Термофильные углеводородокисляющие почвенные бактерии из контрастных природно-климатических зон

Глава 1. Почвенная микробиота в условиях нефтезагрязнения
В литературном обзоре представлены современные данные о влиянии нефтезагрязнения на почвенную микробиоту, включая отдельные группы микроорганизмов, нефтеразлагающих бактерий различных географических зон, о распространении и особенностях термофильных нефтеразлагающих бактерий, включая бактерии, принадлежащие к типу Firmicutes, в том числе в контексте глобального изменения климата в сторону повышения контрастности температуры почв и урбанизированных территорий. Несмотря на то, что влияние нефтезагрязнения на микробное сообщество почв изучено весьма подробно, о распространении термофильных бактерий в почвах зон с холодным
и умеренным климатом и их роли в деструкции нефтепродуктов в условиях, не являющихся для этих бактерий типичными, в настоящее время все еще мало сведений, как и о пригодности этих культур в качестве составляющих микробных ассоциаций для ремедиации нефтезагрязненных территорий, поэтому направление исследования является актуальным.
Глава 2. Объекты исследования и методика проведения экспериментов
Объекты и предметы исследования. Объектами исследования служили нефтезагрязненные почвы, седименты озер, а также урбанизированные почвы и грунты с территорий свалки и железной дороги. Использовалось 27 проб в 5 пулах, соответствующих различным географическим зонам: Апшеронский полуостров (Азербайджан) (A), г. Кудрово (K), г. Пушкин (Санкт-Петербург, Россия) (P), г. Луга (Ленинградская область, Россия) (L), Ямало-Ненецкий округ (Россия) (YN). Предметом исследования являлась почвенная микробиота (бактерии и археи), в том числе – термофильные бактерии, способные к разложению нефти и отдельных углеводородов.
Отбор образцов почвогрунта. Отбор нефтезагрязненных почв и грунтов производился согласно «Методическим рекомендациям по выявлению деградированных и загрязненных земель» (1995). Пробы почв и почвогрунтов Апшеронского полуострова были предоставлены д.б.н. Соромотиным А.В. (Тюменский Государственный Университет, НИИ экологии и рационального использования природных ресурсов). Пробы грунтов г. Пушкин отбирались под руководством к.б.н. ВНИИСХМ Андронова Е.Е. Пробы почв Ямало-Ненецкого округа и пробы грунтов г. Кудрово, Ленинградская область, были предоставлены д-р с.-х. наук, проф. Волковой Е.Н. (ФГБНУ АФИ).
Лабораторные эксперименты. Для выявления присутствия термофильных бактерий и получения накопительных культур в усредненных пробах проводили высев образцов на модифицированную нами жидкую минеральную питательную среду Ворошиловой-Диановой (далее – ВД) (Ворошилова, Дианова, 1952) с добавлением микроэлементов (Palatinszky et al., 2015) и индивидуальных углеводородных субстратов в качестве единственного источника энергии и углерода для роста микроорганизмов.
Используемые индивидуальные субстраты:
 Ацетат натрия (трехводный) вносили в количестве 1,36 г/л.
 Бензоат натрия вносили в количестве 0,721 г/л.
 Нефть сырую (ГОСТ 9965-62, Черкасский завод химреактивов) вносили в
количестве 10 мл/л.
 Гексадекан вносили в количестве 30мл/л.
Подробная методика выявления термофильных бактерий, выделения чистых штаммов микроорганизмов, проверки их чистоты и постановки культивационных и ростовых экспериментов с выделенными штаммами и индивидуальными углеводородными субстратами описана в источниках (Журавлева и др., 2021, Галушко и др., 2021).
Идентификацию выделенных штаммов молекулярно-генетическими методами проводили в компании «Евроген» (Москва) на основе анализа последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК с использованием стандартных праймеров – 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) и 1492R (5′-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′). Анализ нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических деревьев осуществляли с помощью NCBI BLAST и методов Neighbour-Joining и Maximum Likelihood (Tamura, Nei, 1993, Chevenet et al., 2006, Dereeper et al., 2008, 2010), программ MUSCLE, Gblocks, PhyML, TreeDyn, MEGA 10. Длина анализируемых последовательностей составляла 1439–1444 нуклеотидов.
Определение содержания нефтепродуктов в почвогрунтах проводили спектрофотометрическим методом в соответствии с МУК 4.1.1956-05 (2005).
Исследование метагенома образцов почвогрунтов. Методики выделения и очистки ДНК, конструирования и секвенирования ампликонных библиотек и преобразования данных в таксономические единицы подробно и поэтапно описаны в литературе (Андронов и др., 2009, Malferrati et al., 2002, De Santis et al., 2006, Caporaso et al., 2010, Edgar, 2010).
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку проводили в программе MC Excel. Определялись средние значения изучаемых показателей, доверительные интервалы. Достоверность различий между вариантами оценивали методами параметрической (t-критерий Стьюдента) статистики. Различия между вариантами считались достоверными при p ≤ 0,05.
Глава 3. Термофильные почвенные бактерии из нефтезагрязененных почв и почвогрунтов различных природно-климатических зон
3.1. Свойства исследуемых образцов почв и грунтов
В результате высева почвенных образцов на среду ВД с добавлением в качестве органического субстрата ацетата натрия или нефти и культивирования в термостате при 60oС, накопительные культуры бактерий, показавшие активный рост, были отобраны для дальнейшей работы. Впоследствии из них были выделены чистые штаммы термофильных бактерий, также в этих пробах определяли исходное общее содержание нефтепродуктов (далее – НП). pH в пробах почвогрунтов варьировал от 4,5 до 7,8, при этом наименьшим значением отличалась проба P3 (г. Пушкин), а наибольшим – К2 (г. Кудрово, территория свалки). Содержание нефтепродуктов в пробах загрязненных почв Азербайджана варьировало от 1,48 до 5,13 массовых %. Содержание НП в почвах и грунтах Санкт-Петербурга и Ленинградской области было довольно низким и варьировало от следовых количеств в фоновом образце P9 до 2,67 масс % загрязненном образце P3. Наибольшим содержанием НП закономерно отличались обладающие высокими сорбционными способностями торфяные почвы Ямало-Ненецкого округа – до 25 масс %. Такая концентрация нефти является критичной для многих групп микроорганизмов, в особенности при низких температурах, приводящих к подавлению микробной активности, но, несмотря на это, в одном из образцов (при загрязнении 19,6 масс %) было
обнаружено присутствие культивируемых аэробных органогетеротрофных термофильных бактерий.
