«Субъединица PBAF комплекса, ремоделирующего хроматин, PHF10 опосредует транскрипционную активность онкогена MYC»

Экспрессия онкогена MYC коррелирует с экспрессией PHF10
На первом этапе работы методом иммуноблоттинга мы определили уровень экспрессии изоформ PHF10 и белковой формы онкогена МYС в пятнадцати онкотрансформированных клеточных линиях разного происхождения (рис. 1).
Рисунок 1. Анализ экспрессии онкогена MYC и изоформ PHF10 в разных клеточных линиях.
Интенсивность окраски изоформ PHF10 и продукта белка МYС, выявленных с помощью специфических антител, оценили с помощью денситометрического анализа с использованием программного обеспечения ImageJ. Между экспрессией MYC и изоформами PHF10 мы наблюдали положительную корреляцию (коэффициент рангов Спирмена составил 0,478, n = 15, p = 0,073).
Совместная повышенная экспрессия PHF10 и MYC в клетках может приводить к усиленной пролиферации онкотрансформированных клеток по сравнению с влиянием каждого из факторов по отдельности.
2. MYC-ассоциированные PBAF комплексы клеток меланомы содержат PHF10
Согласно анализу базы данных TCGA, уровень мРНК PHF10 увеличивается от первичных очагов меланомы до регионарных кожных метастазов и далее в отдаленные метастатические узлы, указывающие на корреляцию экспрессии PHF10 с прогрессированием заболевания. Кроме того, уровни белка MYC увеличивались вместе с прогрессированием от первичных опухолей до отдаленных метастазов.
Чтобы выявить потенциальные взаимодействия между PHF10 и MYC экстракты клеток меланомы Sk-Mel28 и Sk-Mel29 были использованы для иммунопреципитации с антителами против коровых субъединиц BRG1, BAF155 и специфических PHF10, BAF200, BAF180, BRD7 субъединиц комплекса PBAF. Иммунопреципитированный материал был проверен с помощью антител против PHF10 и других субъединиц PBAF, а также с помощью антител против MYC. Антитела против PHF10 и других субъединиц PBAF преципитировали эндогенный MYC в клеточных линиях меланомы Sk-Mel28 и Sk-Mel29 (рис. 2).
Рисунок 2. Иммунопреципитация эндогенного MYC с антителами против коровых и специфических субъединиц PBAF комплекса из клеток Sk-Mel28 (А) и Sk-Mel29 (Б).
Для дальнейшего изучения взаимодействий между MYC и субъединцами PBAF комплекса нами были получены клетки другой мелономальной линии A375 c индуцируемой экспрессией FLAG-MYC.
Антитела против субъединиц комплекса PBAF в том числе и против PHF10 были способны копреципитировать рекомбинантный FLAG-MYC, экспрессия которого была индуцирована в меланомных клетках A375 (рис. 3).
Рисунок 3. Иммунопреципитация FLAG-меченого MYC антителами против коровых и специфических субъединиц PBAF комплекса из экстрактов клеток A375, стабильно трансфецированных с FL-MYC конструкцией.
В реципроктных экспериментах по иммунопреципитации в клетках HEK293T мы продемонстрировали способность эндогенного и рекомбинантного MYC соосаждать все исследуемые субъединицы PBAF комплекса, в том числе и PHF10. Результаты данных экспериментов показывают, что PHF10 присутствует в комплексах PBAF, взаимодействующих с MYC.
3. PHF10 способствует взаимодействию MYC с PBAF комплексом
Чтобы проверить, взаимодействует ли PHF10 напрямую с MYC, мы подавили эндогенный PHF10 с помощью транзиентной трансфекции siРНК-I и siРНК-II PHF10 в клетках линии А375 (рис. 4А).
Рисунок 4. А. Нокдаун PHF10 c помощью siPHF10-I и siPHF10-II. Б. Соосаждение специфическими антителами различных субъединиц PBAF (указаны сверху) из клеток дикого типа (-) и клеток с нокдауном PHF10 (+). Указаны коровые и специфические субъединицы PBAF комплекса.
Далее мы провели соосаждение субъединиц комплекса при нокдауне и в норме из лизатов клеток А375 и показали, что истощение PHF10 не приводило к разрушению комплекса PBAF. (рис. 4Б).
