Вакцина для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (исследования безопасности и иммуногенности)

Материалы и методы
1. Изготовление вакцины
Производственная культура клеток. Использование линии клеток VERO для производства
инактивированной вакцины ГЛПС стало возможным в результате успешной адаптации первично
выделенных штаммов 3-х хантавирусов к размножению в клетках VERO в условиях отсутствия
сыворотки крови животных в среде поддержки роста клеток. Для выращивания рабочих посевных
вирусов Пуумала, Хантаан, Сочи использовали производственную культуру клеток линии VERO,
полученную из клеточной взвеси рабочего банка клеток VERO (РБК VERO).
Производственные штаммы вирусов. Для изготовления вакцины ГЛПС-Вак использовали
штаммы 3-х хантавирусов:
штамм ТКД/Уфа-97 вируса Пуумала выделен из лёгочной ткани погибшего от ГЛПС
больного в Башкирии;
штамм Р-88/Хабаровск-89 вируса Хантаан выделен из крови больного тяжелой формой
ГЛПС в Хабаровском крае;
штамм Орлова/Сочи-09 вируса Сочи (подтип вируса Добрава/Белград) выделен из крови
больной, погибшей от ГЛПС в Краснодарском крае.
После адаптирования к культуре клеток VERO выше перечисленные штаммы получили
название вакцинных штаммов:
штамм ПУУ-ТКД/Vero (вирус Пуумала), депонирован в ГКВ, № 1026, 2009 г.;
штамм ХТН-Р88/Vero (вирус Хантаан), депонирован в ГКВ, № 1283, 2018 г.;
штамм ДОБ-Сочи/Vero (вирус Сочи), депонирован в ГКВ, № 1282, 2018 г.
Вакцинные штаммы ПУУ-ТКД/Vero, ХТН-Р88/Vero и ДОБ-Сочи/Vero обладают видовой
специфичностью, способностью размножаться в чувствительных к хантавирусам культурах клеток
VERO и VERO-E6, к которым эти штаммы адаптированы, с достаточным накоплением
иммунологически активного материала.
Видовая специфичность штаммов вирусов Пуумала, Хантаан и Сочи была установлена в опытах
нейтрализации в культуре Vero E6 с помощью перекрёстного титрования с иммунными сыворотками.
На вакцинные штаммы получены патенты, полногеномные сиквенсы вакцинных штаммов
зарегистрированы в GenBank под номерами: PUU-TKD/VERO: S – MH251331, M – MH251332, L –
MH251333; HTN-P88/VERO: S – MH251328, M – MH251329, L – MH251330; DOB-SOCHI/VERO: S –
MH251334, M – MH251335, L – MH251336.
Производственные штаммы получены в результате пассирования (1-3 пассажа) вакцинных
штаммов в культуре клеток VERO. Производственные штаммы ПУУ-ТКД/Vero, ХТН-Р88/Vero и
ДОБ-Сочи/Vero, аттестованные в соответствии с международными требованиями, явились
исходными для приготовления штаммового, маточного и посевного запасов вирусов, хранение
которых осуществляли в ампулах (типа Cryotube) при температуре минус (190±2)0С в Дьюаре с
жидким азотом.
Методы контроля
Методы контроля, регламентируемые Государственной Фармакопеей, представлены в Таблице 1
Таблица 1 – Методы контроля, регламентируемые Государственной Фармакопеей

Виды контроляРегламентирующий документ
1. СтерильностьГФ XIII. ОФС «Стерильность»
2. Контроль на отсутствие посторонних агентовГФ XIII, ОФС.1.7.2.0006.15
3. Белок по ЛоуриГФ XIII, ОФС.1.7.2.0023.15
4. Содержание БСАГФ XIII, ОФС.1.7.2.0020.1
5. Бактериальные эндотоксиныГФ XIII, ОФС.1.2.4.0006.15
6. Содержание алюминияГФ XIII, ОФС.1.2.2.2.0001.15
7. ПирогенностьГФ XIII ОФС.1.2.4.0005.15
8. рНГФ XIII, ОФС.1.2.1.0004.15
9. ФормальдегидГФ XIII, ОФС.1.7.2.0024.15

Специфические методы, разработанные для контроля хантавирусных вакцин:
Метод определения инфекционной активности вируса применяли для индикации и
титрования вируса по выявлению фокусобразующих единиц (ФОЕ), основанный на
постулате – 1 ФОЕ соответствует одной вирусной частице.
Типоспецифичность вирусных штаммов определяли в реакции нейтрализации по редукции
ФОЕ. Достоверным иммунологическим отличием штаммов является 4-х кратная и более
разница в титрах контрольных сывороток в перекрестных опытах нейтрализации с
прототипными штаммами хантавирусов.
