Влияние гидрофильных полимеров на архитектуру, стабильность и активность биокатализаторов, полученных путем инкапсулирования метилотрофных дрожжей в органосиликатные матрицы

Оценка количества Si-O-Si связей в органосиликатных матрицах различного состава с помощью ИК-спектроскопии
Синтез органосиликатных матриц из кремнийорганических соединений проводили в условиях основного катализа фторидом натрия при рН 7,6 и соотношении МТЭС и ТЭОС – 85/15 об. % (условия выбраны по результатам предыдущих исследований) в присутствии ПЭГ с молекулярными массами 1000, 2000, 3000, 4000 и 6000 Да. ИК спектроскопическое исследование проводили на ИК Фурье спектрометре ФМС 1201. ИК-спектры золь-гель систем получены на приставке МНПВО горизонтального типа в кювете из селенида кадмия (объем 1 мл), в режиме пропускания в диапазоне 500 – 4000 см-1 с разрешением 4,0 см-1. ИК- спектры всех образцов регистрировали через равный промежуток времени после начала синтеза (15 минут), что позволяет проводить сравнительный анализ количества силоксановых связей в образцах на этом этапе получения материалов. К этому времени после начала реакции в представленных условиях синтеза образуется большая часть силоксановых связей, что продемонстрировано в предыдущих исследованиях.
Количество образовавшихся связей Si-O-Si (n(Si-OSi)) рассчитывали по уравнениям (1-2):
(1); (2);
0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
0 1000 2000
Молекулярная масса ПЭГ, Да
3000 4000 5000 6000
Рисунок 1. Графическая зависимость отношения количества образовавшихся Si- O-Si связей от пространственной организации ПЭГ-М
взаимодействуют с кремнийорганическими соединениями, при этом не вызывают стерических затруднений для образования силоксановых связей, о чем свидетельствует их высокое содержание в органосиликатных матрицах на основе ПЭГ-1000 и ПЭГ-2000.
При использовании ПЭГ-3000 наблюдается наименьшее количество образовавшихся Si-O-Si связей. Это связано с трехмерной структурой ПЭГ, в которой кремнийорганические соединения находится в сетке зацепления полимера, что снижает степень их взаимодействия, и, соответственно, приводит к уменьшению степени конденсации. ПЭГ-4000 и ПЭГ-6000 формируют кластерную структуру в растворе, при которой минимизируется взаимодействие их с кремнийорганическими соединениями, что и приводит снова к увеличению количества образовавшихся Si-O-Si связей в матрицах.
В органосиликатных матрицах со структуроуправляющими агентами ПЭГ- 3000 или ПВС-78000 при разном соотношении исходных кремнийорганических соединений (МТЭС и ТЭОС) зависимости степени конденсации соединений кремния от содержания гидрофобной добавки МТЭС отличаются по виду (рисунок 2).
ПВС ПЭГ [-CH2-CH(OН)-]n HO-[CH2-CH2-O]n-H
АБ
0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
Рисунок 2. Количество образующихся Si-O-Si связей в образцах органосиликатного материала на основе МТЭС и ТЭОС в различном соотношении и гидрофильных полимеров: А – ПВС; Б – ПЭГ-3000
Зависимость количества силоксановых связей от молекулярной массы ПЭГ имеет явный экстремум: наименьшая
степень
кремнийорганических
наблюдается в органосиликатной матрице в присутствии ПЭГ-3000 (рисунок 1). Это можно объяснить способностью ПЭГ формировать различные, в зависимости от содержания и молекулярной массы, пространственные структуры в водных растворах. Так, низкомолекулярные ПЭГ из-за неспособности к формированию трехмерных структур в растворах представляют собой линейные молекулы, которые
поликонденсации соединений
0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
0 20 40 60 80 100 Количество МТЭС в системе, % об.
0 20 40 60 80 100 Количество МТЭС в системе, % об.
