Сравнительное морфологическое исследование различных форм врожденного гиперинсулинизма у детей

Для дифференциального диагноза форм ВГ доказана необходимость проведения не только ПЭТ-КТ с 18F-DOPA и молекулярно-генетического исследования, но и интраоперационного биопсийного исследования ПЖ. Установлено, что самым быстрым и адекватным дифференциально-диагностическим методом на интраоперационном этапе является цитологическое исследование мазков-отпечатков ткани ПЖ с подсчетом количества клеток с нуклеомегалией в поле зрения. На основании данных цитологического, гистологического, гистохимического и
иммуногистохимического исследований получены четкие морфологические признаки различных форм ВГ.
Выявлены наиболее специфичные иммуногистохимические маркеры для постановки окончательного диагноза ВГ и его форм: инсулин, Nkx2.2, Isl1, хромогранин А или DR1. При атипичной форме подтверждена крайне выраженная степень гетерогенности не только гистоархитектоники ПЖ, но и экспрессии иммуногистохимических маркеров. Обнаружено резкое повышение уровня экспрессии NeuroD1 в экзо- и эндокринной частях ПЖ при всех морфологических формах ВГ. Доказана роль NeuroD1 в патогенезе ВГ, а также выявлена его возможная связь с дофаминовым сигнальным путем. ФТ NeuroD1 предложен в качестве мишени для таргетной терапии. Подтверждено участие в патогенезе соматостатина и его рецепторов 2-го и 5-го типов, а также ФТ Nkx2.2 и Isl1 в патогенезе ВГ.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Проведение многоуровневого морфологического (цитологического, гистологического, гистохимического, иммуногистохимического) исследования ткани поджелудочной железы у детей с врожденным гиперинсулинизмом расширило имеющиеся представления о звеньях патогенеза и формах этого заболевания.
Полученные данные позволили повысить точность диагностики врожденного гиперинсулинизма и его форм как на интраоперационном, так и на послеоперационном этапах. Для установления предварительного диагноза рекомендуется выполнение цитологического исследования мазков-отпечатков поджелудочной железы, а для установления окончательного диагноза — гистологического исследования залитых микропрепаратов, изготовленных из каждого резецированного фрагмента, и иммуногистохимической реакции с одним из следующих антител: инсулин, Nkx2.2, Isl1, хромогранин А или DR1.
Выявление резко повышенного уровня экспрессии NeuroD1 в эндо- и экзокринной частях поджелудочной железы больных с врожденным гиперинсулинизмом позволяет рассматривать этот фактор транскрипции как мишень для таргетной терапии. Возможно, создание ингибитора NeuroD1 позволит лечить таких пациентов медикаментозным методом, что позволит избежать
хирургического лечения и послеоперационных осложнений в виде сахарного диабета и экзокринной недостаточности (особенно у детей с диффузной формой).
Результаты исследования внедрены в работу НИЛ патоморфологии ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.
Методология и методы исследования
Теоретической основой диссертационного исследования являются научные работы отечественных и зарубежных авторов по изучению патоморфологии ВГ. Методология работы основана на подходах доказательной медицины, в соответствии с которыми спланирован дизайн ретроспективного исследования «случай- контроль». Объектом исследования явились пациенты с различными морфологическими формами ВГ, а предметом — ткань ПЖ. В ходе исследования использовались как общенаучные, так и специальные методы (цитологическое, гистологическое, гистохимическое и иммуногистохимическое исследования, флуоресцентная и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, медицинская статистика). На проведение диссертационного исследования получено разрешение Этического комитета ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России (протокол No10-19 от 14.10.2019).
Положения, выносимые на защиту
1) Предоперационная ПЭТ-КТ с 18F-DOPA и молекулярно- генетическое исследование недостаточны для дифференциального диагноза форм ВГ. Необходимо интра- и постоперационное морфологическое исследование.
2) Морфометрический анализ результатов цитологического исследования мазков-отпечатков ПЖ и гистологического исследования ее замороженных срезов является необходимым для интраоперационного дифференциального диагноза, так как нуклеомегалия ЭЦ встречается при всех формах ВГ.
