Сравнительная эмбриология подрода Esula Pers. рода Euphorbia L. (Euphorbiaceae): развитие семязачатка и семени у избранных представителей

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В главе дана краткая характеристика молекулярно-филогенетического древа подрода Esula (Riina et al., 2013) – число основных клад и входящих в их состав секций, объем секций по числу видов, их распространение, жизненные формы. Отмечено соответствие двух крупных продвинутых клад – «суперклад» Holophyllum-Helioscopia и Myrsiniteae-Esula (далее условно обозначенных как клады I и II, соответственно) двум основным линиям эволюции подрода Esula (мезофильной и ксерофильной). Охарактеризованы различия в положении секции Lathyris на древе, построенном на основе комбинированного анализа маркеров и анализа ядерных маркеров, а также в системах, основанных на анализе морфологических признаков (Boissier, 1862; Проханов, 1964). Представлена краткая эмбриологическая характеристика сем. Euphorbiaceae и рода Euphorbia (согласно сводкам по сравнительной эмбриологии и анатомии семян), а также подробные сведения по развитию семязачатка и семени у видов Euphorbia и подрода Esula и итоги их систематизации. Отмечено значительное соответствие характеристик их развития таковым, приведенным в сводках, исключая дискуссионные признаки – морфологический тип семязачатка, наличие в семязачатках/семенах пахихалазы и системы постхалазального ветвления проводящего пучка. В связи с различной трактовкой строения халазы у видов Euphorbia рассмотрены принципы типизации структур халазальной части семязачатка цветковых растений; сделан вывод о большей корректности типизации И.И. Шамрова (2008) (модификации типизации K. Dahlgren, 1940), учитывающей происхождение, функции и пространственно-временную координацию развития структур.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Завязи и плоды на разных стадиях развития собирали в условиях естественного произрастания и интродукции: Euphorbia lathyris – с растений, интродуцированных на территории Перкальского дендрологического парка (Эколого-ботанической станции «Пятигорск») Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (г. Пятигорск) и

Ботанического сада Петра Великого БИН РАН (июнь-август 2016-2018гг.); E. myrsinites – на территории Ботанического сада БИН РАН (июнь-август 2016-2017гг.), E. rigida – в окр. г. Ялта (март 2015г.); E. komaroviana – на территории Ботанического сада-института ДВО РАН и в окр. г. Владивосток; E. rupestris – в Алтайском природном заповеднике (апрель, июнь 2015г.).
Для анализа процессов развития семязачатка и семени методом световой микроскопии (СМ) материал фиксировали в смеси FAA (100:7:7). Постоянные препараты изготавливали по общепринятой цитоэмбриологической методике (Паушева, 1980). Срезы толщиной 12 мкм получали на микротоме Microm HM 325 (Carl Zeiss, Germany) и окрашивали сафранином и алциановым синим, с последующим заключением в Mowiol 4-88 (Fluka, Germany). Для анализа признаков использовали примерно по 10 завязей и плодов разных растений на каждой стадии.
Внешнее строение семян изучали на стереомикроскопе Stemi-2000 (Carl Zeiss, Germany). Тонкие детали строения поверхности выявляли с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) JSM-6390 LA (Jeol Ltd, Japan), а также методом СМ на полутонких срезах. Для анализа методом СЭМ образцы напыляли смесью палладия с золотом. Для получения полутонких срезов (0.5-4.0 мкм) семена фиксировали в смеси глутаральдегид- формальдегид на 0.1 М фосфатном буфере с рН 7.4, промывали фосфатным буфером и дофиксировали 2% четырехокисью осмия; обезвоживали в серии ацетонов возрастающих концентраций (от 30 до 100%) и заливали в смесь эпона и аралдита. Срезы получали на микротоме Ultracat E (Reichert-Jung, Vienna) и окрашивали толуидиновым синим О.
Качественные гистохимические тесты на содержание в сферокристаллах липидов (окраска Суданом III) и углеводов (реакция Молиша, PAS-реакция) проводили по методикам У. Дженсен (1965), солей кальция – по методу Коссы (Ромейс, 1954), общих полисахаридов и белков (окраска проционовыми ярко-голубым RS и ярко-красным 2 BS) – по методу В.Б Иванова и Т.К. Литинской (1967). Строение сферокристаллов в поляризованном свете изучали по методу Н.А. Колтового (2021). Анализ и съемку препаратов осуществляли на световом микроскопе Axioplan 2 с ПО AxioVision (Carl Zeiss, Germany).
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Развитие семязачатка и семени у Euphorbia lathyris (монотипная секция
Lathyris)
Развитие семязачатка и зародышевого мешка. Гинецей у E. lathyris (как и у
остальных Euphorbia) синкарпный, из трех плодолистиков. В каждом гнезде 3-гнездной завязи формируется по одному семязачатку, закладывающемуся на центральной плаценте одновременно с плодолистиками. Далее плацента подвергается интеркалярному росту, с образованием колончатого выроста с 3 лопастями на апексе, каждая из которых формирует массивный плацентарный обтуратор. В итоге семязачатки, исходно лежащие в пазухах плодолистиков, оказываются расположенными на боковой поверхности верхушки плацентарного выроста.
Сформированный семязачаток геми-кампилотропный, крассинуцеллятный, битегмальный, с коротким фуникулусом и осью микропиле-халаза, расположенной под углом 15-25о к плаценте. Зародышевый мешок моноспорический, биполярный, 3-митозный – Polygonum-тип развития, по классификации И.Д. Романова (1971). В ходе развития семязачатка происходит заложение и формирование его основных структур, сопряженное с определенными стадиями мегаспоро- и мегагаметофитогенеза.
На ранних стадиях, в субэпидерме примордия семязачатка выделяются 1-3, но чаще – 2-3 клетки археспория, которые делятся периклинально с образованием париетальных и спорогенных клеток. Спорогенные клетки далее преобразуются в мегаспороциты, лежащие в один ярус друг под другом. Одновременно происходит формирование нуцеллуса, под которым выделяется будущая зона инициации интегументов и гипостазы, состоящая из таблитчатых клеток, вставочные деления которых приводят к значительному удлинению семязачатка.
К началу мейоза, в который вступает один или несколько мегаспороцитов, число слоев клеток нуцеллуса, включая париетальную ткань, увеличивается, в его базальной части выделяются инициали постамента и подиума. Происходит заложение внутреннего и
наружного интегументов, но что необычно – на удалении друг от друга и с проникновением в зону их инициации проводящего пучка (вследствие вставочных делений ее клеток).
По завершении мейоза в мегаспороцитах (с образованием линейной или Т-образной тетрады мегаспор, с функциональной халазальной мегаспорой) апекс нуцеллуса становится клювовидным и изогнутым к обтуратору. Клетки его эпидермы делятся периклинально, с образованием нуцеллярного колпачка: толщина париетальной ткани достигает 8-9 слоев клеток. В базальной части нуцеллуса формируются колонковидный постамент и бокаловидный подиум. В париетальной ткани и мегаспорах появляются сферические включения, а в постаменте – признаки лизиса, усиливающиеся к стадии функциональной мегаспоры, что проявляется в его интенсивной окраске сафранином. Начинается лизис латеральной части нуцеллуса. Происходит рост интегументов, но с опережающим ростом наружного интегумента. При этом основание внутреннего интегумента, в который проникает тяж прокамбия, становится особенно массивным, а в его пределах дифференцируются таблитчатые клетки инициалей гипостазы. Клетки, лежащие выше гипостазы, остаются меристематичными, ниже нее – становятся паренхиматозными. Таким образом, семязачаток E. lathyris характеризуется поздним выделением инициалей гипостазы (обычно закладывающихся одновременно с интегументами) и нетипичным положением окончания проводящего пучка (как правило, оканчивающегося возле гипостазы).
В ходе ценоцитных стадий развития женского гаметофита происходит возрастание массивности нуцеллуса, интегументов и халазы, а также достраивание гипостазы (за счет нижних производных делений клеток сохраняющейся вставочной зоны между нуцеллусом и гипостазой). В апикальной части наружного интегумента начинается формирование карункулы. К стадии 4-ядерного гаметофита в париетальной ткани (в области прилегания к гаметофиту) появляются признаки лизиса – при его одновременном усилении в клетках постамента и латеральной области нуцеллуса, что приводит к округлой форме гаметофита.
Сформированный зародышевый мешок – 7-клеточный 8-ядерный, все клетки сохраняются к моменту созревания гаметофита и завершения формирования семязачатка.