3.2. Характеристика выделенных штаммов термофильных бактерий
В результате выделения чистых штаммов на твердой питательной среде на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ), их последующей очистки и проверки чистоты, была составлена рабочая коллекция из 18 штаммов термофильных бактерий, выделенных из проб почвогрунтов различных исследуемых географических зон. Между некоторыми из них было отмечено морфологическое сходство по внешнему виду колоний, виду и размеру клеток и форме крепления спор. Все обнаруженные бактерии представляли собой неподвижные спорообразующие палочки, способные образовывать парные соединения (диплобациллы) и цепочки (стрептобациллы). Форма крепления спор – субтерминальная или терминальная. После выделения, термофильные бактериальные штаммы были идентифицированы с помощью молекулярно- генетических методов.
3.2.1. Идентификация выделенных штаммов термофильных бактерий
Идентификация бактериальных штаммов молекулярно-генетическими методами показала, что штаммы A2-1b, L2-1 принадлежат к виду Geobacillus thermodenitrificans (рис. 1), при этом выявлена близость обоих штаммов не к типовому штамму вида, а к штамму WJ-9 (Xia, 2012), A3-1 – к штамму DSM 465 вида Geobacillus stearothermophilus (Egan et al., 2017), штамма P6-1 – к штамму BGSC95A1 Geobacillus (Parageobacillus) thermoglucosidasius (Suzuki et al. 1983, Aliyu et al. 2016), штамма 7-1-2 – к виду Anoxybacillus sp. штамма YIM73012 (Khan et al., 2018), штамма YN2 – к штамму WSUCF-022A вида Geobacillus jurassicus (Carlson et al., 2018), штаммов A7-1-1, K2-2, K6, L1, L2-2, L2-3, P2-1, P2-2, P4, P6-2, P8-2 – к близкому к геобациллам роду Aeribacillus, сравнительно недавно отделенному от Geobacillus в отдельный ((Scholz et al., 1987, Miñana-Galbis et al, 2010), и на данный момент насчитывающему два вида (Miñana-Galbis et al, 2010, Finore et al, 2017). Интересно отметить, что генетически близкородственные штаммы Geobacillus (A2-1b (Азербайджан) и L2-1 (Луга); A3-1 (Азербайджан) и YN2 (Ямал)) встречаются в нефтезагрязненных почвах и грунтах весьма отдаленных друг от друга регионов, а различные представители рода Aeribacillus были обнаружены в 10 пробах грунтов четырех из пяти исследуемых регионов.
Бактерии рода Geobacillus считаются «космополитами», широко распространенными на планете (Zeigler, 2014). Однако, чаще всего представителей родов Geobacillus, Aeribacillus и Anoxybacillus находят в подогретых экосистемах, например, в почвах районов с геотермальной активностью и горячих источниках (Pikuta et al, 2000, Banat et al, 2004, Pinzón- Martínez et al, 2010, Dai et al, 2011, Yasawong et al, 2011, Zhang et al, 2013, Cihan et al, 2014, Mnif et al., 2014, Filippidou et al, 2015, Inam et al, 2018, Yamprayoonswat et al, 2019, и др.), имеются также отдельные данные об их обнаружении в антропогенных экосистемах, таких, как свалка и компостный
завод (Carlson et al., 2018). Общий вид клеток и спор некоторых выделенных нами штаммов представлен на рис. 2.
Рис. 1. Филогенетическое древо близкородственных штаммов, полученное путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице попарных расстояний (Tamura, Nei, 1993, Edgar, 2004, Chevenet et al, 2006, 2008, 2010). Длина ветвей соответствует количеству нуклеотидных замен на сайт.
Рис. 2. Общий вид клеток и спор штаммов: a – A7-1-2 (Anoxybacillus sp.), b – L2-1 (Geobacillus thermodenitrificans), c – P6-1 (Parageobacillus thermoglucosidasius), d – L2-3 (Aeribacillus sp.). Увеличение 400х.
10

По литературным данным, на территории России были обнаружены некоторые другие термофильные представители рода Geobacillus (Nazina et al., 2004, Rozanov et al., 2014, Bryanskaya et al., 2015), и эти виды также были найдены преимущественно в горячих источниках, тогда как о присутствии их в почве на территории России на настоящий день информации очень мало, имеются лишь отдельные сведения об их обнаружении в антропогенно измененных почвах, таких как сельскохозяйственные почвы после внесения продуктов переработки сточных вод (Ахтемова, 1998) и территории лесозаготовок (Юницына и др., 2019). Сведения о присутствии в почвах регионов Санкт-Петербурга и Ленинградской области термофильных бактерий рода Aeribacillus были получены нами впервые. При этом, исходя из данных филогенетического анализа, отмечается разнообразие выделенных штаммов рода Aeribacillus, что подтверждено в том числе, несовпадениями в скорости роста и способности к использованию различных субстратов. Данные проведенных нами анализов позволяют заключить, что виды термофильных бацилл также присутствуют в антропогенно измененных почвах и почвогрунтах северных регионов, и факт их обнаружения не является случайной находкой.
3.2.2. Особенности роста выделенных штаммов бактерий на индивидуальных углеводородных субстратах
При проверке роста выделенных чистых культур термофильных бактерий на отдельных органических субстратах была выявлена их способность к разложению нефти и отдельных углеводородов. Выявлено, что выживание и способность к разложению углеводородов при температуре 60oС для 4 из 18 выделенных культур, предположительно зависит от их включенности в бактериальное сообщество (табл. 1).
Таблица 1
Способность штаммов к росту на индивидуальных углеводородных субстратах*
Наименование штамма
А2-1b (Geobacillus thermodenitrificans) А3-1 (Geobacillus stearothermophilus) А7-1-1 (Aeribacillus sp.)
А7-1-2 (Anoxybacillus sp.)
K2-2 (Aeribacillus sp.)
K6 (Aeribacillus sp.)
L1 (Aeribacillus sp.)
L2-1 (Geobacillus thermodenitrificans) L2-2 (Aeribacillus sp.)
L2-3 (Aeribacillus sp.)
P2-1 (н/о)
P2-2 (Aeribacillus sp.)
P4 (Aeribacillus sp.)
P6-1 (Parageobacillus thermoglucosidasius) P6-2 (Aeribacillus sp.)
P8-1 (н/о)
P8-2 (Aeribacillus sp.) YN2 (Geobacillus sp.)
Ацетат Na +
+
+ + + + + + +
+ + +
+
Нефть +
+
Не
+ + + н/о +
+ +
+ – +
Не
Не
C16 Бензоат Na + н/о
н/о н/о
обнаружена
+ н/о
+ н/о
+ н/о н/о н/о + + + + + +
обнаружена
н/о н/о
+ –
обнаружена
обнаружена
Не
– +
+
* Примечание: «+» – наблюдается кратковременный рост штамма на индивидуальном
+– + +– н/о
субстрате, при этом OD570 культуры не превышает 0,35; н/о – не определялось 11

При этом, данные культуры способны расти индивидуально при температуре 60oС на богатых питательных средах.