Специфическая активность (иммуногенность) определяется по выявлению специфического
иммунного ответа на введение мышам линии BALB/c вакцины ГЛПС-Вак (продукция
нейтрализующих антител к хантавирусам Пуумала, Хантаан и Сочи).
Контроль специфической безопасности (отсутствие живого хантавируса) осуществляется по
ранее разработанной методике (Бархалёва О.А. и др., 2011).
Контроль специфической активности проводили иммуноферментным методом по контролю
содержания N белка (Дзагурова Т.К. и др., 2013).
Контроль полноты сорбции на гидроокиси алюминия проводили по контролю содержания N
белка с использованием иммуноферментного метода (Дзагурова Т.К. и др., 2013).
2. Доклинические исследования
Для проведения доклинических исследований поливалентной вакцины против ГЛПС (иммуногенность
и стабильность, острая и хроническая токсичность, аллергизирующие и иммунотоксические свойства,
эмбриотоксическое воздействие, влияние вакцины на репродуктивную функцию, мутагенные свойства
вакцины) использовали материалы и методы в строгом соответствии с требованиями официальных
регламентирующих документов.
3. Методы статистической обработки результатов исследований
Статистический анализ результатов токсикологических исследований вакцины выполнен с
помощью программы Statistica 6.0. Уровень статистической значимости различий между выборками
оценивали с помощью критериев Манна Уитни. Полученные результаты представлены в виде М ±
m, где М – среднегеометрическое значение титра нейтрализующих антител, m – стандартная ошибка
среднего. Достоверность различий выборочных совокупностей оценивались по критериям
Стьюдента-Фишера и Вилкоксона. Достоверность их корреляции определялась по коэффициенту
корреляции.Результатыисследованияиммуногеннойстабильностивакциныбыли
проанализированы в программе GraphPad Prism версии 8.2.0. Статистическую значимость
определяли с использованием одностороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюка.
Статистическая значимость указывается как ns = несущественно, *p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.005, **** p <0.0001. Результаты собственных исследований и их обсуждение 1 Основные технологические этапы изготовления вакцины ГЛПС-Вак Этапы производства. Схемы основных этапов производства вакцины ГЛПС-Вак представлены на Рисунках 1 и 2. Накопление вируссодержащего материала. Для заражения использовали посевной вирус или после одно- или двукратного пассирования в культуре клеток VERO. Множественность заражения клеток составляла для каждого вируса 0,02-0,1 ФОЕ/кл. В расчете на пятьдесят 1 литровых роллеров готовили клеточную взвесь в объеме 400 мл, содержащую 9х108 клеток в мл. Посевной вирус оттаивали при температуре (18±2)°С, разводили средой Игла ИМЕМ2 с 5 % сыворотки теленка в объеме 100 мл до концентрации от 3 до 5 на 107 ФОЕ/мл. Объединяли 400 мл клеточной взвеси со 100 мл посевного вируса. Полученную вирус-клеточную взвесь инкубировали при температуре (35±1)°С на шейкере в течение 1 часа. Вирус-клеточный субстрат разливали по 10 мл в 1л роллерные бутыли, в которые предварительно внесли по 80 мл ростовой среды (ИМЕМ2 с 5 % сыворотки теленка). На 3 день инкубирования при (37±0,5)°С делали смену среды на поддерживающую (Игла МЕМ). С 5 по 9 сутки делали ежедневные сливы культуральной жидкости с последующим внесением 50 мл на роллерную бутыль свежей среды ИМЕМ. Сведение партий вируссодержащей культуральной жидкости (отдельно для вирусов Пуумала, Хантаан и Сочи) проводили на 5,6,7,8,9 сутки одной или нескольких закладок клеток-продуцентов. VERO клетки – продуцент хантавирусов ПУУМАЛАХАНТААН СОЧИ вирусный субстратсубстрат субстрат вирусныйвирусный Осветляющая фильтрацияОсветляющая фильтрацияОсветляющая фильтрация вирусного субстратавирусного субстратавирусного субстрата КонцентрированиеКонцентрированиеКонцентрирование ультрафильтрациейультрафильтрациейультрафильтрацией Очистка гель-фильтрациейОчистка гель-фильтрацией Очистка гель-фильтрацией ИнактивированиеИнактивированиеИнактивирование формалиномформалиномформалином Контроль моновакциныКонтроль моновакциныКонтроль моновакцины Комбинированная тривалентная вакцина Контроль готовой вакцины Рисунок 1 – Основные этапы изготовление вакцины ГЛПС-Вак. Осветляющая фильтрация Восстановление культуробъединенного сбора клеток из РБК Концентрирование объединенного сбора Закладка и выращивание культуры клеток при t (37±1)°С Очистка концентрата: гель- фильтрация на SEPHAROSE 6FF Заражение культур клеток