Однако нокдаун PHF10 существенно нарушил взаимодействие между PBAF и MYC (рис. 5), о чем свидетельствует тот факт, что в клетках с нокдауном PHF10 количество MYC, соосажденного с 4 антителами против BAF200 или против BAF150, было значительно меньше, чем соответствующие количества в клетках, обработанных siControl.
Рисунок 5. Истощение PHF10 приводит к уменьшению взаимодействий между MYC и субъединицами PBAF
Таким образом, мы установили, что PHF10 в составе PBAF комплекса напрямую взаимодействует с MYC.
4. PHF10 взаимодействует с MYC через MBI, MBII и CTD домены
Для того чтобы понять каким именно доменом белок MYC взаимодействует с PHF10 мы получили мутантные формы MYC (рис. 6).
Рисунок 6. Схема полученных мутантов MYC. MYC-wt – дикий тип белка MYC.
Затем мы транзиентно коэкспрессировали HA-PHF10-Pl и HA-PHF10-Sl c полным FLAG-MYC и с FLAG-MYC делеционными мутантами в клеточной линии HEK293T с последующей иммунопреципитацией антителами против НА и иммуноблоттингом c антителами против FLAG эпитопа.
PHF10 эффективно осаждал MYC дикого типа. Напротив, делеция доменов MYC Box I и II (MBI и MBII, соответственно), которые, как известно, взаимодействуют с медиаторами транскрипционных кофакторов, TRRAP, p300 / CBP, GCN5 и другими, а также делеция C- концевого домена bHLH-Zip, необходимого для связывания с MYC-ассоциированным фактором X (MAX), влияет на взаимодействие PHF10-MYC (рис. 7А).
Рисунок 7. А. Взаимодействие делеционных мутантов MYC с PHF10-Pl. Б. Взаимодействие HA-PHF10-Sl с MYC.
Изоформа PHF10-Sl также аналогично связывается с FLAG-MYC, из чего можно сделать вывод что DPF-домены изоформы PHF10-Pl не участвуют во взаимодействии PHF10-MYC (рис. 7Б).
5. PHF10 участвует в MYC-зависимой транскрипции
Чтобы определить, влияет ли взаимодействие MYC с PHF10 на MYC-зависимую активацию транскрипции, мы провели репортерный анализ на основе экспрессии люциферазы. Конструкцию, содержащую ген люциферазы под промотором MYC-зависимого гена CDK4, котрансфецировали контрольными siРНК или siРНК PHF10 в клетки HEK293T с последующим измерением активности люциферазы через 48 часов после трансфекции.
Значительное снижение репортерной активности было обнаружено в клетках, обработанных siРНК PHF10, по сравнению с клетками, обработанными контрольной siРНК, что позволяет предположить, что PHF10 коактивирует MYC-зависимую транскрипцию (рис. 8).
Рисунок 8. Уровень экспрессии люциферазы репортера MYC в норме и при нокдауне PHF10.
6. Взаимодействия MYC и PHF10 происходят в ядре клетки на хроматине
Для подтверждения прямых взаимодействий между изоформами PHF10 и онкогена MYC на хроматине были проведены эксперименты проксимального лигирующего анализа (Proximal Ligation Assay PLA) с помощью кита DuoLink® PLA Technology, Sigma-Aldrich. DuoLink® PLA позволяет детектировать и измерять взаимодействия между белками, расстояние между которыми не превышает 40нм с помощью специфических антител, соответствующих зондов и последующей флуоресцентной микроскопии.
Для этого мы получили дважды стабильные линии клеток А375, позволяющие ко- экспрессировать каждую из изоформ Fl-PHF10 и HA-MYC с помощью доксициклина в клетках А375. В ходе дальнейшего изучения взаимодействий с помощью PLA эссея мы идентифицировали наличие сигнала между белками Fl-PHF10 и HA-MYC, которые индуцировано экспрессировали в клетках A375 (рис. 9).
Рисунок 9. Детекция взаимодействия Flag-PHF10i с HA-MYC с помощью DuoLink PLA. Изображения являются максимальными проекциями 10 z-срезов. Ядра показаны синим (DAPI), сигнал DuoLink красным.
Количество сигналов взаимодействия между Fl-PHF10i с HA-MYC на ядро различалось при экспрессии различных изоформ Fl-PHF10i (PL, PS, SL, SS) (рис. 10).
Рисунок 10. Количество сигналов взаимодействия белка HA-MYC с различными изоформами Fl-PHF10i в ядре.