Имеются существенные различия во времени, за которое культуры достигают максимальной плотности, как между штаммами бактерий разных видов, так и между штаммами бактерий одного вида, выделенными из проб почв и грунтов различных географических зон.
Рис. 3. Графики роста некоторых исследуемых культур на индивидуальных углеводородных субстратах (a – A3-1 (Geobacillus stearothermophilus), A7-1-2 (Anoxybacillus sp.); b – L2-1 (Geobacillus thermodenitrificans), L2-2, L2-3 (Aeribacillus sp.); c – K2-2, K6 (Aeribacillus sp.); d – YN2 (Geobacillus sp.) e – P2-2 (Aeribacillus sp.); f – P6-1 (Parageobacillus thermoglucosidasius)); К – контроль (посев на среду ВД без органических субстратов)
Наивысшей скоростью роста на ацетате натрия характеризуются бактериальные культуры А3-1 и А7-1-2 (Азербайджан), а также культура YN2 (Ямал) (рис. 3), достигающие максимальной оптической плотности (OD570 1,11, 1,15 и 0,7) через 0,6, 1,0 и 0,8 суток после посева, соответственно. Максимальная оптическая плотность для культуры L2-1 (OD570 1,7) наблюдается через 0,9 суток начиная с окончания лаг-фазы, а для культур L2-2, L2-3 – через 1,5 суток с окончания лаг-фазы (OD570 1,2, 1,3, соответственно).
Вид кривой роста позволяет предположить, что штаммы L2-2 и L2-3 близкородственны, и это подтверждается их идентификацией молекулярно- генетическими методами. Показано, что культура K2-2 (территория свалки) характеризовалась более плавным изменением кривой роста, чем культура K6 (край свалки), при этом максимальная оптическая плотность (OD570 1,2) наблюдалась через 2,3 суток для культуры K2-2, и 1,7 суток – для культуры K6.
Максимальная оптическая плотность культур (OD570) в конце опыта при культивации их на жидкой среде ВД с добавлением нефти составляла 0,7 для культуры K2-2 и 0,31 – для культуры K6, что указывает на способность обеих культур использовать углеводороды нефти в качестве субстрата. Выявлено, что культура YN2 способна использовать углеводороды нефти, при этом максимальная OD на нефти достигается через 2,9 суток. Выявлено, что культура P2-2 (Санкт-Петербург) способна к использованию в термофильных условиях нефти, а также ацетата и бензоата натрия, при этом на нефти и бензоате она достигает существенно более высокой OD. Выявлено, что культура P6-1 способна использовать ацетат натрия, нефть и гексадекан, достигая на нефти наиболее высокой OD.
Таким образом, было отмечено разнообразие характеристик выделенных бактериальных штаммов, в частности – штаммов бактерий рода Aeribacillus, обладающих разными скоростью роста, максимальной оптической плотностью при выходе кривой роста на плато и способностью к использованию различных субстратов.
3.3. Метагеномный состав сообществ бактерий и архей исследуемых почвогрунтов Санкт-Петербурга и Ленинградской области
Для исследования микробных сообществ грунтов методом ПЦР были взяты пробы почвогрунтов Санкт-Петербурга и Ленинградской области P1–P9, а также L1, L2 (г. Луга), К2, К6 (г. Кудрово). Структура бактериального ценоза позволила охарактеризовать процессы, происходящие в грунтах при разных уровнях нефтяного загрязнения. Известно, что при концентрации нефтепродуктов в почве до 0,7 мл/кг микробиологические показатели стабильны (Киреева, Водопьянов, 1996). Однако, имеющиеся литературные данные преимущественно касаются микробиома почв, тогда как исследований микробных сообществ антропогенно измененных песчаных грунтов, бедных легкодоступным органическим веществом и характеризующихся низким содержанием азота (Журавлева и др., 2017), в литературе на данный момент имеется недостаточно.
Изменение сообществ бактерий и архей на уровне типа.
Ранжирование проб по уровню загрязнения позволяет наглядно продемонстрировать изменения сообществ на уровне типа в сравнении с контрольным образцом P9 (табл. 2).
Так, уже при загрязнении 0,29% наблюдается практически полное исчезновение архей типа Thaumarchaeota. При низких уровнях загрязнения 0,02–0,55% наблюдается возрастание количества представителей типа Actinobacteria, резко снижающегося при загрязнении в 2,67%. В наших
исследованиях ранее было показано, что в нефтезагрязненных почвах Ленинградской области при 2% загрязнении нефтью возросла доля Actinobacteria, осуществляющих анаэробную деградацию циклических и ароматических углеводородов на более поздних стадиях биодеградации нефти (Журавлева и др., 2017).
При уровнях загрязнения 1,91–2,67% наблюдается выраженное доминирование типа Proteobacteria, занимающего, соответственно, 42,76% и 53,20% в сравнении с 23,23% в контрольном образце, что соотносится со многими литературными данными (Popp et al., 2006, Zrafi-Nouira et al., 2009, Head et al., 2006, Dos Santos et al., 2011). Для представителей типа Verrucomicrobia, занимающих в контрольном образце 5,38%, критичным оказывается загрязнение нефтепродуктами между 0,55 и 1,91%, а при 2,67% они подавляются полностью, аналогичный уровень загрязнения является критичным для представителей типа Planctomycetes.
