Участие пероксида водорода в процессе гибели опухолевых клеток при воздействии цисплатина

Глава 1 посвящена обзору литературы по следующим темам: особенности опухолевых клеток; типы клеточной гибели, апоптоз, его стадии и особенности, способы определения; активные формы кислорода, основные типы АФК, пероксид водорода, защита клетки от АФК, способы определения АФК; цисплатин, основное действие цисплатина, сигнальные каскады, цисплатин и пероксид водорода.
В главе 2 перечислены использованные в работе оборудование, культуральная посуда и реактивы, а также описаны методики исследования.
В работе были использованы клетки карциномы шейки матки HeLa Kyoto, трансфицированные сенсорами HyPer2 или SypHer2, а также не подвергшиеся данной трансфекции.
помощи проточного цитофлуориметра-сортера FACSAria III (BD, США).
Определение жизнеспособности клеточных линий
Метилтетразолиевый тест (МТТ-тест). Для проведения МТТ-теста клетки HeLa Kyoto, HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-SypHer2 подвергали воздействию цисплатина (Тева, Израиль) в концентрациях от 0 до 50 мкМ. После инкубации с MTT измеряли оптическую плотность полученного раствора формазана, растворенного ДМСО на планшетном спектрофотометре Synergy MX (BioTek, США).
Изучение динамики уровня H2O2 на разных стадиях клеточной гибели
Клетки HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-SypHer2 подвергали воздействию цисплатина в концентрациях: 4,2 мкМ, 8,3 мкМ, 16,6 мкМ, 33,2 мкМ, 83,0 мкМ, 200 мкМ в течение 12 и 24 часов. Окрашивали с использованием набора на апоптоз PE Annexin V apoptosis detection kit I (BD Biosciences, США). Анализ флуоресценции красителей и сенсоров проводился при помощи проточного цитофлуориметра FACSCalibur (BD, США). Дополнительно исследовали воздействие цисплатином в концентрациях 0; 4,2 мкМ; 8,3 мкМ; 16,6 мкМ; 33,2 мкМ; 83,0 мкМ при 18-часовой инкубации, анализ флуоресценции красителей и сенсоров осуществлялся при
Изучение динамики уровня H2O2 в условиях использования ловушек АФК Экстерназизация фосфатидилсерина. Клетки HeLa Kyoto-HyPer2 подвергали воздействию 16,6 мкМ цисплатина с добавлением 5,0 мМ NAC (Sigma-Aldrich, США) и окрашивали набором на апоптоз PE Annexin V apoptosis detection kit I (BD Biosciences, США). Инкубация длилась 18 часов, регистрация флуоресценции осуществлялась при помощи проточного цитофлуориметра-
Окрашиванию трипановым синим подвергались клетки HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto- SypHer2, предварительно обработанные цисплатином в концентрации 8,3 мкМ – IC50 (концентрация, ингибирующая 50% клеток по результатам МТТ-теста). Экспозиция с препаратом составляла от 0 до 24 часов, подсчет окрашенных и неокрашенных клеток производился под микроскопом в камере Горяева каждые 2 часа.
сортера FACSAria III (BD, США).
Определение состояния мембранного потенциала митохондрий. Клетки HeLa Kyoto-HyPer2
обрабатывали одновременно 16,6 мкМ цисплатина и 5,0 мМ NAC (Sigma-Aldrich, США). После 18 часов инкубации клетки обрабатывали TMRE (BD Biosciences, США) и 7-AAD (BD Biosciences, США). Анализ образцов проводили с использованием цитофлуориметра-сортера FACSAria III (BD, США).
Глава 3 содержит изложение и обсуждения результатов исследования.
Определение жизнеспособности клеточных линий
Определение жизнеспособности по активности НАДФ-H–зависимых клеточных оксидоредуктазных ферментов. По данным МТТ-теста были построены кривые зависимости жизнеспособности клеточных линий HeLa Kyoto, HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-SypHer2 от концентрации цисплатина (рисунок 1).