Сформированный семязачаток обычно содержит единственный зародышевый мешок, но иногда до трех мешков – один полностью развитый (зрелый) и два недоразвитых (в ценоцитном состоянии). Зрелый зародышевый мешок округлый, содержит яйцеклетку, две синергиды, центральную клетку (с двумя не слитыми полярными ядрами, находящимися в контакте возле яйцевого аппарата) и 3 вакуолизированные клетки антипод. Характерно, что при созревании гаметофита антиподы начинают смещаться халазальным концом центральной клетки из осевого в боковое положение. Нуцеллус с отчетливой зональностью строения – с присутствием в апикальной части париетальной ткани (12 слоев клеток, покрытых 1-3- слойным нуцеллярным колпачком), в средней – четких рядов вакуолизированных клеток, следующих от крупных клеток эпидермы к постаменту и антиподам. Базальная зона массивная, четко дифференцирована на бокаловидный подиум (из мелких таблитчатых, активно делящихся клеток) и колонковидный постамент, контактирующий с антиподами и ярко окрашивающийся сафранином. Клетки париетальной ткани и средней зоны содержат сферические включения.
Наружный интегумент в средней части 4-слойный, внутренний – 7-8-слойный, причем последний по-прежнему короче наружного и на этой стадии не участвует в формировании микропиле (последнее представлено экзостомом, в который врастают клетки обтуратора). Халаза необычного строения, с нетипичным положением окончания проводящего пучка и гипостазы. Проводящий пучок рафе входит в широкое основание внутреннего интегумента, куда смещена и чашевидная гипостаза, подстилающая здесь лишь основание нуцеллуса. В проводящем пучке рафе присутствуют элементы ксилемы, но в гипостазе и основании внутреннего интегумента его ответвления представлены прокамбием, контактирующим с сохраняющейся вставкой делящихся клеток между гипостазой и подиумом. Клетки вставки, прокамбия и гипостазы образуют единое целое – халазу, с отчетливыми лишь внешними границами и суммарной толщиной структур (включая постамент и подиум) 33-35 слоя клеток.
Развитие семени. После оплодотворения в формирующихся семенах происходит усиление искривления оси микропиле-халаза (за счет преобладания роста всех структур с стороны антирафе): семена становятся кампилотропными (с легким изгибом всех структур). К стадии зиготы внутренний интегумент полностью обрастает нуцеллярный клюв (с образованием эндостома и зигзагообразного микропиле), а наружный – внутренний интегумент, с окончательным формированием в апикальной части карункулы. Эмбриогенез включает стадии зиготы, проэмбрио, глобулярного, сердечковидного, торпедовидного, сформированного и зрелого зародыша. Интегументы преобразуются в тесту и тегмен.
Эндоспермогенез нуклеарного типа. Первичная клетка эндосперма делится раньше зиготы, при этом ее халазальный конец образует инвагинации в постамент и окончательно смещает антиподы в боковое положение, которые далее (как и недоразвитые дополнительные зародышевые мешки) подвергаются деструкции; пыльцевая трубка длительно сохраняется в синергиде. На стадии раннего проэмбрио наблюдается удлинение эндоспермального ценоцита, а далее – расширение и обособление его халазальной части, с приобретением ею пузыревидной формы, плотной цитоплазмы с большим количеством ядер и образованием клиновидных выростов в постамент. На стадии глобулярного зародыша в эндосперме начинается клеткообразование, завершающееся на стадии сердечковидного зародыша, исключая его обособленную халазальную часть. Наличие этих особенностей развития халазальной части эндосперма свидетельствуют о выполнении ею гаусториальной функции. Со стадии торпедовидного зародыша эндосперм полностью заполняется клетками, которые аккумулируют обильные запасные вещества – белки и масла.
Развитие эндосперма также сопровождается существенными изменениями в нуцеллусе и халазе. На стадиях проэмбрио-глобулярного зародыша продолжается лизис клеток нуцеллуса, прилегающих к эндосперму, в париетальной ткани исчезают сферические включения, однако размеры подиума резко возрастают, за счет периклинальных и антиклинальных делений клеток и их радиального удлинения. К стадии сердечковидного зародыша подиум приобретает характерный вид «нуцеллярной подушки», но далее (как и постамент и париетальная ткань) подвергается деструкции. Периклинальные деления клеток гипостазы и клеток вставки в основании нуцеллуса и внутреннего интегумента также длятся до стадии сердечковидного зародыша, что приводит к увеличению массивности халазы и сокращению длины тегмена со стороны нуцеллуса. Толщина структур халазальной части семени к этой стадии достигает 80-82 слоев клеток. Рост массивности халазы сопровождается проникновением окончаний проводящего пучка не только в гипостазу и основание тегмена, но что особенно необычно – в подиум нуцеллуса, с образованием своеобразной системы постхалазального ветвления. На уровне гипостазы и основания тегмена они представлены элементами ксилемы и специфическими удлиненными клетками с утолщенными оболочками, окрашивающимися алциановым синим, однако на уровне подиума лишь специфическими клетками, ветвящимися, анастомозирующими и встраивающимися в систему клеток подиума. При этом специфические клетки проводящего пучка очень сходны с млечниками перикарпия. Характерно, что вхождение специфических клеток в подиум осуществляется в зоне делящихся клеток вставки между подиумом и гипостазой и коррелирует с накоплением в клетках подиума сферических включений (рис. 1, 1а-в). Со стадии торпедовидного зародыша халаза приобретает вид чаши (с погружением в нее эндосперма), верхняя часть которой участвует в построении семенной кожуры; клетки гипостазы и вставки (с утолщенными оболочками) заполняются танинами.
Таким образом, развитие халазы в семени E. lathyris характеризуется рядом особых черт: 1) ее значительной массивностью, сопряженной с развитием системы «постхалазального ветвления» – в виде сети дополнительных пучков, продолжающихся в гипостазу, основание тегмена и (в виде особых клеток) – в нуцеллус; 2) относительно глубоким погружением в нее эндосперма в созревающем семени; 3) ее частичным участием в построении семенной кожуры. Следовательно, исходя из критериев типизации (Periasamy, 1962; Сorner, 1976; Boesewinkel,
Bouman, 1984; Шамров, 2008), халаза E. lathyris является тегминальной пахихалазой (по Сorner, 1976), или эндопахихалазой (по Boesewinkel, Bouman, 1984).
Семенная кожура формируется с участием обоих интегументов. В прогамной фазе число слоев тегмена увеличивается до 14-16 (за счет периклинальных делений клеток промежуточных слоев наружного интегумента), а тесты – до 5-7, но нерегулярно (за счет периклинальных делений клеток промежуточных слоев внутреннего интегумента); при этом
Рис. 1. Строение халазальной части семени на стадии сердечковидного зародыша: 1а-в – E. lathyris, 2а-в – E. komaroviana, 3а-в – E. myrsinites, 4а-в – E. rigida (1а, 2а, 3а, 4а – общий вид халазы,
1б, 2б, 3б, 4б – ее фрагменты в области гипостазы и подиума (видна различная глубина вхождения специфических клеток окончаний проводящего пучка), 1в, 2в, 3в, 4в – зональность строения халазы); г – гипостаза, пд – подиум, пс – постамент, с к – специфические клетки, х г э – халазальный гаусторий эндосперма. Масштабная линейка: 50 мкм.
деления клеток сопряжены с началом активных делений клеток в халазальной части семени. Эти процессы сопровождаются дифференциацией тегмена на экзо-, мезо- и эндотегмен, а тесты – на экзо-, мезо- и эндотесту, с приобретением каждым из слоев специфических черт строения к стадии сердечковидного зародыша. Экзотегмен представлен удлиненными склереидами (неравномерными по длине и с сильно утолщенными пористыми стенками), эндотегмен – трахеидоподобными клетками (с неравномерными кольчатыми утолщениями клеточных стенок), мезотегмен – тонкостенными клетками промежуточных слоев (большей частью облитерирующих в зрелом семени). Экзотеста представлена крупными выпуклыми клетками наружной эпидермы (с утолщенными внешними оболочками), эндотеста – радиально удлиненными клетками внутренней эпидермы (с утолщенными внутренними периклинальными и антиклинальными стенками), мезотеста – уплощенными тонкостенными клетками промежуточных слоев. Клетки всех слоев в процессе развития постепенно

утрачивают свое содержимое, однако в клетках мезотесты и отдельных клетках экзотесты после стадии глобулярного зародыша появляются сферические включения, визуально сходные с включениями клеток нуцеллуса, но значительно меньших размеров.
Рис. 2. Строение тесты зрелого семени: 1а, б – E. lathyris, 2а, б – E. komaroviana, 3а, б – E. rupestris, 4а, б – E. myrsinites, 5а-в – E. rigida; 1а, 2а, 3а, 4а, 5а – СМ, 1б, 2б, 3б, 4б, 5б, в – СЭМ; ск – сферокристаллы. Масштабная линейка: 4а, 5а – 50; 2б, 5в – 20; 1а, 2а, 3а – 10; 1б, 3б, 4б, 5б – 5 мкм.