Таблица 2
Изменение сообществ бактерий и архей почвогрунтов г. Пушкин при различных уровнях нефтезагрязнения (на уровне типа)
Archaea Bacteria
Тип
Euryarchaeota Thaumarchaeota Acidobacteria Actinobacteria Armatimonadetes Bacteroidetes Caldiserica
Chlamydiae
Chloroflexi Coprothermobacteraeota Cyanobacteria Firmicutes Gemmatimonadetes Nitrospirae Patescibacteria Planctomycetes Proteobacteria Spirochaetes Verrucomicrobia
% сиквенсов в образцах почвогрунтов
P3 P5 P1 P4 P2 P6 P7 P8 P9
–
– – – 15,66 19,08 6,62
– – –
0,14 0,00 3,26
6,76 8,94 7,46
2,22 10,08 18,48 21,82 17,62 20,60 18,00 13,32 9,73
– 0,46
0,30 – – 0,18 0,46 7,48
– – – 2,80 2,56 2,90 5,72 4,10 5,83
– 0,26 – 0,02 – 0,03
0,06 – – – –
0,24 – – – 0,32 – 0,16 – – –
6,38 10,30 6,64 – – – 0,02 0,12 0,04 0,02 – 0,02 – – – 0,52 0,04 0,24 0,24 0,58 0,72 0,50 0,90 0,84 0,12 – 0,58
– 0,02 0,10 1,64 1,90 1,52
12,04 13,06 14,53 ––– 0,14 0,20 0,30 0,04 – 0,05 – – – 0,20 – 0,03 0,58 1,00 1,68 0,20 0,18 0,15 0,50 0,92 0,75 0,20 0,10 0,08 1,62 1,94 1,98
20,92 10,32 0,16
– – – –
– 0,22
– 0,10 0,16 0,26 0,06 0,76
53,20 42,76 37,30 35,42 32,68 29,50 26,56 23,94 23,23
– 0,02 –
– 0,12 4,32
2,67 1,91 0,55
– – – 7,34 3,60 4,14 0,35 0,29 0,15
– – – 4,72 5,84 5,38
Содержание НП, масс %
0,03 0,02
<0,01 При этом, в литературе имеются данные о доминировании представителей типа Thaumarchaeota и типов Actinobacteria и Proteobacteria в почвах разного типа – серых лесных, каштановых, черноземных при загрязнении в 20 массовых % (Manucharova et al., 2020), и о подавлении представителей типа Planctomycetes при загрязнении нефтью черноземной почвы, тогда как количество представителей типа Verrucomicrobia при загрязнении этого типа почвы, по данным авторов, меняется мало. Отдельно стоит упомянуть то, что в образце с загрязнением НП 1,91% наблюдается возрастание численности представителей типа Firmicutes (в 6 раз в сравнении с контрольным образцом, при снижении численности в образцах с загрязнением до 55%), становящееся еще более выраженным при уровне загрязнения 2,67% (в 12 раз). Cообщества бактерий и архей загрязненных грунтов с железной дороги г. Луга и грунтов со свалки г. Кудрово (табл. 3) также характеризуются преобладанием представителей типа Proteobacteria, однако в них, кроме этого, высока доля представителей типа Actinobacteria, как и в грунтах г. Пушкин с низкими уровнями загрязнения (до 0,55%). Количество представителей архей типа Thaumarchaeota снижается в загрязненном нефтью образце L2 при 0,39% содержании нефти в сравнении с фоновым L1, с 2,73% до 0,4 %. При этом, сообщества образцов почвогрунтов с железной дороги г. Пушкин значительно отличаются от сообществ образцов, взятых со свалки г. Кудрово и с железной дороги г. Луга. Так, при загрязнении 0,39% в почвогрунтах г. Луга и 0,69 и 1,02% в почвогрунтах свалки г. Кудрово присутствуют представители типа Thaumarchaeota, в то время как в образцах почвогрунтов г. Пушкин при загрязнении выше 0,15% они обнаружены не были. Таблица 3 Изменение сообществ бактерий и архей почвогрунтов г. Луга и г. Кудрово при различных уровнях нефтезагрязнения (на уровне типа) Тип % сиквенсов в образцах почвогрунтов L2 L1 (фон) K2 K6 Archaea Bacteria Euryarchaeota – – 0,40 – Thaumarchaeota 0,40 2,73 1,77 1,50 Acidobacteria 5,50 3,40 2,50 4,67 Actinobacteria Bacteroidetes Chlamydiae Chloroflexi Cyanobacteria Firmicutes Gemmatimonadetes Nitrospirae Patescibacteria Planctomycetes Proteobacteria Verrucomicrobia 13,40 14,17 4,67 8,33 0,47 0,27 0,03 0,10 – – 0,50 1,93 0,10 0,20 0,87 1,10 0,43 0,03 3,03 4,67 27,03 25,73 2,27 4,17 0,39 0,02 16,40 18,57 3,70 6,80 – – 2,17 0,43 – 0,17 3,80 1,63 0,20 0,07 0,43 0,43 – – 1,07 2,50 24,53 24,10 0,50 2,27 0,69 1,02 Содержание НП, масс % Таким образом можно сделать вывод, что влияние нефтяного загрязнения на микробные сообщества песчаных насыпных грунтов требует отдельного всестороннего изучения для понимания процессов, происходящих в микробных сообществах зон, непосредственно включенных в среду обитания человека. Изменение сообществ бактерий и архей на уровне класса. На уровне класса, при загрязнении 1,91 и 2,67%, в образцах грунтов г. Пушкин наблюдается доминирование класса Gammaproteobacteria, количество представителей которого возрастает в 2,6 и 2,7 раз, соответственно (табл. 4), что согласуется со многими литературными данными (Head et al., 2006, Popp et al., 2006, Zrafi-Nouira et al., 2009, Dos Santos et al., 2011), тогда как количество представителей класса Alphaproteobacteria последовательно возрастает при загрязнении 0,02–0,55%, снижается при 1,91% и снова возрастает при 2,67%. Таблица 4 Изменение сообществ бактерий и архей почвогрунтов г. Пушкин при различных уровнях нефтезагрязнения (на уровне класса) Тип Euryarchaeota Thaum- archaeota Acidobacteria Actinobacteria Armati- monadetes Bacteroidetes Caldiserica Chlamydiae Chloroflexi Coprothermo- bacteraeota Cyanobacteria Firmicutes Gemmati- monadetes Nitrospirae Patesci- bacteria Plancto- mycetes Proteo- bacteria Spirochaetes Verruco- microbia Содержание НП, масс % 2,67 1,91 Класс % сиквенсов в образцах почвогрунтов P3 P5 P1 P4 P2 P6 P7 P8 P9 Methanomicrobia – 0,20 0,10 – 0,40 0,04 – – 0,02 9,94 – 0,10 – – – – – – – – – Thermoplasmata Nitrososphaeria Acidobacteriia Blastocatellia (Subgroup 4) Subgroup 6 Thermoanaerobaculia Acidimicrobiia Actinobacteria Rubrobacteria Thermoleophilia Unclassified Actinobacteria Chthonomonadetes Fimbriimonadia Bacteroidia Caldisericia Chlamydiae Anaerolineae Chloroflexia Coprothermobacteria Oxyphotobacteria Bacilli Clostridia 20,48 – – 0,46 – – – – 2,22 – – – – – – – 0,18 0,14 – 1,16 2,58 2,42 6,10 4,14 5,78 0,02 0,02 – 0,20 – 0,72 0,48 0,24 0,42 – – – – 3,26 2,80 2,56 2,90 0,88 0,94 0,96 1,33 6,04 4,18 2,60 3,60 0,28 0,42 0,52 0,50 0,30 0,18 0,04 0,40 1,76 2,28 2,28 1,70 17,22 19,02 15,50 16,46 12,56 8,48 6,08 –––– 0,02 – – – 15,66 19,08 0,74 0,04 – – 6,62 – – – – – 0,22 – 0,10 0,26 2,14 1,66 2,22 2,56 2,14 1,70 0,40 – 0,18 0,58 0,44 0,30 – 0,12 – –– – – 0,12 – –– 0,03 – 0,06 – – – – 0,24 – 0,32 – 0,16 – 0,54 9,40 – 0,34 0,08 – – – 0,16 6,38 10,30 6,64 – – – 0,02 0,12 0,04 – – – 0,02 – 0,02 – – – 0,52 0,04 0,24 0,16 0,08 0,56 0,10 – 0,10 – 0,46 – 12,04 13,06 14,53 ––– 0,14 – – – 0,20 0,42 0,18 – – 0,34 – 0,12 – 0,04 – 0,20 0,30 – 0,03 – – – – – 0,03 0,34 1,00 0,62 0,65 0,84 0,18 0,18 0,15 – 0,02 – – 0,58 0,50 0,92 0,75 0,10 0,20 0,10 0,08 Erysipelotrichia Negativicutes Unclassified Firmicutes Gemmatimonadetes Longimicrobia Nitrospira Saccharimonadia – 0,08 0,02 – – – – – – – 0,03 – 0,00 – – – – – – – – – 0,48 0,90 – – 0,12 – – 0,02 – – 0,26 0,30 0,40 Phycisphaerae Planctomycetacia Alphaproteobacteria 11,84 Deltaproteobacteria 0,90 Gammaproteobacteria 32,50 31,82 14,84 12,94 13,60 13,64 11,60 12,90 12,05 Unclassified 7,94 4,00 Proteobacteria Spirochaetia – 0,02 – 0,06 6,04 0,90 0,18 0,16 0,14 0,10 0,50 18,46 20,20 16,00 14,26 13,00 9,32 8,68 1,32 1,48 0,38 0,90 0,94 1,02 1,88 1,68 2,43 1,36 1,48 1,80 1,83 Verrucomicrobiae – 0,12 3,62 1,36 2,10 – – – 4,32 7,34 3,60 0,55 0,35 0,29 0,60 0,06 – – 4,14 4,72 0,15 0,03 0,10 0,13 –– 5,84 5,38 0,02 <0,01 Среди Gammaproteobacteria при уровне загрязнения 2,91% доминируют представители рода Fulvimonas, а также неидентифицированные представители класса Betaproteobacteria и семейства Burkholderiaceae, а среди Alphaproteobacteria – неклассифицированные представители семейства Acetobacteraceae. Доминируют при высоких уровнях загрязнения также классы Clostridia, доля которых в контрольном образце не превышает 0,65%, а также Bacteroidia, составляющие изначально высокую долю и сообщества контрольного незагрязненного образца (14,5%). При этом, при низких уровнях загрязнения доля представителей этого класса снижается. Важно отметить, что класс Clostridia в загрязненных образцах грунтов г. Пушкин практически полностью представлен родом термофильных бактерий Caloribacterium, в образцах P3 и P5 занимающим 19,5 и 6,78% всего метагенома, соответственно. Этот род был описан в литературе сравнительно недавно (Slobodkina et al., 2012). Тип Thaumarchaeota в исследуемых грунтах представлен классом Nitrososphaeria, преимущественно неидентифицированными представителями семейства Nitrososphaeraceae, а среди представителей типа Acidobacteria доминирует класс Blastocatellia (Subgroup 4). И те, и другие, показали чувствительность к нефтяному загрязнению выше 1,91%. Класс Bacilli, к которому принадлежат выделенные нами культивируемые термофильные микроорганизмы, занимает малую часть сообществ, в контрольном образце насчитывая 1% и снижаясь во всех загрязненных образцах до 0,02–0,56%. Численность представителей класса Actinobacteria возрастает при уровнях загрязнения 0,02–1,91%, но резко снижается при 2,67%, выраженное снижение численности представителей класса Thermoleophilia наблюдается, начиная с 0,55%, а при 2,67% они обнаружены не были. Представители класса обнаруженные в пробах г. Пушкин к мезофильным родам с наличием представителей (Suzuki, Whitman, 2012). принадлежат некоторых Возможно, Thermoleophilia, преимущественно психрофильных чувствительность представителей этого класса к условиям, создающимся в наиболее загрязненных образцах, связано именно с поверхностным нагревом грунта. Представители класса Nitrososphaeria, занимающие в контроле 2,9%, оказываются чувствительными к уровню загрязнения начиная с 0,29%, а Planctomycetacia – начиная с 0,55%. Среди класса Bacteroidia, при уровне загрязнения 2,91% доминирует род Proteiniphilum (грамотрицательные, облигатно анаэробные, протеолитические и хемоорганотрофные бактерии), занимающий 15,36% метагенома и отсутствующий в контрольном образце почвогрунта и в образцах с загрязнением НП менее 1,91%. Состав микробного сообщества образца почвогрунта с загрязнением 2,91% свидетельствует об образовавшихся в грунте анаэробных условиях, способствующих увеличению доли представителей групп и даже отдельных родов бактерий, не нуждающихся в кислороде (Caloribacterium, Proteiniphilum). При этом, количество разнообразных классов микроорганизмов сокращается в этом образце грунта с 38 в контрольном грунте до 12. Таким образом, была выявлена чувствительность отдельных классов бактерий даже к низким уровням нефтяного загрязнения, если речь идет о подвергающихся поверхностному нагреву песчаных грунтах и доминирование групп, приспособленных к данным условиям. Доминирующими классами в образцах почвогрунтов г. Луга и г. Кудрово являются Gammaproteobacteria (число представителей этого класса увеличивается в загрязненных образцах по сравнению с фоновыми), Alphaproteobacteria, Actinobacteria (табл. 5). Среди доминирующих гаммапротеобактерий в пробах почвогрунтов г. Луга присутствует множество неклассифицированных представителей этого класса, а также неклассифицированные представители семейства Burkholderiaceae, класса Betaproteobacteria, и представители рода Acidibacter (проба L1), а г. Кудрово – неклассифицированные представители семейства Burkholderiaceae, класса Betaproteobacteria (проба К2). Таблица 5 Изменение сообществ бактерий и архей почвогрунтов г. Луга и г. Кудрово при различных уровнях нефтезагрязнения (на уровне класса) Тип Euryarchaeota Thaumarchaeota Acidobacteria Actinobacteria Bacteroidetes Chlamydiae Chloroflexi Cyanobacteria Firmicutes; Gemmatimonadetes Nitrospirae Patescibacteria Planctomycetes Класс % сиквенсов в образцах почвогрунтов L2 L1 (фон) K2 K6 – 0,37 – 2,73 1,77 1,50 0,97 0,53 0,87 0,93 1,47 2,43 1,10 0,43 0,97 0,27 0,07 0,27 0,10 – 0,17 2,37 5,27 3,97 Methanomicrobia – Nitrososphaeria 0,40 Acidobacteriia 0,60 Blastocatellia (Subgroup 4) 4,20 Subgroup 6 0,20 Thermoanaerobaculia 0,53 Unclassified Acidobacteria – Acidimicrobiia 2,13 Actinobacteria 10,23 Thermoleophilia 0,90 Unclassified Actinobacteria 0,13 Bacteroidia 4,67 Ignavibacteria – Chlamydiae 0,47 Anaerolineae – Chloroflexia 0,03 Oxyphotobacteria – Bacilli 0,27 Clostridia 0,23 Negativicutes – Gemmatimonadetes 0,10 Nitrospira 0,87 