Вклад протеомных перестроек в проявление защитных эффектов 24-эпибрассинолида на растения пшеницы в условиях обезвоживания

Объектом исследования служили растения мягкой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Омская 35 (О-35, устойчивый к засухе) и Салават Юлаев (СЮ, менее засухоустойчивый). В первом варианте опытов семена высеивали в кюветы на бумажные фильтры, смоченные водопроводной водой, и оставляли для проращивания на 3-е суток при 21-23°C, 16-часовом фотопериоде и освещенности 15 кЛк. После отделения от эндосперма проростки помещали в питательный раствор 2%-ной сахарозы. Далее проростки выдерживали в течение 24 ч на растворе 2%-ной сахарозы с 0.4 мкМ ЭБ. Впоследствии, предварительно обработанные и необработанные ЭБ 4-х суточные проростки подвергали воздействию обезвоживания присутствием в среде 5%-ного маннита в течение суток на разные интервалы времени для анализа ростовых параметров и физиолого-биохимических показателей. Контрольные проростки помещали на раствор 2% сахарозы и не подвергали влиянию ЭБ и маннита. Во второй схеме эксперимента семена после стерилизации замачивали в растворе 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида в течение 3 ч, необработанные гормоном семена замачивали в дистиллированной воде. В последующем семена пшеницы проращивали в кюветах на бумажных фильтрах, смоченных водопроводной водой, содержащей 5%-ный маннит при освещенности 160 ммоль / (м2 с), 16 ч фотопериоде, температуре 21-23°C. Растения выращивали в течение одной недели, каждый день их пересаживали на свежую среду. Через 3, 5, 7 дней прорастания отдельные проростки фиксировали в жидком азоте для оценки
различных физиологических и биохимических параметров. О росте корней проростков в ходе опытов судили по митотическому индексу (МИ) меристематической ткани. Митотическую активность апикальной меристемы корней проростков оценивали цитологическими методами с использованием окуляр-микрометра при анализе не менее 2000 клеток на вариант. Митотический индекс (МИ) рассчитывали как процентное соотношение количества митотических клеток к общему числу клеток в ткани (Shakirova et al., 2004). Содержание фитогормонов пшеницы в одной растительной навеске определяли с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА) (Shakirova et al., 2016b). Процедура иммуноанализа содержания свободных форм фитогормонов АБК, а также ИУК и цитокининов описана ранее (Shakirova et al., 2003). О проницаемости клеточных мембран проростков пшеницы судили по выходу электролитов (Малый практикум по физиологии растений, 1994), который регистрировали с использованием кондуктометра типа ОК 102/1 (Radelkis, Венгрия), измеряя омическое сопротивление водных экстрактов в постоянном токе (Талиева и др., 2002). Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию в проростках одного из конечных продуктов ПОЛ – малонового диальдегида (МДА) с помощью цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Bezrukova et al., 2008). Для протеомного анализа использовали побеги, которые отделяли от корней и фиксировали в жидком азоте. Экстракцию растворимых белков проводили с помощью буфера, содержащего 50 мМ Hepes KOH, рН 7.5; 1 мМ ДТТ; 1 мМ ФМСФ; 10 мМ ЭГТА; 0.1 мМ ортованадат натрия; 1 мМ теофиллин и 3% поливинилпирролидон. Определение количества белка в растворе проводили по методу Бредфорда (Bradford, 1976). Белки разделяли методом двумерного электрофореза (2DE) (Федина, 2013). Для идентификации белков из геля изолировали пятна белков и проводили триптический гидролиз белка. Масс-спектры фрагментов белков получали на тандемном MALDI-TOF-TOF масс-спектрометре Ultraflex II («Bruker», Германия), оборудованном ультрафиолетовым лазером, в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. Идентификацию белков осуществляли при использовании программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск белков выполнялся в базах данных NCBI и
UniProt (подбаза – растения). Регистрацию масс-спектров и идентификацию белков проводили в Междисциплинарном центре протеомных исследований при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». Методом иммуно- блоттинга с использованием кроличьих антител, полученных к обязательному для дегидринов высоко консервативному К-сегменту, проанализированы качественные и количественные изменения в уровне белков дегидринов. Интенсивность окрашивания белковых пятен оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ. Эксперименты проводили в 3-х биологических и 3-х аналитических повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ ростовых параметров предобработанных и необработанных 24-эпибрассинолидом проростков пшеницы в условиях засухи
Первоначально важно было выявить различия в изменениях ростовых параметров в ответе на дефицит влаги растений контрастных по устойчивости к засухе сортов пшеницы. Присутствие маннита в среде проращивания проростков существенно тормозило их рост, что выражалось в снижении сырой и сухой массы растений обоих сортов по сравнению с контролем, причем этот эффект особенно был выражен у сорта СЮ (рис. 1).