Зрелые семена яйцевидные, коричневые (иногда неравномерно окрашены), длиной около 5, шириной – около 3 мм, уплощенные в дорсивентральной плоскости и асимметричные в латеральной проекции, с рубчиком и желтоватой карункулой. Поверхность семени покрыта мелкими складками с бугорками на вершинах. Семена кампилотропные, экзотегминальные, с несколько изогнутым зародышем и массивным эндоспермом. Зародыш осевой, лопатчатый, с развитыми семядолями (с системой проводящих пучков и млечников), апексом побега (в виде конуса нарастания) и изогнутой гипокотиль-корневой осью. Специализированные структуры микропилярной и халазальной части представлены эпистазой, склерифицированными клетками эндостома и эндопахихалазой, клетки которой, включая гипостазу, содержат танины. Все слои тесты и тегмена входят в состав семенной кожуры. При этом специфической особенностью клеток мезотесты и отдельных клеток экзотесты является присутствие в них особых сферических тел, ранее идентифицированных как сферокристаллы (Гельтман и др., 2014). На сколах клеток они выглядят как отдельные мельчайшие тела, часто объединенные в более крупные массы, занимающие бóльшую часть полостей клеток (рис. 2, 1а, б). Данные по генезису тесты указывают на то, что они являются продуктами кристаллизации сферических включений, накапливающихся в ней в процессе развития. Помимо этого, для клеток тесты характерно присутствие иных кристаллоподобных образований – конгломератов зернистых включений в клетках экзотесты, неравномерных отложений на внутренних периклинальных и антиклинальных стенках клеток эндотесты.
3.2. Развитие семязачатка и семени у Euphorbia komaroviana и E. rupestris (секция Holophyllum)
3.2.1. Euphorbia komaroviana
Развитие семязачатка и зародышевого мешка. Строение гинецея, характер развития
плодолистиков и перемещения семязачатков по плаценте у E. komaroviana сходны с таковыми E. lathyris. Семязачаток также геми-кампилотропный, крассинуцеллятный, битегмальный (с коротким фуникулусом и осью микропиле-халаза, лежащей под углом 15-25о к плаценте), зародышевый мешок того же Polygonum-типа развития. Их развитие (прослеженное со стадии мейоза) отличается лишь несколькими признаками – формированием более массивного спорогенного комплекса и его двуярусной организацией (о чем свидетельствует присутствие в семязачатке множественных линейных тетрад мегаспор – не менее 6 в каждом ярусе), а также значительным удлинением нуцеллуса на поздних стадиях развития, что обуславливает узкую, удлиненную форму его зародышевого мешка (развивающегося, как и у E. lathyris, как правило, на безе одной из тетрад мегаспор, занимающей в нуцеллусе центральное положение). Кроме

того, антиподы в гаметофите E. komaroviana в ходе развития сохраняют осевое положение, а лизис клеток постамента (с окрашиванием сафранином) начинается лишь при созревании гаметофита, причем для последних характерно накопление сферических включений.
Сформированный семязачаток имеет ту же зональность строения нуцеллуса и халазы – с тем же нетипичным строением и той же массивностью структур, что и у E. lathyris (12 слоев клеток париетальной ткани, 33-35 слоев клеток в халазальной части, 4-слойный наружный и 7-8-слойный внутренний интегументы); в его халазальной части (между бокаловидным подиумом и чашевидной гипостазой) также присутствует вставка клеток. В редких случаях в семязачатке E. komaroviana также наблюдалось формирование дополнительных гаметофитов, более развитых, однако, чем у E. lathyris (иногда достигающих клеточного состояния).
Развитие семени. Процесс развития семени у E. komaroviana также очень сходен с таковым E. lathyris, что проявляется как в общей схеме его формирования, так и сходном характере морфогенетических корреляций в развитии структур.
Так, после оплодотворения для формирующегося семени E. komaroviana также характерно продолжение искривления оси микропиле-халаза и становление кампилотропии, образование зигзагообразного микропиле (в прогамной фазе) и длительное сохранение антипод (до стадии зиготы). Эмбриогенез включает те же стадии; эндоспермогенез нуклеарного типа (с образованием халазального гаустория), оба интегумента участвуют в формировании семенной кожуры. Деления клеток в халазальной части семени также длятся до стадии сердечковидного зародыша и сопровождаются возрастанием массивности ее структур – подиума, гипостазы и вставки клеток между подиумом и гипостазой (при постепенном лизисе париетальной ткани, латеральной области нуцеллуса и постамента). Окончания проводящего пучка (вместе со специфическими клетками) проникают в основание тегмена, гипостазу и подиум нуцеллуса (в подиум – в области вставки клеток), при этом их проникновение в подиум коррелирует с накоплением его клетках сферических включений и внедрением клиновидных выростов гаустория эндосперма в постамент. К стадии сердечковидного зародыша (рис. 1, 2а-в) халаза в семени E. komaroviana и система постхалазального ветвления его проводящего пучка достигает примерно той же степени развития, что и у E. lathyris (с толщиной структур в 80-82 слоя клеток и сокращением длины тегмена со стороны нуцеллуса), что также свидетельствует о формировании в нем эндопахихалазы. Вместе с тем, E. komaroviana отличает специфическая форма гаустория эндосперма (как и у E. lathyris, пузыревидная, но сильно сужающаяся в нижней части), более интенсивное накопление сферических включений в подиуме к стадии сердечковидного зародыша и менее глубокое погружение эндосперма в эндопахихалазу при созревании семени (на 1/3, а не на 2/3 как у E. lathyris).
Развитие интегументов протекает по той же схеме, что и у E. lathyris – с дифференциацией тегмена на экзо-, мезо- и эндотегмен, а тесты – на экзо-, мезо- и эндотесту, однако в прогамной фазе число слоев клеток увеличивается лишь в тегмене (12-14 слоев клеток); толщина тесты остается неизменной (4 слоя клеток). Клетки всех слоев тегмена и тесты в целом устроены также как и у E. lathyris, но склереиды экзотегмена однородны по длине, а для клеток тесты не характерен процесс накопления сферических включений.
Зрелые семена E. komaroviana той же организации и с теми же запасными веществами, что у E. lathyris, исключая различия в окраске, размерах семян (блестящих, коричневых, около 5,5 мм в длину и 4 мм в ширину) и ровную структуру их поверхности. Однако, тесту этого вида отличает полное отсутствие в ее клетках сферокристаллов (рис. 2, 2а, б), что коррелирует с отсутствием накопления в них сферических включений на более ранних стадиях развития.
3.2.2. Euphorbia rupestris
В связи с ограниченностью материала по E. rupestris (труднодоступный эндемик
Западной Сибири), развитие семязачатка и семени у данного вида было прослежено лишь на отдельных стадиях. Тем не менее, полученные данные позволяют говорить о значительном сходстве этих процессов с таковыми E. lathyris, и особенно E. komaroviana. Так, сформированный семязачаток E. rupestris также геми-кампилотропный, крассинуцеллятный
битегмальный, с искривлением оси микропиле-халаза в области микропиле, с той же зональностью строения нуцеллуса, интегументов и халазы. Как и у E. komaroviana, семязачаток содержит узкий, длинный 7-клеточный 8-ядерный зародышевый мешок с антиподами, сохраняющими осевое положение и без признаков деструкции в прогамной фазе. Постамент также почти без признаков лизиса и со сферическими включениями, халаза нетипичного строения и с той же массивностью структур (33-35 слоев).
На стадии глобулярного зародыша строение семени также сходно с E. komaroviana (становление кампилотропии, зигзагообразного микропиле и ценоцитного эндосперма с пузыревидным гаусторием с клиновидными выростами). Строение нуцеллуса и халазальной части семени близко к таковому E. komaroviana на той же стадии развития – с суммарной массивностью структур 51-53 слоя в толщину и началом вхождения окончаний проводящего пучка в гипостазу и подиум нуцеллуса, что также свидетельствует о формировании в семени E. rupestris эндопахихалазы. Толщина тегмена, как и у E. komaroviana, составляла 12-14 слоев (с дифференциацией на экзо, мезо- и эндотегмен), но толщина тесты, состоящей из экзо-, мезо- и эндотесты, была неравномерной – 4-7 слоев клеток (как у E. lathyris).
Зрелые семена E. rupestris той же окраски и формы, что у E. komaroviana, но меньших размеров (длина около 3,5, ширина – около 2,5 мм) и с неровной поверхностью (как у E. lathyris). Общая конструкция семени сходна с E. komaroviana – кампилотропные, экзотегминальные, с развитым зародышем, эндоспермом и той же организацией тегмена и тесты (исключая структуру склереид и более многослойную тесту), но, что характерно, как и у E. komaroviana, с полным отсутствием сферокристаллов в клетках тесты (рис. 2, 3а, б).
3.3. Развитие семязачатка и семени у Euphorbia myrsinites и E. rigida (секция Myrsiniteae)
Развитие семязачатка и зародышевого мешка. Общая схема формирования семязачатка у видов секции Myrsiniteae в целом та же, что и у видов секций Lathyris и Holophyllum, однако имеются существенные отличия.