Количество Si-O-Si связей, ммоль
Количество Si-O-Si связей, ммоль
Количество Si-O-Si связей, ммоль

В органосиликатных матрицах в присутствии ПВС при увеличении содержания гидрофобной добавки МТЭС происходит постепенный рост количества Si-O-Si связей. Появление алкильного радикала в МТЭС способствует увеличению скорости гидролиза алкоксильных заместителей, что приводит к формированию не только сетчатой структуры органомодифицированного кремнезема, но и к образованию более гидрофобных олигомеров при взаимодействии МТЭС между собой и, как следствие, увеличению количества силоксановых связей в образцах, в целом. ПЭГ может взаимодействовать как с гидрофобными, так и с гидрофильными компонентами системы благодаря присутствию дополнительных метиленовых фрагментов в структуре в структуре (- СН2-СН2-O)n и не образует межмолекулярные водородные связи. В присутствии ПЭГ-3000 происходит более равномерное распределение алкоксисиланов в сетке зацепления полимера, чем в присутствии ПВС, и при содержании МТЭС 85 об.% уменьшается взаимодействие между кремнийорганическими компонентами системы за счет стерических ограничений (рисунок 2Б). Дальнейшее увеличение содержания гидрофобной добавки приводит к разделению фаз в системе и образованию олигомеров МТЭС. Таким образом, наличие гидрофобных метиленовых фрагментов в цепи ПЭГ-3000 играет важную роль в формировании структуры органосиликатных матриц: гидрофобные взаимодействия между ПЭГ и МТЭС приводят к образованию структуры с минимальным количеством Si-O-Si связей в матрице с содержанием МТЭС 85 об%, чего не наблюдается в матрицах с ПВС.
2. Исследование структуры биогибридных материалов на основе иммобилизованных в органосиликатные матрицы клеток метилотрофных дрожжей
Биогибридные материалы получали путем иммобилизации клеток микроорганизмов в органосиликатные матрицы на основе МТЭС, ТЭОС и гидрофильных полимеров золь-гель синтезом в одну стадию в условиях основного катализа. Объектом иммобилизации являлись метилотрофные дрожжи Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 (Пущино, Россия), которые устойчивы к образующемуся в процессе гидролиза и конденсации алкоксисиланов спирту, поскольку для этих микроорганизмов низкомолекулярные спирты являются природными субстратами.
2.1 Исследование архитектуры биогибридных материалов типа «клетка в оболочке» методом сканирующей электронной микроскопии
Электронно-микроскопический анализ материалов, которые формировались в течение 5 часов после запуска реакций гидролиза и конденсации алкоксисиланов в присутствии клеток дрожжей, проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-6510 LV («JEOL», Япония) в режиме низкого вакуума (30 Па) при регистрации обратно-отраженных электронов (BSE) в лаборатории цитологии микроорганизмов отдела аналитической биохимии, ФГБУН «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН» (г. Пущино).
В зависимости от молекулярной массы структурообразующего агента ПЭГ менялась и архитектура биогибридов, полученных путем иммобилизации
метилотрофных дрожжей в органосиликатные матрицы из МТЭС, ТЭОС и ПЭГ-М (рисунок 3).
Рисунок 3. СЭМ – изображения клеток дрожжей Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559, иммобилизованных в золь-гель матрицы различного состава (МТЭС:ТЭОС 85:15): a – ПЭГ-1000; б – ПЭГ-2000; в – ПЭГ-3000; г– ПЭГ-4000; д – ПЭГ-6000
При использовании низкомолекулярных ПЭГ (1000, 2000 Да) в биогибридных материалах формируется монолитная архитектура со встроенными в нее клетками (рисунок 3А, Б). Это обусловлено линейной конфигурацией молекул структуроуправляющего агента (рисунок 4А). На микрофотографиях биогибридных материалов с ПЭГ-4000, и, особенно, с ПЭГ-6000 наблюдаются неинкапсулированные дрожжевые клетки (рисунок 3Г, Д). Эти полимеры из-за кластерной организации в растворе в меньшей степени контактируют как с исходными кремнийорганическими соединениями, так и с микроорганизмами, что снижает эффективность инкапсулирования клеток (рисунок 4В). В биогибридном материале с ПЭГ-3000 явно просматриваются клетки, упакованные в оболочку из сферических частиц размером около 1 мкм (рисунок 3В). Механизм формирования такой архитектуры объясняется взаимодействием кремнийорганических соединений с ПЭГ-3000 в его сетке зацеплений, которая локализована на поверхности клеток микроорганизмов за счет участия нуклеофильных центров полимера с функциональными группами на поверхности клеточной стенки (рисунок 4Б). Полученные методом сканирующей электронной микроскопией результаты согласуются с данными ИК-спектроскопии.
