Технология получения противотуберкулезного препарата и оценка его иммунобиологических свойств

Экспериментальная часть
диссертационной работы выполнена в период с 2019 по 2021 год в ФГБОУ ВО Омский ГАУ на кафедре ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней и на базе лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом ФГБНУ «Омский аграрный научный центр».
Объектом исследования служили морские свинки линии агути в возрасте 4–5 мес. массой 400-450 г, содержавшиеся в условиях специализированного вивария лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом отдела ветеринарии Омского аграрного научного центра. Исследования проведены в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приложения к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 No 755) и согласно схеме исследований. Лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно нормам рациона для лабораторных животных (Г.Е. Батрак, А.М. Кудрин, 1979). За подопытными животными вели постоянное наблюдение, в опыт брали только клинически здоровых животных.
Для экспериментального инфицирования использовали вирулентные культуры M. bovis (14 и 8 штаммы из биоресурсной коллекции ВНИИБТЖ).
При анализе протективных свойств противотуберкулезных препаратов на морских свинках применяли метод С.И. Гельберг, Е.А. Финкель (1959), для оценки напряженности иммунитета использовали индекс защиты, предложенный А.И. Тогуновой (1951). Оценку препаратов на их способность восстанавливать у морских свинок иммунологическую реактивность проводили по способу В.С. Власенко с соавт. (2007).
Антигенные комплексы получали из культуры вакцинного штамма БЦЖ, выращенной на жидкой синтетической среде Сотона, а затем дезинтегрированной ультразвуком на установке УЗДН-1 в течение 30 мин при частоте 22-35 кГц и мощности 60-70 Вт/см2. Разрушенную клеточную суспензию центрифугировали, надосадочную жидкость инкубировали с формалином и затем определяли содержание белка биуретовой пробой на фотометре – 5010 V5+ (М.А. Бажин с соавт., 2009), концентрацию которого доводили до 1 мг/мл белка, затем в препарат добавляли адъювант (бетулин, бетулоновую и бетулиновую кислоты) и размешивали до полного растворения при комнатной температуре.
До начала исследований всем животным выстригали боковую поверхность тела и внутрикожно вводили очищенный (ППД) туберкулин для млекопитающих (Курская биофабрика – фирма “БИОК”, Россия) в дозе 25 МЕ в объеме 0,1 мл растворителя. Аллергическую реакцию оценивали через 24 ч. Для проведения исследований были отобраны только особи с отрицательной реакцией на введение туберкулина.
Иммуногенез у животных изучали с помощью иммунологических реакций: число Т-лимфоцитов определяли с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-рок); цитотоксических Т-лимфоцитов – непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка (ЕА-рок); В-лимфоцитов
– комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка (М.А. Бажин с соавт., 2005). Подсчет лейкоцитов и лейкограммы осуществляли по общепринятым методикам.
Функциональную активность нейтрофилов оценивали фотометрическим способом в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) в спонтанном и индуцированном (вакцина БЦЖ) вариантах. Дополнительно рассчитывали функциональный резерв нейтрофилов как отношение индуцированного варианта НСТ с последующей фотометрической фиксацией результатов с помощью многоканального иммунохимического анализатора «Fluorofot STD Less-486-М». (В.С. Власенко с соавт., 2015). В нейтрофильных гранулоцитах цитохимическим методом определяли активность миелопероксидазы (МПО) по методу Грэхем– Кнолля с использованием бензидина (A. Hrycek 1993), а также содержание лизосомально-катионных белков (ЛКБ) по методу М.Г. Шубича (1974) с бромфеноловым синим. При анализе мазков подсчитывали процент положительно прореагировавших клеток и в соответствии со стандартными методиками рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК).
Для гистологического исследования были взяты аутоптаты легких, селезенки, печени и паховых лимфатических узлов. Аутоптаты были заключены в кассеты и помещены в 10%-ный раствор нейтрального формалина на фосфатном буфере. Подготовку материала осуществляли на станции MICROM STR-120.
Заливку парафином проводили на заливочной станции MICROM ES-350. Готовили гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопию и морфометрию осуществляли с помощью микроскопа Zeizz AXIO Imager A1.