Так, для E. myrsinites также характерно заложение в семязачатке множественного археспория, формирование на его базе спорогенных и париетальных клеток, прохождение мейоза с образованием линейных или Т-образных тетрад мегаспор с функциональной халазальной мегаспорой и Polygonum-тип развития зародышевого мешка. Сформированный семязачаток также геми-кампилотропный, крассинуцеллятный, битегмальный. В то же время, археспорий E. myrsinites представлен 8-9 клетками, а спорогенный комплекс – 16-18 клетками, лежащими в два яруса (двуярусность создается за счет повторных периклинальных делений спорогенных клеток). Все спорогенные клетки преобразуются в мегаспороциты, но в первую очередь – центральные мегаспороциты верхнего яруса, при этом, в отличие от E. lathyris, мегаспороциты лежат преимущественно в дорсивентральной плоскости семязачатка. На этой стадии в семязачатке уже закладываются интегументы, но также на удалении друг от друга.
В мейоз вступают большинство мегаспороцитов, с образованием множественных тетрад мегаспор, однако дальнейшее развитие претерпевает единственная осевая тетрада верхнего яруса. Семязачаток на стадии развития функциональной мегаспоры устроен также, но отличается иным соотношением структур – более развитой париетальной тканью (12 слоев) при меньшем развитии латеральной и базальной части нуцеллуса (4-5 и 6-7 слоев).
Сформированный зародышевый мешок также 7-клеточный 8-ядерный, но при созревании становится 8-9-клеточным, 8-10-ядерным – вследствие делений клеток и ядер антипод, с образованием 4-5-клеточного антиподального аппарата, сохраняющего осевое положение. Развитие семязачатка в ходе мегагаметофитогенеза также протекало с отличиями – с почти полным прекращением делений клеток париетальной ткани (12-13 слоев) и менее интенсивным развитием базальной части нуцеллуса (с началом активного лизиса постамента со стадии 2-4-ядерного гаметофита, а париетальной ткани и латеральной области – лишь при его созревании), а также с отсутствием образования дополнительных гаметофитов.
Зональность строения нуцеллуса и халазы в сформированном семязачатке сходна с таковыми видов секций Lathyris и Holophyllum (с тем же нетипичным положением гипостазы
и окончания проводящего пучка и вставкой клеток между подиумом и гипостазой). Однако, массивность структур, составляющих халазальную часть значительно меньше, чем у видов секций Lathyris и Holophyllum (суммарно лишь 24-26 слоев в толщину) при сходной толщине париетальной ткани (12 слоев) и интегументов (внутренний –7-8, наружный – 4 слоя).
Развитие семязачатка у E. rigida по большинству признаков сходно с E. myrsinites, но тип развития женского гаметофита выявить не удалось. Строение зрелого зародышевого мешка и сформированного семязачатка идентично таковому E. myrsinites, с единственным отличием в отсутствии делений ядер в клетках антипод (8-9-клеточный, 8-9-ядерный).
Развитие семени у изученных видов секции Myrsiniteae в целом осуществляется по той же схеме, что и у видов секций Lathyris и Holophyllum – постепенное становление кампилотропии семян, формирование зигзагообразного микропиле (в прогамной фазе), эндосперма с халазальным гаусторием (нуклеарного типа развития), дифференцированного на органы зародыша (с теми же стадиями развития) и семенной кожуры на основе обоих интегументов. Однако виды этой секции отличаются по степени выраженности гаустория эндосперма, длительности делений клеток в структурах халазальной части семени (и соответственно, их массивности), а также по особенностям развития семенной кожуры.
Так, гаусторий эндосперма у обоих видов выражен слабее (без выростов в постамент), хотя антиподы также сохраняются до стадии зиготы и первых делений ядер эндосперма. Развитие гаустория также коррелирует с продолжением лизиса постамента, ростом массивности подиума и развитием проводящей системы семени. Однако, вследствие более раннего прекращения делений клеток в структурах халазальной части семени (к стадии глобулярного зародыша) массивность последних значительно меньше, чем у видов секций Lathyris и Holophyllum, а система постхалазального ветвления ограничена. Их суммарная толщина к этой стадии достигает лишь 32-35 слоев (у видов секций Lathyris и Holophyllum 80- 82 слоя) и к стадии сердечковидного зародыша не меняется, а вхождение специфических клеток окончаний проводящего пучка в подиум блокируется на уровне гипостазы (исключая редкие случаи их вхождения в подиум у E. myrsinites) (рис. 1, 3а-4в). Тем не менее, в клетках подиума этих видов также отмечалось появление сферических включений (более интенсивное у E. myrsinites). Погружение эндосперма в халазу на поздних стадиях менее значительно (⁓ на 1/4), как и ее участие в построении семенной кожуры. Таким образом, в семени этих видов также формируется эндопахихалаза, однако значительно менее развитая, чем у видов секций Lathyris и Holophyllum. Несмотря на это, развитие париетальной ткани и латеральной части нуцеллуса у всех видов сходно (резорбция включений, последующий лизис структур).
Развитие семенной кожуры осуществляется также – с дифференциацией тегмена на экзо-, мезо- и эндотегмен, а тесты – на экзо-, мезо- и эндотесту. В то же время, для видов секции Myrsiniteae характерно сочетание признаков видов секций Lathyris и Holophyllum. Так, число слоев тегмена в прогамной фазе у E. myrsinites и E. rigida увеличивается до 12-14 (как у E. komaroviana и E. rupestris), тесты – лишь у E. myrsinites (до 5–6, как у E. lathyris и E. rupestris); теста E. rigida остается 4-слойной (как у E. komaroviana). Склереиды экзотегмена E. myrsinites гетерогенны по длине – как у E. lathyris и E. rupestris, но у E. rigida однородны – как у E. komaroviana (эндотегмен у обоих видов также из трахеидоподобных клеток). Структура клеток тесты в целом та же, что и у видов секций Lathyris и Holophyllum, однако мезотеста E. myrsinites и E. rigida резко отличается накоплением в ней сферических включений – характерных и для E. lathyris, но гораздо более обильных и накапливающихся лишь в клетках мезотесты, и практически не свойственных видам секции Holophyllum. Клетки экзотесты E. myrsinites и E. rigida (как и у E. lathyris) содержат зернистые включения.
Зрелые семена той же общей конструкции и с теми же запасными веществами, что у видов секций Lathyris и Holophyllum, однако они удлиненно-яйцевидные, около 4,5-5 мм в длину и 3 мм в ширину и с характерной матовой окраской поверхности – складчатой у E. myrsinites, но относительно ровной у E. rigida (что связано со спецификой морфологии их склереид и различиями в толщине тесты). В то же время, наиболее характерным отличием
строения тесты E. myrsinites и E. rigida является присутствие в клетках мезотесты обильных сферокристаллов, выделяющихся на поверхность семени через систему «поверхностных
Рис. 3. Сферокристаллы в клетках тесты и подиума в поляризованном свете: 1а-2в – строение тесты E. lathyris и E. myrsinites в обычном (1а, 2а) и поляризованном (1б, в, 2б, в) свете, 3-5 – строение подиума в поляризованном свете (3 – E. lathyris, 4 – E. myrsinites, 5 – E. komaroviana); ск –
сферокристаллы. Масштабная линейка: 1а, б, 2а, б, 3, 4а, 5 – 50; 1в, 2в, 4б – 10 мкм.
межклетников» и обуславливающих матовость окраски последней (рис. 2, 4а-5б). Причем генезис тесты также указывает на их образование в результате кристаллизации накапливающихся в ней сферических включений. В то же время, карункула и подиум у видов со сферокристаллами в тесте и без них существенно отличались по содержанию липидов. Так, реакция карункулы на содержание липидов у видов со сферокристаллами в тесте была гораздо более интенсивной, чем у видов без сферокристаллов в тесте, тогда как в подиуме – наоборот, более слабо выраженной у видов со сферокристаллами в тесте (E. myrsinites).
3.4. Гистохимический анализ сферокристаллов
Гистохимический анализ сферокристаллов тесты проводили у E. lathyris и E. myrsinites, различающихся по характеру их локализации (E. lathyris – в клетках мезо- и экзотесты, E. myrsinites – в клетках мезотесты) и поведения (E. myrsinites – с выделением, E. lathyris – без выделения на поверхность семени). Применение различных тестов показало, что у обоих видов сферокристаллы содержат липиды и соли кальция (присутствия других соединений не выявлено). Характерно, что в поляризованном свете они проявляли свойство двойного лучепреломления в виде симметричного «Мальтийского креста» (с постоянством ориентации и яркости свечения при вращении столика микроскопа); при этом у E. lathyris отчетливо видно их частое объединение в более крупные массы. В отличие от этого, кристаллоподобные образования и зернистые включения в клетках экзотесты у обоих видов двойного лучепреломления в поляризованном свете не имели (рис. 3, 1а-2в).
