Влияние этилена на пролиферацию культивируемых клеток Arabidopsis thaliana

Обзор литературы включает информацию по пролиферации клеток высших
растений и её регуляции, влиянию на неё внешних факторов, фитогормонов, биосинтезу этилена и его сигнальному пути, по культивированию клеток высших
растений in vitro и изучению пролиферации в клеточных культурах, эффектам этилена на клетки растений in vitro.
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты. Объектами исследования служили суспензионные культуры клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. четырёх генотипов: дикого типа (экотип Columbia, Col-0) и мутантов etr1-1, ctr1-1, ein2-1. Семена были получены из Nottingham Arabidopsis Stock Centre: Col-0 [N1092], etr1-1 [N237], ctr1-1 [N8057], ein2-1 [N3071]. Для получения каллуса использовали сформировавшиеся листья стерильно выращенных четырехнедельных растений. Отбирали наиболее рыхлые участки каллуса и переносили в жидкую питательную среду SH (Schenk, Hildebrandt, 1972). Суспензионные культуры клеток выращивали в 50 мл среды SH с 3% сахарозы, 1 мг/л 2,4-Д и 0.1 мг/л кинетина в стеклянных колбах объемом 250 мл, закрытых алюминиевой фольгой и крафт-бумагой, в темноте при температуре 26°С на орбитальном шейкере (100 качаний/мин). Также использовали суспензионные культуры клеток из Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших
растений (ВКККВР ИФР РАН).
2.2. Исследование ростовых характеристик. В течение субкультивирования
периодически отбирали по три колбы, в которых определяли сырую массу клеток, их число и размеры, после высушивания при 37°С в течение 3 суток — сухой вес. Число клеток оценивали по числу протопластов, которые выделяли по ранее опубликованной методике (Носов et al., 2014). Число протопластов подсчитывали в камере Фукса-Розенталя. Жизнеспособность оценивали по числу клеток, неокрашенных 0.02% водным раствором Erythrosin B (“Sigma-Aldrich”, США).
2.3. Цитофотометрическое определение количества ядерной ДНК. Клетки фиксировали смесью ледяной уксусной кислоты с 96% этанолом (1 : 3). При окрашивании материала придерживались стандартного протокола, (Greilhuber, 2005), используя холодный гидролиз (1 ч в 5М HCl при 20oC) и окраску реактивом Шиффа (Filkuka, Kleinwächter, 1981) в течение 1.5 ч при 20oC. Цитофотометрический анализ проводили по протоколу (Zoriniants et al., 2003) двухволновым методом. Для обработки результатов использовали алгоритма, предложенный А.В.Носовым с соавт. (Nosov et al., 1983).
2.4. Выявление клеток, находящихся в S-фазе митотического цикла
проводили по модифицированной методике Kotogány с соавт. (Kotogány et al., 2010) с использованием аналога тимидина — 5-этинил-2′-дезоксиуридина (EdU). Включение EdU выявляли при помощи клик-реакции азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемой Cu(I) с азидом Alexa Fluor 488 с модификациями, которые значительно улучшили воспроизводимость метода (Носов et al., 2014).
2.6. Получение этилена, определение содержания этилена, двуокиси углерода и кислорода проводили согласно методам, описанным ранее (Ракитин, Ракитин, 1986). Этилен получали при разложении 2-хлорэтилфосфоновой кислоты в щелочных условиях; 1-метилциклопропен (1-MCP) получали по методу Sisler и Serek (1997) в реакции фениллития с 3-хлор-2-метилпропеном. Концентрацию 1-MCP и этилена определяли в газовом хроматографе Цвет 106 (Россия) с пламенно- ионизационным детектором с предварительным концентрированием углеводородов.
2.7. Оценка скорости образования этилена. Отбирали по 3–5 мл суспензии клеток и переносили в стеклянные 15-миллилитровые флаконы. Флаконы помещали в термостатируемые условия (26°С) на качалку (100 качаний/мин) на 10 мин для проветривания, затем герметично закрывали пробками из самоуплотняющейся резины (Suba-Seal septa red rubber, “Sigma-Aldrich”) и инкубировали 0.5–1.0 ч при температуре 26°C на шейкере в темноте. Так же поступали с флаконами со средой без клеток, газовую фазу которых использовали в качестве контроля на содержание этилена в воздухе.