Saccharimonadia 0,43 Phycisphaerae 0,20 Planctomycetacia 2,73 Unclassified Planctomycetes 0,07 Alphaproteobacteria 10,73 Deltaproteobacteria 0,37 Gammaproteobacteria 15,77 Unclassified Proteobacteria 0,17 Verrucomicrobiae 2,27 9,57 9,93 1,83 0,93 3,17 0,43 0,27 1,03 8,33 3,50 6,80 – 0,23 – 0,27 – – 0,03 2,17 0,43 0,10 – – – – 0,17 1,73 2,10 0,63 0,17 1,70 0,90 – – 0,03 0,20 0,20 0,07 1,10 0,43 0,43 0,03 – – 0,20 0,07 0,17 4,30 1,00 2,30 0,17 – 0,07 10,37 10,63 8,00 2,30 0,70 1,53 10,93 12,40 15,47 0,37 0,40 0,30 4,17 0,50 2,27 11,40 Proteobacteria Verrucomicrobia Содержание НП, масс % 0,39 0,02 0,69 1,02 В фоновых образцах среди доминант также присутствуют представители класса Bacteroidia. Присутствие Bacteroidia закономерно для грунтов, загрязненных органическими отходами, в то же время большое количество этих бактерий и представителей других анаэробных классов свидетельствует о складывающихся в верхнем слое нефтезагрязненных песчаных грунтов анаэробных условиях, даже при низких уровнях загрязнения НП. В образце К2 также высоко число представителей класса Acidimicrobia, преимущественно рода Iamia и неклассифицированных представителей семейства Microtrichaceae. Класс Actinobacteria в образцах почвогрунтов г. Кудрово представлен в основном родом Nocardioides. В образце с полотна железной дороги г. Луга среди актинобактерий доминирует род Mycobacterium, тогда как в фоновом – сообщество актинобактерий более разнообразно и выравнено, и выраженных доминант не наблюдается. В целом, в образцах почвогрунтов г. Луга насчитывается 180 родов бактерий в образце L1, и 156 – в образце L2, в образцах почвогрунтов г. Кудрово – 143 рода в образце К2 и 213 родов – в образце К6. Можно говорить, что при нефтезагрязнении 1,02% в образцах почвогрунтов г. Кудрово наблюдается стимуляция микробного сообщества, вызванная присутствием поллютанта. При этом, в образцах почвогрунтов г. Кудрово не наблюдается ярко выраженного доминирования отдельных родов и можно говорить о большей выравненности обоих сообществ в целом, не только в образце с территории свалки, но и в образце с ее края. Однако, условия, складывающиеся в этих грунтах, специфичны и выраженно отличаются от условий зональных почв, в том числе нефтезагрязненных, и являются подходящими для развития отдельных групп как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов, включая бактерии, способные метаболизировать соединения железа и серы. 3.3.1. Экологические характеристики исследуемых сообществ Для обобщения полученных результатов и оценки общего состояния микробиомов были рассчитаны экологические индексы (рис. 4, рис. 5). Экологические индексы представляют собой численные показатели, рассчитывающиеся на основе числа таксонов в сообществе и числа особей (в метагеномике это число сиквенсов) в разных таксонах и применяются для оценки состояния сообществ (Чернов и др., 2015). Расчет индекса видового богатства Маргалефа в пробах почвогрунтов г. Пушкин показал резкие изменения этого параметра при загрязнении выше 0,29% и выше 1,91%. Видовое богатство при диапазонах загрязнения 0–0,15% и 0,29–0,55% отличается незначительно. При этом, по результатам исследования нефтезагрязненных почвогрунтов на территории нефтехранилища (Журавлева и др., 2017), индекс видового богатства составлял 2,1 и 3,5 – для грунтов с загрязнением НП 6% и 2%, что говорит о том, что по сравнению с ранее исследованными грунтами, в грунтах железной дороги складываются специфичные условия, не способствующие выживанию отдельных групп микроорганизмов при невысоком уровне загрязнения 2%. Рис. 4. Экологические индексы микробных сообществ почвогрунтов г. Пушкин Рис. 5. Экологические индексы микробных сообществ почвогрунтов г. Луга и г. Кудрово Расчеты индекса разнообразия Шеннона и индекса выравненности Пиелу показали, что наиболее стабильный ценоз сформировался при низких уровнях загрязнения нефтью 0,03–0,35%, по-видимому, за счет развития разнообразных групп микроорганизмов, способных перерабатывать НП либо промежуточные продукты их разложения. Значение индекса доминирования Симпсона в исследуемых пробах меняется несущественно при загрязнении менее 0,55%, и резко возрастает при уровнях загрязнения НП 1,91%, и в особенности – 2,67%. По предыдущим исследованиям, значение этого индекса для микробных сообществ почвогрунтов при загрязнении в 6% составляло 0,41, а при загрязнении 2% – 0,18, что еще раз подтверждает специфичность микробных сообществ почвогрунтов полотна железной дороги. В целом, в исследуемых грунтах с загрязнением 1,91% и, в особенности, – с загрязнением 2,67%, все показатели свидетельствуют о негативных изменениях в структуре ценоза бактерий и архей и его общей нестабильности, характеризующихся доминированием отдельных групп и даже родов микроорганизмов, выраженным снижением видового богатства и некоторым снижением выравненности сообществ. Исследования микробных сообществ железнодорожных почвогрунтов г.Луга показывают, что уровень загрязнения НП 0,39% отражается преимущественно на показателе выравненности сообществ (рис. 5). Анализ микробных сообществ свалки г. Кудрово с помощью экологических индексов показывают, что сообщество бактерий и архей почвогрунтов края свалки с загрязнением 1,02% отличается большим разнообразием, видовым богатством и выравненностью, чем сообщество почвогрунтов с территории свалки с загрязнением 0,69%. При этом, индекс доминирования Симпсона для сообществ почвогрунтов г.Луга и г.Кудрово очень низок и составляет менее 0,005. Это подтверждает, что в исследованных сообществах не наблюдается ярко выраженного доминирования отдельных групп микроорганизмов. Интересно отметить, что значения этого индекса для проб с железной дороги г. Луга при загрязнении 0,02 и 0,39% коррелируют со значениями, отмеченными для проб с железной дороги г. Пушкин при сходных уровнях загрязнения (0,02 и 0,35%) (рис. 4). 