Анализ других структур семени в поляризованном свете (включая виды без сферокристаллов в клетках тесты) показал, что сферокристаллы с симметричным «Мальтийским крестом» также образуются в карункуле (как и теста, производной наружного интегумента) и подиуме нуцеллуса: в карункуле – при созревании семени, а в подиуме – со стадии сердечковидного зародыша. В карункуле они локализованы главным образом в клетках центральной паренхимы (генеалогическом продолжении клеток мезотесты), но в явно большем количестве у видов со сферокристаллами в тесте (E. myrsinites, E. lathyris). В подиуме отмечена обратная зависимость: большое количество сферических включений с «Мальтийским крестом» у E. komaroviana и E. rupestris без сферокристаллов в тесте, но их почти полное отсутствие у E. lathyris и E. myrsinites со сферокристаллами в тесте (у E. myrsinites они появлялись в единичных количествах и лишь при деструкции большей части подиума) (рис. 3, 2-3б, 5). Гистохимический анализ (PAS-реакция, окрашивание Суданом III) показал, что клетки карункулы и подиума у всех видов содержат пластиды с крахмалом, а также липиды, концентрирующиеся как возле пластид (липидные капли), так и в самих пластидах; при этом собственно зерна крахмала в поляризованном свете двойного лучепреломления не имели. В то же время, карункула и подиум у видов со сферокристаллами

в тесте и без них существенно отличались по содержанию липидов. Так, реакция карункулы на содержание липидов у видов со сферокристаллами в тесте была гораздо более интенсивной, чем у видов без сферокристаллов в тесте, тогда как в подиуме – наоборот, более слабо выраженной у видов со сферокристаллами в тесте (E. myrsinites).
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование в целом подтвердило общую схему формирования семязачатка и семени в роде Euphorbia, но также внесло в их характеристики определенные уточнения. Изученные нами виды также характеризуются наличием крассинуцеллятных, битегмальных семязачатков (с коротким фуникулусом, нуцеллярным клювом, зигзагообразным микропиле), нуклеарного типа эндоспермогенеза, экзотегминальных семян с развитыми зародышем, эндоспермом и с карункулой (Corner, 1976; Johri, 1992; Kapil, Bhatnagar, 1994; Tokuoka, Tobe, 1995; Камелина, 2009, и др.). Однако, по нашим данным, они имеют геми-кампилотропные, а не анатропные семязачатки (как считалось ранее) и кампилотропные семена, с формированием в эндосперме халазального гаустория, а в семени – эндопахихалазы и системы постхалазального ветвления проводящего пучка – дискуссионных признаков в роде Euphorbia.
Большинство авторов считают семязачаток Euphorbia анатропным, но некоторые определяют его как гемитропный или геми-кампилотропный. Как известно, анатропный семязачаток имеет прямую ось микропиле-халаза (с полным обращением микропиле к плаценте). Однако у всех изученных нами видов, как и у других детально изученных в этом отношении видов Euphorbia (E. palustris, E. squamosa, E. virgata, E. iberica, и др.; Титова и др., 2018; Виноградова, 2017), она лежит под углом к плаценте и изогнута в области микропиле – признак геми-кампилотропных семязачатков (по Шамров, 2017). Подтверждением этому служит усиление искривления морфологической оси при развитии семени, становящегося кампилотропным, с изгибом всех структур (Титова и др., 2018, 2019).
Наличие эндоспермальных гаусториев – мешковидных, с пальцевидными выростами, ранее отмечено лишь в роде Croton сем. Euphorbiaceae (Kapil, Bhatnagar, 1994). Однако, по мнению ряда авторов, виды Euphorbia (особенно подрода Esula) также обладают халазальным гаусторием эндосперма (хотя и разной активности), на что указывает гипертрофия ядер, задержка образования клеток в его халазальной части (Modilewski, 1909; Carmichael, Selbo, 1999), а у некоторых видов – и формирование выростов, внедряющихся в нуцеллус (E. condylocarpa; E. squamosa, и др., Титова и др., 2018). Сходные особенности развития этой части эндосперма отмечены и у изученных нами видов Euphorbia, причем по степени обособленности и развития выростов у E. lathyris и E. komaroviana она особенно сопоставима с гаусториями Croton, что резко укрепляет эту точку зрения.
Мнение об отсутствии в семени Euphorbia пахихалазы и системы постхалазального ветвления проводящего пучка (Corner, 1976; Tokuoka, Tobe, 2002) связано со слабой изученностью генезиса его халазальной части и применением несовершенных типизаций структур. О наличии этих признаков у видов Euphorbia свидетельствуют данные о массивности их халазы, нетипичном («тегминальном») положении в семязачатке гипостазы и проводящего пучка, с его вхождением в основание внутреннего интегумента и гипостазу (E. geniculatа, S.P. Singh, 1959; Bor, Kapil, 1975; E milii, Bor, Bouman, 1974; E. virgata, E. iberica, E. cyparissias, и др.; Титова и др., 2018), а у ряда видов – и в подиум нуцеллуса (E. palustris, Е. soongarica, E. squamosa, E. condylocarpa; Титова и др., 2018). У ряда видов отмечено частичное участие халазы в построении семенной кожуры и даже накопление ею запасных веществ (E. hirta – Kajale, 1954; E. dracunculoides, E. microphylla – Mukherjee, 1961; E. helioscopia – Singh, 1969, и др.). Несмотря на наличие признаков, типичных для эндопахихалазальных семян (Boesewinkel, Bouman, 1984; Шамров, 2008), многие авторы определяли их халазу как обычную халазу (мезохалазу, по Шамров, 2008) – очевидно, вследствие ее значительной редукции в роде Euphorbia и трактовки «нуцеллярной подушки» семени как гипостазы, в действительности – подиума нуцеллуса, по типизации Dahlgren (1940) и Шамрова (2008). Собственно гипостаза (пограничная ткань между нуцеллусом и халазой, по Шамрову, 2008) в
семени Euphorbia лежит ниже подиума, но на удалении от него – вследствие образования вставки клеток между основаниями внутреннего интегумента и нуцеллуса, которое также приводит к укорочению тегмена со стороны нуцеллуса. Причем наличие этой вставки подтверждает представление об эндопахихалазе как о продукте конгенитального объединения внутреннего интегумента и нуцеллуса (Шамров, 2008)
Также наше исследование подтвердило преобладание в роде Euphorbia и его подроде Esula многоклеточного археспория и Polygonum-типа развития зародышевого мешка. Как известно, роду Euphorbia свойственно наличие моно-, би- и тетраспорических типов развития женского гаметофита; при этом би- и тетраспорические типы о сих пор выявлены лишь в его подроде Esula (Bhanwra, 1987; Виноградова, 2017; Титова, Нюкалова, 2021, и др.).
В то же время, несмотря на сходную общую схему формирования семязачатка и семени и единый Polygonum-тип развития женского гаметофита (кроме E. rupestris и E. rigida), виды секций Lathyris, Holophyllum и Myrsiniteae, принадлежащих к различным кладам молекулярно- филогенетического древа подрода Esula рода Euphorbia (Riina et al., 2013), различаются: 1) по массивности структур семязачатка и семени, особенно базальной части нуцеллуса и эндопахихалазы, 2) числу клеток археспория, 3) организации спорогенного комплекса, 4) потенциям репродуктивных клеток к формированию дополнительных зародышевых мешков, 5) особенностям развития антипод и, соответственно, строению зрелого зародышевого мешка, 6) характеру развития халазального гаустория эндосперма и глубине погружения эндосперма в ткань эндопахихалазы в зрелом семени, 7) степени развития системы постхалазального ветвления проводящего пучка семени, 8) толщине тегмена по завершении прогамной фазы и специализации клеток экзотегмена в зрелом семени, 9) толщине тесты и наличию/отсутствию в ней сферокристаллов. При этом сравнительный анализ морфогенетических корреляций в развитии структур показал, что бόльшая часть различий являются взаимосвязанными, что, однако, менее выражено на этапе формирования семязачатка.
Так, связь числа клеток археспория с массивностью структур, особенно нуцеллуса семязачатка – традиционно считающихся связанными признаками (Никитичева, 1994; Кордюм, 1994, и др.), у подробно изученных в этом отношении видов подрода Esula с Polygonum-типом развития гаметофита (E. lathyris, E. myrsinites, E. komaroviana – наши данные; E. virgata – Виноградова, 2017) не прослеживается. У E. lathyris с максимальной массивностью структур семязачатка (базальная клада Lathyris) число клеток археспория минимально (1-3), а спорогенные клетки периклинально не делятся, тогда как у видов с меньшей массивностью структур (E. myrsinites и E. virgata из клады II) число клеток археспория значительно, а спорогенный комплекс сложно организован (два яруса вследствие периклинальных делений клеток). У всех видов, независимо от массивности семязачатка, большинство спорогенных клеток преобразуются в мегаспороциты и вступают в мейоз с образованием тетрад мегаспор, но в основном развиваются центральные мегаспороциты, а после мейоза – обычно одна центральная тетрада мегаспор. Эти факты свидетельствуют о том, что потенции клеток к развитию более определяются их положением в нуцеллусе (оптимальным в отношении транспорта веществ), что подтверждает точку зрения о роли позиционного контроля в регуляции этих процессов (Dawe, Freeling 1992; Chevalier et al., 2011; Tucker, Koltunow, 2014; Vinogradova, Zhinkina, 2021, и др.). Тем не менее, склонность более массивных семязачатков E. lathyris и E. komaroviana из секций Lathyris и Holophyllum, а также некоторых видов секции Helioscopia из клады I подрода Esula (E. palustris, Титова и др., 2015) к формированию нескольких зародышевых мешков все же заслуживает внимания.