Инактивация формалином Стерилизующая фильтрация Инкубирование вируса при t (36 ± 1)°СКонтроль полноты инактивации вируса Соединение 3-х компонентов Получение объединенноговакцины сбора вирусной биомассы отдельно для каждого вируса Добавление альбумина человеческого Добавление гидроокиси алюминия Готовая форма вакцины Рисунок 2 – Биологическая схема производства вакцины ГЛПС-Вак. Использовалитольковируссодержащиекультуральныежидкости,вкоторых инфекционный титр вируса составлял не менее 5,0 lg ФОЕ/мл, свободные от бактериальной и грибковой контаминации и микоплазм. Перед объединением партии вируссодержащей культуральной жидкости размораживали путем выдерживания при температуре (18±2) °С. Материал асептично переливали в одну ёмкость для каждого вируса в отдельности. Отбирали пробы на контроль инфекционной активности (титр вируса). Концентрирование вируссодержащей культуральной жидкости. Концентрирование проводилипутемультрафильтрациивтангенциальномпотоке,используясистему концентрирования с пределом отсечения 100 кДа и площадью фильтрации от 0,1 до 0,5 м 2. Ультрафильтрацию проводили при температуре 20-240 С и давлении до 2,5 бар. Для предупреждениязначительногоповышениятемпературыполуфабрикатапоследний предварительно охлаждали до температуры 6±2 0С. Очистка первичных концентратов вирусов. Для гель-фильтрации использовали колонку с Sepharose 6 Fast Flow производства GE Healthcare, которую уравновешивали трис-буфером (10 мМ Tris-HCl, 130 мМ NaCl; pH 7,2 – 7,4). Затем наносили образец (концентрат) объёмом 15 - 20 мл. Элюировали тем же буфером со скоростью 4 - 6 мл/мин, собирали фракции объёмом 10 мл. Оптическую плотность (ОП) каждой фракции определяли при длине волны 280 нм. Хранили концентрат при температуре: (6±2) 0С не более 5 дней, при температуре минус (18±2) °С - не более 1 месяца, при температуре минус (70±2) °С – до 1 года. Инактивированиеиконтрольнаотсутствиеживоговируса(специфическая безопасность) моновалентных вакцин против ГЛПС. Очищенный вирус в виде вируссодержащей жидкости (пул фракций после хроматографической очистки, каждый хантавирус в отдельности) подвергали инактивированию формалином. Вируссодержащую жидкость после добавления формалина подвергали стерилизующей фильтрации через мембрану Millipore с диаметром пор 0,22 мкм. Процесс инактивации длился 30 дней при температуре 6 ±2 0С. На 30-й день процесс инактивации останавливали: нейтрализовали формальдегид добавлением сульфита натрия (Na2SO3) до конечной концентрации 0,0264 М/л. По окончании срока инактивации из каждой бутыли забирали пробы для контроля на специфическую безвредность. Получение готовой формы вакцины ГЛПС-Вак. Полуфабрикат серии трехвалентной вакцины против ГЛПС получали после сведения равных объёмов полуфабрикатов моновалентных вакцин Пуумала, Хантаан и Сочи в разведениях, содержащих N антиген в титре не менее 1/128 для каждой из моновакцин. В соответствии с описанной технологией были приготовлены 3 экспериментальные серии вакцины ГЛПС-Вак по 600, 650 и 660 доз соответственно. Основные характеристики экспериментальных серий вакцины представлены в Таблице 10. Для оценки иммуногенности готовую адсорбированную комбинированную вакцину вводили не менее чем 8 мышам линии BALB/c 9-10 недельного возраста, весом 18-20 г внутримышечно 3-х кратно с 2-х недельным интервалом, используя для одной иммунизации 1 РД готовой вакцины. В качестве контрольных использовали мышей BALB/c, которым в те же сроки вводили адсорбент – гидроокись алюминия. Через 2 недели после последней инъекции у животных брали кровь из орбитальной вены и готовили из неё сыворотку. В полученных сыворотках крови определяли титр вируснейтрализующих антител к вирусам Пуумала, Хантаан и Сочи. 2 Результаты токсикологических исследований вакцины ГЛПС-Вак Результаты исследования острой токсичности. Перечень исследований острой токсичности вакцины включал следующие разделы: влияние кратного внутримышечного введения вакцины на общее состояние и поведенческие реакции половозрелых и неполовозрелых мышей; поведение мышей в «открытом поле»; эмоциональная реактивность животных в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»; клиническая характеристика интоксикации; оценка состояния животных на внутривенное и внутримышечное введение вакцины; результаты некропсии. Таблица 10 - Исследования экспериментальных серий вакцины ГЛПС-Вак на соответствие требованиям, предъявляемым к инактивированным вакцинам, вводимым людям* ПоказателиТребованияСерия 