Необходимо отметить, что проростки, подвергнутые стрессу росли гораздо медленнее контрольных. Так, в течение 7-ми дней проращивания семян на растворе 5%-ного маннита наблюдалось снижение сырой массы проростков у сорта О-35 на 26% относительно контроля, в то время как у проростков сорта СЮ – на 45%. Вместе с тем к 7-м суткам стресса наблюдалось снижение сухой массы проростков O-35 на 24%, СЮ – 39% от контроля (рис. 1б). Вероятно, наблюдаемые нами изменения параметров роста у растений, различающихся по устойчивости к засухе, были обусловлены сложными взаимосвязями генетических, экологических, физиологических и морфологических процессов (Fahad et al., 2017).
Ингибирующее влияние стрессовых факторов, вызывающих засуху, на ростовые параметры, вероятно, связано со снижением тургора клеток листьев, что как следствие приводит к ингибированию роста, деления клеток и снижению
скорости фотосинтеза, что отражается на накоплении сырой и сухой массы, способствуя их уменьшению (Osakabe et al., 2014; Hussain et al., 2019).
Вместе с тем сравнительный анализ влияния предпосевной ЭБ обработки на рост проростков пшеницы обоих сортов показал, что ЭБ в нормальных условиях оказывает на них ярко выраженное ростстимулирующее действие, особенно на растения устойчивого сорта О-35, о чем судили по показателям сырой и сухой массы 3-х, 5-ти и 7-ми суточных проростков (рис. 1).
Таким образом, сравнительный анализ влияния предпосевной ЭБ обработки на рост проростков пшеницы обоих сортов показал, что ЭБ в нормальных условиях оказывает выраженный ростстимулирующий эффект, что выражалось в показателях сырой и сухой массы (рис. 1а, б). Полученные результаты согласуются с рядом работ, в которых продемонстрирована ярко выраженная ростстимулирующая активность брассиностероидов (Авальбаев и др., 2010; Shakirova et al., 2012; Peres et al., 2019; Oh et al., 2020). Вместе с тем предобработка семян 0.4 мкМ ЭБ в течение трех часов не предотвратила, но значительно снизила негативное действие маннита на ростовые параметры растений пшеницы, при этом защитный эффект был сильнее выражен у растений устойчивого сорта О-35 (рис. 1). Так, наблюдалось снижение сухой массы на 9% у О-35 и 20% у СЮ у ЭБ-предобработанных растений в сравнении с контролем (рис. 1б).
Рис. 1. Влияние предпосевной обработки семян 0.4 мкМ ЭБ на динамику сырой (а) и сухой (б) массы побегов 3-, 5-, 7-суточных проростков пшеницы сорта Омская 35 и Салават Юлаев, выращенных на водопроводной воде в присутствии и отсутствии 5%- го маннита.
Результаты проведенного анализа позволяют сделать вывод об эффективности предобработки эпибрассинолидом с целью повышения устойчивости растений обо-
10

их сортов пшеницы к дефициту влаги, что подтверждается снижением уровня негативного действия стресса на ростстимулирующий эффект растений.
Влияние предобработки ЭБ на гормональный статус растений пшеницы при обезвоживании
Ключевая роль в регуляции роста – интегрального показателя степени благоприятности условий произрастания, развития и устойчивости растений к изменяющимся условиям выращивания отводится гормональной системе растений (Shakirova et al., 2016; Abobatta, 2019).
Поэтому принципиально было исследовать характер влияния обработки ЭБ на гормональный статус проростков, различающихся по устойчивости к дефициту влаги сортов пшеницы в ходе их проращивания на манните. Иммуноанализ гормонов в одной растительной навеске выявил стресс-индуцированное увеличение уровня АБК, максимальное накопление которого у сорта О-35 было обнаружено на 5-е сутки и составило 180% относительно контроля, тогда как в проростках сорта СЮ оно оказалось большим по уровню и более продолжительным – на 5-е и 7-е сутки – на 215 и 174%, соответственно.