Статистическую обработку цифровых данных проводили с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Excel. Достоверность различий между группами по количественным признакам оценивали при помощи t- критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимым при p <0,05. 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Конструирование экспериментальных препаратов на основе антигенов БЦЖ и бетулина, и его производных. Выделение из бересты основного компонента – тритерпенового спирта бетулина и осуществление химической модификации до бетулоновой и бетулиновой кислот осуществлялось согласно описанным литературным методикам на кафедре органической и экологической химии Института химии Тюменского государственного университета (проф., д-р хим. наук Кулаков И.В.). С целью получения антигенных комплексов культуру вакцинного штамма БЦЖ, выращенную на жидкой синтетической среде Сотона, подвергали ультразвуковой дезинтеграции. Для посева на питательную среду использовали суспензию из лиофилизата микобактерий вакцинного штамма БЦЖ-1. Полученную взвесь центрифугировали, в надосадочной жидкости после предварительной инкубации с формалином определяли содержание белка с помощью красителя бромфенолового синего. Концентрацию белка в антигенном комплексе доводили до 1000 мкг/мл, путем добавления в препарат, предварительно растворенного в полиэтиленгликоле-300-монолаурате экстракта бетулина или его производных (бетулоновую и бетулиновую кислоты) в количестве 500, 1000 и 1500 мкг на 1 мл белка, получив в общей сложности 9 серий конъюгатов. 2.2.2. Испытание иммунологической активности экспериментальных конъюгатов на морских свинках, инфицированных M. bovis (шт. 14) 2.2.2.1. Изучение иммуногенных и протективных свойств полученных конъюгатов. Для исследований были отобраны 55 морских свинок, которых разделили на 11 групп (n=5). Животным 1-, 2- и 3-й группы инокулировали под кожу конъюгат антигенов БЦЖ с бетулином в объеме 0,5 мл с содержанием экстракта соответственно 500, 1000 и 1500 мкг/мл белка; особям 4-, 5- и 6-й групп по идентичной схеме был введен иммуноген, содержащий бетулиновую кислоту; 7-, 8- и 9-й – препарат на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в тех же количествах в 1 мл белка; морским свинкам 10-й группы – внутрикожно вакцину БЦЖ в дозе 100 мкг в 0,1 мл физиологического раствора. Остальные пять интактных особей (группа 11) служили в качестве контроля. Через 30 сут после введения экспериментальных конъюгатов животным контрольной и всех опытных групп инфицировали вирулентной культурой М. bovis (штамм 14) подкожного в дозе 1 мкг/мл и через 45 сут подвергали эвтаназии для патологоанатомических исследований (табл. 1). Таблица 1 – Иммуногенные и протективные свойства различных серий экспериментальных конъюгатов на морских свинках Группа животных (препарат, доза) 1-я (а/г БЦЖ+бетулин, 500 мкг) 2-я (а/г БЦЖ+бетулин, 1000 мкг) 3-я (а/г БЦЖ+бетулин, 1500 мкг) 4-я (а/г БЦЖ+бетулиноваяк-та,500мкг) 5-я (а/г БЦЖ+бетулиновая к-та, 1000 мкг) 6-я (а/г БЦЖ+бетулиновая к-та, 1500 мкг) 7-я (а/г БЦЖ+бетулоноваяк-та,500мкг) 8-я (а/г БЦЖ+бетулоновая к-та, 1000 мкг) 9-я (а/г БЦЖ+бетулоновая к-та, 1500 мкг) 10-я (вакцина БЦЖ) 11-я (контроль) Кожная аллергическая реакция через 30 сут после заражения, мм Степень пораженности органов, в баллах M±m 3,40±0,25** 50 4,0±0,45** 41 4,2±0,37** 38 4,0±0,44** 41 3,40±0,24** 50 4,6±0,81* 32 2,0±0,45** 70 3,4±0,24** 50 3,6±0,40** 47 1,80±0,49** 74 6,80±0,20 - n Реаги- ровало 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 M±m 11,0±1,09 12,6±1,25 12,2±0,58 11,8±0,80 11,0±1,05 12,4±0,51 6,2±1,16 8,6±1,40 6,6±0,93 10,2±1,24 9,6±1,72 5 5 Примечание: а/г – антиген; * - р <0,05; ** - р <0,001. 9 Индекс защиты, % Установлено, что наибольшее снижение степени пораженности органов у особей, сенсибилизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой (500 мкг/мл белка) до 2,0±0,45 против 6,80±0,20 (р<0,001), при этом индекс защиты составил 70%. Следует отметить, что полученный результат был сопоставим с морскими свинками, привитыми живой вакциной БЦЖ, у которых пораженность органов составляла 1,80±0,49, а индекс защиты – 74%. При обработке морских свинок препаратами, содержащими бетулин, наилучшими свойствами обладал иммуноген, комплексированный с 500 мкг адъюванта (индекс защиты 50%). Из конъюгатов антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой самая низкая степень пораженности наблюдалась у морских свинок, получивших 1000 мкг/мл этого производного в антигенном комплексе. Протективные свойства также составили 50%. Таким образом, с увеличением содержания в антигенном комплексе БЦЖ бетулина и его производных снижается способность животного противостоять экспериментальному инфицированию вирулентной культурой M. bovis (шт. 14). 