1Серия 2Серия 3 ГФ и проекта НТД ОписаниеНепрозрачнаяСоответствуетСоответствуетСоответствует суспензия ИммуногеннаяТитрПуумала – 1:512Пуумала –Пуумала – активностьнейтрализующих АТХантаан – 1:4801:5201:480 к хантавирусам вСочи – 1:440Хантаан –Хантаан – иммунных1:4801:465 сыворотках BALB/cСочи – 1:450Сочи – 1:440 ≥ 1:20 СпецифическаяТитр N антигена неСоответствуетСоответствуетСоответствует активностьменее 1/256 рНот 7,0 до 7,67,67,67,6 БактериальныеНе более 25 ЕЭМенее 25 ЕЭМенее 25 ЕЭМенее 25 ЕЭ эндотоксины ПирогенностьДолжна бытьАпирогеннаАпирогеннаАпирогенна апирогенна АномальнаяДолжна быть неНе токсичнаНе токсичнаНе токсична токсичностьтоксична СтерильностьДолжна бытьСтерильнаСтерильнаСтерильна стерильна МикоплазмыНе должна содержатьНе содержитНе содержитНе содержит микоплазм ФормальдегидНе более 0,01 мг/дозуОтсутствуетОтсутствуетОтсутствует АлюминийОт 1,0 до 1,5 мг/дозу1,1 мг/дозу1,15 мг/доза1,11 мг/доза СпецифическаяНе должна содержатьНе содержитНе содержитНе содержит безопасностьживого вируса БСАНе более 0,5 мкг/доза< 0,5 мкг/доза< 0,5 мкг/доза< 0,5 мкг/доза БелокНе более 12585 мкг/доза70 мкг/доза78 мкг/доза мкг/доза Остаточная ДНКНе более 10 нг/доза< 10 нг/доза< 10 нг/доза< 10 нг/доза клеток Полнота сорбцииОт 80 до 100%99 %99 %99 % * Экспериментальные серии поливалентной вакцины приготовлены и проконтролированы совместно с научными сотрудниками лаборатории геморрагических лихорадок С.С. Курашовой, к.б.н. М.В.Баловневой, к.б.н. М.С. Егоровой, Н.А. Коротиной. Проведенные экспериментальные исследования острой токсичности на аутбредных мышах и морских свинках показали, что вакцина в условиях внутримышечного применения максимальных доз не оказывает токсического действия на организм лабораторных животных. При исследовании острой токсичности вакцины на аутбредных половозрелых и неполовозрелых мышах значения ЛД50 установить не удалось, в связи с отсутствием гибели экспериментальных животных. Максимальная доза вакцины при внутримышечном введении составила 1,5 дозы на половозрелую мышь и 5 доз на морскую свинку и была ограничена предельно возможными объемами введения для данного вида животных. Клиническая картина интоксикации при применении исследуемой вакцины была выраженанеярко,наблюдалосьнезначительноеугнетениеобщегосостояния,при внутримышечном введении – хромота, гиподинамия. Причем, все указанное, в основном, было характерно как для животных, получавших вакцину, так и для тех, которые получили физиологический раствор. Наблюдаемые побочные эфекты исчезали в течение 2-х часов от момента введения препаратов. Ежедневное наблюдение за общим состоянием животных, поведенческими реакциями в руках и на открытой площадке, а также изучение индивидуального поведения показали, что введение вакцины не оказывало отсроченного влияния на общее состояние, ориентировочно- исследовательскую активность и эмоциональный статус экспериментальных животных. Вскрытие животных спустя 14 дней после острого введения вакцины не показало наличия каких-либо остаточных явлений, связанных с перенесенной интоксикацией. По результатам патоморфологических исследований внутримышечное введение вакцины в максимальных дозах не вызывало развития дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов. Таким образом, вакцина не обладала токсическим и местно-раздражающим действием при введении лабораторным животным. Результаты исследования хронической токсичности. Целью исследования хронической токсичности вакцины являлось: изучение влияния многократного (21 дневного) введения вакцины на массу тела; на общее состояние и поведенческие реакции половозрелых и неполовозрелых мышей (поведение мышей в тесте «открытое поле», в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»); влияния вакцины на биохимические показатели крови, а также патоморфологические и гистологические изменения в ответ на введение вакцины. В результате проведенных исследований по выявлению хронической токсичности вакцины на аутбредных мышах и морских свинках было показано, что вакцина в условиях многократного пролонгированного внутримышечного 21 дневного введения не оказывала токсического действия на организм лабораторных животных. Динамика массы тела контрольных и экспериментальных животных была положительной на протяжении всего исследования. Наблюдалось незначительное отставание в росте половозрелых и неполовозрелых морских свинок, получавших препараты в максимальном объёме – 0,5 дозы, при отмене препаратов