Предобработка ЭБ способствовала снижению стресс-индуцированного накопления АБК, которое было более выражено у устойчивого сорта О-35 (рис. 2а). Характерным ответом растений на стресс является последовательно направленное снижение в ходе опыта концентрации ИУК в проростках обоих сортов, но у растений сорта СЮ оно было более существенным: на 3-и сутки на 45%, на 5-е – 50%, на 7-е – 60%. У предобработанных ЭБ растений СЮ наблюдалось поддержание концентрации ИУК при стрессе на уровне, близком к необработанным гормоном растениям О-35. При этом у предобработанных ЭБ растений О-35 содержание ИУК поддерживалось на существенно высоком уровне, тогда как к концу опыта оно было на 27% ниже контроля (рис. 2б).
Иная картина наблюдалась при анализе концентрации иммунореактивных к антителам, полученным к зеатин-рибозиду, свободных форм цитокининов. У обоих сортов максимальное падение концентрации цитокининов в проростках приходи- лось на 7-е сутки действия стресса, которое у проростков сорта СЮ было более выраженным.
Рис. 2. Влияние предпосевной обработки семян 0.4 мкМ ЭБ на содержание АБК (а), ИУК (б) и цитокининов (в) в побегах 3-, 5-, 7- суточных проростков пшеницы сорта Омская 35 и Салават Юлаев, выращенных на водопроводной воде в присутствии или отсутствии 5%-го маннита. Значения и их стандартные ошибки представлены (n = 3).
Содержание дегидринов в предобработанных ЭБ проростках пшеницы при воздействии маннита
Накопление АБК, являясь характерным ответом на засуху, играет ключевую роль в закрытии устьиц, предотвращая тем самым потерю воды при транспирации. Тем не менее, этот ответ приводит к нарушению газообмена и фотосинтеза, что
Наряду с этим, следует выделить, что содержание цитокининов в предобработанных ЭБ растениях обоих сортов сохранялось на су- щественно высоком уровне: у сорта О-35 оно уже к 5-м суткам соответствовало контрольному уров- ню, у сорта СЮ оно оставалось почти на 20% ниже контроля (рис. 2в).
Таким образом, прорастание предобработанных ЭБ растений обо- их сортов на среде, содержащей ман- нит, характеризовалось значительно низким показателем стресс-индуциро- ванного увеличения содержания АБК и поддержанием повышенного уровня ауксинов и гормонов цитокининовой природы по сравнению с необрабо- танными ЭБ проростками (рис. 2).

способствует ингибированию роста растений в целом. Кроме того, повышение уровня АБК в ответ на осмотический стресс, вызванный засухой, приводит к экспрессии широкого спектра генов, белковые продукты которых задействованы в развитии устойчивости растений к повреждениям (Shakirova et al., 2010; Osakabe et al., 2014; Burgess, Huang, 2016; Feng et al., 2019). К ним относятся гены белков дегидринов (ДГ), накопление и синтез которых происходит на поздних стадиях эмбриогенеза, поскольку эти белки играют ключевую роль в регуляции созревания и покоя семян, способствуя защите целостности клеточных высокомолекулярных природных соединений в условиях окислительного стресса (Аллагулова и др., 2003; Kosova et al., 2014; Shakirova et al., 2016а; Liu et al., 2017). С целью выявления вклада дегидринов в формирование устойчивости растений к дефициту влаги методом иммуноблоттинга с использованием кроличьих антител, которые получены к необходимому для дегидринов высоко консервативному К-сегменту, проведена сравнительная оценка качественных и количественных изменений в уровне этих белков в побегах необработанных и предобработанных ЭБ растений контрастных по засухоустойчивости сортов Омская 35 и Салават Юлаев на 3-е, 5-е и 7-е сутки прорастания на среде с 5%-ным маннитом. Иммунопозитивные полипептиды идентифицированы в побегах контрольных и опытных вариантов, причем наиболее значимые различия выявлены в содержании дегидринов с молекулярной массой 22, 28 и 55 кДа (рис. 3, 4). Существенное возрастание уровня дегидринов