Более отчетливы связи в развитии антипод и халазального гаустория эндосперма, хотя и формирующегося после оплодотворения. Всем изученным нами видам свойственно длительное функционирование антипод (до стадии зиготы), способствующих транспорту веществ к зародышевому мешку из халазальной части семязачатка до становления гаустория эндосперма (Zhukova, Batygina, 2006). Последнее подтверждается и спецификой зональности строения их нуцеллуса – четкой ориентацией рядов клеток латеральной части нуцеллуса и постамента в направлении антипод (базальный путь транспорта метаболитов в семязачатке,
по Шамрову, 2008). Однако, разное время становления гаусториальной активности эндосперма определяет разный характер развития антипод. Видам секций Lathyris и Holophyllum с максимально развитыми гаусторием эндосперма и структурами халазальной части семязачатка и семени свойственно сохранение исходного числа клеток антипод при созревании гаметофита (3), тогда как видам секции Myrsiniteae с относительно слабым развитием гаустория эндосперма (без выростов в нуцеллус) и меньшей массивностью структур – его увеличение (4-5), что очевидно компенсирует снижение функции гаустория их эндосперма в сравнении с видами секций Lathyris и Holophyllum. Вместе с тем, E. lathyris (базальная клада Lathyris) отличает ранняя деструктивная активность халазального полюса женского гаметофита (лизис постамента со стадии мейоза), раннее, хотя и постепенное замещение его антипод центральной клеткой (при созревании зародышевого мешка) и гаусторием эндосперма (сразу после оплодотворения), что свидетельствует не только о более раннем становлении гаусториальной активности эндосперма у этого вида, но и наличии этой активности у его зародышевого мешка. У видов секций Holophyllum и Myrsiniteae эти процессы сдвинуты на более поздние стадии развития – с началом активного лизиса постамента лишь после стадии 4-ядерного гаметофита, а замещения антипод – лишь при формировании ценоцитного эндосперма; при этом оба вида секции Holophyllum (клада I) отличает более поздняя деструкция постамента (при созревании гаметофита) и накопление им сферических включений, а оба вида секции Myrsiniteae (клада II) – деления клеток антипод. Полученные данные расширяют представления о связи специфики развития антипод с особенностями развития эндосперма у цветковых растений, согласно которым, виды с халазальными гаусториями эндосперма обычно имеют эфемерные антиподы, тогда как виды без халазального гаустория – долго сохраняющиеся антиподы (Шамров, 2008).
В противоположность семязачатку, бόльшая часть признаков развития семени у видов секций Lathyris, Holophyllum и Myrsiniteae – степень массивности структур, развития проводящей системы, гаустория эндосперма, наличие/отсутствие сферокристаллов в клетках тесты, являются взаимосвязанными, на что указывает четкая сопряженность их проявления в пространстве и времени. Существенный рост массивности структур (тегмена, базальной части нуцеллуса, эндопахихалазы) у всех видов происходит начиная с прогамной фазы и связан с ростом активности делений их клеток, а разное время их прекращения делений приводит к различной массивности структур и разной степени их иннервации проводящими пучками, что, в свою очередь, обуславливает последующий характер специализации клеток тесты. Бóльшая длительность делений клеток структур халазальной части семени у видов секции Holophyllum (до стадии сердечковидного зародыша) приводит к их большей массивности и к более глубокому проникновению в них специфических клеток окончаний проводящего пучка – в подиум нуцеллуса, что сопровождается накоплением в его клетках сферокристаллов (при отсутствии этого процесса в клетках тесты). Наоборот, меньшая длительность делений клеток структур семени у видов секции Myrsiniteae (до стадии глобулярного зародыша) имеет следствием их меньшую массивность и блокирование вхождения специфических клеток проводящего пучка в подиум, что коррелирует с отсутствием появления в его клетках сферокристаллов, но их последующим обильным накоплением в клетках тесты. При этом система морфогенетических корреляций у видов секции Holophyllum полностью совпадает с таковой видов секции Helioscopia из той же клады I, а у видов секции Myrsiniteae – с видами секции Esula из клады II (Титова и др., 2018), что также подтверждено недавними данными по другим видам этих клад (E. procera – секция Helioscopia, клада I; E. stepposa – секция Pithyusa, E. paralias – секция Paralias, E. peplus – секция Tithymalus, клада II; Титова и др., 2019). В то же время, E. lathyris свойственна своеобразная система корреляций, сочетающая признаки обеих продвинутых клад: с одной стороны (как у видов клады I) – значительная массивность структур семени и развитая система постхалазального ветвления (с вхождением окончаний проводящего пучка в подиум), с другой (как у видов клады II) – отсутствие сферокристаллов в подиуме и их наличие в тесте (хотя и специфической локализации). Вид отличает и медленное обрастание нуцеллуса интегументами (к стадии зиготы, а не в прогамной фазе).
Выявленные закономерности подтвердили гипотезу об основных различиях между видами двух крупных клад подрода Esula рода Euphorbia по признакам развития семени (Титова и др., 2018) – логического продолжения высказанной ранее гипотезы о причинах формирования сферокристаллов в клетках тесты у видов клады II, основанной на присутствии в них кальция и выделительной функции различных кристаллических образований у растений (Гельтман, 2016). Согласно последней гипотезе, формирование сферокристаллов в тесте у видов клады II, обычно произрастающих в аридных условиях на почвах, богатых кальцием (ксерофильная линия эволюции подрода Esula), может быть связано с удалением из них избытка кальция, а виды клады II (со сферокристаллами в клетках тесты) и клады I (без сферокристаллов), возможно, несколько различаются по метаболизму. Наши данные позволяют развить эти гипотезы.
Во-первых, анализ генезиса семенной кожуры показал, что сферокристаллы, содержащиеся в клетках тесты зрелого семени видов секций Lathyris и Myrsiniteae являются продуктами кристаллизации особых сферических включений, накапливающихся в ней на более ранних стадиях развития (у E. myrsinites и E. rigida – в клетках мезотесты, а у E. lathyris – и в клетках экзотесты, хотя специфичного строения – часто объединенных в более крупные сферокристаллы). При этом, по данным гистохимического анализа, сферокристаллы E. lathyris и E. myrsinites содержат липиды и соли кальция, что согласуется с литературными сведениями по другим видам молочаев (Gram, 1895-1896; Can, Küçüker, 2015; Гельтман, 2016). Вместе с тем, в поляризованном свете они проявляют свойство двойного лучепреломления, что подтверждает их интерпретацию как истинных сферокристаллов (Гельтман и др., 2014), причем имеющих липидную природу (наличие симметричного «Мальтийского креста» с постоянством яркости свечения и ориентации при вращении столика микроскопа, Колтовой, 2021). Присутствие в сферокристаллах тесты помимо солей кальция липидных компонентов указывает на то, что их формирование может быть связано с процессами удаления из растений не только избытка кальция, но и липидов, что хорошо согласуется с общей характеристикой молочаев как масличных растений – с высоким, но разным содержанием масел в семенах (Bewley, Black, 1978, и др.). Последнее подтверждается и данными гистохимического анализа: у всех изученных нами видов выявлено присутствие масел в эндосперме и карункуле зрелых семян, а также в подиуме (на ранних стадиях развития), однако в карункуле и подиуме – в разном количестве, что коррелировало с разным содержанием в них сферокристаллов. Наличие этой корреляции, и в частности, существенно большее количество липидов и сферокристаллов в карункуле у видов клады II (E. myrsinites, E. rigida), позволяет полагать, что накопление сферокристаллов в их тесте может быть связано с более интенсивным синтезом липидов в их карункуле – структуре, общей с тестой по происхождению.
Во-вторых, анализ строения специфических клеток проводящего пучка, проникновение которых в структуры семени четко коррелирует с появлением в них сферокристаллов (исключая E. lathyris), подтвердил их сходство с млечниками перикарпия (по характеру роста, наличию ветвлений, анастомозов) и, соответственно, правомерность их интерпретации как млечников (Титова и др., 2018), причем их членистость не противоречит этой интерпретации – формирование млечников данного типа выявлено в семени некоторых молочайных (Hevea brasiliensis; обзор Rudal, 1987) и может быть связано с местом их локализации. При этом более ранее прекращение делений клеток в структурах халазальной части семени у видов клады II (ксерофильной линии эволюции подрода Esula), и как следствие – отсутствие вхождения «млечников» в их подиум, хорошо согласуется с данными о произрастании этих видов преимущественно в аридных условиях: как известно, растения аридных зон нередко имеют ускоренный цикл развития (Серебряков, 1962; Willson, 1983, и др.).