3.3.2. Разнообразие родов бактерий, в которых присутствуют термофильные виды, в исследуемых образцах На основе метагеномных исследований было выявлено присутствие в образцах исследуемых почвогрунтов родов бактерий, среди представителей которых имеются термофильные виды (табл. 6). Количество родов, в которых имеются термофильные виды, в почвогрунтах железной дороги (пулы P и L) возрастает с повышением содержания нефтепродуктов в образце. Выявлено, что приведенные рода составляют собой преимущественно малую часть обнаруженных микроорганизмов. Исключением является абсолютно доминирующий в образце P3, и являющийся одним из доминант в образце P5 род термофильных бактерий Caloribacterium, не обнаруженный в остальных образцах, и род Mycobacterium, представители которого занимают 2,36–4,62% в образцах P1, P2, P4, P5, P6. Известно, что у микобактерий были обнаружены миколовые кислоты, которые благодаря наличию длинных ароматических цепей, выполняют роль связующего субстрата для таких углеводородов, как нефть и нефтепродукты, способствуя их утилизации (Кобзев и др., 2001, Халилова и др., 2014). Ранее микобактерии были обнаружены нами в образцах песчаного грунта с территории нефтехранилища при загрязнении НП 2% (Журавлева и др., 2017), а также в контрольном, без нефтяного загрязнения. Наиболее распространенными в исследуемых группах образцов почв в совокупности являются рода Rhodococcus и Bacillus, представители которых были обнаружены практически во всех исследуемых грунтах, кроме P3 (грунт с загрязнением НП 2,67%, pH 4,5 и вероятными анаэробными условиями). Авторы предполагают, что молекулярно-генетические методы не позволили идентифицировать близких к Bacillus Geo- и Aeribacillus ввиду их высокого внутреннего сходства (более 97%), хотя их наличие в пробах доказано с использованием культивационного подхода. Таблица 6 Процент бактериального генома представителей некоторых родов бактерий, в которых присутствуют термофильные виды, в образцах почвогрунтов (на основе метагеномных исследований) Род % сиквенсов в образцах почвогрунтов P3 P5 P1 P4P2P6P7P8P9 – – – – – – 0,02 – 0,05 L1L2K2K6 – – – – 0,23 0,03 0,70 0,17 –––– 0,14 0,40 0,06 0,04 – – – – – – 0,60 1,48 – – – – – – – – – – – 0,06 3,80 4,62 3,38 3,92 2,36 0,58 0,48 0,20 – – – – – – 0,10 0,12 – 0,58 0,50 0,92 0,75 1,10 0,87 0,43 0,43 – – – – – – 0,02 – – – – – – – – – 0,08 – – 0,04 0,12 0,15 0,10 – 0,03 0,07 Actinocorallia Bacillus Caloribacterium Conexibacter Mahella Mycobacterium Nitrospira Nocardia Paenibacillus Pseudoxanthomonas 0,96 Rhodococcus – Содержание НП, – 0,02 0,02 19,50 6,78 – 0,08 0,04 0,38 0,30 0,20 0,33 –––––– – – 0,06 масс%* 2,67 5,84 – – – 0,02 0,32 0,10 – – – – 0,03 0,16 1,24 0,24 0,22 0,58 0,22 0,20 0,05 0,23 0,20 0,27 0,10 1,91 0,55 0,35 0,29 0,15 0,03 0,02 <0,01 0,39 0,02 0,69 1,02 Ранее нами было выявлено, что представители рода Pseudoxanthomonas занимали 61% бактериального сообщества песчаного грунта территории нефтехранилища при загрязнении нефтепродуктами 6% (Журавлева и др., 2017), являясь в тех условиях абсолютными доминантами. В исследуемых образцах эти бактерии составляют 5,84% микробного сообщества при уровне загрязнения 1,91%, а при более высоком – 2,67% резко снижаются до 0,96%. Вероятно, это связано с условиями, создавшимися в грунте. Единственный вид доминирующего в наиболее загрязненных образцах рода Caloribacterium, известный на данный момент был выделен в 2012 году из Северо-Ставропольского подземного газового резервуара (Россия). Температурный диапазон для роста – 28–65°C, с оптимумом при 50°C. На основе исследований, штамм получил название Caloribacterium cisternae gen. nov., sp. SGL43T, как типовой представитель нового рода (Slobodkina et al., 2012). При этом, условия в исследуемом нами грунте P3, где представители рода Caloribacterium занимают 19,5% бактериального генома, не соответствуют выявленным ростовым границам pH (5,5–8,0) для типового штамма Caloribacterium cisternae (pH в образце P3, где Caloribacterium является абсолютным доминантом, равен 4,5). О способности типового штамма разлагать углеводороды нефти сведений не имеется, так что выявленный представитель рода Caloribacterium требует дальнейшего пристального изучения. Глава 4. Изменение микробных сообществ почв в зависимости от антропогенного загрязнения и изменений климата Результаты проведенных исследований, а также анализ имеющихся литературных данных свидетельствуют о том, что микробиомы антропогенно измененных почв и грунтов выраженно отличаются от таковых в зональных почвах, при этом, территории, занятые урбанизированными почвами, постоянно расширяются с ростом и перераспределением населения. Так, уже по данным 1996 года, большая часть земного населения уже проживала в городах, при этом, ежегодно площади городов расширяются на 476 тыс. га (Pouyat et al., 2002). В результате человеческой деятельности и антропогенных загрязнений в зоне обитания человека сформированы специфичные урбанизированные экосистемы (Pickett et al., 2001), и в дальнейшем можно ожидать, что они будут приобретать все большее влияние на экосистему в целом (Васенев и др., 2013, Collins et al., 2000, Pickett et al., 2008). Урбанизированные почвы характеризуются более высокими значениями рН, легким гранулометрическим составом, уплотненностью ввиду рекреационных нагрузок и воздействия техники, повышенным содержанием карбонатов и оксидов железа (Герасимова и др., 2003. Савич и др., 2007). В индустриальных почвах повышено содержание углерода за счет органических поллютантов (Lovett et al., 2000), в то же время наблюдается снижение содержания элементов питания, которые в естественных условиях возвращаются в почву в составе растительных остатков. Снижение поступления элементов питания в индустриальных почвах и грунтах закономерно приводит к изменениям в биогеохимических циклах углерода и азота (Кадулин, Копцик, 2013, Byrne, 2007, Tratalos et al., 2007). Численность микроорганизмов в почвах таких территорий, хотя и может быть достаточно высокой, все же уступает по значениям таковым в почвах ненарушенных