3) Окончательный диагноз ВГ и его форм возможен только после количественного иммуногистохимического исследования (ИГХИ) с антителами к инсулину и ФТ, что особенно важно при атипичной форме.
4) Для дальнейшей послеоперационной терапии заболевания при диффузной и атипичной формах необходимо определение SSTR2 и
5 с целью оценки чувствительности к аналогам соматостатиновых рецепторов.
5) Морфологическое исследование ПЖ выявило участие NeuroD1 в патогенезе ВГ. Создание ингибитора этого ФТ целесообразно для эффективной таргетной терапии тяжелых форм заболевания.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность результатов исследования определяется репрезентативным объемом выборки, использованием современных методов и применением адекватных приемов статистической обработки. Основные результаты работы доложены и обсуждены на международных конференциях: 1) XXIV Международная медико- биологическая научная конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье» (24.04.21, устный доклад в онлайн формате); 2) Национальный конгресс с международным участием «Здоровые дети — будущее страны» (26.05.21, устный доклад). Результаты диссертационного исследования были доложены на заседании общества патологоанатомов Санкт-Петербурга и Ленинградской области на конкурсе имени М.М. Руднева 10.11.20. В 2020 году автором работы был выигран конкурс грантов для студентов и аспирантов вузов, проводимый КНВШ Правительства Санкт- Петербурга.
В 2021 году в Федеральную службу по
интеллектуальной собственности была подана заявка на изобретение No2021117772 «Способ интраоперационной
дифференциальной диагностики морфологических форм ВГ».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы исследования
В исследование было включено 38 пациентов с диагнозом
ВГ возрастом от 1 месяца до 4-х лет (медианный возраст 3 месяца). Среди этих пациентов у 21 была очаговая (аденоматозная) форма ВГ, у 12 — диффузная, у 5 — атипичная. Критерием включения являлся клинически и гистологически подтвержденный диагноз ВГ, а критерием исключения — отсутствие ВГ. Среди пациентов было 13 мальчиков (34,2%) и 25 девочек (65,8%). В группу сравнения без ВГ вошел аутопсийный материал гистологически неизмененной ПЖ 10 пациентов, умерших от пороков сердечно-сосудистой системы.

Средний возраст пациентов из группы сравнения составил 3,2±2,9
месяцев, из них 4 девочки и 6 мальчиков.
Методы исследования
Анализ клинических данных
Исследовались клинические данные (пол, возраст, масса тела при рождении), результаты молекулярно-генетического
исследования и ПЭТ-КТ с 18F-DOPA.
Цитологическое, гистологическое и гистохимическое
исследование
Мазки-отпечатки нефиксированной ткани ПЖ окрашивались гематоксилином, а замороженные и парафиновые срезы — гематоксилином и эозином. На замороженных срезах также проводилась гистохимическая реакция с использованием толуидинового синего, азур-эозина, реактива Шиффа, окрасок пикро-Маллори и Май-Грюнвальда.
Иммуногистохимическое исследование
ИГХИ проводилось с антителами к инсулину, NeuroD1, Nkx2.2, Isl1, ChrA, соматостатину, SSTR2 и 5, дофаминовым рецепторам 1-го, 2-го и 5-го типов (DR1, 2 и 5).
Флуоресцентная и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
Для определения колокализации искомых маркеров использовались следующие сочетания первичных антител: NeuroD1 и ChrA, Isl1 и инсулин, инсулин и SSTR2, DR2 и NeuroD1. Полученные микропрепараты исследовались на флуоресцентном микроскопе Leica DM6000B и конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FV1000D.