2.8. Культивирование клеток с экзогенным этиленом и 1-MCP. Суспензии выращивали в 100-миллилитровых колбах Эрленмейера с 25 мл среды SH, колбы закрывали одним слоем стерильной плотной хроматографической бумаги, помещали на столик из органического стекла, закрывали 20-литровым газовым колоколом и герметизировали. Через тюбинг, присоединенный к выходящему из столика штуцеру, в колокола вводили следующие газы: 1-MCP (100 нл/л); этилен (20 мкл/л или 100 мкл/л); смесь 1-MCP (100 нл/л) с этиленом (20 мкл/л). Контрольный колокол содержал воздух. Всю конструкцию помещали на орбитальный шейкер (26°C, темнота, 100 качаний/мин). Проветривание и замену газов (1-MCP и этилена) проводили каждые четверо суток культивирования.
2.9. Культивирование клеток в условиях гипоксии. Гипоксию обеспечивали, культивируя клетки в стерильных сосудах, закрытых фильтровальной бумагой, помещённых в герметично закрытые пластиковые контейнеры, газовая фаза которых содержала 5% кислорода и 95% азота. Альтернативно, клетки инкубировали в герметично закрытых сосудах, газовая фаза которых содержала 5% кислорода и 95% азота. В конце вторых суток, сосуды открывали, продували стерильным воздухом и стерильно закрывали фольгой.
2.12. Электрофорез белков в денатурирующих условиях — в ДДС-Na-ПААГ, проводили в 12.5 или 15% гелях по (Laemmli, 1970) в аппарате Mini-PROTEAN 3 (“Bio-Rad”). Вырезанные из гелей полипептиды идентифицировали при помощи MALDI-TOF MS в центре «Постгеномных и нанотехнологических инноваций» ГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА.
2.13. Определение активности ферментов глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы. Клетки гомогенизировали в жидком азоте и экстрагировали в 50 мМ глицин-фосфатном буфере, pH 9.0; 1 мМ ЭДТА; 4 мМ цистеина; 1 мМ фенилметилсульфонил фторида; 2 мМ Тетрамизол гидрохлорида; 10 мМ дитиоэритритола. Гомогенат центрифугировали при 16 000×g, проводили замену буфера и удаление низкомолекулярных соединений на колонках PD-10 (Merck), концентрацию белка определяли бицинхониновым реагентом (BCA Kit, Merck). Реакционная смесь содержала: 50 мМ глицин-фосфатный буфер pH 9.0; 1 мМ ЭДТА; 10 мкг белка; 1 мМ НАД; 1 мМ глицеральдегид-3-фосфата (G-3-P). В случае алкогольдегидрогеназы вместо G-3-P добавляли 50 мМ этанола. Активность определяли по накоплению НАД•Н (340 нм) на линейном участке кинетической кривой (первые 10–15 с) с помощью спектрофотометра UV-2700 (Shimadzu), используя молярный коэффициент экстинкции ε = 6230×10–6 л × мкмоль–1 × см–1.
2.14. Вестерн блоттинг GAPC2. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (45 мкм, Hybond-C Extra) в системе быстрого блоттинга Trans-Blot Turbo (Bio-Rad), мембрану блокировали 2 ч в буфере 10 мМ Трис-НСl рН 7.6; 0.05% Твин 20; 150 мМ NaCl; 1% желатин из кожи холодноводных рыб (Sigma), инкубировали 18 ч при 4°С c кроличьими Ig против белка GAPC2 (Agrisera) в разведении 1:1000 и затем 1.5 ч при 25°С с антителами против Ig кролика, меченными пероксидазой хрена (разведение 1:10000). Визуализацию сигнала проводили с ECL
Kit (Bio-Rad). Сигнал детектировали в системе ChemiDoc MP (Bio-Rad) в режиме Chemi Hi Sensitivity в течение 0.5–2 с.
2.16. Обработка данных и представление результатов. Обработку данных проводили при помощи программ Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, США), SigmaPlot (SYSTAT Software Inc., США). На графиках представлены средние арифметические значения биологических повторностей и их стандартные отклонения.
Глава 3. Результаты и обсуждение
Интенсивность роста суспензионных культур клеток и продукция этилена.