2.2.2.2. Оценка функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов у морских свинок, сенсибилизированных экспериментальными конъюгатами. Для изучения состояния кислород- независимой и кислород-зависимой бактерицидных систем нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови морских свинок определяли процентное содержание положительно прореагировавших фагоцитов с лизосомальными катионными белками и миелопероксидазой в зависимости от степени их активности (клетки с низкой, средней и высокой плотностью гранул в цитоплазме) с последующим расчетом среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Взятие проб крови осуществляли на 30-е сут после введения экспериментальных противотуберкулезных препаратов и на 30-е сут после инокуляции вирулентной культуры микобактерий от морских свинок контрольной и всех опытных групп. Анализ наблюдаемых изменений уровней биологически активных противомикробных веществ в нейтрофильных гранулоцитах отражает тенденцию снижения их активности с увеличением в препарате количества бетулина и его производных с 500 до 1500 мкг/мл. При этом минимальное содержание адъюванта (500 мкг/мл) в конъюгате стимулировало деятельность антибактериальных систем фагоцитов, о чем свидетельствовало повышение СЦК ЛКБ и МПО у морских свинок 1-й, 4-й и 7-й групп относительно контроля. В то же время введение животным вакцины БЦЖ способствовало снижению содержания катионных белков на 24% и, особенно, ферментной активности миелопероксидазы на 46,4% (р <0,01). Таким образом, увеличение концентрации адъюванта в иммуногене приводит к снижению деятельности изучаемых антибактериальных компонентов нейтрофильных гранулоцитов. Необходимо отметить, что аллергическая реакция на введение ППД- туберкулина на 30-е сут после введения экспериментальных конъюгатов отсутствовала. Кожная сенсибилизация наблюдалась только у морских свинок, привитых вакциной БЦЖ. Введение экспериментальных конъюгатов (1-9-я группы), а также живой вакцины БЦЖ (10-я группа) перед инокуляцией инфекта по сравнению с морскими свинками, инфицированными M. bovis, способствовало сохранению активности антимикробных систем нейтрофильных гранулоцитов, о чем свидетельствовало увеличение средне групповых показателей СЦК ЛКБ и МПО во всех опытных группах относительно контроля. Следует отметить, что наиболее выраженное усиление активности как неферментной (ЛКБ), так и ферментной бактерицидных систем (МПО), достигающее статистической значимости, наблюдалось только в 3-х группах животных: 5-й, 7-й и 9-й. В частности, цитохимические параметры, характеризующие деятельность катионных белков и миелопероксидазы у особей, привитых БЦЖ, превосходили значения контрольной группы соответственно в 4,4 (р<0,001) и 1,83 (р<0,01) раза; у морских свинок, подвергнутых обработке конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой (500 мкг/мл белка) – в 3,1 (р<0,001) и 1,4 (р<0,01) раза; у сенсибилизированных антигенным комплексом с бетулиновой кислотой (1000 мг/мл белка) – в 2,6 и 1,28 (р<0,01) раза. Таким образом, инокуляция вирулентной культуры микобактерий морским свинкам, привитым БЦЖ, а также особям, сенсибилизированным конъюгатами на основе антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой, в дозе 1000 мкг/мл и с бетулоновой кислотой в дозе 500 мг/мл, сопровождалось достоверным усилением как кислород-независимой, так и кислород-зависимой бактерицидных систем. 2.2.2.3. Оценка способности экспериментальных конъюгатов восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность у морских свинок. В опыт взято 25 морских свинок, из которых 15 особям подкожно вели инъекцию ППД-туберкулина для млекопитающих в дозе 1,5 мл с целью создания иммунологической толерантности. На 3-и сут после толерогенной обработки 5 морских свинок были подвергнуты подкожной инъекции конъюгатов антигенов БЦЖ с бетулином в дозе 500 мкг/мл белка (1-я группа), 5 животных – антигенных комплексов БЦЖ с бетулиновой кислотой в дозе 1000 мкг/мл белка (2-я группа) и еще 5 – конъюгатов антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в дозе 500 мкг/мл белка (3-я группа). Затем на 10-е сутки после сенсибилизации экспериментальными конъюгатами морских свинок 1-3 группы привили вакциной БЦЖ. Еще 5 здоровых интактных морских свинок также были привиты вакциной БЦЖ (4-я группа) и остальные 5 – служили в качестве контроля. Спустя 30 дней все животные (n=25) были подвергнуты инфицированию вирулентной культурой M. bovis (шт. 14) подкожно в область паха слева в дозе 0,1 мкг/мл физиологического раствора. Через 30 дней были подвергнуты эвтаназии для оценки степени инфицированности, используя схему C.