обнаруживалось в проростках обоих сортов при обработке маннитом, что естественно, поскольку обезвоживание индуцирует синтез этих важнейших осмопротектантов (Аллагулова и др. 2003; Kosova et al., 2014; Shakirova et al., 2016a; Liu et al., 2017). Инкубация проростков на манните приводила к накоплению всех трех дегидринов в побегах обоих сортов на 3-и и 5-е сутки на фоне небольшого увеличения дегидрина с молекулярной массой 55 кДа в течение всего эксперимента (рис. 3 и 4), однако по динамике накопления и их количественному уровню сорта различались. Так, у засухоустойчивого сорта О-35 максимумы накопления дегидринов с молекулярной массой 22 и 28 кДа выявлены на 3-и сутки действия стресса, когда их содержание увеличилось соответственно в 5 и 6.5 раз, далее на 5-е и 7-е сутки содержание этих дегидринов постепенно уменьшалось (рис. 3а). К 7-м
суткам уровень этих белков снизился более чем в 1.5 раза, но все еще превышал контрольные значения в 3-4 раза. При этом следует отметить, содержание дегидрина с молекулярной массой 55 кДа в устойчивом к засухе сорте О-35 увеличилось в два раза только лишь на 7-е сутки. В побегах проростков неустойчивого к засухе сорта СЮ наблюдалась иная картина ответа низкомолекулярных дегидринов на маннит (рис. 4).
Рис. 3. Влияние пред- посевной обработки семян 0.4 мкМ ЭБ на накопление дегидрина в побегах 3-, 5-, 7- суточных проростков пшеницы сорта Омс- кая 35, выращенных на водопроводной воде в присутствии или отсу- тствии 5%-го манни- та. Иммуноблоттинг термостабильных бел- ков (а). Денситометри- ческий анализ 22 кДа, 28 кДа, 55 кДа дегид- риновых полос, выра- женных в процентах от значений для соответ- ствующего контроля (б). 1 – контроль; 2 – 0.4 мкМ ЭБ; 3 – ман- нит; 4 – 0.4 мкМ ЭБ + маннит. Значения и их стандартные ошибки представлены (n = 3).
Данные денситограммы (рис. 4б) показали, что содержание дегидринов с молекулярной массой 22 и 28 кДа достигало двух- и трехкратного накопления на 3-и сутки стресса, тогда как на 5-е сутки их уровень превышал контрольные значения в 3 и 3.5 раза, который оставался неизменным до конца опыта. В побегах обоих сортов на 7-е сутки стресса выявилось более чем трехкратное накопление дегидрина с молекулярной массой 55 кДа, хотя в предыдущие временные периоды значимых изменений в содержании этого белка не обнаруживалось (рис. 3, 4).
14

Рис. 4. Влияние пред- посевной обработки семян 0.4 мкМ ЭБ на накопление дегидри- нов в побегах 3-, 5-, 7- суточных проростков пшеницы сорта Сала- ват Юлаев, выращен- ных на водопровод- ной воде в присутст- вии или отсутствии 5% маннита. Иммуно- блоттинг термоста- бильных белков (а). Денситометрический анализ 22 кДа, 28 кДа, 55 кДа дегидриновых полос, выраженных в процентах от значений для соответствующего контроля (б). 1 – конт- роль; 2 – 0.4 мкМ ЭБ; 3 – маннит; 4 – 0.4 мкМ ЭБ + маннит. Значения и их стан- дартные ошибки пред- ставлены (n = 3).
Проведена оценка вовлечения дегидринов в спектр защитного эффекта ЭБ на растения обоих сортов. Предпосевная обработка ЭБ вызвала транзиторное увеличение уровня низкомолекулярных дегидринов в побегах проростков пшеницы обоих сортов на 3-и и 5-е сутки: у сорта О-35 оно составило 2-кратное накопление дегидринов с молекулярной массой 22 и 28 кДа, сорта СЮ – 1.5-кратное, однако к 7-м суткам в обоих сортах данные белки не выявлялись (рис. 3, 4). В то же время, дегидрин с молекулярной массой 55 кДа не проявлял чувствительность к ЭБ на протяжении всего опыта.
Вместе с тем в побегах ЭБ-предобработанных проростков обоих сортов, подвергнутых воздействию маннита, на 3-и и 5-е сутки наблюдалось дополнительное почти 25% накопление дегидринов с молекулярной массой 22 и 28 кДа, хотя к 7-м суткам опыта различия в содержании этих белков в предобработанных и необработанных гормоном проростках нивелировались.