В наших экспериментах все использованные штаммы суспензионных культур клеток в процессе субкультивирования выделяли этилен, который накапливался в газовой фазе колб. Отметим, что содержание этилена было на 1–3 порядка выше, чем в воздухе (содержание этилена в воздухе — 5 нл/л.) и значительно варьировало для разных культур клеток, и очевидно должно зависеть от его продукции культивируемыми клетками, от плотности закрывания колб, количества биомассы, объема среды и её состава. Поэтому более корректным будет рассматривать связь продукции этилена клетками и удельной скорости роста. При этом правильнее использовать не максимальную удельную скорость, а локальную, относящуюся к моменту определения продукции этилена. Продукцию этилена также необходимо выражать в расчете на единицу сухого веса, поскольку культуры различаются по содержанию воды. Данные показали, что вне зависимости от штамма клеток наблюдается существенная корреляция между продукцией этилена и удельной скоростью увеличения сухого веса (Рис. 1).
Характеристика суспензионных культур клеток Arabidopsis thaliana. Для более детального анализа была выбрана быстро растущая гетеротрофная суспензионная культура клеток A.thaliana штамма Col-0 и впервые полученные суспензионные культуры клеток из растений A. thaliana, имеющих мутацию в генах: рецептора этилена, ETR1 (мутант etr1-1); негативного регулятора этиленового сигналинга, Raf-подобной киназы, CTR1 (мутант ctr1-1); позитивного регулятора этиленового сигналинга, EIN2 (мутант ein2-1). Стабилизация параметров роста суспензионных культур клеток A. thaliana, используемых в нашей работе проходила первые 1.5 года культивирования: постепенно уменьшался размер клеточных
агрегатов, увеличивалась скорость роста. После чего культуры клеток демонстрировали стабильные ростовые характеристики и цитоморфологию.
Кривые роста (Рис. 2) имели форму, характерную для многих культивируемых клеток, за десятидневный период субкультивирования суспензия клеток дикого типа завершает цикл роста, так же, как и суспензии etr1-1 и ein2-1, а ctr1-1 характеризуется наиболее медленным ростом.
Известно, что клетки всех тканей растений, в том числе и A.thaliana, миксоплоидны (Barow, Meister, 2003). Для клеток in vitro миксоплоидия — также широко распространенное явление. В связи с этим было проанализировано влияние продолжительного культивирования, в том числе и этилена, продуцируемого клетками и, неизбежно, накапливающегося в культуральных сосудах, на распределение клеток по количеству ядерной ДНК. Цитофотометрический анализ
Рис.1. Зависимость между удельной скоростью роста сухого веса и продукцией этилена для суспензионных культур клеток. 1 — Panax ginseng, 2 — Euonymus maximoviczianus, 3 — Beta vulgaris, 4 — Medicago sativa, 5 — Triticum timopheevii, 6 — Ajuga turkestanica, 7 — Arabidopsis thaliana (миксотрофный штамм), 8 — A. thaliana (гетеротрофный штамм). Абсцисса представлена в логарифмическом масштабе.
Рис. 2. Кривые роста суспензионных культур A. thaliana. Ордината представлена в логарифмическом масштабе.
культур клеток Col-0, etr1-1, ctr1-1 и ein2-1 проводили через два года с момента их получения. Для первых трёх культур (полученных на три года раньше, чем ein2-1) цитофотометрию проводили дополнительно спустя 6 лет, а для клеток ein2-1 применяли проточную цитометрию спустя 4 года её роста in vitro (Рис. 3).
Представленные данные показывают (Рис.3), что все культуры были миксоплоидны. Учитывая, что полученные данные представляют собой «моментальные срезы ситуации» в субкультивированиях, разделенных значительным интервалом времени, можно уверенно говорить о стабильности распределения ядер по количеству ДНК в клетках суспензионных культур и об отсутствии существенного влияния условий in vitro на спектр плоидности культур клеток Arabidopsis thaliana.
Соотношение пролиферативной активности и продукции этилена в суспензионной культуре клеток Col-0. Как уже отмечалось, культура клеток Col-0 производит много этилена. Сразу же после инокуляции клеток в свежую питательную среду, резко активировалась продукция этилена (Рис. 4, кривая 1), потом она снижалась, возрастала в первые сутки и достигала максимума в середине логарифмической фазы роста (72 ч). Важно отметить, что с момента начала логарифмической фазы (48 ч) и далее по циклу выращивания совпадали максимумы и общий ход кривых, отражающих динамику продукции этилена, доли S-фазных клеток и удельной скорости увеличения числа клеток (Рис. 4, кривые 1–3).