И. Гельберга, Е.А. Финкеля и индекс защиты А.И. Тогуновой. Анализ полученных результатов показал (табл. 2), что высокой способностью восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность обладает комплекс антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой. Степень пораженности органов – 0,8±0,49 (р <0,001) баллов; индекс защиты – 84%, тогда как у привитых вакциной БЦЖ 1,4±0,6 (р <0,01) – 73%. Более низкая способность у конъюгатов с бетулином и бетулиновой кислотой, соответственно: 2,2±0,37 с 57% и 2,4±0,24 с 54 % (р <0,001). Таблица 2 – Оценка конъюгатов антигенов БЦЖ с дериватами бетулина на их способность восстанавливать иммунологическую реактивность у морских свинок Кожная аллергическая реакция через 30 сут после вакцинации, мм Кожная аллергическая реакция через 30 сут после заражения, мм Интенсивность поражения органов, баллы, M±m 2,2±0,37** 57 2,4±0,24** 54 0,8±0,49** 84 1,4±0,6* 73 5,2±0,37 0 реаги- ровало M±m реаги- ровало M±m n 1-я 5 5 2-я 5 5 3-я 5 5 4-я 5 5 Контроль 5 - 6,8±0,58 7,00±0,71 5,00±0,89 11,4±1,08 - n 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 8,2±1,07* 8,0±0,77* 3,8±1,07** 10,6±1,03 13,0±1,00 Примечание: * р <0,01; **р <0,001. Таким образом, конъюгат антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой способен наиболее эффективно восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность, на что указывали результаты патологоанатомических исследований (индекс защиты – 84%). 2.2.2.4. Анализ патогистологических изменений легких, лимфоузлов, селезенки и печени у морских свинок, сенсибилизированных экспериментальными конъюгатами. С целью проведения гистологических исследований были взяты аутоптаты легких, селезенки, печени и паховых лимфатических узлов от: 5 морских свинок, которым за 30 сут до экспериментального заражения вводили подкожно физиологический раствор в объеме 0,5 мл (1-я контрольная группа); 5 особей, которым перед инфицированием M. bovis (шт. 14) подкожно ввели конъюгат антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой в дозе 1000 мкг/мл белка в объеме 0,5 мл (2-я группа); 5 животных, обработанных до инокуляции патогена, препаратом, содержащим комплекс антигенов БЦЖ с бетулином подкожно в дозе 500 мкг/мл белка в объеме 0,5 мл (3-я группа); 5 морских свинок, сенсибилизированных перед введением вирулентной культуры конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой, подкожно в дозе 500 мкг/мл в объеме 0,5 мл (4-я группа). Помимо этого, материал для гистологического исследования отбирали от 5 морских свинок, привитых перед инфицированием живой вакциной БЦЖ, в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора. При гистологическом исследовании органов морских свинок 5 групп был выявлен ряд морфологических отличий туберкулезного процесса. Группа животных Индекс защиты, % У морских свинок всех групп в паховых лимфоузлах, регионарных к месту введения культуры M. bovis (шт. 14), образовывались туберкулезные гранулемы, которые характеризовались активной пролиферацией эпителиоидных макрофагов и клеток стромы, а также очагами некроза (рис. 1, 2). 1 Рисунок 1 – Лимфоузел морской свинки контрольной группы (No1). 1. Участок на границе крупного очага некроза с гнойным расплавлением мертвой ткани. 2. Видоизмененные в различной степени эпителиоидные клетки, псевдоэозинофилы (нейтрофилы) и «гнойные тельца». Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 100. 