Таким образом мы показали, что все четыре изоформы PHF10 взаимодействуют с MYC. Полученные интенсивность и количество сигнала для разных изоформ PHF10 различается, что может быть связано с их функцией.
7. PHF10 и MYC регулируют экспрессию схожего набора генов
Чтобы оценить важность влияния PHF10 на транскрипционную регуляцию эндогенного MYC мы сравнили эффекты, вызванные истощением PHF10 или MYC, на глобальную экспрессию генов. Полногеномное секвенирование библиотек мРНК проводили на клетках меланомы A375 трансфецированных контрольной siРНК или PHF10 siРНК-I и siРНК-II или MYC siРНК-I и siРНК-II. В результате анализа данных РНК секвенирования было показано, что большинство дифференциально экспрессируемых генов (DEG) между контрольными и истощенными по PHF10 клеточными популяциями значительно перекрываются с DEG между контрольными и MYC-истощенными популяциями клеток (FDR<0.05; рис. 11). Рисунок 11. Диаграммы Венна для генов регуляция которых зависит от истощения MYC и PHF10. A. Гены с пониженной регуляцией при истощении MYC и PHF10. Б. Гены с повышенной регуляцией при истощении MYC и PHF10. В. Гены с пониженной регуляцией при истощении MYC и повышенной регуляцией при истощении PHF10. Г. Гены с повышенной регуляцией при истощении MYC и пониженной регуляцией при истощении PHF10 В частности, 61,8% всех DEG, подавляемых с помощью нокдауна PHF10, перекрываются с генами, которые подавляются с помощью нокдауна MYC. Соответственно, 56% генов, активируемых в клетках с нокдауном PHF10 (по сравнению с контрольными клетками), также активируются с помощью нокдауна MYC. Напротив, только 20,8% генов, активированных нокдауном PHF10, снижались после нокдауна MYC. Всего лишь 10,4% генов, экспрессия которых была повышена в результате нокдауна PHF10, подавлялись в клетках с нокдауном MYC (рис. 11). Таким образом, паттерны генов, активируемых или подавляемых либо PHF10, либо MYC, полностью совпадают, указывая на то, что PHF10 кооперирует с MYC в регуляции транскрипции. Кроме того, анализ обогащения набора генов (GSEA) с использованием базы данных Reactome выявил значительно обогащенные пути в клетках с нокдауном MYC и PHF10 (рис. 12). Рисунок 12. Двадцать наиболее обогащенных путей базы Reactome (отсортированных, по нормализованной оценке, обогащения) для MYC и PHF10-зависимых генов согласно GSEA. Красные рамки указывают пути, связанные с клеточным циклом в классификации сигнальных путей Reactome. Среди двадцати основных сигнальных путей, обогащенных нокдауном MYC или PHF10, большинство имеет отношение к регуляции клеточного цикла. Двести сорок три гена, подавляемых посредством нокдауна PHF10 или MYC, были проанализированы с помощью анализа избыточного представления (Overrepresentation analysis ORA) с использованием базы данных Reactome. Все обогащенные пути использовались для построения сети с использованием информации о взаимосвязи иерархии путей Reactome и были сгруппированы в кластеры, названные по родительскому узлу в иерархии. Чаще всего гены, общие для обоих сравнений (PHF10 siРНК/Control siРНК и MYC siРНК/Control siРНК) принадлежали к путям, которые регулируют клеточный цикл, репликацию ДНК или пути репарации ДНК, что совпадает с функциями MYC в клетке (рис. 13). Рисунок 13. Схема взаимодействия сигнальных путей из базы Reactome, обогащенных генами экспрессия которых была понижена или повышена как при нокдауне MYC, так и при нокдауне PHF10 в соответствии с анализом ORA. Сеть была построена с использованием классификации путей Reactome. Аналогичным образом PHF10 регулирует экспрессию генов, контролирующих вышеупомянутые процессы. Таким образом, кооперация PHF10 и MYC в активации транскрипции была дополнительно подтверждена глобальным анализом экспрессии генов после нокдауна MYC или PHF10. 