15

Предобработка ЭБ не оказала влияние и на стресс-индуцированное увеличение содержания дегидрина с молекулярной массой 55 кДа в обоих сортах в ходе всего опыта (рис. 3, 4).
Таким образом, было обнаружено, что засуха привела к многократному накоплению дегидринов с молекулярной массой 22 кДа и 28 кДа у устойчивого сорта О-35 особенно в начальный период воздействия стресса, в отличие от восприимчивого сорта СЮ. Дегидрин с молекулярной массой 55 кДа также способствует защите растений от обезвоживания, причем это проявляется к 7-м суткам воздействия стресса. У подвергнутых стрессу побегов обоих сортов, предобработанных ЭБ, наблюдалось дополнительное увеличение содержания дегидринов с молекулярной массой 22 и 28 кДа, что предполагает участие этих белков в развитии ЭБ-индуцированной устойчивости пшеницы к засухе.
Таким образом, впервые продемонстрировано участие низкомолекулярных дегидринов в реализации защитного эффекта предпосевной обработки ЭБ на проростках пшеницы обоих сортов, наиболее ярко проявившееся на засухоустойчивом сорте O-35 в начальный период обезвоживания.
Протеомный анализ растений пшеницы
Проведен анализ вызываемых обезвоживанием протеомных перестроек в контрольных и предобработанных ЭБ проростках в норме и при дефиците влаги.
Исследование влияния 24-эпибрассинолида на профиль растворимых белков растений пшеницы в нормальных условиях произрастания
Из полученных нами ранее данных известно о сочетании у 24-эпибрассиноли- да ростстимулирующего в нормальных условиях и защитного эффектов при действии засухи на растениях пшеницы различающихся по засухоустойчивости сортов Омская 35 и Салават Юлаев (Shakirova et al., 2016b), что подтверждается в других исследованиях (Divi et al., 2016; Planas-Riverola et al., 2019), и находит отражение в способности этого фитогормона оказывать влияние на протеом растений. Методом двумерного электрофореза в диапазоне рН 3 – 10 было установлено свыше ста растворимых белков в побегах проростков на электрофореграммах контрольных и предобработанных ЭБ вариантах обоих сортов (рис. 5). В то же время с помощью анализа интенсивности окраски белковых пятен 16

выявлено, что предварительная обработка фитогормоном привела к увеличению количества белков в широком спектре молекулярных масс и изоэлектрических точек у обоих сортов (рис. 6). Вероятно, наблюдаемая ЭБ-индуцированная стимуляция роста побегов обоих сортов (Shakirova et al., 2016 b) зависит от изменения содержания ряда белков, поэтому было необходимо выяснить, какие именно белки принимают участие в ответ на обработку фитогормоном. В этой связи методом матричной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) были идентифицированы белки, наиболее отзывчивые на обработку эпибрассинолидом.
Среди идентифицированных полипептидов особый интерес представляют белки фотосинтеза (NoNo 1-9), а также белки, принимающие участие в процессе роста (актин (No 21), субъединицы тубулина (No 22 и 23), белок CDC48 (No 24)).
Среди белков, участвующих в энергетическом обмене растений, обнаружены субъединицы АТФ-синтазы (No 11–13), протеинкиназы семейства SHAGGY (No 14), хлоропластный рибонуклеопротеин (No 15) и фермент глутамин синтетаза (No 16).
К настоящему времени весьма немногочисленны данные о белках растений, вовлеченных в реализацию физиологического действия БС. Так, в растениях арабидопсиса при проведении протеомного исследования выявлены чувствительные к обработке брассиностероидами полипептиды, задействованные в фотосинтезе, энергетическом обмене, сигналинге и принимающие участие в изменениях цитоскелета и биосинтезе гормонов, а также витаминов (Deng et al., 2007). Исследованиями последних лет идентифицированы белки, участвующие в регуляции БС прорастания семян риса, причем 10% входящих в их состав полипептидов проявляли повышенную чувствительность к действию этих гормонов (Li et al., 2016). Наряду с этим, были выявлены белки, задействованные в регуляции роста первичных корней пшеницы, в их числе два полипептида, участвующих в биосинтезе БС (Li et al., 2019).