Рисунок 4. Графическое представление взаимодействия гидрофильных полимеров с кремнийорганическими соединениями и клеточной стенкой дрожжей
Поверхность клеток дрожжей в органосиликатных матрицах из МТЭС:ТЭОС 85:15 и ПВС полностью покрыта слоем, состоящим из мелких сферических частиц размером менее 0,2 мкм (рисунок 5).
Рисунок 5. СЭМ изображения образования 3Д-структуры: А – органосиликатный гидрогель на основе МТЭС:ТЭОС 85:15 и ПВС; Б – свободные клетки дрожжей Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559; В – биогибридный материал на основе клеток дрожжей Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559, инкапсулированных в золь-гель матрицы на основе МТЭС:ТЭОС 85:15 и ПВС
Гидроксильные группы в молекулах ПВС способствуют более эффективному зарождению частиц золя, что обеспечивает формирование более мелких фрактальных структур (рисунок 4Г).
Важно отметить, что органосиликатные материалы дополнительно стабилизированы водородными связями, образующимися между электронно- донорными атомами (эфирный атом кислорода у ПЭГ и гидроксильными группами у ПВС) и нейтральными силанольными группами на поверхности кремнезема при нейтральном рН. Наличие нуклеофильных центров гидрофильных полимеров вблизи клеточной поверхности при нейтральных значениях рН способствует формированию более плотных и мелких частиц золя прямо у поверхности клеток. Это приводит к направленному формированию фрактального геля в виде оболочек вокруг клеток.
Таким образом, эффективное инкапсулирование микроорганизмов обеспечивается при локализации полимера на всей поверхности дрожжевых клеток, что наблюдали при ПЭГ-3000 и ПВС (рисунок 4). С одной стороны, гидрофильные полимеры выполняют роль структуроуправляющего агента, взаимодействуя с соединениями кремния, а с другой – обеспечивает благоприятное окружение микроорганизмам.
2.2 Исследование динамики образования архитектуры биогибридных материалов типа «клетка в оболочке»
Для визуализации процесса инкапсуляции дрожжевых клеток использовали модельные дрожжи Cryptococcus curvatus ВКМ Y-3288, поскольку клетки этих дрожжей имеют продолговатую палочковидную форму и их легко отличить от шарообразных частиц золя в системе (рисунок 6). Исследования проводили на оптическом световом микроскопе Nikon Eclipse Ci (Nikon, Япония), оборудованном камерой ProgRes SpeedXT core5 (Jenoptik, Германия), в лаборатории цитологии микроорганизмов отдела аналитической биохимии, ФГБУН «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН» (г. Пущино).
Рисунок 6. Динамика формирования органосиликатной оболочки вокруг модельных палочковидных дрожжах Cryptococcus curvatus ВКМ Y-3288. Оптическая микроскопия. Бар метка 10 мкм
В условиях основного катализа в присутствии ПВС на поверхности микроорганизмов наблюдается формирование частиц золя, число которых увеличивается со временем. Через 5 часов все клетки дрожжей покрыты оболочкой. Аналогичная картина наблюдалась ранее при изучении динамики инкапсулирования этих дрожжей в силикагели в присутствии ПЭГ-3000. ПВС является пленкообразующим полимером, поэтому биогибридные материалы на основе ПВС представляют собой пленки по макроструктуре.
2.3 Исследование пористости биогибридных материалов методом низкотемпературной адсорбции азота
Исследование пористости структуры и определение удельной поверхности органосиликатной матрицы на поверхности иммобилизованных микроорганизмов проводили методом низкотемпературной адсорбции азота с использованием аналитического оборудования Центра коллективного пользования «Институт нано- и биотехнологий» ФГБОУ ВО «Тверской государственный технический университет» (рег. номер 3212).