Статистические методы исследования
Статистический анализ полученных данных проводился с помощью программы Statistica v. 10. В случае нормального распределения для описания количественных показателей использовалось среднее значение (M) и стандартное отклонение (SD). При наличии распределения, отличного от нормального, количественные величины оценивали с помощью медианы (Ме) и межквартильного размаха. Статистическая значимость различий оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении) или U-критерия Манна-Уитни. Различия между группами были определены как значимые при р<0,05. Для корреляционного анализа использовался коэффициент Спирмена, сила корреляционных связей оценивалась по шкале Чеддока. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Анализ клинических данных По данным анамнеза, у 44,7% детей с ВГ вес при рождении составил более 4000 г. Клинические проявления ВГ в виде приступов гипогликемии наблюдались практически у всех детей вне зависимости от морфологической формы заболевания уже в течение 1-й недели жизни. Судорожный синдром был диагностирован у 65,8% пациентов (25 детей). У 24 из 30 детей (80,0%) мутации располагались в генах ABCC8 или KCNJ11, кодирующих белки АТФ-зависимых калиевых каналов. При этом гетерозиготные варианты мутаций в этих генах были характерны для очаговой формы, а гомозиготные — для диффузной, что хорошо согласуется с данными других исследователей [Galcheva S. et al., 2019]. Проведение ПЭТ-КТ с 18F-DOPA позволило в 32 случаях верно диагностировать морфологическую форму ВГ. Только 1 пациенту с очаговой и 4 пациентам с атипичной формой были даны сомнительные заключения. Таким образом, полученные нами данные подтверждают обоснованность применения ПЭТ-КТ с 18F- DOPA у больных с ВГ [Ni J. et al., 2019; Christiansen C.D. et al., 2018]. Цитологическое исследование Цитологическое исследование мазков-отпечатков было выполнено 13 пациентам с очаговой формой, 11 — с диффузной, 5 — с атипичной и 9 пациентам из группы сравнения без ВГ. Интраоперационное исследование мазков-отпечатков ПЖ показало наличие клеток с нуклеомегалией. Количество таких клеток в 10 полях зрения при увеличении х400 составило: при очаговой форме — 17,00±8,77, при диффузной — 8,40±1,14, при атипичной — 5,00±3,46, в группе без ВГ — 3,75±0,96. Клеток с гипертрофированными ядрами оказалось статистически значимо (p<0,01) больше в узле аденоматозной гиперплазии, чем за его пределами, а также чем при других формах ВГ или без него. У пациентов с диффузной формой было статистически значимо больше клеток с нуклеомегалией, чем в ПЖ без ВГ (p<0,01) и в неизмененных участках ткани железы при очаговой форме (p<0,01). Гистологическое исследование В результате подсчета количества ЭЦ с гипертрофированными ядрами в замороженных срезах было установлено, что при очаговой форме в зоне аденоматозной гиперплазии встречается 5,08±1,36 таких клеток в поле зрения, за пределами узла — 0,24±0,21, при диффузной форме — 4,02±1,56, в группе без ВГ — 0,65±0,21. Таким образом, и в зоне аденоматозной гиперплазии при очаговой форме, и при диффузной форме ВГ количество ЭЦ с увеличенными в размерах ядрами было статистически значимо выше как по сравнению с группой без ВГ (p<0,05), так и по сравнению с участками неизмененной ткани ПЖ при очаговой форме (p<0,01). При подсчете доли клеток с нуклеомегалией среди общего числа ЭЦ в поле зрения в пораженном участке ПЖ при очаговой форме увеличение в размерах ядер было обнаружено в 1,36±0,50% ЭЦ, за пределами зоны поражения при очаговой форме — в 0,31±0,24%, при диффузной форме — в 2,83±0,82%, а в группе без ВГ — в 0,41±0,03%. При подсчете клеток с нуклеомегалией