Рис. 5. Влияние ЭБ на разделение растворимых полипептидов побегов 4-суточных проростков пшеницы сортов Салават Юлаев (а – контроль, б – 0.4 мкМ ЭБ) и Омская 35 (в – контроль, г – 0.4 мкМ ЭБ) при помощи 2DE. Идентифицированные белки пронумерованы. Расшифровка нумерации белков, участвующих в фотосинтезе (1- малая субъединица рибулозобисфосфат карбоксилазы (РБФК); 2 – большая субъедини- ца РБФК; 3 и 4 – предшественник белка 1 и 2, соответственно, входящих в состав кислород-выделяющего комплекса фотосистемы II; 5 – хлоропластная фруктозо- бисфосфат альдолаза; 6 – субъединица хлоропластного РБФК-связывающего белка; 7 – активаза РБФК; 8 – фосфоглицерат киназа; 9 – предшественник белка 2, входящего в состав кислород-выделяющего комплекса фотосистемы II), энергетическом обмене (11 – β-субъединица митохондриальной АТФ синтазы; 12 – предшественник митохондриальной АТФ синтазы; 13 – d-субъединица митохондриальной АТФ синтазы; 14 – протеинкиназа семейства SHAGGY; 15 – хлоропластный рибонуклеопротеин 31 kDa; 16 – изоформа хлоропластной глутамин синтетазы), росте растений (21 – актин 1; 22 – α-тубулин; 23 – β-тубулин; 24 – белок группы CDC 48), защите растений (31 – хлоропластный 2-цис-пероксиредоксин; 32 – хлоропластный 20 kDa шаперонин; 33 – хлоропластный 20 kDa шаперонин; 34 – полипептид семейства PINB-2v2-2; 35 – глутатион-S-трансфераза; 36 – белок 1 теплового шока 16.9 kDa класса I; 37 – L-аскорбат пероксидаза 1).
В пользу роли ЭБ в защите растений от стресса также свидетельствуют данные о повышении в обработанных фитогормоном растениях содержания защитных белков, а именно, хлоропластного 2-цис-пероксиредоксина (31), хлоропластного 20 kDa шаперонина (32); глутатион-S-трансферазы (35), белка 1 теплового шока (36), L-аскорбат пероксидазы (37), что ярко проявлялось у растений сорта Омская 35 (рис. 6).
Рис. 6. Влияние ЭБ на содержание белков в проростках растений двух сортов, выраженное как соотношение окрашивания соответствующих им пятен по отношению к их окрашиванию в контроле. Расшифровка нумерации белков приведена на рис. 5. Результаты оценки содержания белков по интенсивности окрашивания соответствующих пятен для контрольных и обработанных ЭБ растений отдельно приведены в диссертации.
Таким образом, в проведенных нами экспериментах выявлено стимулирующее влияние БС на протеом побегов проростков пшеницы, которое характеризуется повышением уровня белков, задействованных в процессах фотосинтеза, роста и энергетического обмена растений, что в дальнейшем будет отражаться в реализации ростстимулирующего действия данного фитогормона на проростки пшеницы.
Исследование влияния 24-эпибрассинолида на спектр растворимых белков растений пшеницы в условиях засухи
Влияние маннита вызвало значительные модификации по отношению к количественным и качественным характеристикам в белковом спектре проростков обоих сортов пшеницы (рис. 7 и 8).
Воздействие засухи на проростки приводило к снижению содержания большого количества белков. Некоторые белки «исчезали» из хроматограммы, поскольку их содержание уменьшалось ниже пределов чувствительности метода. У проростков обоих сортов «исчезали» белки фотосинтеза No 2, 6, 7, и 8, а также снижался уровень белков No 1, 4 и 9 (рис. 7). В случае белков, участвующих в росте и энергетическом обмене, зарегистрировано «исчезновение» No 12, 21 и 23, а также снижение уровня No 11 (у Салавата Юлаева), No 13 и 15 (у Омской 35) (рис. 7). Представляет интерес то, что уровень белков No 31-37, участвующих в защите растений, изменялся под влиянием маннита в меньшей степени.