Первый пик S-фазных клеток, сравнимый с пиком на 72 ч, приходился на первые сутки. Этот пик отражает хорошо известный феномен частичной синхронизации КЦ в начале субкультивирования, когда клетки получают новую порцию углеводов, нитратов и фосфатов. Факт совпадения первого пика S-фазных клеток с подъемом
Рис. 3. Анализ количества ядерной ДНК в суспензионных культурах клеток A. thaliana. Для суспензии клеток ein2-1 спустя 4 года культивирования использовали проточную цитометрию (*).
продукции этилена в точке 24 ч, может указывать на участие этилена в реализации событий частичной синхронизации КЦ. Исходя из максимальной удельной скорости увеличения числа клеток (μmax = 0.048 ч–1), время их удвоения (Td) равно 14.4 ч. Такая продолжительность Td меньше продолжительности КЦ в меристеме корня Arabidopsis (16–18 ч) (Yin et al., 2014; Филин, Иванов, 2016). Иными словами, клетки себя чувствуют «комфортно» и большая концентрация этилена не тормозит КЦ.
Рис. 4. Динамика продукции этилена (1), количества S- фазных клеток (2) и удельной скорости роста числа клеток (3) в цикле выращивания суспензионной культуры клеток штамма Col-0.
Рис.5. Зависимость между удельной скоростью роста числа клеток и продукцией этилена в суспензионной культуре клеток штамма Col-0. (а) — удельная скорость роста числа клеток рассчитана для 12-часового интервала после точки определения продукции этилена; (б) — удельная скорость роста числа клеток рассчитана для 12-часового интервала, предваряющего точку определения продукции этилена.
Если предположить, что этилен является триггером, а не следствием пролиферации клеток, то при построении графика в координатах продукция этилена против удельной скорости роста числа клеток последний параметр следует вычислять для 12-часового интервала после точки определения продукции этилена. В таком случае корреляция между выделением этилена и удельной скоростью роста числа клеток весьма высока (Рис. 5, а). Если значение μ вычислять для 12-часового отрезка
времени, предваряющего точку определения продукции этилена, то подобной корреляции уже не наблюдается (Рис. 5, б). Это косвенно говорит о том, что синтез этилена предшествует пролиферации клеток (Фоменков с соавт., 2015).
Влияние экзогенного этилена и 1-MCP на суспензионную культуру клеток Col-0. В предварительных экспериментах было показано, что в используемых нами системах инкубации суспензионных культур в атмосфере экзогенного этилена (газовые колокола и герметичные контейнеры) концентрация этилена падает не более чем на 10–15% за время эксперимента, а культивируемые клетки сохраняют высокую жизнеспособность даже при очень высоких концентрациях этилена, превосходящих физиологические на 2–3 порядка. В связи с этим была выбрана концентрация этилена близкая к его концентрации в газовой фазе колб (~20 мкл/л), а концентрация 1-MCP, ингибитора связывания этилена с его рецепторами – 100 нл/л, поскольку 1-MCP в концентрации 50–100 нл/л блокирует эффекты этилена до 20 мкл/л (Sisler, Serek, 1997).
Как уже отмечалось, в начале цикла выращивания после всплеска продукции этилена в первый час культивирования наблюдали её быстрый спад (Рис. 6). При этом к 4 ч начинало увеличиваться количество S-фазных клеток. Причиной активации выделения этилена могут быть как физические манипуляции с клетками («пипетирование» при пересадке), так и смена среды, приводящая к изменению pH, осмолярности и ионного состава. Известно, что в ответ на механическое повреждение в растениях в течение нескольких минут увеличивается синтез этилена (Konze, Kwiatkowski, 1981). В случае с суспензией клеток A. thaliana такой кратковременный, но высокий уровень этилена может быть сигналом к переходу клеток из G1-фазы КЦ в S-фазу.
Рис. 6. Продукция этилена и количество S-фазных клеток в первые часы после инокуляции клеток штамма Col-0 в свежую питательную среду. 1 — продукция этилена; 2 — количество S- фазных клеток в контрольном варианте (воздух); 3 — количество S-фазных клеток после предобработки инокулята этиленом (100 мкл/л) в течение 5 ч и дальнейшего культивирования в атмосфере со 100 мкл/л этилена.
Если предположить, что этилен является одним из факторов, участвующих в регуляции перехода клеток из G1-фазы КЦ в S-фазу и необходим для поддержания их активной пролиферации, тогда вероятно, что эти процессы можно стимулировать при помощи экзогенного этилена. После предобработки 10-дневных клеток этиленом в концентрации 100 мкл/л в течение 5 ч их инокулировали в свежую среду и культивировали в атмосфере с той же концентрацией этилена.