Изотерма адсорбции-десорбции для биогибридного материала с ПЭГ вне зависимости от молекулярной массы полимера по классификации Брунауэра- Деминга-Деминга-Теллера (БДДТ) соответствует III типу изотерм, которые, как правило, описывают непористые или макропористые материалы (рисунок 7А). Изотерма адсорбции-десорбции для органосиликатных с ПВС по классификации БДДТ соответствует V типу, характерной особенностью которого является наличие петли гистерезиса, что определяет заполнение материала мезопорами (рисунок 7Б). Вид петли гистерезиса зависит от формы и типа пор. По классификации ИЮПАК такой тип петли относится к Н3 типу, который характерен или для щелевидных пор, или для пор, состоящих из плоскопараллельных частиц. Такая структура материала соответствует пространственной организации гидрофильных полимеров в растворе, что подтверждает их участие в формировании структуры органосиликатной матрицы: так, линейные длинноцепочечные молекулы ПВС направляют образование щелевых пор в материале, в то время как сетчатая
структура ПЭГ в растворе способствует формированию более плотной и равномерной структуры материала.
АБ
30 25 20 15 10
0
0 0,5 1 1,5 Относительное давление, Ps/P
25 20 15 10
0
0 0,5 1 1,5 Относительное давление, Ps/P
Рисунок 7. Изотермы адсорбции-десорбции органосиликатных матриц на поверхности иммобилизованных клеток дрожжей из МТЭС:ТЭОС в соотношении 85:15 об. % и гидрофильных полимеров: А- ПЭГ-3000, Б – ПВС
Для определения величины удельной поверхности используют различные модели: теоретическую модель Ленгмюра для монослойной адсорбции, уравнением которой описываются изотермы I типа; модель БЭТ (полислойная адсорбция, для II и IV типа изотерм). Однако эти модели достоверно описывают однородные системы. Изотермы адсорбции-десорбции азота для исследуемых биогибридных материалов соответствуют III и V типам изотерм, которые нельзя описать уравнениями Ленгмюра и БЭТ, поэтому наиболее приемлемым подходом анализа изотерм для них является t-метод, основанный на t-кривой, в которой зависимой переменной является статистическая толщина адсорбционной пленки (таблица 1).
Таблица 1. Значение удельных поверхностей и общего объема пор в органосиликатных матрицах
Органосилакатная матрица из МТЭС:ТЭОС 85:15
ПЭГ- ПЭГ- ПЭГ- ПЭГ- ПЭГ- ПВС
1000 2000 3000 4000 6000
0,0078 0,0306 0,0371 0,0187 0,0284 0,0355 В зависимости от молекулярной массы ПЭГ менялись значения удельной
поверхности и общий объем пор биогибридного материала (рисунок 8).
Удельная поверхность, м2/г
(R – коэффициент корреляции)
8,840 (R=0,9998)
33,010 (R=0,9994)
38,636
(R=0,9996)
20,175 (R=0,9988)
20,314 (R=0,9758)
20,969
(R=0.9951)
Общий объем пор, см3/г
12
Количество адсорбируемого газа, см3/г (STP)
Количество адсорбируемого газа, см3/г (STP)
40
30
20
10
0
Удельная поверхность
Общий объем пор
2000 4000 6000 Молекулярная масса ПЭГ, Да
0,037 0,032 0,027 0,022 0,017 0,012 0,007
Рисунок 8. Зависимости значений удельной поверхности и объема пор биогибридных материалов от ПЭГ-М
При использовании низкомолекулярных ПЭГ (ПЭГ- 1000, ПЭГ-2000), материал характеризуется наименьшем количеством пор, что связано с формированием монолитной структуры. Материалы на основе ПЭГ-3000 характеризуется наибольшей удельной поверхностью и объемом пор. Это связано с сетчатой архитектурой материала, который формируется при ПЭГ-3000, где соединения кремния заключены в сетку зацеплений полимера
Дальнейшее увеличение молекулярной массы ПЭГ приводит к снижению удельной поверхности и объему пор в материале, что связано с пространственной организацией ПЭГ в виде кластерной структуры. Данные результаты согласуются с данными, полученными ранее методами ИК-спектроскопии. Так, органосиликатная матрица на основе ПЭГ-3000 характеризуется наименьшем количеством образующихся силоксановых связей, что приводит к большему объему пор в данном материале. В свою очередь, в органосиликатном материале с низкомолекулярным ПЭГ образуется наибольшее количество Si-O-Si связей, при этом наблюдается наименьший объем пор.
Использование ПВС в качестве структуроуправляющего агента при синтезе органосиликатных матриц приводит к уменьшению значения удельной поверхности, в то время как объем пор остается примерно на одном уровне в сравнении с органосиликатными матрицами на основе ПЭГ-3000. Это можно объяснить изменением структуры и диаметра пор в органосиликатных матрицах на основе ПВС.