Рисунок 1. Жизнеспособность опухолевых культур HeLa Kyoto, HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto- SypHer2 при воздействии 0–50 мкМ цисплатина. Данные МТТ- теста каждой из исследуемых культур представляли в виде среднего значения ± СОС. Для HeLa Kyoto проведено 4 эксперимента в трехкратной повторности, для HeLa Kyoto- HyPer2 8 экспериментов в трехкратной повторности, для HeLa Kyoto-SypHer2 7 экспериментов в трехкратной повторности
Сравнение кривых показало, что клеточные линии с генетически кодируемыми сенсорами HyPer2 и SypHer2 отвечают на повышение концентрации препарата практически идентично, (IC50) их клеток сходны (таблица 1). Необходимо отметить, что, несмотря на схожую динамику ответа, чувствительность клеточной линии, не содержащей генетически-кодируемых сенсоров, была выше, IC50 цисплатина для неё была сопоставима с представленной в статье (Komleva, Lapshina et al., 2015).
Таблица 1 Основные характеристики сравнения кривых жизнеспособности клеточных линий
Клеточная линия
IC50, 95%
мкМ доверительный
интервал IC50, мкМ 8,30 [7,3; 9,45]
8,54 [7,4; 9,81] 10,53 [8,4; 13,19]
коэффициент Хилла
-2,196 -2,108 -1,876
95% доверительный интервал коэффициента Хилла
HeLa Kyoto-HyPer2
[-2,739; -1,652] [-2,651; -1,566] [-2,583; -1,170]
HeLa Kyoto- SypHer2
HeLa Kyoto
Для анализа сходства ответов трех клеточных линий был применен критерий Фишера, показавший, что жизнеспособность всех трех клеточных линий может быть описана одной кривой (p>0,05) (таблица 2), поэтому для расчета рабочих концентраций цисплатина была использована IC50, определенная для HeLa Kyoto-HyPer2.
Сравнение кривых жизнеспособности по Критерию Фишера (F-тест)
Таблица 2
Клеточная линия
HeLa Kyoto-HyPer2 HeLa Kyoto-SypHer2 HeLa Kyoto
Все клеточные линии
HeLa Kyoto- HyPer2
p = 0,92 p = 0,11
HeLa Kyoto- SypHer2
p = 0,19
HeLa Все клеточные Kyoto линии
p = 0,18
p = 0,92 p = 0,11
p = 0,19
Уменьшение количества МТТ в клетках может рассматриваться как показатель «окислительно-восстановительной активности клеток» (Marshall, Goodwin et al., 1995). Полученная в нашей работе небольшая разница в чувствительности клеточных линий может быть связана с наличием флуоресцентного белка, воздействующего на гомеостаз клетки (Goto et al., 2003, Greenbaum et al., 2000).
Определение жизнеспособности по целостности плазматической мембраны
осуществлялось при помощи окрашивания трипановым синим. При воздействии цисплатином в концентрации 8,3 мкМ в течение всего времени исследования количество живых клеток для обеих клеточных линий колебалось в незначительных пределах и через 24 часа было соизмеримо с таковым в начальный момент воздействия. В контроле количество живых клеток увеличивалось с течением времени и через 24 часа возрастало примерно в 2,2 раза (рисунок 2).
Количество мертвых клеток с увеличением длительности инкубации для обеих клеточных линий увеличивалось как в пробах с цисплатином, так и в пробах без цисплатина. Однако при рассмотрении доли мертвых клеток очевидно, что изменения со временем в контрольных пробах незначительны. Эти данные свидетельствуют о том, что воздействие цисплатином в концентрации, равной IC50, приводит в бóльшей степени к остановке клеточного деления, чем к клеточной гибели. Следовательно, низкие концентрации цисплатина в большей степени вызывают цитостатический эффект, в то время как высокие концентрации препарата преимущественно обладают цитотоксическим действием. Способность цисплатина и других платиновых комплексов останавливать клеточный цикл была продемонстрирована многими авторами (Dasika, Lin et al., 1999; Desoize and Madoulet, 2002; Attardi, de Vries et al., 2004; Velma, Dasari et al., 2016). Показано, что остановка в G2 фазе может играть роль в дальнейшем при запуске цисплатин-индуцированной гибели (Sorenson and Eastman, 1988).