Рис. 7. Влияние экзогенного этилена на количество S-фазных клеток в зависимости от момента обработки штамма Col-0 в течение цикла выращивания. 1 — предобработка клеток за 5 ч до инокуляции, анализ через 3 ч после инокуляции; 2 — культивирование в газовой среде с этиленом в течение 24 ч после инокуляции; 3 — культивирование в газовой среде с этиленом в течение 96 ч после инокуляции; 4 — начало культивирования в газовой среде с этиленом через 24 ч после инокуляции, анализ через 72 ч; 5 — начало культивирования в газовой среде с этиленом через 96 ч после инокуляции, анализ через 120 ч; 6 – начало культивирования в газовой среде с этиленом через 120 ч после инокуляции, анализ через 216 ч. Стрелка вверх — время начала инкубации в газовой среде с этиленом. Стрелка вниз — время фиксации для анализа количества S-фазных клеток. Черная колонка — контрольный вариант; серая колонка — процент к контролю.
В результате через три часа количество S-фазных клеток было в два раза больше по сравнению с клетками, которые культивировали в воздухе (Рис. 6, колонка 3; Рис. 7, вариант 1). Если начинали культивирование суспензии клеток в газовой среде с 20 мкл/л или 100 мкл/л этилена сразу после инокуляции, то ни на 1-е, ни на 4-е
сутки эффекта не наблюдали (Рис. 7, варианты 2, 3). Аналогичный результат получили при действии 100 мкл/л этилена с первых по третьи сутки (Рис. 7, вариант 4). Небольшое увеличение количества S-фазных клеток наблюдали при их культивировании в атмосфере со 100 мкл/л этилена в течение 24 ч, начиная с четвёртых суток (Рис. 7, вариант 5). Если культуру клеток подвергали действию этилена, начиная с пятых суток (Рис. 7, вариант 6), то на девятые сутки индекс S-фазных клеток значительно увеличивался.
Следует отметить, что этилен, продукция которого индуцируется во время инокуляции клеток в свежую питательную среду, возможно, занимает все «посадочные» места на рецепторах, и «отвечать» на дополнительный сигнал в данный момент «некому». Если сравнить кривую 1 на Рис. 4 и Рис. 7, то можно предположить, что экзогенный этилен эффективен тогда, когда продукция эндогенного этилена мала. В отличие от 1-MCP, этилен не снижал жизнеспособность культуры клеток, более того, культивирование клеток с этиленом в течение всего цикла выращивания приводило к повышению индекса роста, а действие 1-MCP — к снижению (Фоменков с соавт., 2014). Отметим, что влияние 1-MCP — ингибитора связывания этилена с рецепторами на экспрессию митотических циклинов CYCB1;1 и CYCA2;3 (Рис. 8, в) подтверждает его негативное влияние на рост суспензии клеток Col-0. Таким образом, есть основания считать, что этилен является активным участником регуляции пролиферации культивируемых клеток Col-0.
Влияние экзогенного этилена и 1-MCP на суспензионные культуры клеток etr1-1 и ctr1-1. Жизнеспособность клеток etr1-1 под действием 1-MCP значительно снижалась на четвертые сутки (Рис. 8, а) Этилен, в отличие от 1-МСР, повышал жизнеспособность культивируемых клеток мутанта etr1-1. Аналогичным образом и 1-МСР, и этилен влияли на индекс роста etr1-1, что подтверждает экспрессия митотических циклинов (Рис. 8, в). Смесь 1-МСР с этиленом по своему действию на рост и жизнеспособность культуры занимала промежуточное положение. На клетки мутанта ctr1-1, отличающегося значительно более медленным ростом, обработки не влияли сколько-нибудь значимым образом (Рис. 8, б).
В культуре клеток etr1-1 этилен значительно увеличивал количество S-фазных клеток в начале пассажа. Аналогичная картина сохранялась и в конце пассажа (Рис. 9). Ингибитор связывания этилена с его рецепторами (1-МСР) действовал противоположным образом. Данные о количестве S-фазных клеток во всех экспериментальных вариантах хорошо соотносились с индексами роста культуры etr1-1 (Рис. 9). Отдельно следует отметить, что, несмотря на то, что во всех экспериментальных условиях индекс роста ctr1-1 достоверно не изменяется, но в присутствии МСР, хотя и с большой ошибкой, увеличивается количество S-фазных клеток (Рис. 9). Это может говорить о том, что существуют «альтернативные» пути передачи сигнала в обход CTR1.