8. PHF10 локализуется на промоторах MYC-зависимых генов и необходим для активации их транскрипции Далее мы изучили уровень PHF10 и MYC на сайтах связывания MYC рядом с промотором MYC-зависимых генов с помощью хроматин иммунопреципитации (рис. 14). Рисунок 14. Уровень PHF10 и MYC на регуляторных участках промоторов MYC-зависимых генов. Обогащение было подсчитано как процент от общего количества ДНК соответствующих генов во внесенном материале. Затем мы изучили роль PHF10 в активации транскрипции MYC-зависимых генов. Клетки A375 дикого типа в норме и с нокдауном PHF10 культивировали в бессывороточной среде с последующим добавлением сыворотки для активации ответов MYC (рис. 15А,Б). Рисунок 15. А. уровни мРНК PHF10 и MYC в контроле(siCont) и при нокдауне PHF10 (siPHF10) после до добавления сыворотки (-FBS) и после добавления сыворотки (+FBS). Б. добавление сыворотки не изменяет уровень мРНК PHF10 после нокдауна PHF10. В. При нокдауне PHF10 активация МYC-зависимых генов снижена на 8-47%. Как и ожидалось, в клетках дикого типа сыворотка значительно увеличила содержание мРНК всех изученных генов. Однако в клетках с нокдауном PHF10 эти гены стимулировались сывороткой в значительно меньшей степени (рис. 15В). Эти результаты подтверждают, что PHF10 действует как коактиватор MYC-зависимой транскрипции. 9. Истощение PHF10 вызывает клеточное старение и задержку G0/G1 фазу клеточного цикла в клетках меланомы Ранее было показано, что истощение MYC в клетках меланомы вызывает фенотип, подобный клеточному старению. Мы попытались понять, может ли подавление PHF10 приводить к развитию такого же фенотипа, как и при истощении MYC. Действительно, подавление PHF10 с помощью siРНК в клетках A375 сопровождалось изменениями в клеточной морфологии и повышенной активностью, связанной с клеточным старением, β- галактозидазы (рис. 16). Рис. 16 Оценка активности β-галактозидазы. Нокдаун PHF10 и MYC вызывают клеточное старение клеток A375. Соответственно, истощение MYC и PHF10 вызывает сходные фенотипы. Кроме того, нокдаун MYC или PHF10 в клетках меланомы Sk-Mel-28, Sk-Mel-29 и A375 приводил к накоплению в G1 и сопутствующему снижению фаз S и G2 / M клеточного цикла, демонстрируя аналогичную роль MYC и PHF10 в регуляции клеточного цикла (рис. 17). Рис. 17 Анализ клеточного цикла клеток A375 при нокдауне MYC и PHF10. Эти фенотипические изменения подтверждают роль PHF10 как партнера MYC и совместную роль при регуляции экспрессии одинаковых MYC-зависимых генов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе мы показали механизмы взаимодействия SWI/SNF и онкогена MYC, реализующиеся для регуляции транскрипции генов в клеточных линиях меланомы. Комплексы SWI/SNF млекопитающих – BAF и PBAF – одни из ключевых участников ремоделирования хроматина, осуществляющих перемещение нуклеосом. Несмотря на их важнейшую роль в регуляции транскрипции, их влияние на каждый из клеточных и физиологических процессов, в которых они участвуют трудно определима, из-за того, что в их состав входит множество субъединиц специфичных для различных тканей, клеток и этапов развития. Процесс онкогенной трансформации еще больше усложняет интерпретацию их активности, так как мутации в субъединицах комплекса (встречающиеся в более чем 20%) опухолей меняют его функцию. Сведения о про- и антионкогенной роли SWI/SNF комплексов одновременно встречаются в литературе, как и для других эпигенетических белков, например, гистонметилтрансфераз. MYC является не только одним из важнейших онкогенов, но и общим регулятором транскрипции. Множество исследований показали, что MYC привлекает разнообразные модификаторы хроматина, их ко-факторы и ко-активаторы, такие как гистон ацетилазы, гистон метилтрансферазы, комплекса Медиаторы и другие. Ремоделирование нуклеосом является важнейшим компонентом регуляции транскрипции, поэтому не удивительно, что MYC и комплексы SWI/SNF взаимодействуют друг с другом. Ранее было показано, что коровый компонент PBAF, субъединица BAF47 (INI) привлекается вместе с MYC на промоторы и взаимодействует с его C-концевым доменом. Это взаимодействие ингибирует MYC-зависимую транскрипцию. В этой работе мы показали, что MYC также взаимодействует с PHF10, специфической субъединицей PBAF комплекса. Ранее, в нашей лаборатории и другими группами было показано PHF10 необходим для пролиферации множества типов клеток, таких как фибробласты, HEK293, нейробласты и миелобласты - предшественники клеток крови. Однако механизм поддержания клеточной пролиферации, опосредованный