Рис. 7. Разделение растворимых полипептидов побегов 5-суточных проростков пшеницы сортов Салават Юлаев (а, б) и Омская 35 (в, г) и при помощи 2 DE в условиях обработки маннитом. а, в – необработанные ЭБ проростки; б, г – 0.4 мкМ ЭБ. 3- суточные проростки инкубировали в течение 24 ч на среде, содержащей 0.4 мкМ ЭБ, и затем подвергали воздействию 5% маннита в течение 24 ч. Идентифицированные белки пронумерованы. Расшифровка нумерации белков приведена под рисунком 5.
Поскольку предпосевная обработка ЭБ оказывала влияние в виде антистрессового эффекта на ростовые процессы растений пшеницы при воздействии засухи (Shakirova et al., 2016b), возможна активация ЭБ адаптационного потенциала протеома к стрессам. Это подтверждается данными о предотвращении при использовании этого гормона стресс-индуцированного понижения уровня белков, принимающих участие в фотосинтезе, росте и энергетическом обмене растений (рис. 7 и 8). У проростков сорта Салават Юлаев уровень белков в среднем повысился до 96 % по сравнению с контролем, а у растений сорта Омская 35 был в среднем на 36 % выше, чем в контроле.
Совокупность полученных в работе данных подтверждает эффективность предварительной обработки 24-эпибрассинолидом семян для повышения устойчи- вости контрастных по чувствительности к засухе сортов пшеницы к условиям обезвоживания и указывает на важную роль ЭБ в адаптации протеома растений
пшеницы к неблагоприятному действию стресса.
2,5 2 1,5 1 0,5 0
а
Салават Юлаев Омская 35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11121314152122232431323334353637
2,5 2 1,5 1 0,5 0
б
Салават Юлаев Омская 35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11121314152122232431323334353637
Рис. 8. Влияние маннита (а) и его сочетания с ЭБ (б) на содержание белков в проростках растений двух сортов, выраженное как соотношение окрашивания соответствующих им пятен по отношению к их окрашиванию в контроле. Расшифровка нумерации белков приведена под рисунком 5. Результаты оценки содержания белков по интенсивности окрашивания соответствующих им пятен на фоне действия маннита для обработанных и необработанных ЭБ растений отдельно приведены в диссертации.
Таким образом, эпибрассинолид задействован в регуляции активации белкового метаболизма, который лежит в основе проявления его рост- стимулирующего и формирования предадаптирующего, а также протекторного эффектов на проростки пшеницы обоих сортов, что показано в устранении значительных стресс-индуцированных изменений в протеоме ЭБ-предобработанных растений сортов Омская 35 и Салават Юлаев.
ВЫВОДЫ
1. Предпосевная обработка ЭБ способствовала стимуляции роста растений пшеницы двух контрастных по чувствительности к засухе сортов – Салават Юлаев (чувствительный сорт), Омская 35 (устойчивый сорт). Ростстимулирующее действие ярче выражено у растений устойчивого сорта Омская 35.
2. Предобработка ЭБ снижала негативное действие обезвоживания на рост растений пшеницы обоих сортов, о чем судили по показателям биомассы, митотическому индексу корней и внешнему виду проростков. При этом негативное действие стресса сильнее проявлялось в растениях сорта Салават Юлаев, тогда как защитный эффект ЭБ – в проростках сорта Омская 35.
3. Предобработка ЭБ способствовала поддержанию целостности мембранных клеточных структур в растениях пшеницы обоих сортов, особенно сорта Омская 35,
подвергнутых обезвоживанию, о чем судили по накоплению в них МДА и выходу электролитов из тканей.
4. Защитный эффект ЭБ связан с его влиянием на состояние гормональной системы растений пшеницы обоих сортов в условиях обезвоживания, о чем свидетельствуют данные о снижении под влиянием ЭБ-обработки стресс-индуци- рованного накопления АБК и падения ИУК, а также поддержании цитокининов на уровне, близком к контролю, особенно у проростков сорта Омская 35.
5. Собственный вклад в проявление защитного действия ЭБ на растения пшеницы вносят дегидрины, о чем свидетельствуют данные о накоплении этих белков в предобработанных и необработанных ЭБ и подвергнутых обезвоживанию проростках двух исследованных сортов.
6. Ростстимулирующее и защитное действие ЭБ на растения обоих сортов в норме и при обезвоживании связано с его способностью оказывать влияние на состояние протеома, которое проявляется в индукции накопления отдельных групп белков. Среди них были идентифицированы белки, связанные с ростом и развитием, фотосинтезом, а также защитные белки.