динамика массы тела восстанавливалась. Признаков интоксикации не было выявлено. Снижение активности животных после 21 дневного применения вакцины было незначительным и обратимым. Ежедневное наблюдение во время изучения хронической токсичности за общим состоянием животных, поведенческими реакциями в руках и на открытой площадке, а также изучение индивидуального поведения показали, что внутримышечное введение 2-х доз вакцины невлиялонаобщеесостояние,ориентировочно-исследовательскуюактивностьи эмоциональный статус мышей. Гематологические и биохимические показатели у половозрелых морских свинок при длительном внутримышечном и внутривенном введении вакцины (для внутривенного введения использовали вакцинный препарат, не сорбированный на гидроокись алюминия) оставались в пределах физиологической нормы. При патоморфологическом исследовании внутренних органов половозрелых и неполовозрелых морских свинок, и беспородных белых мышей, которым вводили вакцину и физиологический раствор (контроль) не вызывало раздражения, воспаления или деструкции тканей в месте введения; не вызывало макроскопическихизменений головного мозга, внутренних и эндокринныхорганов, гиперволемического отека внутренних органов, что подтверждается величинами их массовых коэффициентов.Слабовыраженноеместно-раздражающеедействиепримногократном внутримышечном введении наблюдалось у некоторых животных как из опытной, так и из контрольной групп, что может быть обусловлено длительной травматизацией в месте инъекции. В результате гистологического исследования было показано, что пролонгированное введение вакцины мышам и морским свинкам не сопровождалось развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов. Результаты исследования аллергизирующих свойств. Для определения аллергизирующих свойств вакцины использовали тест «реакция общей анафилаксии» у половозрелых и неполовозрелых животных, а также тест «конъюнктивальная проба» у половозрелых животных. При постановке теста «реакция общей анафилаксии» у несенсибилизированных и сенсибилизированных морских свинок после введения разрешающей дозы вакцины признаков анафилактической реакции по индексу Weigle, практически, не было выявлено. Лишь только в одном случае среди сенсибилизированных животных были отмечены признаки слабой аллергическойреакции(беспокойство,учащениедыхания,почесываниемордочкии непроизвольное мочеиспускание), которые в течение 30 минут исчезли. Выявленная слабая реакция у одного животного позволяет заключить о возможной способности вакцины к сенсибилизации организма при индивидуальной чувствительности. Припостановкетеста«конъюнктивальнаяпроба»послевведенияживотным разрешающей дозы вакцины не было выявлено развития аллергического конъюнктивита при оценке через 15 минут (немедленный тип), а также через 24 и 48 часов (замедленный тип). Результаты исследования иммунотоксичности. Целью исследования было установление иммунотоксических свойств вакцины при введении половозрелым и неполовозрелым мышам. Для определения антител использовали реакцию гемагглютинации эритроцитов барана. Иммунотоксическое воздействие вакцины на Т-клеточный иммунитет in vivo оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей к эритроцитам барана. Сравнение индексов воспаления в тесте определения гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана показало, что вакцина не обладала ни стимулирующим, ни ингибирующим воздействием на иммунную реакцию как половозрелых, так и неполовозрелых мышей. Введение вакцины в дозе 0,5 и 1,0 мл не оказывало угнетающего влияния на антителогенез; титр гемагглютининов был незначительно выше в сыворотках крови половозрелых мышей испытуемой группы по сравнению с контрольной группой (разница 0,51 log2), а значение индекса реакции составляло 1,07. В испытуемой группе неполовозрелых мышей также отмечалась некоторая тенденция к увеличению общего титра антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных вакциной, однако значение индекса реакции (1,18) не превышало порог, указывающий на стимулирующий эффект. Результаты изучения эмбриотоксического действия. Исследование эмбриотоксического действия вакцины на репродуктивную систему половозрелых белых крыс, а также антенатального повреждающего действия в постнатальном периоде на развитие эмбрионов крыс показало отсутствие токсического воздействия на репродуктивные органы животных, на развитие эмбрионов и на потомство, родившееся от самок, получавших вакцину в течение 20 дней