Наши данные показали, что цисплатин в концентрации IC50 практически не приводит клетки HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-SypHer2 к гибели в течение 24-х часов воздействия, следовательно, данная концентрация препарата недостаточна для изучения механизма апоптотической гибели клеток в течение первых суток после введения препарата в среду.
Разработка методики изучения уровня H2O2 одновременно с механизмом клеточной гибели
Разработана методика, основанная на использовании генетически-кодируемых сенсоров одновременно с витальным красителем и маркерами на апоптоз и позволяющая методом проточной цитофлуориметрии определить уровень Н2О2 отдельно в популяциях живых и
Рисунок 2. Количество
жизнеспособных
мертвых
определенных окрашивания трипановым синим при воздействии 8,3 мкМ цисплатина. (А) HeLa Kyoto-HyPer2, (Б) HeLa Kyoto-SypHer2. Графики представлены в виде средних значений и СОС для 3 экспериментов в двухкратной повторности. Звездочками отмечены статистически значимые различия между значениями для обработанных и
необработанных цисплатином клеток (критерий Стьюдента для
независимых выборок)
и клеток, методом
апоптотических клеток, а также осуществить контроль рН в каждой из клеточных популяций (рисунок 3).
Рисунок 3. Методика распределения клеток на популяции живых, апоптотических и мертвых клеток, основанная на целостности плазматической мембраны и: (А) экстернализации ФС, (Б) изменении мембранного потенциала митохондрий. (В) Методика оценки уровня H2O2 и/или pH в живых и апоптотических клетках, а также во всех клетках. М1 – область флуоресценции сенсора, используемая для расчета медианного значения
Экстернализация фосфатидилсерина (ФС). Использование двух красителей ФЭ Аннексина V и 7-AAD позволило распределить все клетки на 3 популяции по степени окрашивания: 1) живые клетки – клетки, не окрашенные ни одним из красителей, 2) клетки, проходящие стадии

апоптоза – окрашенные Аннексином V, но не окрашенные 7-AAD, 3) мертвые клетки – клетки, которые окрашивались обоими красителями или окрашивались 7-AAD, но не окрашивались Аннексином V (рисунок 3А). Флуоресценция сенсоров HyPer2 или SypHer2 изучалась в популяциях живых и переживающих апоптоз клеток по отдельности. Анализ отклика сенсоров осуществлялся при помощи расчета медианного значения пика распределения клеток по интенсивности флуоресценции. Поскольку в мертвых клетках флуоресценция сенсоров была сильно снижена в связи с их вероятной утечкой через повреждённую плазматическую мембрану при подготовке клеток к проточной цитофлуориметрии, либо по причине повреждения сенсоров в мертвых клетках при данном способе пробоподготовки, либо по другой причине, уровень H2O2, а также pH в данных клетках не мог быть проанализирован.
Изменение мембранного потенциала митохондрий. TMRE, использованный в сочетании с 7- AAD, также позволяет выделить 3 популяции клеток: 1) живые клетки – интенсивно окрашенные TMRE, но не окрашенные 7-AAD, 2) клетки, переживающие апоптоз – не окрашенные ни одним из красителей, 3) мертвые клетки – клетки, которые окрашивались обоими красителями или окрашивались 7-AAD, но не окрашивались TMRE (рисунок 3Б). Анализ отклика сенсоров также осуществлялся при помощи расчета медианного значения пика распределения клеток по интенсивности флуоресценции в живых и апоптотических клетках по отдельности (рисунок 3В).
Для проверки участия Н2О2 в наблюдаемых реакциях дополнительно в обе методики были включены инкубации опухолевых культур с ловушкой АФК (NAC).