экосистем (Казанцев и др., 2007, Медведева и др., 2014). Температура воздуха в урбанизированных зонах выше за счет тепла, исходящего от асфальта летом, жилых зданий и предприятий зимой. Этот температурный эффект в городах создает “острова тепла” (heat island) (Oke, 1990). Особенно ощутимо превышение фоновых температур в начале ночи, прирост может достигать 2–3°С (Brazel et al., 2000). При этом, в парках температура воздуха и почвы ниже, чем в городских кварталах с высокой долей “запечатанных” почв (Oke, 1990, Hidalgo et al., 2008). В жаркое лето снижение температуры в озелененных зонах улучшает экологические условия для обитателей почвы. Таким образом, в городах создаются локальные контрастные условия микроклимата (Водяницкий, 2015). Еще один фактор, способствующий локальной контрастности температур – то, что тепловой режим песчаных почв и грунтов в целом своеобразен и резко меняется: у них сильно нагревается поверхность и прилегающий к ней воздух, что приводит к значительным колебаниям температуры в течение суток. Зональные песчаные и супесчаные почвы называют теплыми из-за того, что они быстро прогреваются, однако они также быстрее охлаждаются, поскольку имеют низкую теплоемкость (Даббаг и др., 2016, Булохов, Финина, 2015). При этом, контрастность температурного режима проявляется и в резком падении температуры почвы с глубиной, тогда как на поверхности песка она может достигать 70°С (Казаков, 2015, Даббаг, 2021). Учитывая, что основная часть почвенных микроорганизмов сосредоточена в верхних слоях почвы, в ходе изменения климата и расширения территорий с контрастным температурным режимом, стоит ожидать, что почвенные микробные сообщества будут претерпевать изменения в сторону увеличения доли приспособленных к этим условиям термофильных и термотолерантных споровых бактерий. Результаты данной работы показывают, что термофильные споровые бактерии уже сейчас присутствуют, а в отдельных зонах – доминируют в антропогенно измененных почвогрунтах северного региона – Санкт-Петербурга и Ленинградской области, и свидетельствуют о специфичности условий, создающихся в этих грунтах, в контексте почвенной микробиоты. Изучение функционирования почвенных микробных сообществ земной биосферы в условиях меняющегося климата является серьезной перспективой для дальнейших исследований. 4. Выводы 1. В почвах и почвогрунтах различных географических зон (Апшеронский полуостров, Азербайджан, Ленинградская область (г. Луга), Санкт- Петербург (г. Кудрово, г. Пушкин), Ямало-Ненецкий округ) в настоящее время присутствуют термофильные бактерии, способные к разложению нефти и индивидуальных углеводородов. Выделено 13 штаммов культивируемых термофильных нефтеразлагающих бактерий типа Firmicutes, стабильно растущих при температуре 60oС и способных к разложению нефти и индивидуальных углеводородов (ацетат натрия, бензоат натрия, гексадекан), а также 2 перспективных штамма для дальнейшего изучения их способности к нефтедеструкции. 2. Наибольшей скоростью роста и нарастанием биомассы среди выделенных нами термофильных бактериальных штаммов характеризуются штаммы А3-1 (Geobacillus stearothermophilus), А7-1-2 (Anoxybacillus sp.) (Азербайджан) и YN2 (Geobacillus jurassicus) (Ямал) – 0,6–0,8 суток для наиболее быстро разлагаемого субстрата – ацетата натрия. Средней скоростью роста – штаммы L2-1 (Geobacillus thermodenitrificans), L2-2, L2-3 (Aeribacillus sp.) (г.Луга), K2-2, K6 (Aeribacillus sp.) (г.Кудрово) – 1,5–2,5 суток для ацетата натрия. Штаммы P2-2 (Aeribacillus sp.), P6-1 (Parageobacillus thermoglucosidasius), P8-2 (Aeribacillus sp.) (г.Пушкин) характеризуются медленным ростом (на ацетате натрия – до 5 суток), но длительно сохраняют его стабильность в условиях повышенных температур. 3. Установлено, что несмотря на филогенетическое сходство, наблюдается выраженное влияние среды на жизнедеятельность почвенных термофильных микроорганизмов. Наиболее быстрорастущие термофильные нефтеразлагающие бактерии обнаружены в регионах с контрастным континентальным климатом, средне- и медленно растущие – в регионах умеренного климата. 4. На основе исследований бактериальных метагеномов нефтезагрязненных грунтов Санкт-Петербурга и Ленинградской области до рода получены данные о составе микробных сообществ почвогрунтов в зависимости от уровня нефтезагрязнения, и доле (численной распространенности) отдельных групп и родов бактерий. Показано, что при уровне загрязнения 2,67% доминируют рода анаэробных бактерий Caloribacterium (19,5%), Proteiniphilum (15,36%), тогда как в контроле доминирование отдельных групп не выражено (численность представителей отдельных родов не превышает 3,7% от бактериального сообщества). 5. С повышением уровня загрязнения нефтью и ее производными в микробных сообществах антропогенно измененных почвогрунтов железной дороги происходит увеличение доминирования отдельных групп и родов бактерий и снижение выравненности и разнообразия бактериальных сообществ, судя по индексам Симпсона, Шеннона, Маргалефа и Пиелу. По совокупности экологических показателей наблюдается негативное изменение состояния микробных сообществ, начиная с уровня загрязнения нефтепродуктами 1,91 масс %. 6. Показано, что при увеличении содержания нефтепродуктов 1,91 масс % и выше в почвогрунтах возрастает доля термофильных представителей микробных сообществ (род Caloribacterium), а в диапазоне концентраций нефтепродуктов 0,15–1,91 масс % в микробных сообществах почвогрунтов наблюдается возрастание доли родов бактерий, в которых присутствуют термофильные виды (род Mycobacterium), в сравнении с сообществами в контрольном незагрязненном образце почвогрунта и в образцах с загрязнением ниже 0,15 масс %. 7. С помощью молекулярно-генетических методов в исследуемых почвогрунтах выявлены культивируемые анаэробные термофильные бактерии, составляющие значительную часть бактериального сообщества, перспективные для выделения и дальнейшего изучения в лабораторных условиях (Caloribacterium sp.).