В то же время, причины формирования сферокристаллов все же нуждаются в дальнейших исследованиях – анализе метаболизма кальция и липидов у исследуемых видов, их связей с деятельностью млечников, получении новых доказательств в пользу природы последних.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование по развитию семязачатка и семени у видов секций Lathyris, Holophyllum и Myrsiniteae подрода Esula рода Euphorbia и сопоставление результатов с литературными данными по другим изученным видам этого подрода позволили:
– дополнить эмбриологическую характеристику рода Euphorbia;
– выявить различия в развитии семязачатка, женского гаметофита и семени у разных видов подрода Esula (включая различия в системах морфогенетических корреляций в развитии структур) и подтвердить гипотезу об основных различиях между видами двух его крупных продвинутых клад – «суперклад» I и II (Титова и др., 2018).
– подтвердить интерпретацию сферокристаллов, образующихся в клетках тесты у видов клады II, как истинных сферокристаллов (с вхождением в их состав солей кальция и липидов) и дополнить гипотезу о причинах их появления в этой структуре (Гельтман, 2016).
Также полученные нами данные позволили дополнить список признаков, полезных для систематики рода Euphorbia, и подойти к оценке распределения и эволюции некоторых признаков в молекулярно-филогенетической системе его подрода Esula (Riina et al., 2013). Так, помимо признаков, полезных для систематики рода Euphorbia, приведенных ранее (толщина интегументов, наличие/отсутствие в семени карункулы – Tokuoka, Tobe, 1995; число клеток археспория, спорогенного комплекса, тип развития женского гаметофита, сопряженность их развития со структурами семязачатка – Bhanwra, 1987; Виноградова, 2017, и др.; наличие/отсутствие сферокристаллов в клетках тесты – Гельтман и др., 2014; степень массивности структур семязачатка и семени, характер специализации клеток эндотегмена – Титова и др., 2018); к их числу также следует отнести число клеток антипод в женском гаметофите (возможность его увеличения у видов Euphorbia показана нами впервые). В то же время, на данном этапе (в предварительном виде) в молекулярно-филогенетической системе подрода Esula возможно оценить распределение лишь нескольких эмбриологических признаков – тип развития женского гаметофита (включая развитие антипод) и признаки развития семени (в силу их наибольшей изученности у видов данного подрода).
Тип развития женского гаметофита (рис. 4). Из 37 изученных в этом отношении видов подрода Esula (включая изученные E. komaroviana и E. myrsinites) 25 видов имеют Polygonum-тип развития зародышевого мешка, тогда как 11 видов – би- и тетраспорические типы развития (Титова, Нюкалова, 2021). Моноспорический Polygonum-тип отмечен в секции Lathyris (базальная клада Lathyris) и в 9 секциях обеих продвинутых клад (Holophyllum, Helioscopia – клада I, Myrsiniteae, Pithyusa, Paralias, Pachycladae, Exiguae, Arvales, Esula – клада II); при этом в кладах I и II он выявлен в секциях, занимающих в них и базальное, и продвинутое положение. Все тетраспорические типы до сих пор отмечены лишь в кладе I – у 7 видов секции Helioscopia (E. procera, E. palustris, E. soongarica – Modilewski, 1909; 1911; Виноградова, 2017; Титова и др., 2018, E. dulcis – Carano, 1925; Kapil, 1961; E. bivonae, E. acanthothamnos, E. epithymoides – Cesca, 1966, 1969). Биспорический же Allium-тип выявлен лишь в кладе II (секция Aphyllis: E. mauritanica – Ventura, 1933; секция Patellares: E. characias, E. amygdaloides – D’Amato, 1939), а также в базальной кладе Lagascae (секция Lagascae: E. lagascae – D’Amato, 1946) – всего 4 вида. Концентрация тетраспорических типов в кладе I (мезофильной линии эволюции подрода Esula), вызывающая закономерный интерес (Титова и др., 2015; Виноградова, 2017), пока не нашла подтверждения (E. komaroviana обладает Polygonum-типом развития), но число изученных видов недостаточно. В целом, наличие Polygonum-типа гаметофита у E. lathyris из базальной клады Lathyris и его преобладание у большинства видов секций обеих продвинутых клад указывают на первичность этого типа гаметофита в подроде Esula и производность от него других типов развития, что согласуется с современными представлениями об эволюции этого признака у цветковых растений (см. Pechenitsyn, 2002).
Строение антиподального аппарата (рис. 4). У большинства видов подрода Esula отмечено наличие 3-х клеток антипод, но точная стадия их деструкции не приводится. Однако,
имеющиеся подробные данные по этому процессу позволяют полагать, что виды секций, приуроченных к основанию древа подрода Esula (Lathyris, Lagascae, Holophyllum, Myrsiniteae,
Рис. 4. Комбинированное филогенетическое дерево подрода Esula (Riina et al., 2013), соотнесенное с признаками «тип развития зародышевого мешка» и «длительность функционирования антипод» (голубым цветом выделены секции, в которых отмечен
моноспорический тип развития гаметофита, зеленым – биспорический, красным – тетраспорические типы, символом ⁎ – секции, для которых характерны длительно функционирующие антиподы).
Pithyusa – Ventura, 1933; D’Amato, 1939; наши данные), а также секции Helioscopia из клады I с тетраспорическими типами гаметофита (E. procera, E. palustris, E. dulcis и др. – Modilewski, 1910; Carano, 1925; Cesca, 1966, 1969, и др.) отличает длительное функционирование антипод (до стадии зиготы или 2-клеточного зародыша), а некоторые виды (секция Myrsiniteae) – даже их вторичное размножение (возможно, признак секционного уровня). В отличие от этого, виды продвинутых секций (Aphyllis, Exiguae, Pachycladae, Esula) обычно имеют эфемерные антиподы (E. dendroides, E. terracina, E. exigua, E. mauritanica – Ventura, 1933; D’Amato, 1939, 1946, E. dracunculoides – Mukherjee, 1961; E. esula – Carmichael, Selbo, 1999; E. virgata – Виноградова, 2017, и др.), что, вероятно, свидетельствует о постепенной редукции антиподального аппарата женского гаметофита в пределах подрода Esula.
Развитие семени (рис. 5). Подробные данные по развитию семени у 16 видов из 8 секций подрода Esula (Титова и др., 2018а, б, 2019) позволяют заключить следующее.
Во-первых, изученные виды двух крупных продвинутых клад подрода Esula (I и II) различаются по комбинации нескольких устойчивых признаков – степени развития эндопахихалазы, нуцеллуса, гаустория эндосперма и системы постхалазального ветвления проводящего пучка семени (более развитых у видов клады I, чем у видов клады II), а также наличию/отсутствию сферокристаллов в тесте (наличие у видов клады II, отсутствие у видов клады I). При этом в пределах каждой клады отмечается прогрессивное снижение массивности структур (от большей в секциях Holophyllum и Myrsiniteae – к меньшей в секциях Helioscopia и Esula), а в пределах клады II – и степени развития постхалазального ветвления (от редких случаев вхождения его окончаний в нуцеллус у E. myrsinites до полного отсутствия этого процесса у остальных видов).

Во-вторых, E. lathyris из монотипной секции Lathyris (клада Lathyris), занимающей базальное положение на деревьях, построенных с использованием хлоропластных маркеров и комбинированного анализа, но промежуточное положение между секциями Myrsiniteae и
Рис. 5. Комбинированное филогенетическое дерево подрода Esula, соотнесенное с признаками развития семени.
1 – древо подрода Esula (по: Riina et al., 2013): знаком «+» отмечено наличие сферокристаллов в тесте хотя бы у некоторых исследованных видов секции, знаком «–» – отсутствие сферокристаллов у всех исследованных видов секции (по: Гельтман, 2016), синим цветом выделены секции, в которых
отмечены значительная массивность структур халазальной части семени и вхождение окончаний проводящего пучка в подиум нуцеллуса; красным – секции, которые характеризуются меньшей массивностью структур и отсутствием вхождения окончаний проводящего пучка в подиум; 2 – иллюстрация нанесенных на древо признаков.
Pithyusa в кладе II — на деревьях, построенных с использованием ядерных маркеров (Riina et al., 2013), по большинству признаков семени сходен с видами секции Holophyllum из клады I. С видами секции Myrsiniteae клады II его сближает лишь наличие сферокристаллов в тесте, хотя и малочисленных, и специфичных по локализации и строению.