Изучение динамики уровня Н2О2 на разных стадиях клеточной гибели Определение стадий клеточной гибели. По мере возрастания длительности инкубации и/или концентрации препарата у обеих клеточных линий наблюдалось уменьшение количества жизнеспособных клеток и увеличение процента мертвых клеток (рисунок 4). Но лишь две концентрации препарата вызывали значительный процент апоптоза как у клеток HeLa Kyoto- HyPer2, так и у клеток HeLa Kyoto-SypHer2: 83,0 мкМ цисплатина при 12-часовом воздействии
и 16,6 мкМ цисплатина при 18 часах воздействия (средний столбец на рисунке 4).
Следует обратить внимание, что концентрация 83,0 мкМ соответствует 10×IC50 цисплатина в изучаемых клеточных линиях и является довольно высокой концентрацией для воздействия на
клеточные культуры, в то время как 16,6 мкМ соответствует 2×IC50 цисплатина.
Рисунок 4. Процент жизнеспособных, апоптотических и мертвых клеток HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-SypHer2 при воздействии возрастающих концентраций цисплатина в течение 12, 18 или 24 часов. Графики представлены в виде средних значений ± СО. При длительности 12 часов было проведено по 5 экспериментов для каждой клеточной линии, при инкубации 18 часов – по 3 эксперимента, при экспозиции с препаратом в течение 24 часов – 6 экспериментов для HeLa Kyoto-HyPer2 и 5 экспериментов для HeLa Kyoto-SypHer2. Звездочками отмечены статистически значимые различия между значениями для обработанных и необработанных цисплатином клеток (критерий Стьюдента для независимых выборок)
Влияние цисплатина на цитоплазматический уровень Н2О2 и pH. При анализе отклика сенсоров интенсивность флуоресценции контрольных клеток (клетки без воздействия цисплатином) была принята за 100%. Инкубация с цисплатином в течение 12 часов приводила к росту интенсивности флуоресценции HyPer2 и уменьшению флуоресценции SypHer2 в живых клетках при 83,0 мкМ и 200,0 мкМ (рисунок 5, верхний ряд). В апоптотических клетках лишь концентрация в 83,0 мкМ у сенсора HyPer2 вызывала существенное увеличение интенсивности флуоресценции. Через 18 часов инкубации (рисунок 5, средний ряд) в живых клетках интенсивность флуоресценции HyPer2 возрастала при концентрациях цисплатина 16,6 мкМ, 33,2 мкМ и 83,0 мкМ, в апоптотических клетках рост флуоресценции был более выраженным и начинался уже при 8,3 мкМ препарата (IC50). При этом для клеток, проходящих стадию апоптоза, значения превышают таковые для живых клеток. Интенсивность флуоресценции сенсора SypHer2 показала отсутствие значительных изменений в уровне pH. Следовательно, реакция сенсора HyPer2 при данной длительности воздействия препаратом была обусловлена только увеличением внутриклеточного уровня Н2О2.
При инкубации с цисплатином в течение 24 часов (рисунок 5, нижний ряд) количество живых клеток при высоких концентрациях препарата было недостаточным для анализа изменений реакции сенсоров в них. Интенсивность флуоресценции HyPer2 увеличивалась при воздействии 16,6 мкМ и 33,2 мкМ цисплатина как в живых, так и в апоптотических клетках. Интенсивность флуоресценции SypHer2 была увеличена в сравнении с контролем в апоптотических клетках при инкубации с низкими концентрациями препарата 4,2 мкМ и 8,3 мкМ, что свидетельствовало о защелачивании внутриклеточной среды. Повышение интенсивности флуоресценции сенсора HyPer2 после 24 часов инкубации с 16,6 мкМ и 33,2 мкМ цисплатина, таким образом, было обусловлено увеличением концентрации Н2О2 в опухолевых клетках, а не сдвигом рН. Также следует отметить, что, учитывая изменения интенсивности флуоресценции сенсора SypHer2, при действии 4,2 мкМ и 8,3 мкМ цисплатина, количество Н2О2 могло быть определено как сниженное в сравнении с контрольными интактными клетками.