Представленные в настоящей работе результаты показывают, что культура клеток etr1-1 способна в течение длительного времени сохранять рост и пролиферацию in vitro, это указывает, что за контроль пролиферации клеток скорее всего отвечает не ETR1, а другие рецепторы этилена, тем более, что в литературе активно обсуждается вопрос о том, что рецепторы этилена могут обладать
Рис. 8. Жизнеспособность и индексы роста клеток штаммов etr1-1 (а) и ctr1-1 (б) после культивирования в газовых колоколах, содержащих воздух, 20 мкл/л этилена, 100 нл/л 1-MCP, либо смесь 20 мкл/л этилена и 100 нл/л 1-MCP. (в) Экспрессия генов CYCB1;1 и CYCA2;3 во всех использованных в работе штаммах суспензионных культур клеток A. thaliana после культивирования в газовых колоколах, содержащих воздух или 100 нл/л 1-MCP.
индивидуальными неперекрывающимися свойствами, необходимыми для возникновения специфического ответа на фитогормон (Shakeel et al., 2013).
Влияние экзогенного этилена и 1-MCP на суспензионную культуру клеток ein2-1. В проведении сигнала этилена его рецепторы и белок CTR1 играют роль негативных регуляторов, и при действии этилена они перестают работать на элиминацию EIN2, путём его фосфорилирования с последующим протеолизом. Но в случае нефункциональности позитивного регулятора EIN2 (например, в результате мутаций, таких как ein2-1) сигнал этилена пройти дальше не может, как следует из канонического пути проведения сигнала этилена. Суспензионная культура клеток ein2-1 получена в 2009 г. и прекрасно растёт. На графиках (Рис. 10) видно, что максимум количества S-фазных клеток совпадает с логарифмической фазой роста обеих культур.
При этом у культуры Col-0 S-фазный индекс имеет два пика, которые совпадают с интенсивностью выделения этилена. В культуре ein2-1 присутствует лишь один пик и выделение этилена ему соответствует. Особо на себя обращает тот факт, что при незначительной разнице в скорости роста этих двух культур (Рис. 10) интенсивность выделения этилена отличается примерно в 40 раз. Поскольку известно, что ауксины активируют синтез этилена, то встал вопрос о том, не связана ли эта разница с нарушением восприятия ауксина. Для этого был проверен эффект 2,4-Д на стимуляцию синтеза этилена отделёнными листьями растений Col-0 и ein2-1.
Рис. 9. Изменение количества S- фазных клеток и индексов роста культивируемых клеток A. thaliana etr1-1 и ctr1-1 на 4-е и 10-е сутки культивирования в газовых колоколах, содержащих воздух, 20 мкл/л этилена, 100нл/л 1-MCP, либо смесь 20 мкл/л этилена и 100 нл/л 1-MCP.
Обнаруженопрактически одинаковое стимулирование выделения этилена отделёнными листьями обоих генотипов.
В культуре клеток ein2-1 действие этилена и МСР и смеси этих газов, также как и для суспензии клеток Col-0 (см. Рис. 7), во многом определялось временем по кривой роста, когда применяли обработку экзогенными газами. В случае культуры клеток ein2-1, положительный эффект на индекс роста, жизнеспособность и количество S-фазных клеток оказывало их культивирование в смеси 20 мкл/л этилена и 100 нл/л 1-MCP. Если усреднить все отдельные эксперименты (6–8) по влиянию экзогенных газов, не учитывая время обработки по кривой роста, но учитывая стандартные отклонения в каждом конкретном эксперименте, что, безусловно, приводит к увеличению итоговой ошибки в значениях результирующего графика, то можно увидеть основные отличия между суспензиями Col-0 и ein2-1 (Рис. 11).
Рис. 10. Динамика продукции этилена, количества S-фазных клеток и роста числа клеток в цикле выращивания культур клеток A. thaliana дикого типа Col-0 и мутанта ein2-1.
Рис. 11. Изменение количества S-фазных клеток в культурах Col-0 (а) и ein2-1 (б) при культивирования в газовых колоколах, содержащих воздух, 20мкл/л этилена, 100 нл/л 1- MCP, либо смесь 20 мкл/л этилена и 100 нл/л 1-MCP. Объединённый график для 6–8 независимых экспериментов.