2 2 При гистологическом исследовании селезенки морских свинок контрольной и экспериментальных групп установлено, что профилактическое введение конъюгатов антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой (группа No2) и бетулином (группа No3), не предотвратила генерализацию возбудителя с кровью, что обусловило развитие в органе специфических для туберкулеза изменений и вызвало подавление его иммунопоэтической функции (рис. 3). В то же время, при применении конъюгата антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой и вакцинации БЦЖ, генерализация микобактерий либо отсутствовала, либо размножение возбудителя в селезенке было подавлено и специфические изменения не развились (рис. 4). При вакцинации отмечались также выраженные признаки усиления выработки иммунокомпетентных клеток. В печени животных всех экспериментальных групп специфические для туберкулеза процессы не развивались. Обнаруженные различные дистрофические процессы не являются специфичными, а могут являться признаками нарушения метаболизма у исследуемых животных. Наряду с этим, у некоторых животных наблюдалось размножение клеток с дифференцировкой их в гепатоциты. Возможно, что бетулиновая кислота и бетулин стимулировали регенеративные процессы в печени. Рисунок 2 – Лимфоузел морской свинки (группа No4). Туберкулезный очаг под капсулой лимфоузла. 1. Бесструктурный очаг некроза. 2. Пролиферирующие эпителиоидные макрофаги и лимфоциты. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 50. 2 Рисунок 3 – Селезенка морской свинки контрольной группы (No1). 1. Обширный участок сухого некроза. 2. Пролиферирующие клетки стромы, макрофаги и лимфоциты. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 100. Рисунок 4 – Селезенка морской свинки (группа No4). Белая и красная пульпа селезенки без видимых патологических изменений. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 50. При изучении возможного влияния на морфологию туберкулезного процесса в легких бетулина и его производных, нами отмечен ряд различий. При воздействии конъюгатов антигенов БЦЖ с бетулином и, особенно, с бетулоновой кислотой наблюдалось значительное уменьшение пролиферации лимфоидной ткани в органе, по сравнению с контрольной группой, выразившееся, прежде всего, в уменьшении диаметра лимфофолликулов и снижении их активности. В то же время существенных морфологических различий у животных, которым вводили конъюгат антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой и инфицированных, но не вакцинированных животных не отмечено. Вместе с тем, в ткани легких морских свинок 3-й и 4-й группы, получавших конъюгаты антигенов БЦЖ с бетулином и бетулоновой кислотой, визуально наблюдалось большее количество плазматических клеток. Это позволяет предполагать, что отсутствие в легких животных данных групп туберкулезных очагов и низкая активность лимфоидной ткани связаны с активизацией гуморального иммунитета при действии этих препаратов. 2.2.3. Испытание иммунологической активности экспериментальных конъюгатов на морских свинках, инфицированных M. bovis (шт. 8). По результатам исследований иммунобиологических свойств вновь синтезированных препаратов на модели экспериментального туберкулеза у морских свинок, индуцированного вирулентной культурой M. bovis (шт. 14), для дальнейших испытаний были отобраны экспериментальные конъюгаты антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой в дозе 1000 мкг/мл белка, а также антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в дозе 500 мкг/мл белка. 2.2.3.1. Изучение иммуногенных и протективных свойств иммуногенов, комплексированных с производными бетулина. С этой целью было использовано 20 морских свинок, разделенных на 4 группы (n=5). Морским свинкам 1-й группы (n=5) вводили подкожно в область паха справа антигены вакцинного штамма БЦЖ, конъюгированные с бетулиновой кислотой в дозе 1000 мкг/мл в объеме 0,5 мл. Морским свинкам 2-й группы (n=5) тем же способом вводили антигены вакцинного штамма БЦЖ, конъюгированные с бетулоновой кислотой в дозе 500 мкг/мл в объеме 0,5 мл. Животным 3-й группы (n=5) вводили внутрикожно вакцину БЦЖ в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора, а морским свинкам 4-й (контрольной) группы (n=5) вводили подкожно физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Все 20 особей через 30 суток после введения препаратов были инфицированы вирулентной культурой M. bovis штамм 8 подкожно в область паха слева в дозе 1 мкг/мл. Через 45 суток после инфицирования М. bovis животных подвергали эвтаназии ингаляционным наркозом парами эфира и проводили патологоанатомические исследования (табл. 3). Таблица 3 – Иммуногенные и протективные свойства препаратов на основе антигенов БЦЖ с производными бетулина Группа животных 1-я группа 2-я группа 3-я группа Контроль Примечание: * р <0,001 Кожная аллергическая реакция через 30 сут после заражения, мм Степень пораженности органов, в баллах M±m 2,40±0,40* 1,80±0,20* 1,60±0,68* 6,60±0,40 Индекс защиты, % 63 73 76 - n Реагирова ло 5 5 5 5 5 5 M±m 5,4±1,53 5,6±0,60 7,0±1,30 9,2±0,58 5 5 На 30-е сутки после иммунизации противотуберкулезными препаратами, аллергическая реакция развивалась только у морских свинок, иммунизированных вакциной БЦЖ; диаметр припухлости кожи составил 8,8±1,2 мм. Наиболее низкую степень пораженности наблюдали у животных, сенсибилизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой – 1,80±0,20 баллов (индекс защиты – 73%). Следует отметить, что результаты лишь немногим уступали живой вакцине БЦЖ, которая создавала протективный иммунитет на уровне 76%. 