в парафиновых срезах ПЖ были получены аналогичные данные. Несмотря на утверждение некоторых авторов о том, что обнаружение в ПЖ ЭЦ с нуклеомегалией является надежным дифференциально-диагностическим признаком диффузной формы ВГ [Sempoux C. et al., 2004; Han B. et al., 2016; Lord K. et al., 2018], полученные нами данные свидетельствуют о том, что появление в пораженных участках эндокринных клеток с такой морфологией характерно для всех форм ВГ. Гистохимическое исследование Окрашивание гранул экзокриноцитов в замороженных срезах ПЖ азур-эозином, реактивом Шиффа и пикро-Маллори давало непостоянный результат, а окрашивание толуидиновым синим и по Май-Грюнвальду не позволяло дифференцированть эндо- и экзокринные части ПЖ. Хотя вышеназванные окраски в доиммуногистохимическую эру применялись для дифференцировки экзо- и эндокринной частей ПЖ [Bensley R.R., 1911; Bowie D.J., 1924; Lillie R.D., 1969], их использование при срочном гистологическом исследовании не дало никаких преимуществ перед стандартным окрашиванием гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование Пациенты из группы сравнения без ВГ Экспрессия ChrА, инсулина, Isl1, Nkx2.2 наблюдалась в ЭЦ островков Лангерганса и единичных клетках вне их. Соматостатин экспрессировался в клетках по периферии эндокринных островков и в единичных клетках вне их. Окрашивание на NeuroD1 выявилось в клетках островков Лангерганса лишь у 1 ребенка и лишь в 7% ЭЦ. DR1 определялись почти исключительно в эндокринной части ПЖ, а DR2 — преимущественно в эндокринной части ПЖ. Во всех случаях окрашивание было цитоплазматическим. У части пациентов гранулярная цитоплазматическая экспрессия обнаруживалась не только в эндо-, но и в экзокринной части ПЖ. DR5 выявлялись только в цитоплазме эндотелия кровеносных сосудов, а у некоторых пациентов — в цитоплазме выводных протоков. SSTR2 определялись исключительно в эндокринной части ПЖ. Доля ЭЦ, экспрессирующих SSTR2 составила 75,35±12,80%, SSTR5 — 2 7,34±27,21%. Пациенты с очаговой формой ВГ Как и в группе сравнения без ВГ, экспрессия СhrА, инсулина, Isl1, Nkx2.2, соматостатина наблюдалась в ЭЦ островков Лагерганса и единичных клетках вне их. Доля экспрессирующих ChrА ЭЦ составила 71,10±18,41% в узле аденоматозной гиперплазии и 76,83±9,22% за его пределами, доля экспрессирующих инсулин ЭЦ – 94,26±5,83% в пораженном участке и 74,3±16,74% за его пределами; Isl1 — 92,17±4,07% и 95,22±4,28% соответственно, Nkx2.2 — 91,70±4,65% и 90,25±6,17% соответственно; соматостатин — 20,02±8,63% и 38,36±14,64% соответственно (Рис. 1). При этом доля соматостатин+ЭЦ в зоне аденоматозной гиперплазии была статистически значимо ниже, чем за ее пределами и у пациентов без ВГ (р<0,01), а также чем в островках Лангерганса при атипичной форме (p<0,05). Кроме того, в неизмененном участке ПЖ у пациентов с очаговой формой доля окрашенных антителами к ChrА ЭЦ оказалась статистически значимо (р<0,01) выше, чем при отсутствии ВГ. Доля NeuroD1+ЭЦ в пораженном участке была в среднем 57,64±41,96%. Причем у 7 пациентов размах значений составил 2-20% (в среднем 10,03±7,13%), а у остальных 10 — 66,5-100,0% (в среднем 90,95±10,13%). У 3-х из 7 вышеназванных пациентов экспрессия NeuroD1 выявлялась лишь по контуру узла аденоматозной гиперплазии. В целом у больных с очаговой формой экспрессия NeuroD1 в эндокринной ткани зоны аденоматозной гиперплазии была статистически значимо (р<0,01) выше по сравнению с пациентами без ВГ. В островках Лангерганса за пределами пораженного участка экспрессия NeuroD1 наблюдалась в 53,00±39,04% ЭЦ, что статистически значимо выше по сравнению с группой без ВГ (p<0,01). Кроме того, была выявлена высокая (rs = 0,703) значимая (p<0,05) положительная корреляция между количеством NeuroD1+ЭЦ в пораженном участке ПЖ и за его пределами. Среди ЭЦ с увеличенными в размерах ядрами доля экспрессирующих NeuroD1 клеток практически не отличалась от доли всех NeuroD1+ЭЦ в поле зрения: 50,51±38,22% против 57,64±41,96%. При оценке экспрессии этого ФТ в экзокринной части ПЖ было выявлено статистически значимое (р<0,01) по сравнению с группой без ВГ увеличение доли NeuroD1+ацинарных клеток. За пределами зоны аденоматозной гиперплазии NeuroD1 экспрессировало 74,52±26,44% экзокриноцитов. Дофаминовые рецепторы экспрессировались так же, как и в группе сравнения без ВГ, только более интенсивно. Доля DR1+эндокринных клеток составила 88,23±4,88% в пораженном участке и 89,33±5,13% за его пределами, и не отличалась от контроля. Относительное количество DR2+эндокринных клеток составило 62,27±29,08% в пораженном участке и 74,11±19,24% за его пределами. При этом за пределами аденоматозной гиперплазии доля ЭЦ, окрашенных антителами к DR2 была статистически значимо (р<0,05) выше, чем при отсутствии ВГ. У части пациентов гранулярная экспрессия этого антигена обнаруживались не только в эндокринной, но и в экзокринной части ПЖ. DR5, так же, как и в контроле, не экспрессировались на ЭЦ. Доля ЭЦ, экспрессирующих SSTR2, составила 84,24±19,75% в пораженном участке и 76,47±32,06% за его пределами, и в узле аденоматозной гиперплазии была значимо выше (р<0,05), чем в островках Лангерганса в группе без ВГ. Единственным исключением стал пациент, у которого доля SSTR2+клеток была существенно ниже, чем при отсутствии ВГ: 23,7% в зоне аденоматозной гиперплазии и 25,8% за ее пределами. Причем некоторые островки Лангерганса окрашивались антителами к SSTR2 практически полностью, а некоторые — вообще не окрашивались. Выраженность иммуногистохимической реакции с SSTR5 была намного слабее, чем с SSTR2. Рисунок 1. Иммуногистохимическое исследование ткани поджелудочной железы у пациентов с различными формами врожденного гиперинсулинизма. HEO – гематоксилин-эозин, Somat - соматостатин Доля ЭЦ, экспрессирующих SSTR5 составила 31,39±33,07% в пораженном участке и 53,73±18,65% за его пределами. Причем относительное число SSTR5+эндокринных клеток в зоне аденоматозной гиперплазии и в группе без ВГ оказалась статистически значимо ниже, чем в неизмененных участках ПЖ детей с очаговой формой ВГ (р<0,01 и р<0,05 соответственно). Пациенты с диффузной формой ВГ В целом локализация и степень интенсивности экспрессии всех иммуногистохимических маркеров не отличались от таковых из группы пациентов с очаговой формой. Экспрессия NeuroD1 также преобладала в экзокринной части поджелудочной железы в отличие от группы без ВГ. Доля экспрессирующих ChrА ЭЦ составила 82,21±19,85%. При этом доля ChrА+эндокринных клеток у пациентов с диффузной формой была статистически значимо (р<0,01) выше, чем в группе без ВГ и в узле аденоматозной гиперплазии при очаговой форме. Относительное количество экспрессирующих инсулин ЭЦ было 82,98±8,31%, Isl1 — 90,09±7,13%, Nkx2.2 — 92,42±3,73%, соматостатин — 26,69±12,17%. Доля экспрессирующих NeuroD1 ЭЦ составила в среднем 53,62±33,29%, что оказалость статистически значимо (p<0,01) выше по сравнению с пациентами без ВГ. Однако, у 2-х пациентов наблюдался выраженный мозаицизм: часть островков Лангерганса была практически полностью NeuroD1+, а часть — NeuroD1-. Среди ЭЦ с увеличенными в размерах ядрами доля экспрессирующих NeuroD1 клеток практически не отличалась от доли всех NeuroD1+ЭЦ в поле зрения, как и при других формах ВГИ. NeuroD1 экспрессировало 72,07±24,86% экзокриноцитов. Относительное количество ЭЦ с экспрессией