Полученные данные согласуются с исследованиями других авторов, показывающих, что цисплатин способен вызывать повышенное образование АФК и окислительный стресс (Santos, Catao et al., 2007; Marullo, Werner et al., 2013; Yin, Sun et al., 2017). Показано, что в клетках млекопитающих митохондриальная продукция АФК усиливает цитотоксический эффект цисплатина, вызванный повреждением ядерной ДНК (Marullo, Werner et al., 2013). Существуют работы, указывающие, что Н2О2 может являться участником клеточной реакции на воздействие противоопухолевыми агентами, включая цисплатин, а также способствовать развитию апоптоза (Ahmad, Iskandar et al., 2004; Mizutani, Tada-Oikawa et al., 2005; Wang, Chanvorachote et al., 2007; Wan, Xiang et al., 2016).
Рисунок 5. Изменение интенсивности флуоресценции HyPer2 (уровень H2O2 и pH) и SypHer2 (уровень pH) при действии возрастающих концентраций цисплатина. Графики представлены в виде средних значений ± СО. При длительности 12 часов было проведено по 5 экспериментов для каждой клеточной линии, при инкубации 18 часов – по 3 эксперимента, при экспозиции с препаратом в течение 24 часов – 6 экспериментов для HeLa Kyoto-HyPer2 и 5 экспериментов для HeLa Kyoto-SypHer2. Звездочками отмечены статистически значимые различия между значениями для обработанных и необработанных цисплатином клеток (критерий Стьюдента для независимых выборок)
Практически все клетки, погибающие при воздействии цисплатина в нашем исследовании, претерпевали экстернализацию фосфатидилсерина, что исключало некротический механизм гибели. Считается, что выбор клеткой апоптотического или некротического механизма определяется концентрацией и длительностью воздействия цисплатина. При больших концентрациях и коротких временах воздействия клетка склонна погибать по некротическому
механизму, в то время как более низкие концентрации вызывают преимущественно активацию апоптотического механизма (Baek, Kwon et al., 2003; Sancho-Martínez, Piedrafita et al., 2011).
Таким образом, для последующих экспериментов была выбрана концентрация цисплатина 16,6 мкМ и длительность инкубации с препаратом 18 часов.
Определение уровня Н2О2 в условиях использования ловушек АФК Определение апоптоза по экстернализация фосфатидилсерина. При 18-часовой инкубации добавление NAC в культуральную среду с цисплатином привело к увеличению количества жизнеспособных клеток HeLa Kyoto-HyPer2 по сравнению с их количеством при инкубации только с цисплатином, количество апоптотических клеток при этом уменьшается с 33 ± 9% до
17 ± 8% (рисунок 6А).
Рисунок 6. Процент жизнеспособных, апоптотических и мертвых клеток HeLa Kyoto-HyPer2 относительно степени их окрашивания ФЭ Аннексином V и 7-AAD (А) и изменение флуоресценции сенсора HyPer2 (Б) при воздействии /без воздействия 16,6 мкМ цисплатина и 5,0 мМ NAC. Графики представлены в виде средних значений трех экспериментов ± СО. Звездочками отмечены статистически значимые различия между значениями для обработанных и необработанных цисплатином клеток (однофакторный дисперсионный post-hoc анализ с критерием Бонферрони)
Добавление NAC в инкубационную среду с цисплатином приводило к значительному снижению интенсивности флуоресценции сенсора HyPer2 как в популяции жизнеспособных (с 170 ± 32% до 132 ± 10%), так и в популяции апоптотических клеток (263 ± 47% до 158 ± 22%) (рисунок 6Б). Способность NAC предотвращать вызванный цисплатином апоптоз была продемонстрирована ранее. В работе (Wang, Martindale et al., 2000) обнаружено, что добавленный с 30 мкМ цисплатина 1мМ NAС способен предотвратить развитие апоптоза клеток HeLa при инкубации в течение 24 часов посредством ингибирования активации ERK и

расщепления PARP, индуцированных цисплатином. Возможность NAC повышать выживаемость клеток через активацию ERK и предотвращать апоптоз была также показана другими авторами (Wung, Cheng et al., 1999; Li, Dehnade et al., 2000). NAC также способен ингибировать активацию c-Jun N-концевой киназы, p38 MAP-киназы, редокс-чувствительного активирующего белка-1, подавлять активность ядерного фактора транскрипции каппа B, а также предотвращать апоптоз и способствовать выживанию клеток путем активации внеклеточного сигнал-регулирующего киназного пути (Zafarullah, Li et al., 2003).