беременности, в независимости от путей её введения. Внутримышечное введение самкам крыс вакцины в одной и трех прививочных дозах с 1 по 19 день беременности не оказывало эмбриотоксического действия: показатели эмбрионального развития в опытных группах не имели статистически значимых отклонений от показателей в группе контроля; физическое развитие, скорость развития сенсорно-двигательных функций и эмоционально-двигательная активность потомства опытных и получавших вакцины крыс также не выявило наличия отклонений от нормы. Результаты исследования влияния на репродуктивную функцию животных. В период введения вакцин снижения темпов прироста массы тела, изменений в поведении, гибели животных не отмечалось ни в одной из изучаемых групп самцов или самок. Индекс беременности достоверно не отличался в изучаемых группах. При вскрытии самок не было выявлено повышения уровней пред- и постимплантационной смертности в подопытных группах по сравнению с соответствующими контрольными группами. У оставленных рожать самок, каких- либо особенностей в протекании родов и заботе о потомстве не отмечено. Уровни гибели новорожденных крысят, соотношение самцов и самок в помете не различались в изучаемых группах. Сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов были синхронны в пометах подопытной и контрольной. Открытие глаз у потомства самцов и самок, получавших вакцину, произошло практически в те же сроки, как и в контрольной группе. Опускание семенников и открытие влагалища по срокам также не отличались в изучаемых группах. Анализ полученных данных показал, что длительное внутримышечное введение вакцины в прививочной для человека дозе не оказывает воздействия на репродуктивную функцию самцов и самок крыс. Результаты исследования мутагенных свойств в тесте Эймса. Установление мутагенных свойств вакцины было проведено в тесте Эймса в микропланшетном формате (Ames MPF™ 98/100/1535/1537, Xenometrix, Швейцария). В качестве индикаторных микроорганизмов были использованы бактериальные штаммы S. typhimurium ТА98, ТА100, ТА1535, ТА1537, в геном которых внесены мутации по типу замены пар оснований и сдвига рамки считывания. В результате мутаций у бактериальных штаммов была потеряна способность к росту на безгистидиновой среде. Воздействие потенциальных мутагенов могло привести к индукции обратных мутаций и способности к росту на среде, не содержащей гистидин. В качестве негативного контроля применяли стерильную воду для инъекций. Для тестируемых препаратов количество His+-ревертантов в секциях с негативным контролем в варианте без метаболической активации S9 и в системе с метаболической активацией S9 не превышало максимально допустимые значения (≤ 8 для штаммов ТА98, ТА1535, ТА1537 и ≤ 12 для штамма ТА100). В качестве позитивного контроля были использованы стандартные мутагены в соответствии с рекомендациями OECD 471. В варианте без метаболической активации микросомальной фракцией S9 применяли 2-нитрофлуорен (2мкг/мл; штамм ТА98), N-оксид-4- нитрохинолин (0,1 мкг/мл; штамм ТА100), N4-аминоцитидин (100 мкг/мл; штамм ТА1535), 9- аминоакридин (15 мкг/мл; штамм ТА1537). В варианте с метаболической активацией микросомальной фракцией печени крыс был использован стандартный мутаген 2-аминоантрацен (5 мкг/мл) для всех штаммов. Количество мутантных колоний в секциях с позитивным контролем превышало минимально допустимое значение (≥ 25 колоний позитивного контроля) в варианте без метаболической активации S9 и в варианте с метаболической активацией S9. При тестировании вакцины в варианте без активации микросомальной фракцией печени и в присутствии фракции S9 не было выявлено мутагенных свойств на штаммах ТА98, ТА100, ТА1535, ТА1537 в разведениях препарата 1 – 0,00001 дозы. Полученные результаты теста Эймса свидетельствуют об отсутствии мутагенных свойств вакцины ГЛПС-Вак. 3 Результаты исследования иммуногенности и стабильности вакцины ГЛПС-Вак Для исследования иммуногенной активности готовой вакцины на разных сроках её хранения в регламентированных условиях (6, 12 и 24 месяцев) иммунизировали мышей BALB/с с последующим определением в сыворотках крови животных нейтрализующих антител к хантавирусам Пуумала (ПУУ), Хантаан (ХТН) и Сочи (СОЧИ) (Таблица 1, Рисунок 3). Эксперименты по выявлению нейтрализующих антител выполнены совместно с научными сотрудниками лаборатории геморрагических лихорадок С.С. Курашовой и к.б.н. М.