МДМК350,8000,9970,9960,6250,6341,0000,825
ДМВ700,5810,9860,8130,6250,3721,0000,690
МДМВ350,5810,9930,9670,6250,6701,0000,785
ДММ900,4770,8320,9610,6250,3721,0000,668
МДММ510,5980,8360,9990,6250,5841,0000,753
ДМЭ400,7370,6100,7860,6250,3721,0000,659
МДМЭ150,9510,6100,8300,6250,6551,0000,763
Исследование токсичности, специфической активности,
стабильностииопределениесроковгодности
экспериментальных настоек
Для подтверждения целесообразности и перспективности
разработанного метода МДМ в отделе токсикологии ФГБНУ
ВИЛАР проведены исследования in vivo острой токсичности
экспериментальных настоек в сравнении с официнальными,
которые показали, что при одно- и двукратном внутрижелудочном
введении лабораторным животным 25 мл/кг и 50 мл/кг, токсичность
не увеличивается по сравнению с одноименными официнальными
настойками.
Сравнительное исследование биологической активности
экспериментальных и официнальных настоек, проведенное в отделе
экспериментальной и клинической фармакологии ФГБНУ ВИЛАР с
использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro
показало, что в условиях опытов in vitro. биологическая активность
экспериментальных настоек (МДМ) сопоставима с биологической
активностью одноименных официнальных настоек.
Для изучения стабильности экспериментальных настоек при
хранении в естественных условиях при температуре не выше +25°С
и определения их сроков годности, в эксперименте было заложено
по 40 стеклянных флаконов, объёмом 25 мл каждой настойки.
Результатами проведённого исследования показали, что
неизменность содержания БАВ и сроки годности составляют 2,5
года для настоек пустырника и валерианы и 3 года для настоек
боярышника, календулы, мяты перечной и эхинацеи.
На основании полученных результатов разработаны
технологические схемы получения настоек из ЛРС методом МДМ
(Рисунок 21, 22).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты определения нормируемых показателей и
специфической активности экспериментальных образцов настоек,
полученных методом модифицированной дробной мацерации с
индивидуализированным содержанием спирта этилового в
настойке, подтверждают рациональность использования метода в
производстве настоек.
Исследования стабильности настоек методом долгосрочных
испытаний,изготовленныхпоразработанномуметоду
модифицированной дробной мацерации, подтвердили сохранение
показателей качества и позволили определить их срок годности.
Снижение концентрации спирта даёт возможность
выпускать препараты с фасовкой большего объёма, согласно
приказу Минздрава №779н, что снизит затраты в производстве
настоек и позволит снизитьстоимостьпрепаратовна
фармацевтическом рынке.

ТП.4.3. повтор 1-2 раза
Рисунок 21 – Технологическая схема получения настоек
боярышника кроваво-красного плодов, пустырника сердечного
травы, календулы лекарственной цветков, валерианы лекарственной
корневищ с корнями, эхинацеи пурпурной травы методом
модифицированной дробной мацерации
ТП.4.3. повтор 2 раза
Рисунок 22 – Технологическая схема получения настойки мяты
перечной методом модифицированной дробной мацерации
РЕКОМЕНДАЦИИ
Разработанныйметодмодифицированнойдробной
мацерации может быть использован при получении экстрактивных
препаратов из разного вида лекарственного растительного сырья.
Для сокращения продолжительности технологического
процесса, экономии экстрагента, ресурсов, энергозатрат при
производстве настоек на фармацевтических предприятиях
рекомендуется использовать метод модифицированной дробной
мацерации.
Полученные результаты целесообразно включать в учебный
процесс для студентов и аспирантов фармацевтического профиля.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. Обоснованы перечень выбранных объектов исследования
как одних из наиболее востребованных лекарственных препаратов:
«Боярышника настойка», «Пустырника настойка», «Календулы
настойка», «Валерианы настойка», «Мяты перечной настойка»,
«Эхинацеи настойка» и необходимость совершенствования
технологии их получения.
2. Установлено, что при получении настоек методом
мацерации, перколяции, дробной мацерации со сниженной
концентрацией спирта этилового в среднем 2 раза по отношению к
официнальным, приводит к увеличению в них содержания суммы
экстрактивных веществ (сухой остаток) в (1,15±0,17) раз и к
снижению доминирующего комплекса БАВ в (0,90± 0,14) раз по
отношению к официнальным; такая тенденция характерна для
водных извлечений.
3. Разработанметодмодифицированнойдробной
мацерации и обоснована его рациональность для получения настоек
с индивидуализированным содержанием спирта в готовом продукте
не менее 35 % из боярышника кроваво-красного плодов,
пустырника сердечного травы, календулы лекарственной цветков,
валерианы лекарственной корневищ с корнями; не менее 51 % – из
мяты перечной листьев и не менее 15 % – из эхинацеи пурпурной
травы, который приводит к статистически достоверному
увеличению содержания суммы экстрактивных веществ для всех
экспериментальных настоек и доминирующих БАВ – для настоек
боярышника, пустырника, календулы, валерианы.
4. Доказано, что специфическая фармакологическая
активность в опытах in vitro и in vivo, а также токсичность в
«остром» опыте in vivo (при одно- и двукратном желудочном
введении лабораторным животным в дозе 25 мл/кг и 50 мл/кг)
экспериментальных настоек валерианы, календулы, пустырника и
боярышника, полученных методом модифицированной дробной
мацерации, не отличаются от официнальных настоек. Впервые
установлено, что экспериментальные настойка мяты перечной,
кроме известных свойств, проявляет адаптогенные свойства, а
настойкакалендулыдополнительнообладает
иммуномодулирующей активностью.
5. Доказанастабильностьметодомдолгосрочных
испытаний и определены сроки годности для экспериментальных
настоек боярышника, пустырника, календулы, валерианы, мяты
перечной, эхинацеи, полученных методом модифицированной
дробной мацерации с индивидуализированным содержанием спирта
и составляют 2,5 года для настоек пустырника и валерианы, 3 года
для настоек боярышника, календулы, мяты перечной и эхинацеи.
6. Разработаны опытно-промышленные регламенты на
производстволекарственныхпрепаратовметодом
модифицированной дробной мацерации «Боярышника настойка»,
«Пустырника настойка», «Календулы настойка», «Мяты перечной
настойка», «Эхинацеи настойка» и осуществлен трансфер их
технологии на фармацевтическое предприятие ЗАО «Ярославская
фармацевтическая фабрика».