АБ
0,004 0,003 0,002 0,001
0 50 100 150 Диаметр пор, нм
0,003 0,002 0,001
0 50 100 150 Диаметр пор, нм
Рисунок 9. Дифференциальное распределение пор по объему в биогибридного материала на основе инкапсулированных клеток дрожжей в органосиликатные матрицы из МТЭС:ТЭОС в соотношении 85:15 об.% и гидрофильных полимеров:
А- ПЭГ-3000, Б-ПВС
Данные дифференцированного распределения пор по объему, полученные по методу Баррета-Джойнера-Халенды (БДХ, BJH), показали, что вне зависимости
dV/dD, см3/(г*нм) Удельная поверхность, м2/г
dV/dD, см3/(г*нм)
Общий объем пор, см3/г

от используемого полимера наибольший вклад в пористость системы вносят поры диаметром до 10 нм (рисунок 9). По данным о распределении пор по их диаметру (V/f(D) – интегральная характеристика) выявлено, что при использовании ПВС доля пор до 10 нм уменьшается, и увеличивается доля пор диаметром 20-80 нм. Это обусловлено тем, что биогибридные материалы на основе ПВС характеризуются линейной структурой, а при использовании ПЭГ происходит формирование сетчатой структура биогибридного материала. Органосиликатные матрицы на основе ПЭГ-3000 и ПВС биогибридных материалов характеризуются наибольшим объемом пор, что связано с наименьшим количеством образующихся силоксановых связей, согласно результатам, полученным ранее с помощью ИК-спектроскопии. Органосиликатные матрицы с ПЭГ-3000 должны обладать более высокой сорбционной емкостью по отношению к низкомолекулярным соединениям (о чем свидетельствует большее значение удельной поверхности) по сравнению с матрицами на основе ПВС.
3. Характеристики чувствительности и стабильности биосенсоров на основе биокатализаторов, полученных путем иммобилизации клеток дрожжей в органосиликатные матрицы из МТЭС, ТЭОС и структуроуправляющих агентов
Полученные в ходе работы биогибридные материалы характеризовали как биокатализаторы. Для этого на поверхности кислородного электрода размещали иммобилизованные в органосиликатные матрицы микроорганизмы и оценивали их дыхательную активность в присутствии метанола, как типичного субстрата метилотрофных дрожжей. Такой подход широко используется при разработке целоклеточных биосенсоров и обеспечивает оперативность и надежность в получении количественных характеристик биокатализаторов – иммобилизованных микроорганизмов. За ответ биосенсора принимали скорость изменения содержания кислорода при добавлении метанола (мгO2/(мин×дм3)). Рассчитанные параметры чувствительности и стабильности биосенсоров представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2. Значения параметров чувствительности и стабильности биосенсоров на основе иммобилизованных клеток в органосиликатные матрицы из МТЭС:ТЭОС 85:15 и ПЭГ различных молекулярных масс
ПЭГ-М, где М-молекулярная масса, Да
Коэффициент чувствительности, мгО2× мин-1×ммоль-1
0,06±0,01
0,6±0,1
0,87±0,05
0,67±0,07
0,4±0,2
Нижняя граница, мкМ Верхняя граница, мкМ Предел обнаружения, мкМ Операционная стабильность, %
ПЭГ- ПЭГ- ПЭГ- 1000 2000 3000
70 50 5 270±20 850±150 375±20 20 20 2
ПЭГ- ПЭГ- 4000 6000
20 60 370±20 325±20 6 30
8 6 4 6 11 ПЭГ-М, где М-молекулярная масса, Да
ПЭГ- ПЭГ- ПЭГ- ПЭГ- ПЭГ- 14

Долговременная стабильность, сутки
1000 2000 3000 4000 6000 10 14 15 13 13
Максимальной чувствительностью (коэффициентом чувствительности 0,87±0,05 мгО2×мин-1×ммоль-1 и нижней границы диапазона определяемых концентраций 5 мкмоль/дм3) и временем функционирования без замены рецепторного элемента (15 суток) характеризуется биосенсор на основе инкапсулированных дрожжей в органосиликатные матрицы из МТЭС:ТЭОС 85:15 и ПЭГ-3000, что обусловлено особой архитектурой биогибридного материала – «клетка в оболочке». Органосиликатная оболочка на основе ПЭГ-3000 характеризуется минимальным количеством силоксановых связей, и, как следствие, максимальным объемом пор, что обеспечивает высокую скорость поступления субстрата (метанола) к иммобилизованным клеткам. Для остальных биосенсоров величины нижних границ определяемых концентраций составляют от 20 до 70 мкмоль/дм3. Введение в систему низкомолекулярных ПЭГ приводит к образованию максимального количества Si-O-Si связей и монолитной структуре органосиликатной матрицы, что снижает проницаемость для молекул метанола. Уменьшение и увеличение молекулярной массы ПЭГ в органосиликатных матрицах приводит к незначительному снижению долговременной стабильности биосенсоров.