NAC ингибирует цисплатин-индуцированную экспрессию p53 и p21 в клетках мелкоклеточной карциномы легких LX-1, токсичность цисплатина была подавлена NAC в SKOV3 как p53-зависимым, так и p53-независимыми механизмами (Wu, Muldoon et al., 2005). Таким образом, NAC способен блокировать цисплатин-индуцированный апоптоз посредством ингибирования как митохонриального, так и рецепторозависимого механизмов. Наши результаты демонстрируют, что увеличение жизнеспособности клеточных линий при добавлении ловушки АФК в инкубационную среду с цисплатином происходит одновременно со снижением флуоресценции чувствительного к изменениям уровня H2O2 сенсора HyPer2, что свидетельствует об участии H2O2 в индуцируемом цисплатином апоптозе.
Определение апоптоза по изменению мембранного потенциала митохондрий. Добавление NAC в инкубационную среду с цисплатином приводило к существенному увеличению процента жизнеспособных клеток HeLa Kyoto-HyPer2 в сравнении с клетками, обработанными только цисплатином. Одновременно с этим процент апоптотических клеток HeLa Kyoto-HyPer2 значительно снижался: с 43 ± 12% до 15 ± 4% (рисунок 7А).
Одновременное инкубирование клеток HeLa Kyoto-HyPer2 с цисплатином и NAC приводило к снижению интенсивности флуоресценции сенсора HyPer2 в апоптотических клетках в сравнении с клетками, подвергнутыми действию только цисплатином в течение 18 часов: с 263 ± 69% до 137 ± 33% (рисунок 7Б). Таким образом, устранение Н2О2 с использованием NAC может быть причиной предотвращения падение мембранного потенциала митохондрий и развития апоптотической реакции при действии цисплатина.
В отличие от случая выделения апоптотических клеток при окрашивании ФЭ Аннексином V, при выделении клеток на основе окрашивания TMRE, увеличение интенсивности флуоресценции сенсора H2O2 при инкубации с цисплатином наблюдалось исключительно у апоптотических, но не жизнеспособных клеток. Следует отметить, что при развитии апоптоза изменение ΔΨm, определяемое окрашиванием TMRE, происходит раньше, чем экстернализация ФС, определяемая Аннексином V. Поэтому при окрашивании TMRE клетки с нарушенным мембранным потенциалом, но еще не успевшие экстернализировать ФС, попадают в популяцию апоптотических.