2.2.3.2. Иммунные реакции у морских свинок на введение конъюгатов на основе антигенов БЦЖ с производными бетулина. Для проведения опыта отобрали 20 морских свинок (см. схему опыта в разделе 2.2.3.1.). Анализ параметров иммунной системы на 30-е сут после введения противотуберкулезных препаратов показал, что введение морским свинкам изучаемых противотуберкулезных препаратов – конъюгатов на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой и бетулиновой кислотами и вакцины БЦЖ, оказывало иммуностимулирующее действие, которое проявлялось в увеличении числа иммунокомпетентных клеток, а также усилении функциональной активности нейтрофилов в разной степени выраженности. Иммунологическая перестройка на 30-е сутки после инфицирования M. bovis (шт. 8) у морских свинок, иммунизированных конъюгатами на основе антигенов БЦЖ бетулоновой и бетулиновой кислотами, сопровождалась снижением числа лейкоцитов, соответственно, на 35,6 и 33,6% (р <0,001), лимфоцитов – на 39,8 и 36,9% (р <0,001) и нейтрофилов – на 14,3 и 16,8% (р <0,01) относительно соответствующих значений у животных контрольной группы (таб. 4). Таблица 4 – Средние значения иммунологических параметров у морских свинок на 30-е сутки после инфицирования вирулентной культурой M. bovis (штамм 8), M±m 1-я группа (конъюгат антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой) 2-я группа (конъюгат антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой) 3-я группа (вакцина БЦЖ) Показатель Лейкоциты, × 109/л Лимфоциты, × 109/л Нейтрофилы, × 109/л Т-лимфоциты, × 109/л В-лимфоциты, × 109/л ЦТ-лимфоциты, × 109/л НСТ-тест, спонт., ед. оп. пл. НСТ-тест, стим., ед. оп. пл. Функциональный резерв нейтрофилов, у.е. СЦК ЛКБ, у.е. СЦК МПО, у.е. Контроль 10,78±0,34 7,43±0,27 2,79±0,13 0,99±0,06 1,06±0,10 3,22±0,47 0,65±0,03 0,51±0,02 0,78±0,05 0,83±0,05 7,16±0,21*** 4,69±0,25*** 2,32±0,06** 0,87±0,07 0,71±0,08* 1,26±0,03** 0,63±0,02 0,59±0,02 0,94±0,01* 0,99±0,05 Опытные группы 6,94±0,18*** 4,47±0,27*** 2,39±0,12 1,71±0,23* 0,71±0,10* 1,22±0,18** 0,60±0,03 0,56±0,02 0,92±0,02* 1,71±0,18** 1,04±0,02*** 11,36±0,63 7,68±1,05 3,21±0,62 2,69±0,31** 1,22±0,32 2,24±0,36 0,60±0,02 0,57±0,02 0,94±0,01* 1,40±0,30 0,84±0,19 0,45±0,03 Примечание: * р <0,05; ** р <0,01; *** р <0,001. 0,44±0,02 Снижение концентрации лимфоидных клеток после экспериментального заражения морских свинок, иммунизированных конъюгатами антигенов БЦЖ с бетулоновой и бетулиновой кислотами, происходило за счет популяции цитотоксических Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Так, по сравнению с контрольной группой зарегистрировано уменьшение числа цитотоксических Т- клеток, соответственно, на 62,1 и 60,8% (р <0,01), а В-клеток – на 33% (р <0,01). В то же время инфицирование особей, которым предварительно вводили конъюгат антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой, индуцировало существенное увеличение концентрации Т-лимфоцитов на 72,7% (р <0,05). Последнее изменение также было характерно для животных, иммунизированных БЦЖ, у которых пролиферация Т-клеток носила более выраженный характер (увеличение в 2,7 раза по сравнению с контрольной группой, р <0,01). Изменения показателей кислород-зависимой бактерицидной активности нейтрофилов по результатам исследований в НСТ-тесте в анализируемых группах были однонаправленными. При отсутствии значимых отличий был отмечен рост стимулированной и снижение спонтанной тетразолиевой активности. Помимо этого, средние значения функционального резерва нейтрофилов у морских свинок опытных групп были увеличены в 1,18 и 1,2 раза относительно контрольной группы (р<0,05). Сходными изменениями характеризовались также СЦК ЛКБ и СЦК МПО. Значения этих показателей у животных, иммунизированных БЦЖ, увеличились, соответственно, в 1,7 и 1,9 раза, а у морских свинок, иммунизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в 2,1 и 2,3 раза относительно контрольной группы, при этом только у последних наблюдалось статистически значимое повышение показателей. У особей, иммунизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой, эти коэффициенты существенно