Таблица 3. Значения параметров чувствительности и стабильности биосенсоров на основе биокатализаторов, полученных путем иммобилизации клеток в органосиликатные матрицы из ПВС и МТЭС:ТЭОС в различном соотношении
Соотношение МТЭС:ТЭОС, % об. 0:100 50:50 80:20 85:15
100:0
Коэффициент чувствительности, мгО2× мин-1×ммоль-1
0,70±0,09
0,20±0,01
0,18±0,03
1,01±0,0 2
0,30±0,0 3
Нижняя граница, мкМ Верхняя граница, мкМ Предел обнаружения, мкМ Операционная стабильность, % Долговременная стабильность, сутки
65 208 60 22 73
420±20 1200±100 1600±250 440±20
30 137 30 18 25
440±20 2 11 3 6 5
10 11 8 10 7
При сравнительном анализе характеристик чувствительности и стабильности биосенсоров на основе ПВС однозначно определить наиболее эффективный биокатализатор не удалось. Для дальнейших исследований выбрали биокатализатор на основе иммобилизованных метилотрофных дрожжей в матрицу с содержанием МТЭС:ТЭОС 85:15 об. %, который характеризуется наибольшим коэффициентом чувствительности и долговременной стабильности.
Стабильность при хранении биокатализаторов оценивали по величине коэффициентов чувствительности биосенсоров, в которых образцы биогибридных
материалов использовали в качестве биораспознающих элементов, через 7, 90 и 360 дней их хранения при температуре +2 °С и -18 °С (рисунок 10).
Рисунок 10. Оценка стабильности функционирования при хранении биокатализаторов на основе биогибридных материалов
Хранение биокатализаторов при +2oС приводит к снижению дыхательной активности на 60- 70% в течении года. Однако длительное хранение полученных образцов при температуре -18oС практически не влияет на функционирование биокатализаторов, все образцы сохраняют свою активность в течение года, что важно при производстве и хранении коммерческих образцов гибридного биоматериала.
4. Разработка лабораторной модели биофильтра капельного типа для утилизации метанола в условиях естественной и принудительной аэрации
Органосиликатные оболочки вокруг клеток защищают микроорганизмы от воздействия вредных факторов, таких как экстремальные значения рН среды, ионы тяжелых металлов, УФ-излучение, что имеет значение при использовании таких биокатализаторов для биологической очистки стоков. Метилотрофные дрожжи способны окислять метанол, поэтому на их основе можно разрабатывать системы биологической очистки метанолсодержащих стоков. В сточных водах производств крупнотоннажных химических продуктов таких как синтез аммиака, паровая конверсия СО, синтез метанола, получение диметилового эфира и высших спиртов образуются метанолсодержащие технические воды с высоким содержанием спирта (так называемые, метанольные воды). Метанолсодержащие стоки подвергаются биохимической очистке с предельно-допустимая концентрация метанола в сточных водах не более 220 мг/л. В работе исследовали возможность использования метилотрофных дрожжей для утилизации метанола на лабораторной модели капельного биофильтра колоночного типа (параметры колонки: h – 13,5 см, d – 1,5 см). В качестве загрузочного материала применили инкапсулированные в органосиликатные матрицы (МТЭС:ТЭОС 85:15, ПЭГ-3000 и ПВС) метилотрофные дрожжи на поверхности стеклянных шариков (d – 3.3±0.3 мм). Условием для тестирования биофильтра являлась биологическая очистка модельного метанольного стока, в котором содержание метанола (220 мг/л) соответствует предельно-допустимой концентрации для биохимической очистки метанольных стоков. Способность лабораторного биофильтра утилизировать метанол в модельном стоке исследовали в двух режимах (с естественной и принудительной аэрацией) при скорости пропускания модельного стока 0,5 мл/мин (0,96 л/час×лзагрузки). Аэрацию биофильтра проводили через пластиковую трубку с отверстиями (диаметр трубки 0,5 см, число отверстий 100, средний диаметр каждого отверстия 0,4 мм), которую располагали в центре колонны с загрузочным материалом.