Рисунок 7. Процент жизнеспособных, апоптотических и мертвых клеток HeLa Kyoto-HyPer2 относительно степени их окрашивания TMRE и 7-AAD (А) и изменение флуоресценции сенсора HyPer2 (Б) при воздействии /без воздействия 16,6 мкМ цисплатина и 5,0 мМ NAC. Графики представлены в виде средних значений шести экспериментов ± СО. Звездочками отмечены статистически значимые различия между значениями для обработанных и необработанных цисплатином клеток (однофакторный дисперсионный post-hoc анализ с критерием Бонферрони)
Эти же клетки при окрашивании на основе Аннексина V идентифицировались бы как относящиеся к популяции жизнеспособных клеток. Если же клетки успевали за время инкубации с препаратом и потерять ΔΨm, и экстернализировать ФС, то они в обоих вариантах окрашивания были идентифицированы как апоптотические. Даже незначительное снижение ΔΨm может привести к существенному увеличению производства АФК, способных нанести ущерб клетке (Korshunov, Skulachev et al., 1997). В клетке, подвергшейся индуцированному TNF-α апоптозу, наблюдается частичное снижение ΔΨm, сопровождаемое высоким уровнем АФК (Gottlieb, Vander Heiden et al., 2000). Цисплатин способствует увеличению TNF-α, снижению содержания GSP и СОД, вакуолизации митохондрий, оказывает нейротоксичное действие на периферические нервы крыс, а введение NAC уменьшает данные эффекты (Zaki, Mohamed et al., 2018). Показано, что цисплатин вызывает окислительный стресс в митохондриях и снижает ΔΨm (Saad, Najjar et al., 2004). H2O2 может являться основным окислительным компонентом, ответственным за подавление Bcl-2, возникающим одновременно с другими АФК при воздействии цисплатина (Wang, Chanvorachote et al., 2008).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе разработана новая методика оценки уровня H2O2 в популяциях жизнеспособных и апоптотических клеток независимо друг от друга. Возможность использования данной методики для оценки внутриклеточных изменений уровня H2O2 при контроле изменений pH внутри клетки продемонстрирована на примере действия противоопухолевого препарата Цисплатин.
Проведено исследование влияния генетически-кодируемых сенсоров HyPer2 или SypHer2 на жизнеспособность клеточной линии HeLa Kyoto. Показано, что увеличение концентраций цисплатина вызывает схожее дозо- и время-зависимое влияние на жизнеспособность как в культуре с генетически кодируемыми сенсорами, так и в культуре без сенсоров.
Проведена оценка содержания H2O2 в жизнеспособных и апоптотических клетках HeLa Kyoto-HyPer2 и HeLa Kyoto-SypHer2. C использованием флуоресцентных красителей, маркирующих процессы апоптоза на разных стадиях его развития, показано, что цисплатин- индуцированное накопление H2O2 происходит на фоне потери мембранного потенциала митохондрий и начинается раньше экстернализации фосфатидилсерина. Продемонстрировано, что добавление ловушек АФК способствует сохранению мембранного потенциала митохондрий и ингибирует экстернализацию фосфатидилсерина. Показано, что ловушки АФК при одновременном использовании с цисплатином предотвращают вызванную им клеточную гибель опухолевых клеток и сохраняют концентрацию H2O2 на уровне, близком к контрольному.
ВЫВОДЫ
1. Модификация клеток HeLa Kyoto сенсорами HyPer2 и SypHer2 не оказывает существенного влияния на их чувствительность к цисплатину.
2. Низкие концентрации цисплатина в большей степени вызывают цитостатический эффект, высокие концентрации препарата обладают цитотоксическим действием.
3. Цисплатин вызывает дозо-зависимое увеличение уровня H2O2 в клетках HeLa Kyoto. Наибольший подъем уровня H2O2 выявлен при инкубации в течение 18 часов при концентрации 2×IC50 (16,6 мкМ). Динамика изменений уровня пероксида водорода различается в живых и апоптотических клетках, наиболее выраженный подъем выявлен у клеток, претерпевающих апоптоз.
4. Уровень пероксида водорода зависит от стадии клеточной гибели. Сопоставление динамики уровня H2O2 опухолевых клеток с маркерами разных стадий апоптоза показало, что рост его концентрации наблюдается одновременно с потерей мембранного потенциала
митохондриями и предшествует выходу фосфатидилсерина на внешнюю поверхность
плазматической мембраны.
5. Добавление ловушек АФК ингибирует цисплатин-индуцированный апоптоз опухолевых
клеток и препятствует повышению концентрации H2O2 как в живых клетках, так и в клетках, находящихся в апоптозе.