С. Егоровой. Таблица 1 - Нейтрализующие антитела в сыворотках крови мышей BALB/с после иммунизации вакциной с разными сроками хранения Сроки хранения вакцины Разве-06 месяцев12 месяцев24 месяца веденияВирусыСреднеСреднеСреднеСреднеСреднеСреднеСреднеСредне вакциныарифм.геометр.арифм.геометр. арифм.геометр.арифм.геометр. титртитртитртитртитртитртитртитр ПУУ----544±48,89,1±0,1140±14,47,1±0,2 н/рХТН----512±52,28,9±0.580±15,46,3±0,3 СОЧИ----480±53,38,8±0,268±12,66,1±0,2 ПУУ584±38,6*9.2±0,4^576±56,89,1±0,3 304±44,38,1±0,260±145,9±0,3 1/2ХТН540±68,69,1±0,4546±45,89,1±0,1 240±26,77,8±0,240±14,45,3±0,3 СОЧИ488±46,48,9±0,6512±52,28,9±0,2 224±26,17,7±0,230±6,54,9±0,2 ПУУ128±13,16,9±0,2118±13,17,3±0,2 128±13,16,3±0,544±8,95,5±0,2 1/8ХТН192±36,17,3±0,3240±26,76,8±0,2112±136,7±0,240±14,44,8±0,2 СОЧИ112±13,16,7±0,2128±13,16,9±0,2 104±12,26,6±0,128±5,54,8±0,3 ПУУ26,6±4,24,7±0,216±3,44,5±0,224±4,44,6±0,2<20<4,3 1/32ХТН22,8±3,14,5±0,120±3,44,6±0,223±44,5±0,2<20<4,3 СОЧИ26,6±3,64,6±0,226±5,44,8±0,223±3,334,5±0,2<20<4,3 *среднеарифметический титр антител ± стандартная ошибка ^среднегеометрический титр антител, выраженный в log2 ± стандартная ошибка По результатам выявления нейтрализующих антител к вирусам Пуумала, Хантаан и Сочи можно сделать заключение о том, что вакцина через 6 и 12 месяцев хранения в регламентируемых условиях сохраняла исходный уровень иммуногенности. Через 2 года хранения отмечено снижение титров нейтрализующих антител, тем не менее, вакцина до разведения 1/8 включительно индуцирует выработку нейтрализующих антител в титре более, чем 1/20. Исследование стабильности вакцины по неспецифическим показателям не выявило отклонений от нормы, т.е. по физико-химическим параметрам, стерильности, отсутствию пирогенности и аномальной токсичности вакцина после 2-х лет хранения полностью соответствовала требованиям регламентирующих документов на вакцинные препараты, вводимые людям. АБ Титр log2 Титр log2 ПУУПУУ 4ХТН4 ХТН ДОБДОБ 1/21/81/32н/р1/21/81/32 С Титр log2 ПУУ ХТН ДОБ 2 недели6 месяцев12 месяцев24 месяцев32 месяцев время хранения Рисунок 3 - Динамика нейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных мышей. А  на нулевом сроке хранения; Б – через 12 месяцев хранения вакцины; С – иммуногенность вакцины в разведении ½ в зависимости от срока хранения. Таким образом, в результате проведенных доклинических исследований было показано, что вакцина ГЛПС-Вак обладает высокой иммуногенностью, стабильностью и безопасностью, не проявляет токсического эффекта при введении лабораторным животным, не обладает аллергизирующим и иммунотоксическим действием, не проявляет эмбриотоксического и мутагенного действия, а также негативного влияния на репродуктивную функцию организма лабораторных животных. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Целью диссертационной работы явились два последовательных направления: оптимизация технологических режимов на всех стадиях изготовления поливалентной (на основании 3-х хантавирусов) вакцины для профилактики ГЛПС, на основе данных, полученных за последние 20 лет в результате исследований по разработке биотехнологических основ создания хантавирусных вакцинных препаратов; доклинические исследования для доказательства безопасности и специфической эффективности поливалентной вакцины ГЛПС-Вак. В результате проведенных исследований оптимизированы технологические этапы изготовления инактивированной вакцины против ГЛПС на основе трех вирусов, адаптированной к эпидемиологическим условиям РФ, то есть, с использованием наиболее патогенных и эпидемиологическизначимыххантавирусныхштаммов.Приготовлены3серии экспериментальной вакцины для проведения доклинических исследований. Все методические подходы, в соответствии с полученными результатами, могут быть использованы для освоения промышленного производства вакцины ГЛПС-Вак. Токсикологические исследования включали в себя изучение острой и хронической токсичностей, аллергизирующих свойств вакцины, влияния вакцины на иммунную систему, мутагенности, репродуктивной токсичности и эмбриотоксичности вакцины. Показано, что вакцина ГЛПС-Вак не токсична, не обладает аллергизирующими, иммунотоксическими и мутагенными свойствами, не проявляет эмбриотоксического действия, а также негативного влияния на репродуктивную функцию организма лабораторных животных. Вакцина ГЛПС-Вак является безопасной, высоко иммуногенной и стабильной при хранении в регламентируемых условиях (6±2 °С). Широкое распространение, высокие показатели заболеваемости людей, значительная частота тяжелых форм течения болезни, сопровождающихся длительным периодом пониженной трудоспособности, отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую актуальность и социальную и медицинскую значимость проблемы ГЛПС как в России, так и во многих странах мира. Социально–экономическое значение ГЛПС для общества огромно и связано с её широкой распространенностью и высокой затратностью на лечение и реабилитацию. Весьма важной является оценка социально–экономических затрат, в том числе прямых и непрямых, связанных с лечением больных ГЛПС (т.