DR1 было 74,83±12,46%, а DR2 — 82,33±14,42%, при этом доля DR2+ эндокринных клеток у пациентов с диффузной формой была статистически значимо выше, чем в группе без ВГ (р<0,01), при очаговой (в узле аденоматозной гиперплазии и вне ее) и атипичной формах (p<0,05). Доля ЭЦ, экспрессирующих SSTR2 составила 69,99±28,59%, а SSTR5 — 36,55±27,73%. У 1 пациента не экспрессировались SSTR2 и SSTR5, у еще 2 детей не экспрессировались SSTR5. Пациенты с атипичной формой ВГИ Доля экспрессирующих ChrА ЭЦ составила 70,26±15,38%, Isl1 — 92,52±7,39%, Nkx2.2 — 87,8±7,46%. Наибольший процент содержащих инсулин ЭЦ был обнаружен при атипичной форме – 95,55±3,32%. Именно у этих пациентов 98,48±2,63% ЭЦ с гипертрофированными ядрами экспрессировали Isl1, что было значимо выше по сравнению с другими формами ВГ (p<0,05). Различие в экспрессии Nkx2.2 ЭЦ с гипертрофированными ядрами по сравнению со всеми ЭЦ также оказалось значимым (p<0,05): 98,25±3,04% против 87,08±7,46%. Экспрессия соматостатина (34,54±13,65%) не отличалась от таковой у пациентов без ВГ и в ткани ПЖ за пределами узла аденоматозной гиперплазии (р<0,01) и была значимо выше (р<0,05), чем при диффузной и очаговой формах (в очаге аденоматозной гиперплазии). Соматостатин не выявлялся в ЭЦ с гипертрофированными ядрами, в отличие от диффузной и очаговой форм (в 0,41±1,37% и 4,04±4,63% клеток соответственно). Хотя у детей с атипичной формой в эндокринной части ПЖ экспрессия NeuroD1 была статистически значимо (p<0,05) выше, чем в группе без ВГ (45,4±44,2% и 0,70±2,21% соответственно), полученные у разных пациентов данные были крайне неоднородными. В частности, у 2 детей NeuroD1+ЭЦ вообще отсутствовали, в то время как у оставшихся пациентов доля окрашенных NeuroD1 эндокринных клеток составила от 52% до 92%. Относительное количество ЭЦ с экспрессией DR1 было 87,63±10,43%, а DR2 — 59,77±26,53%. Доля SSTR2+ЭЦ составила 72,16±36,22%, а SSTR5+ЭЦ - 32,07±31,50%. У 1 ребенка SSTR2 экспрессировало всего 9,2% ЭЦ, а у 2 не экспрессировались SSTR5. При проведении ИГХИ было установлено, что у пациентов с ВГ доля инсулин+ЭЦ повышалась, а экспрессирующих соматостатин — уменьшалась, что могло быть обусловлено дефицитом или биохимической «неполноценностью» соматостатина [DeCosio A.P. et al., 2019]. Поскольку на поверхности α-клеток преобладают SSTR2 [ ], а на поверхности β- клеток обнаружены SSTR1, 2, 3 и 5 [ et al., 2014], то более редкое выявление SSTR5+ЭЦ при ВГ может быть связано со снижением чувствительности β-клеток к ингибирующему влиянию соматостатина и объяснять фармакорезистентное течение ВГ [Bruns C. et al., 2002]. Согласно данным литературы, ИГХИ на ChrA хорошо визуализирует эндокринную часть ПЖ как в норме, так и при ВГ [Kunz J. et al., 1990]. Полученные нами результаты в целом согласуются с этими данными. Blodgett D.M. et al., 2015 Kailey B. et al., 2012; Braun M. Обнаружение нами у пациентов с ВГ статистически значимого увеличения доли Isl1+ЭЦ и тенденции к повышению экспрессии Nkx2.2 может быть связано с гиперпродукцией инсулина при данном заболевании, поскольку утрата экспрессии даже одного из этих ФТ приводит к снижению уровня инсулиновой секреции и увеличению количества апоптозов в β-клетках [Doyle M.J. et al., 2007; Ediger B.N. et al., 2014]. Хотя ФТ NeuroD1 считается необходимым для созревания и нормального функционирования β-клеток [Gu C. et al., 2010], нами было обнаружено, что в ПЖ детей без ВГ NeuroD1 выявлялся только у некоторых пациентов и только в единичных клетках, причем большинство из них не были эндокринными. При этом у детей с ВГ NeuroD1 экспрессировался в экзо- и в эндокринной частях ПЖ. Ранее экспрессию этого ФТ в