Как видно, позитивный эффект на увеличение доли S-фазных клеток, а следовательно и стимуляцию КЦ, в случае суспензии клеток Col-0 имеет этилен, а негативный эффект имеет 1-MCP и его смесь с этиленом (Рис. 11, а). Клетки ein2-1 позитивно реагируют на смесь 1-MCP с этиленом, а негативно на 1-MCP (Рис. 11, б). Это означает, что для стимуляции или поддержания пролиферации необходимо восприятие сигнала этилена рецепторами (ингибирование 1-MCP), но дальнейшее проведение сигнала, как в случае ein2-1 идёт не через EIN2, а по альтернативному пути/путям, которые «отъюстированы» под определённый уровень исходящего от рецепторов сигнала (эффект смеси этилена и 1-MCP).
Проявление повышенной чувствительности к недостатку кислорода культивируемых клеток ein2-1, биохимическая адаптация на уровне гликолиза. В условиях суспензионной культуры клетки испытывают своего рода постоянное «затопление», важнейшим следствием которого является гипоксия. Если условия гипоксии усилить, задавая в герметично закрытые сосуды 5% кислорода и культивируя клетки двое суток, то различия в ответе клеток разных генотипов выглядит весьма наглядно. В течение первых суток при падении содержания кислорода до полутора процентов жизнеспособность клеток менялась незначительно. На вторые сутки, когда уровень кислорода снижался примерно до 0.2%, жизнеспособность клеток ein2-1 резко падала. После открытия герметично закрытых сосудов после гипоксии и последующей инкубации в течение суток в полностью
Рис. 12. Количество живых клеток Col-0 и ein2-1 в норме и при действии гипоксии в течение 24 ч, 48 ч и после реоксигенации. Цифры над столбцами — процент O2 в момент определения жизнеспособности. Начальное содержание O2 при гипоксии — 5.7%. Без штриховки — сосуды, закрытые фольгой (контроль); со штриховкой — герметично закрытые сосуды (гипоксия).
открытом состоянии, жизнеспособность клеток ein2-1 ещё больше снижалась (Рис. 12).
Рис. 13 Экспрессия GAPC2 и активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГФДГ) в клетках Col-0 и ein2-1. (а) — активность ГФДГ в стандартных условиях (WT и ein2-1) и при выращивании клеток Col-0 в условиях гипоксии — WT(H), а клеток ein2-1 в условиях повышенной аэрации — ein2-1(N); (б) — относительный уровень экспрессии гена GAPC2; (в) — активность алкогольдегидрогеназы клеток при выше указанных условиях культивирования; (г) — количественное выражение детектированного антигена GAPC2 на иммуноблотах (д) растворимых белков клеток Col-0 (WT) и ein2-1.
Эти результаты совпадают с данными литературы по растениям с мутацией ein2-5, которые также не выдерживают реоксигенацию (Tsai et al., 2014). На электрофореграмме растворимых белков цитозоля клеток ein2-1 всегда присутствовала мажорная полоса, которой не было в препаратах из клеток Col-0 и из листьев обоих генотипов. Этот полипептид был идентифицирован с помощью MALDI-TOF MS как глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа цитозольной локализации, изоформа 2 (GAPC2, At1g13440). Важно отметить, что высокая экспрессия GAPC2 наблюдается и на уровне мРНК (Рис. 13, б). Следовательно, в клетках ein2-1 идёт активация гликолиза. Этот вывод также подтверждается на уровне активности фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и маркёрного фермента гипоксии — алкгольдегидрогенезы (Рис.13, а, в). При этом
сверхэкспрессия GAPC2 является адаптивным признаком, поскольку выращивание клеток Col-0 в условиях кислородного голодания приводит к появлению в них активности GAPC2 (Рис. 13, вариант WT(H)), и наоборот, выращивание клеток ein2-1 в условиях повышенной аэрации (Рис. 13, вариант ein2-1(N)) приводит к снижению активности GAPC2.
Очевидно, что наблюдается биохимическая адаптация клеток ein2-1 к жизни в «водной» среде, а значит к не оптимальным условиям снабжения кислородом — гипоксии, что заставило их опираться на гликолиз и на один из главных ферментов гликолиза, которым является GAPC2. Это должно приводить к избытку НАД∙Н и снижению pH цитозоля, что в свою очередь благоприятствует нитратредуктазе в деле производства NO, что подтверждается нашими данными (Novikova et al., 2017). Избыток NO может приводить к S-нитрозилированию молекулы метионинаденозилтрансферазы1, что приводит к ингибированию ферментативной активности и к снижению синтеза этилена (Lindermayr et al., 2006). Возможно, подобная ситуация наблюдается в клетках ein2-1.