е. фактическая “стоимость” этого заболевания для общества и индивидуума). На лечение больных ГЛПС расходуются огромные средства, существенно превышающие бюджетные затраты на другие инфекции. Так, прямые медицинские затраты на лечение одного больного ГЛПС в России оцениваются, согласно различным источникам, от 20 до 30 тысяч рублей, включая: оплату диагностических мероприятий, длительного (3-4 недели и более) стационарного лечения, в том числе и с применением гемодиализа (подключение к аппарату искусственной почки), лабораторных и инструментальных исследований, зарплаты участвующего в обследовании, лечении и реабилитации медицинского персонала, а также оплату ряда немедицинских услуг (транспорта, питания и др.). Непрямые затраты, как правило, превышают прямые в 2-3 раза и составляют 40 – 60 тысяч рублей на лечение одного больного ГЛПС. Если говорить о нашей стране, то социально-экономические потери усугубляются тем, что из числа заболевших ГЛПС до 85% составляют мужчины в возрасте от 20 до 40 лет, то есть. наиболее демографически, экономически и социально продуктивная часть населения, несущая большую долю ответственности за финансовую поддержку и заботу о других. Создание вакцины против ГЛПС и ее широкое внедрение в практику здравоохранения позволит в значительной степени уменьшить тяжесть социально-экономических последствий, связанных с высокой заболеваемостью ГЛПС, сопровождающейся нередко летальным исходом. Результаты анализа структуры заболеваемости ГЛПС и иммунного статуса здорового населения по отношению к возбудителю этой инфекции в России свидетельствуют о том, что показания к вакцинации против ГЛПС не могут быть ограничены определенной группой повышенного риска и, практически, в равной степени распространяются на все профессиональные группы городского и сельского населения эндемичных территорий. Население эндемичных территорий, нуждающееся в вакцинопрофилактике этой инфекции, составляет только в России около 20 миллионов человек, что обусловливает высокую коммерческую ценность вакцины и, соответственно значительную финансовую прибыль от реализации вакцины. Кандидатная поливалентная вакцина для профилактики ГЛПС успешно прошла комплексные доклинические испытания, что может явиться основанием для проведения клинических испытаний. ВЫВОДЫ 1. Оптимизированы биотехнологические этапы изготовления поливалентной (на основе отечественных штаммов 3-х хантавирусов) инактивированной вакцины против ГЛПС, не имеющей аналогов в мире. 2. Результаты доклинических исследований являются доказательством безопасности и высокой иммуногеннойактивностивакциныГЛПС-Вак.Вакцинаиндуцируетвыработку нейтрализующих антител по отношению к каждому из составляющих её вирусов – возбудителей ГЛПС у 100% мышей BALB/c. 3. Вакцина не токсична при испытании на аутбредных белых мышах и морских свинках как при однократном, так и при повторных введениях в дозах, суммарно значительно превышающих вакцинирующие для человека. 4. Не выявлено иммунотоксического влияния вакцины на В-клеточный и Т-клеточный иммунитет на модели мышей линии СВА, а также проявлений аллергизации, вызванных введением вакцины морским свинкам. 5. Вакцина не нарушает репродуктивную функцию экспериментальных животных и не оказывает эмбриотоксического воздействия при длительном введении крысам в дозах, суммарно значительно превышающих вакцинирующие для человека. 6. Вакцина не проявляет мутагенных свойств в тесте Эймса на тестерных штаммах Salmonella typhimurium. 7. Разработаны протоколы доклинических исследований вакцины против ГЛПС, а также соответствующиенормативно-техническиедокументы,включаяпроектыопытно- промышленного регламента, фармакопейной статьи предприятия, инструкции по применению вакцины, брошюры исследователя и протокола клинического исследования. 8. Результаты доклинических исследований могут быть основой для перехода к I фазе клинических испытаний поливалентной вакцины ГЛПС-Вак.