не изменялись, хотя и наблюдалась некоторая тенденция к увеличению СЦК ЛКБ. Известно, что при туберкулезе возникает дефицит Т-системы иммунитета, выраженность которого усиливается по мере прогрессирования заболевания. Ведущую роль в формировании противотуберкулезного иммунитета играет функциональное состояние фагоцитирующих клеток, особенно их бактерицидных систем. Указанные ключевые параметры состояния иммунной системы у морских свинок, иммунизированных БЦЖ и конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой, после заражения вирулентным штаммом микобактерий были существенно выше, чем у инфицированных животных контрольной группы. Это свидетельствует о более высокой противотуберкулезной активности данных препаратов. 2.2.3.3. Анализ патогистологических изменений у морских свинок, сенсибилизированных конъюгатами антигенов БЦЖ с производными бетулина до заражения M. bovis (шт. 8). Для проведения исследований отобрали 20 морских свинок (см. схему опыта в разделе 2.2.3.1.). При гистологическом исследовании органов морских свинок 4-х групп был выявлен ряд морфологических отличий туберкулезного процесса. Гистологические исследования органов морских свинок инфицированных M. bovis (шт. 8) на фоне предварительной иммунизации БЦЖ и применения конъюгатов на основе антигенов БЦЖ с производными бетулина, показали, что во всех опытных группах патогистологические изменения в паховых лимфоузлах, селезенке, печени и легких были существенно менее выражены. У животных контрольной группы наблюдались изменения специфического характера, проявляющиеся образованием скоплений эпителиоидных клеток, некротическими процессами в паренхиматозном компоненте указанных органов (рис. 5, 7). Кроме того, в печени и легких у животных этой группы наблюдали процессы альтеративно-экссудативного воспаления, связанные с деградацией основных паренхиматозных структур, в том числе микроциркуляторного русла. У морских свинок 2 группы, которым предварительно подкожно вводили комплекс конъюгатов БЦЖ с бетулоновой кислотой и последующим заражением M. bovis (шт. 8) наблюдалось замедление пролиферативных процессов в лимфоидных структурах селезенки, лимфоузлов и легких, которое выражалось в уменьшении размеров лимфатических фолликулов и снижении в них лимфоцито- и плазмоцитопоэза (рис. 6, 8). Указанная закономерность, но в менее выраженной степени наблюдалась у морских свинок 1 группы, которым вводили комплекс антигенов БЦЖ с бетулиновой кислотой и последующим заражением культурой M. bovis (шт. 8). У животных этой группы отмечали незначительное увеличение в тканях исследуемых органов плазматических клеток и более, чем у морских свинок 2-й группы, выраженность пролиферации эпителиоидных и лимфоидных клеток. У морских свинок 3 группы, которым внутрикожно вводили вакцину БЦЖ, наблюдали процессы активной иммунной перестройки органов, которые выражались в умеренной пролиферации клеток лимфобластного ряда, увеличением количества лимфоидных структур, усилением процессов лимфоцитопоэза и плазмоцитопоэза. Указанные изменение являются характерным ответом на введение ослабленного специфического антигена, в данном случае вакцины БЦЖ. 1 1 2 Рисунок 5 – Лимфоузел (регионарный) морской свинки контрольной группы (No4). 1. Разросшиеся эпителиоидные клетки. 2. Обширные участки некроза. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 50. Рисунок 6 – Лимфоузел (противоположный к месту заражения) морской свинки (группа No2). 1. Диффузная пролиферация лимфоцитов. 2. Очаги пролиферации эпителиоидных макрофагов. 3. Лимфатические фолликулы. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 50. 18 1 1 1 1 Рисунок 7 – Селезенка морской свинки Рисунок 8 – Селезенка морской свинки контрольной группы (No4). 1. Фолликулы (группа No2). 1. Фолликулы в центральной селезёнки окружены пролиферирующими части селезенки. Окраска гематоксилином и эпителиоидными клетками. Окраска эозином, ув. x 50. гематоксилином и эозином, ув. х 50. Учитывая вышеизложенное, можно констатировать, что характер патогистологических изменений у животных 1-й и 2-й групп, которым вводили комплекс антигенов БЦЖ с бетулиновой и бетулоновой кислотами свидетельствует об активизации основных звеньев специфического противотуберкулезного иммунитета. 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании результатов проведенных исследований нами сделаны следующие выводы: 1. Разработана технология изготовления специфического иммуномодулятора на основе комплекса антигенов микобактерий вакцинного штамма БЦЖ в соотношении 1000 мкг/мл белка с 500 мкг/мл бетулоновой кислоты, позволяющая получать высокоиммуногенные препараты, способные эффективно устранять иммунодефицитные состояния и стимулировать у животных реакции клеточного иммунитета. 