неопухолевых экзокриноцитах у людей удавалось обнаружить только при синдроме множественной эндокринной неоплазии 1-го типа [Lejonklou M.H. et al., 2009]. В отличие от DR1 и DR5, экспрессия которых оставалась в целом неизменной при ВГ, доля DR2+эндокринных клеток в среднем была выше, чем в группе без ВГ. Согласно данным литературы, активация DR1 на поверхности β-клеток стимулирует инсулиновую секрецию, а активация DR2, наоборот, ее ингибирует [Lawlor N. et al., 2017; Bucolo C. et al., 2019]. Но при этом связывание дофамина с DR2 на поверхности δ-клеток подавляет секрецию соматостатина, вследствие чего активируется экзоцитоз инсулина β-клетками [Bucolo C. et al., 2019]. Таким образом, нельзя исключить, что увеличение количества экспрессирующих DR2 ЭЦ у детей с ВГ может быть вызвано нарушением работы дофаминовой сигнальной системы в ПЖ. Флуоресцентная и конфокальная микроскопия Как и ИГХИ, флуоресцентная микроскопия выявила инсулин в цитоплазме, а ФТ Isl1 — в ядрах ЭЦ. В узле аденоматозной гиперплазии у пациента с очаговой формой и в островках Лангерганса ребенка с диффузной формой колокализация инсулина и Isl1 в одних и тех же клетках была 70,8±5,5% и 82,0±3,6% соответственно. Кроме того, в неизмененных островках Лангерганса при очаговой форме инсулин+клетки располагались в основном ближе к центру островка, а Isl1+ — ближе к его периферии. Но при диффузной форме такая тенденция не наблюдалась. Однако, у пациента с очаговой формой значительная часть эндокринных клеток (19,5%) в узле аденоматозной гиперплазии окрашивалась только инсулином, а за его пределами значительная часть (44,2%) ЭЦ была наоборот только Isl1+. Обнаружение большого количества коэкспрессирующих инсулин и Isl1 ЭЦ у детей с ВГ согласуется с данными о том, что ФТ Isl1 является необходимым для функционирования β-клеток и секреции инсулина [ Du A. et al., 2009]. В узле аденоматозной гиперплазии у пациента с очаговой формой доля коэкспрессирующих инсулин и SSTR2 клеток составила 55,6±5,2%, а в островках Лангерганса ребенка с диффузной формой — 62,9±10,8%, в то время как в ткани ПЖ за пределами зоны аденоматозной гиперплазии — лишь 25,0±3,5%. Оставшиеся ЭЦ в узле аденоматозной гиперплазии и при диффузной форме экспрессировали вдвое чаще только инсулин, чем только SSTR2: у ребенка с очаговой формой в аденоматозном узле — 28,6±5,4% и 15,9±4,7% соответственно, а у пациента с диффузной формой доля инсулин+/SSTR2- клеток составила 24,8±4,5%, в то время как инсулин-/SSTR2+ – лишь 12,4±3,9%. При этом в неизмененной ткани ПЖ пациента с очаговой формой большинство ЭЦ (68,8%) были инсулин-/SSTR2+ и лишь единичные (6,3%) — инсулин+/SSTR2-. Такое соотношение экспрессии может объясняться тем, что у больных детей появляется нечувствительная к соматостатиновому влиянию популяция β-клеток, в то время как β- клетки, не подвергшиеся патологическим изменениям, начинают компенсаторно больше экспрессировать SSTR2 [Yao C.Y. et al., 2006]. Колокализация маркера нейроэндокринных клеток ChrA [Krivova Y.S. et al., 2014] с NeuroD1 была выявлена в 50,0±9.3% клеток в узле аденоматозной гиперплазии при очаговой форме и в 61,1±10,6% клеток островков Лангерганса при диффузной форме. Флуоресцентная микроскопия подтвердила, что NeuroD1 есть не только в эндокринных, но и в экзокринных клетках. У пациента с очаговой формой в узле аденоматозной гиперплазии колокализация NeuroD1 и DR2 наблюдалась в 61,8±12,4% клеток, а при диффузной форме – в 34,7±6,9%. Экспрессирующие только DR2 эндокринные клетки были лишь единичными (от 2,4% до 4,1%) при обеих формах ВГ. Подобно обнаруженным ранее колокализациям инсулина и дофамина [Ericson L.E. , 1977], а также