Наконец, оказалось, что в клетках ein2-1 значительно повышен уровень экспрессия гена ERF1 (Рис. 14), фактора транскрипции, который является специфичным индикатором ранних ответов на этилен, подтверждающий работу конечных регуляторных компонентов этиленового сигналинга (Lorenzo, 2003).
Следовательно, для активной пролиферации клеток ein2-1 нужен сигнал этилена и он проводится альтернативным путём (минуя EIN2), в то время как за устойчивость к гипоксии отвечает канонический путь восприятия и проведения сигнала этилена.
Рис.14. Уровень транскриптов гена ERF1 на вторые сутки субкультивирования. Цифры под треками обозначают уровень транскриптов ERF1 относительно уровня транскриптов референс-гена UBQ10.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Активно делящиеся суспензионные культуры клеток — распространённый объект в исследовании КЦ (Nagata et al., 1992). Это определяется тем, что активная пролиферация – основа существования клеток in vitro и тем, что молекулярные события в делении клеток весьма консервативны. Что касается функций фитогормонов в регуляции КЦ растений, то, на наш взгляд, самым загадочным здесь является этилен с его часто противоположным влиянием на одни и те же процессы, в частности на пролиферацию клеток растений
В настоящей работе была сделана попытка выяснить каково влияние этилена на пролиферацию культивируемых клеток A.thalana. Использование суспензионных культур клеток дикого типа (экотип Col-0) и полученных из эксплантов растений с мутациями по гену рецептора этилена (аллель etr1-1) или по компонентам его сигнального пути (аллели ctr1-1 и ein2-1) позволило сделать следующее заключение.
Этилен мало влияет на жизнеспособность клеток дикого типа. Ингибитор связывания этилена с рецепторами — 1-MCP, пагубно влияет на жизнеспособность и пролиферацию клеток. Экзогенный этилен, при функционирующих путях восприятия и проведения его сигнала, действует на клетки только при низком эго эндогенном уровне. Жизнеспособность и пролиферативная активность клеток etr1-1 повышается при действии этилена, следовательно, при неработающем рецепторе ETR1 эти эффекты этилена указывают на функционирование в регуляции пролиферации других рецепторов, имеющих иные константы связывания с фитогормоном.
Эксперименты с культивируемыми клетками мутанта ein2-1 с дефектом в гене белка — единственного позитивного регулятора этиленового сигналинга (EIN2) показали, что для стимуляции или поддержания пролиферации необходимо восприятие сигнала этилена рецепторами (поскольку ингибирование рецепторов с помощью 1-MCP оказывает негативный эффект), но дальнейшее проведение сигнала, идёт не через EIN2, а по альтернативному пути/путям, которые «отъюстированы» под определённый уровень исходящего от рецепторов сигнала (эффект смеси этилена и 1- MCP). Наконец, исправно функционирующий путь этиленового сигналинга необходим для купирования эффектов гипоксии, часто возникающих при культивировании клеток в жидкой питательной среде.
ВЫВОДЫ
1. Для высокой пролиферативной активности и роста клеток in vitro необходимо нормальное функционирование этиленового сигнального пути.
2. Активная пролиферация клеток сопровождается интенсивным выделением этилена.
3. Повышение пролиферативной активности при неработающем рецепторе ETR1 в присутствии повышенной концентрации этилена, указывает на то, что за эту функцию отвечают другие рецепторы.
4. Положительное совместное действие этилена и 1-МСР на пролиферативную активность в культуре клеток ein2-1 указывает на то, что в проведении сигнала, отвечающего за пролиферацию, работают альтернативные пути, в обход EIN2, что подтверждается постоянным и достаточно высоким уровнем транскриптов ERF1.
5. Функционирование альтернативного пути передачи сигнала этилена при неработающем EIN2 требует баланса восприятия этилена его рецепторами, которое достигается при совместном воздействии этилена и 1-МСР, возможно за счёт разной аффинности рецепторов к лиганду.
6. Нормальное функционирование пути восприятия и передачи сигнала этилена необходимо для клеток in vitro для своевременного устранения эффектов гипоксии.