2. Экспериментальные конъюгаты на основе антигенов БЦЖ с бетулином в дозе 500-1000 мкг/мл белка и его производными в дозе 500 мкг/мл белка оказывали стимулирующий эффект на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов, характеризующееся усилением миелопероксидазной активности (в 1,18-1,37 раза) и увеличением содержания катионных белков (в 1,17-1,58 раза) в фагоцитах. Инокуляция вирулентной культуры M. bovis (штамм 14) предварительно иммунизированным морским свинкам сопровождалась достоверным повышением активности антибактериальных систем нейтрофилов у животных, привитых БЦЖ, а также у сенсибилизированных конъюгатами с бетулиновой (1000 мкг/мл) и с бетулоновой кислотами (500 мкг/мл). 3. Гистологическое исследование легких, лимфоузлов, селезенки, печени лабораторных животных показало, что примененный перед их инфицированием культурой M. bovis (шт. 14) конъюгат антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой (500 мкг/мл), по сравнению с конъюгатами антигенов БЦЖ с бетулином и бетулиновой кислотой, вызывает у экспериментальных животных более выраженную иммунологическую перестройку. 4. Протективные свойства наиболее перспективных экспериментальных конъюгатов на модели туберкулеза M. bovis (штамм 8) сопоставимы с протективными свойствами живой вакцины БЦЖ: индекс защиты 63% – средний уровень у морских свинок, иммунизированных препаратом с бетулиновой кислотой, и 73-76% обеспечивает высокий уровень у животных, подвергнутых обработке конъюгатом антигенов вакцинного штамма с бетулоновой кислотой, и привитых БЦЖ, соответственно. 5. Иммунный статус при введении экспериментальных конъюгатов на основе антигенов БЦЖ и дериватов бетулина морским свинкам характеризуется увеличением числа иммунокомпетентных клеток (в 1,7-3,8 раза) и усилением бактерицидной функции нейтрофильных гранулоцитов, особенно активности катионных белков. После введения вирулентного штамма M. bovis шт. 8 у особей, иммунизированных конъюгатом на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой, также, как и у привитых БЦЖ, происходило выраженное повышение концентрации Т-лимфоцитов и активизация антимикробных систем нейтрофильных гранулоцитов, что обеспечивало их высокую противотуберкулезную устойчивость. 6. Патогистологические изменения в органах морских свинок, которым до инфицирования культурой M. bovis (шт. 8) вводили комплекс антигенов БЦЖ с бетулиновой и бетулоновой кислотами, указывают на снижение специфических изменений и активизацию иммунологического ответа. На основании полученных результатов рекомендуются следующие практические предложения: 1. Методические рекомендации «Антигенные комплексы БЦЖ с производными бетулина: перспектива использования в ветеринарии», рассмотрены и утверждены ученым советом ФГБНУ «Омского аграрного научного центра» (протокол No1 от 24 января 2022 года). Предназначены для специалистов ветеринарных научно-исследовательских институтов, ВУЗов и лабораторий, проводящих исследования в области разработки новых средств и методов иммунологической защиты животных. 2. Технология изготовления специфического иммуномодулятора на основе комплекса антигенов микобактерий вакцинного штамма БЦЖ и бетулоновой кислоты, позволяет получать высокоиммуногенные препараты, способные эффективно корректировать иммунодефицитные состояния и стимулировать реакции клеточного иммунитета. «Способ получения специфического иммуномодулятора» (Патент РФ на изобретение No 2774467). 3. Основные теоретические положения и экспериментальные материалы исследований по изучению иммунных реакций и структурно-функционального состояния гистиоцитарной системы на введение экспериментальных конъюгатов морским свинкам на модели туберкулезного процесса целесообразно использовать при выполнении научно-исследовательских работ аналогичной направленности, при написании справочных пособий и монографий, а также в учебном процессе ВУЗов биологического и ветеринарного профиля. Перспективы дальнейшей разработки темы. Полученные результаты открывают перспективу дальнейших испытаний конъюгата антигенов вакцинного штамма БЦЖ с бетулоновой кислотой в производственных условиях с целью разработки условий применения препарата в системе мероприятий специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.