Естественная аэрация (А) Принудительная аэрация (Б)
Рисунок 11. Зависимость содержания метанола на выходе из колонны от времени работы биофильтра капельного типа
В статическом режиме в системе с естественной аэрацией при погружении микроорганизмов (как адсорбированных на стекловолоконном материале, так и в диализной мембраной) в очищаемый модельный раствор содержание метанола снизилось лишь на 3-4 % за 90 минут, степень очистки – 5±1 % (рисунок 11, СФ – микроорганизмы, адсорбированных на стекловолоконном фильтре, ДМ – помещенных в диализную мембрану). При использовании принудительной аэрации увеличилась степень утилизации метанола, степень очистки составила 33±2 %. При использовании биофильтров степень очистки метанольных стоков в условиях естественной аэрации составила 17±1 %, а условиях принудительной аэрации 58±3 (с ПЭГ) и 50±2 %(с ПВС), соответственно (рисунок 3.11). В аэробных условиях очистки на биофильтре лимитирующей стадией является обеспечение иммобилизованных микроорганизмов кислородом. С учетом низкой растворимости кислорода в воде и при больших нагрузках по органическому веществу на биофильтр эффективность удаления метанола из стоков в первую очередь будет снижаться из-за дефицита кислорода внутри гранул загрузки биофильтра, что и наблюдали в биофильтрах без принудительной аэрации (рисунок 11А). В условиях принудительной аэрации биофильтр на основе загрузочного материала с ПВС характеризуется постоянным уровнем утилизации метанола в течение всего времени эксперимента, но с меньшей степенью очистки (содержание метанола на выходе из колонны ниже исходного практически в 2 раза, время цикла 90 минут, рисунок 11Б). Это связано меньшей диффузионной проницаемостью этого материала, что приводит к снижению скорости поступления субстрата к иммобилизованным микроорганизмам. Биофильтр на основе загрузочного материала с ПЭГ-3000 к концу цикла утилизирует только около 5% поступающего в колонну метанола, однако степень утилизации метанола в этом биофильтре в течение первых 40 минут значительно выше, чем в биофильтре с ПВС. Такую динамику утилизации метанола можно объяснить недостаточной степенью аэрации в условиях эффективной доступности субстрата (метанола) для иммобилизованных дрожжей. В результате, степень очистки метанольных стоков при пропускании через оба биофильтра с аэрацией в течение одного цикла примерно одинакова (таблица 4).
Эффективность работы биофильтра определяли по окислительной мощности (ОМ, г О2/м3×цикл):
, где (3)
БПКпост. – БПК поступающей сточной воды, гО2/м3;
Учитывая, что на окисление 1 мг метанола приходится 0,98 мг О2, БПКпост. модельного стока (7 мМ метанола) составит 220 мг/л (220 г O2/м3).
БПКочищ. – БПК очищенной сточной воды, гО2/м3;
Q – количество сточной воды составит 5×10-5 (м3/цикл); Vзагрузки – объем загрузочного материала, 3,1×10-5 м3.
Таблица 4. Характеристики лабораторного биофильтра с загрузочным материалом на основе метилотрофных дрожжей, инкапсулированных в органосиликатные матрицы с ПЭГ и ПВС, в условиях естественной и принудительной аэрации
Биофильтр МТЭС:ТЭОС 85:15
Исходное содержание метанола, мг/л
Степень очистки, %
ОМ, гО2/м3× цикл
ПЭГ-3000 ПВС
ПЭГ-3000 ПВС
Без аэрации 220 9,5±0,3
10,0±0,3
С принудительной аэрацией
220 49±3 41±1
60±10 70±20
180±30 190±30
В условиях естественной аэрации окислительная мощность за один цикл работы биофильтра (90 минут) составила 60-70 гО2/(м3×цикл). Принудительная аэрация биофильтров позволила увеличить их эффективность в 3 раза. Окислительная мощность составляет 180-200 гО2/(м3×цикл), степень очистки модельных метанольных стоков – 50-60 %, что является нормой для капельных биофильтров, работающих в циклическом режиме. При промывке колонны активность биофильтра восстанавливается, что позволяет использовать его многократно. Однако для полного восстановления активности микроорганизмы после трех циклов очистки необходимо выдерживать биофильтр без метаболической нагрузки в течении 12 часов. Загрузочный материал рекомендовано заменять через полмесяца.