В-третьих, несмотря на имеющиеся различия, виды секций Lathyris, Holophyllum и Myrsiniteae, лежащие в основании древа подрода Esula, объединяет не только высокая массивность структур семени, но и более сложная организация тегмена (дифференциация трахеидоподобных клеток в эндотегмене): по первому признаку виды секции Myrsiniteae из клады II ближе к видам секций Lathyris, Holophyllum и Helioscopia, чем к видам секции Esula из той же клады II, а сходная специализация эндотегмена (очевидно связанная с этим признаком) отмечена и в секции Helioscopia (E. palustris; Титова и др., 2015).
В-четвертых, поздняя деструкция постамента у E. komaroviana и E. rupestris из секции Holophyllum, возможно, является признаком секционного уровня. Однако такие признаки как варьирование длины склереид экзотегмена и толщины тесты, отмеченные у видов самых разных секций подрода Esula, вероятно, являются видоспецифичными, что представляет интерес с точки зрения параллельной эволюции признаков в подроде Esula.

В целом, результаты анализа распределения признаков в пределах крупных клад подрода
Esula рода Euphorbia свидетельствуют о логичности его молекулярно- филогенетического древа и не менее логично укладываются в классические представления о направлениях эволюции структур семязачатка и семени у цветковых растений. Согласно этим представлениям, эволюция этих структур в пределах разных таксонов обычно идет по пути их редукции (Шамров, 2008), что четко наблюдается в пределах древа подрода Esula, особенно в кладе II – ксерофильной линии его эволюции. С этих позиций, E. lathyris из секции Lathyris, с наиболее развитыми структурами семязачатка и семени, ранним становлением гаустория эндосперма (и одновременным сочетанием ряда признаков обеих продвинутых клад) обоснованно занимает в системе Riina et al. (2013) базальное положение, а виды остальных секций (с более редуцированными структурами) – продвинутое, что также согласуется с базальным положением этой секции в системе Boissier (1862), но не с ее «противоположным» положением в системе Проханова (1964). Однако в эти представления не совсем укладывается точка зрения о продвинутости признака наличия эндопахихалазы в семени (Corner, 1992), наиболее развитой и типичной в базальной секции Lathyris. Это противоречие снимается, если допустить возникновение этого признака у предковых форм Euphorbia, но претерпевшего в ходе эволюции определенную редукцию: эндопахихалаза E. lathyris и E. komaroviana выглядит как задержавшаяся в развитии эндопахихалаза Cleidion и Dalechampia (Schweiger, 1905; Corner, 1976). Такое предположение усиливается и отсутствием у эндопахихалазы E. lathyris функции «депо», и явной производностью строения семени видов крупных клад подрода от такового E. lathyris. Кроме того, наличие у E. lathyris других отличительных эмбриологических признаков (пóзднее обрастание нуцеллуса внутренним интегументом, наличие гаусториальной активности у центральной клетки гаметофита, длительное сохранение пыльцевой трубки в синергиде, особое строение сферокристаллов) в сочетании с невскрывающимися плодами с губчатым перикарпием, перекрестно-парными листьями (Гельтман, 2016) также свидетельствует об обоснованности самостоятельного положения секции Lathyris в системе подрода Esula (Boissier, 1862; Проханов, 1964; Riina et al., 2013).
ВЫВОДЫ
1. Виды секций Lathyris (E. lathyris), Holophyllum (E. komaroviana, E. rupestris) и Myrsiniteae (E. myrsinites, E. rigida) подрода Esula рода Euphorbia имеют крассинуцеллятные, битегмальные семязачатки (с нуцеллярным клювом, коротким фуникулусом, зигзагообразным микропиле), нуклеарный тип эндоспермогенеза и экзотегминальные семена с карункулой, развитым зародышем и эндоспермом, что согласуется с общей характеристикой развития семязачатка и семени в роде Euphorbia. Однако их семязачатки являются геми- кампилотропными, а не анатропными (как считалось ранее), а семена кампилотропными, с халазальным гаусторием эндосперма, эндопахихалазой и системой постхалазального ветвления проводящего пучка, что подтверждает мнение ряда авторов о наличии этих признаков в роде Euphorbia.
2. Несмотря на сходную общую схему формирования, семязачатки и семена изученных видов различаются по массивности структур (особенно базальной части нуцеллуса и эндопахихалазы), числу клеток археспория, спорогенного комплекса, антиподального аппарата женского гаметофита (при едином Polygonum-типе его развития), потенциям мегаспороцитов к образованию зародышевых мешков, степени развития халазального гаустория эндосперма и системы постхалазального ветвления проводящего пучка, характеру специализации клеток тесты и тегмена, морфогенетическим корреляциям в развитии структур.
3. Четкие связи между массивностью структур семязачатка и числом клеток археспория и спорогенного комплекса у изученных видов отсутствуют: у E. lathyris с максимальной массивностью структур число клеток археспория и спорогенного комплекса минимально, а спорогенный комплекс менее сложно организован, чем у E. myrsinites с меньшей массивностью структур. Дальнейшее развитие у большинства видов лишь нескольких и преимущественно центральных мегаспороцитов (вступление в мейоз, образование тетрад
мегаспор) свидетельствует в пользу точки зрения о большей роли позиционного контроля в этом процессе, чем фактора массивности структур, и в частности, нуцеллуса семязачатка.
4. Различия между видами по признакам развития семени взаимосвязаны, наиболее четко выражены в секциях Holophyllum и Myrsiniteae и обусловлены длительностью делений клеток его структур (до стадии сердечковидного зародыша в секции Holophyllum и глобулярного – в секции Myrsiniteae). Виды секции Holophyllum (клада I) имеют более развитые халазальную часть семени, гаусторий эндосперма и систему постхалазального ветвления – с вхождением окончаний проводящего пучка (вместе со специфическими клетками) в подиум нуцеллуса, что коррелирует с накоплением в его клетках сферокристаллов (при полном отсутствии этого процесса в клетках тесты). Виды секции Myrsiniteae (клада II) обладают меньшей массивностью структур, без вхождения окончаний проводящего пучка в подиум, что коррелирует с отсутствием появления в нем сферокристаллов, но с их последующим обильным накоплением в клетках тесты. Степень развития гаустория эндосперма также влияет на развитие антиподального аппарата – более мощного у видов секции Myrsiniteae, чем у видов секции Holophyllum, что вероятно компенсирует снижение функции их гаустория в сравнении с видами секции Holophyllum.
5. E. lathyris (базальная монотипная секция Lathyris) отличает своеобразная система морфогенетических корреляций – сочетание признаков как видов секции Holophyllum (значительная массивность структур семени, развитая система постхалазального ветвления, с вхождением окончаний проводящего пучка в подиум, выраженный гаусторий эндосперма, 3 клетки антипод), так и видов секции Myrsiniteae (отсутствие сферокристаллов в подиуме и их наличие в тесте, хотя и малочисленных и специфической локализации и строения). Для вида также характерны такие специфичные признаки, как наличие гаусториальной активности у центральной клетки женского гаметофита (как следствие – более раннее замещение ею антипод и становление гаустория эндосперма) и более позднее обрастание апекса нуцеллуса интегументами (к стадии зиготы, а не в прогамной фазе, как у остальных видов).
6. Сферокристаллы тесты содержат липиды и соли кальция, а специфические клетки проводящего пучка семени сходны с млечниками по способу роста, способности к ветвлению, образованию анастомозов, что укрепляет гипотезу о связи накопления сферокристаллов в тесте у видов клады II подрода Esula с деятельностью их выделительной системы. В то же время, присутствие в сферокристаллах помимо солей кальция липидных компонентов указывает на то, что их формирование может быть связано не только с процессами связывания и удаления из растений избытка кальция, но и удаления из них избытка липидов.
7. Анализ распределения признаков в пределах основных клад молекулярно- филогенетического древа подрода Esula показал: преобладание в них моноспорического Polygonum-типа развития женского гаметофита (при спорадичности би- и тетраспорических типов развития); наличие четких различий между видами клад I и II по признакам развития семени (степень развития нуцеллуса, эндопахихалазы, гаустория эндосперма, постхалазального ветвления проводящего пучка, наличие/отсутствие сферокристаллов в клетках тесты) и полное соответствие в системах их морфогенетических корреляций (при сочетании признаков обеих этих клад в базальной кладе Lathyris, но большем сходстве с видами клады I, особенно секции Holophyllum).
8. С позиций эволюционной эмбриологии, молекулярно-филогенетическое древо подрода Esula рода Euphorbia является логичным. Наличие Polygonum-типа женского гаметофита у представителя базальной клады Lathyris и его преобладание у видов секций двух крупных продвинутых клад подрода Esula указывают на первичность этого типа гаметофита в данном подроде и производности от него других типов, что согласуется с мнением большинства авторов о направлениях эволюции этого признака у цветковых растений. Снижение массивности структур семязачатка и семени – от максимальной в базальной кладе Lathyris к меньшей в продвинутых кладах (особенно в кладе II), свидетельствует об их прогрессивной редукции в пределах древа подрода Esula, что также согласуется с представлениями о направлениях их эволюции у цветковых растений.