PHF10, остается неясным. Мы показали, что кроме физического взаимодействия PHF10 необходим для транскрипции MYC-зависимых генов, и что нокдаун PHF10 существенно снижает MYC-зависимую активацию транскрипции. Согласно полученным в настоящей работе данным PHF10 необходим для взаимодействия MYC со всем PBAF комплексом, то есть без данной субъединицы сила такого взаимодействия существенно падает. Взаимодействие осуществляется через MBI, MBII, и bHLH домены MYC. MBI и MBII домены необходимы для взаимодействия и с другими эпигенетическими факторами, такими как BRD4, p400, GCN5 и TRRAP. Таким образом взаимодействие между PHF10 и MYC осуществляется похожим образом с другими белками. Далее мы показали, что взаимодействие PHF10 и MYC имеет функциональное значение. Нокдаун PHF10 снижал MYC зависимую трансактивацию люциферазного репортера, содержащего элементы связывания MYC. Нокдаун PHF10 снижает также эндогенную экспрессию ряда MYC-зависимых генов, таких как TYMS, CYCE2, E2F1, APEX1 и других. MYC и PHF10 вместе находятся на промоторах этих генов. При этом нокдаун PHF10 не влияет на привлечение MYC на промоторы, но снижает взаимодействие MYC с другими субъединицами PBAF. Таким образом, можно сделать вывод что PHF10 необходим для привлечения комплекса PBAF на промоторы MYC-зависимых генов и ремоделирования хроматина на этих сайтах для активации транскрипции. Нокаут MYC в клетках меланомы приводит к выводу этих клеток из клеточного цикла и инициации терминального клеточного блока – фенотипа клеточного старения. Мы показали, что фенотип клеток нескольких линий меланомы при нокдауне MYC и PHF10 схожи – при снижении экспрессии обоих генов происходит увеличение количества клеток в G1 фазе клеточного цикла и последующее развитие клеточного старения (измеренное по окраске на специфический маркер – бета-галактозидазу, ассоциированную с клеточным старением). Роль индивидуальных компонентов комплексов SWI/SNF в канцерогенезе очень индивидуальна. Например, BRG1 инактивирован в практически всех карциномах яичника, но гиперэкспрессирован в остром миелобластном лейкозе. BRG1 также гиперэкспрессирован в меланомах. В данной работе мы показали корреляцию высокого уровня PHF10 в ряде опухолевых линий с высоким уровнем MYC. Вместе с тем другие исследователи показывают роль PHF10 в качестве опухолевого супрессора в увеальной меланоме, и его частые делеции в этих опухолях. Можно предположить, что мутации и гиперэкспрессия компонентов SWI/SNF в опухолях зависит от транскрипционного и эпигенетического контекста. В такой модели проонкогенные субъединицы комплекса будут гиперэкспрессироваться и замещать супрессорные компоненты комплекса, которые будут подвергаться отрицательному отбору, и в результате инактивироваться или делетироваться в большинстве опухолевых клетках. SWI/SNF комплекс является привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии и для стратегии с синтетической летальностью (при которой инактивация компонентов комплексов делает опухоль более чувствительной к определенным видам таргетной или конвенциональной химиотерапии). Однако, если такие ингибиторы будут созданы, их применение будет определяться индивидуально, в зависимости от роли компонентов SWI/SNF в конкретной опухоли. Показанное в данной работе взаимодействие между MYC и PHF10 является примером такого взаимодействия. ВЫВОДЫ По результатам данной работы были сделаны следующие выводы: 1. MYC взаимодействует с комплексом PBAF, включающим PHF10. PHF10 важен для установления этого взаимодействия; 2. PHF10-Pl и PHF10-Sl изоформы взаимодействуют с MYC напрямую через MBI, MBII и CTD домены. Взаимодействия MYC с изоформами PHF10 происходят в ядре клетки на хроматине; 3. PHF10 является коактиватором MYC-зависимой транскрипции и присутствует на промоторах MYC-зависимых генов. Более 60% MYC-зависимых генов в клетках меланомы А375 также зависят от PHF10. Подавляющее большинство этих генов контролируют клеточный цикл и репарацию ДНК; 4. Истощение MYC и PHF10 вызывает сходные фенотипы у клеток меланомных линий: приводит к проявлению фенотипа старения и к накоплению клеток в G0/G1 фазе клеточного цикла.