Следует отметить, что в контрольном фильтре, в котором в качестве загрузочного материала использовали органосиликатный материал с ПЭГ-3000 без микроорганизмов, сорбция метанола составила не более 6% от исходного содержания метанола, что доказывает участие в утилизации метанола именно биокатализатора – инкапсулированных метилотрофных дрожжей.
Таким образом, биогибридные материалы на основе инкапсулированных микроорганизмов в органосиликатную матрицу из МТЭС:ТЭОС в соотношении 85:15 и в присутствии гидрофильных полимеров ПЭГ-3000 и ПВС являются эффективными биокатализаторами при разработке биофильтров.
ВЫВОДЫ:
Проведенные исследования вносят теоретический и практический вклад в изучения биогибридных материалов, в которых происходит самопроизвольное формирование силикатной оболочки вокруг живых микроорганизмов. Полученные биогибридные материалы являются перспективными биокатализаторами для применения в биотехнологии.
На основе полученных результатов сделаны следующие выводы:
1. Пространственная организация ПЭГ в растворе в зависимости от его молекулярной массы влияет на степень конденсации исходных соединений кремния в ходе синтеза органосиликатных матриц: сетчатая структура ПЭГ-3000 в водном растворе обеспечивает образование минимального количества силоксановых связей из-за уменьшения степени взаимодействия соединений кремния между собой.
2. Присутствие дополнительных метиленовых фрагментов (-СН2-СН2-) в структуроуправляющем агенте ПЭГ-3000 (в отличие от ПВС) играет важную роль в формировании структуры органосиликатных матриц на основе ТЭОС и гидрофобной добавки МТЭС: взаимодействия в реакционной системе, включая гидрофобные, приводят к образованию структуры с минимальным количеством Si- O-Si связей в матрице с содержанием МТЭС 85 об%, что не происходит в матрицах с ПВС.
3. Иммобилизация метилотрофных дрожжей в органосиликатные матрицы состава МТЭС:ТЭОС 85:15 об.% приводит к формированию биогибридных материалов с разной архитектурой в зависимости от структурной организации ПЭГ: только в присутствии ПЭГ-3000, с сетчатой организацией в растворе, формируется архитектура, в которой клетки в органосиликатной оболочке образуют единую структуру. Эффективное инкапсулирование микроорганизмов обеспечивается при локализации полимера на всей поверхности дрожжевых клеток, что наблюдали при ПЭГ-3000 и ПВС.
4. Синтез биогибридных материалов в условиях золь-гель синтеза при рН=7,6 приводит к формированию структуры органосиликатной матрицы преимущественно с порами диаметром до 10 нм вне зависимости от гидрофильного полимера. Однако при использовании ПВС удельная поверхность материала уменьшается, объем пор диаметром 20-80 нм увеличивается, что обусловлено образованием архитектурой материала с щелевидными порами в присутствии ПВС из-за пространственного расположения полимера в водных средах.
5. Биокатализаторы на основе иммобилизованных в органосиликатную матрицу с ПЭГ-3000 метилотрофных дрожжей по данным биосенсорного анализа характеризуется более стабильной и эффективной работой, что обусловлено особой архитектурой биогибридного материала – «клетка в оболочке», при этом диффузия метанола к инкапсулированным микроорганизмам не затруднена. Использование в качестве структуроуправляющего агента ПВС приводит к формированию материалов пленочного типа с похожими каталитическими характеристиками в сравнении с ПЭГ-3000.
6. Аэрация лабораторной модели биофильтров позволила увеличить их эффективность в 4 раза. Степень очистки метанола в условиях аэрации через разработанную лабораторную модель биофильтра на основе инкапсулированных в органосиликатную матрицу метилотрофных дрожжей составила 40-50% от исходного содержания метанола.