инсулина и DR2 [Bini J. , 2020], выявление коэкспрессии NeuroD1 и DR2 позволяет подтвердить обоснованность применения ПЭТ-КТ с 18F-DOPA для диагностики форм ВГ и участие этого ФТ в дофаминовом сигнальном пути. et al. et al. ВЫВОДЫ 1. Предоперационной ПЭТ-КТ с 18F-DOPA и молекулярно- генетического исследования недостаточно для диагноза ВГ и его форм. Хотя локализация и интенсивность экспрессии дофаминовых рецепторов при ИГХИ подтверждает обоснованность применения ПЭТ-КТ с 18F-DOPA, окончательный диагноз ставится по результатам количественного ИГХИ парафиновых срезов. 2. Нуклеомегалия ЭЦ выявляется при всех формах ВГ. Для интраоперационного дифференциального диагноза форм заболевания самым быстрым и адекватным способом является подсчет числа увеличенных ядер ЭЦ в мазках-отпечатках ПЖ. В то же время, на замороженном срезе железы можно ориентироваться только на относительное число ЭЦ с нуклеомегалией. 3. Гистохимические окраски (толуидиновый синий, азур-эозин, PAS-реакция, пикро Маллори, фуксин паральдегид по Гомори, Май- Грюнвальд) не имеют преимуществ перед стандартным окрашиванием гематоксилином и эозином замороженных срезов ткани ПЖ для дифференциального диагноза форм ВГ на этапе интраоперационного гистологического исследования. 4. Наиболее специфичный иммуногистохимический маркер ВГ в целом — NeuroD1, однако для дифференциального диагноза форм заболевания нужно использовать инсулин и/или Isl1, Nkx2.2, ChrA, DR1. DR2 обладают меньшей специфичностью, но они также могут использоваться для дифференциальной диагностики ВГ и его форм. 5. Атипичная форма ВГ отличается крайней гетерогенностью гистоархитектоники, наибольшим относительным количеством экспрессирующих инсулин ЭЦ в поле зрения, а также наличием большего количества клеток с крупными ядрами, экспрессирующих ФТ Isl1 и Nkx2.2, что может быть связано с гиперпродукцией инсулина. 6. ИГХИ показало, что DR2 так же, как и NeuroD1, экспрессируется не только в эндокринной, но и в экзокринной частях ПЖ, а флуоресцентная микроскопия продемонстрировала колокализацию DR2 и NeuroD1 в одних и тех же клетках, что свидетельствует об участии этого ФТ в дофаминовом сигнальном пути. Создание ингибитора NeuroD1 целесообразно для таргетной терапии диффузной и атипичной форм ВГ, когда частичная или субтотальная панкреатэктомия не приводит к выздоровлению. 7. Количество клеток с экспрессией соматостатина снижается при очаговой и диффузной формах, а SSTR2 и 5 выявляются не во всех случаях ВГ. Дефицит соматостатина является одним из звеньев патогенеза этого заболевания, а снижение экспрессии SSTR2 и 5 — причиной фармакорезистентности к аналогам соматостатина. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для интраоперационной дифференциальной морфологической диагностики форм ВГ следует использовать цитологическое исследование с подсчетом увеличенных ядер ЭЦ при х400. Если наблюдается 7-11 клеток с нуклеомегалией в 10 полях зрения, диагностируется диффузная форма; более 12 клеток — очаговая форма. Наличие однотипной цитологической картины во всех фрагментах ПЖ подтверждает диффузную форму, а только в некоторых образцах — очаговую. 2. Окончательное подтверждение той или иной морфологической формы ВГ производится при ИГХИ парафиновых срезов ПЖ с антителами к инсулину, Isl1 или Nkx2.2. 3. Атипичная форма ВГ отличается крайней гетерогенностью гистоархитектоники, поэтому для точной дифференциальной диагностики форм ВГ на этапе гистологического исследования требуется тщательное изучение всего присланного операционного материала ПЖ. 4. Для оценки эффективности послеоперационной терапии аналогами соматостатина необходимо выполнение ИГХИ на SSTR2 и 5.