Выделение, характеристика экзополисахаридов молочнокислых бактерий и перспективы их применения

Актуальность темы. Среди биополимеров бактериального
происхождения особое место занимают экзополисахариды (ЭПС), которые хорошо зарекомендовали себя в различных областях деятельности человека: медицине, ветеринарии, нефтяной, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве (Онищенко и др., 2002; Перепелкин, 2005; Ботина, Рожкова, Семенихина, 2010; Сопрунова, Виет Тиен, 2010; Глоба, Гвоздяк, 2015; Сеник, 2015; Широбоков, 2015; Лавина и др., 2016; Ибрагимова, Фомкина, 2016; Пархоменко, 2019). Известно, что полисахариды бактерий обладают реологическими, иммунностимулирующими, ранозаживляющими, пленкообразующими и другими свойствами (Бухарова и др., 2009; Полукаров, 2009; Ботина, Рожкова, Семенихина, 2010; Правдивцева, Карпунина, Бухарова, 2012; Ревин и др., 2018). Экзополисахариды бактерий в отличие от большинства химически созданных полимеров, являются биоразлагаемыми и не вредят экологии (Muhammadi, Ahmed, 2008).
Исходя из этого, изыскание новых продуцентов ЭПС бактериального происхождения является приоритетной задачей в настоящее время.
Степень разработанности темы исследования. Источником получения ЭПС являются многие бактерии (Няникова и др., 2002; Рысмухамбетова и др., 2008; Лахтин и др., 2012; Ксенофонтов и др., 2015; Кичемазова и др., 2017; Boyd, 1995; Garcia – Ochoa, 2000). К бактериям, способным продуцировать ЭПС, относятся и молочнокислые микроорганизмы (Новик, 2002; Ганина, Рожкова, 2005; Абрамова, Семенихина, 2008; Еникеев, 2011; Красникова, Маркелова, 2013; Хохлачева, 2015; Артюхова, Меньших, 2016; Кебекбаева, Молжигитова, Джакибаева, 2017; Kitazawa, 1996; Savadogo et al, 2004; Paulo et al., 2012; Zeidan et al., 2017). Среди них можно выделить бактерии рода Lactococcus и Streptococcus (Cerning, 1988; Deveau, 2002; Yuksekdag, 2008), представители которых входят в состав нормальной микрофлоры человека и животных (Хавкин, Бельмер, 2003; Макарова,
5
Намазова – Баранова, 2015; Beasley, Saris, 2004), а также входят состав заквасок при производстве кисломолочной и мясной продукции (Рожкова, 2006; Стоянова, 2008; Орлова, Иркитова, 2014; Ханхалаева, Митыпова, 2014; Артюхова, Моторная, 2015; Хохлачева, 2015; Иркитова, 2017). Однако роль этих биополимеров является не до конца изученной. Для обоснования принципа воздействия ЭПС молочнокислых бактерий на живой организм, необходимо иметь более обширные знания об их строении, физико – химических и биологических свойствах (Zeidan et al., 2017).
В связи с этим исследования, посвященные изучению физико- химических и биологических свойств экзополисахаридов молочнокислых бактерий рода Lасtococcus и Streptococcus, являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.
Цель работы состояла в оптимизации условий культивирования Lactococcus lactis В-1662 и Streptoccus thermophilus для обеспечения максимального выхода ЭПС, их выделении, характеристике и перспективах использования.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Подобрать условия культивирования (источник углерода, время культивирования) L. lactis В-1662 и S. thermophilus, для обеспечения максимального продуцирования ими экзополисахаридов.
2. Выделить и очистить экзополисахариды из бактерий L. lactis В-1662 и S.thermophilus.
3. Определить физико-химические свойства (молекулярную массу, химическую природу, углеводный состав, вязкость) экзополисахаридов L.lactis В-1662 и S thermophilus.
4. Изучить влияние in vivo L. lactis В-1662 и S. thermophilus на заживление ожоговых ран у экспериментальных животных (крыс).

6
5. Изучить влияние ЭПС
сельскохозяйственной птицы (прирост живой массы птицы и микрофлору) при добавлении в корм.
Научная новизна
Впервые выделены ЭПС L. lactis В-1662 и S. thermophilus, определены их молекулярные массы, химическая природа, моносахаридный состав и вязкость. Показано, что L. lactis В-1662 и S. thermophilus максимально продуцируют экзополисахариды на питательной среде A.Welman с соавт. (2003) с сахарозой в нашей модификации при 27 °С, рН 5,5 на 48 ч культивирования – L. lactis В-1662; при 38 °С, рН 5,5 на 48 ч культивирования – S. thermophilus. Показано влияние ЭПС L. lactis В-1662 и S. thermophilus на заживление ожоговых ран у крыс, в большей степени проявляющееся у ЭПС стрептококка Обнаружено, что добавление в корм сельскохозяйственной птицы ЭПС S. thermophilus способствует увеличению массы тела и количества молочнокислых бактерий.
Теоретическое и практическое значение работы
Полученные результаты вносят значимый вклад в фундаментальные исследования экзополисахаридов бактериального происхождения и открывают перспективы их возможного использования в экспериментальной биологии, ветеринарии и сельском хозяйстве.
По материалам диссертационной работы получен патент на изобретение «Способ выращивания цыплят-бройлеров» (No 2736967 от 23.11.2020), опубликованы «Методические рекомендации по изучению влияния условий культивирования молочнокислых бактерий на их способность образовывать биоплёнку» (в соавторстве с А.Ю. Тяпкиным, Г.Т. Урядовой, Л.В. Карпуниной, 2019) для студентов старших курсов, магистрантов, аспирантов, сотрудников микробиологических и биотехнологических лабораторий, рассмотренные и одобренные на заседании кафедры «Микробиология, биотехнология и химия» (протокол No 16 от 28 апреля 2019 г.);
S. thermophilus на организм

7
«Методические рекомендации по изучению влияния экзополисахаридов молочнокислых бактерий и пленочных покрытий, созданных на их основе, на заживление ожоговых ранений у лабораторных животных» (в соавторстве с Г.Т. Урядовой, Л.В Карпуниной, 2020) для студентов старших курсов, магистрантов, аспирантов, сотрудников микробиологических, биотехнологических и ветеринарных лабораторий, рассмотренные и одобренные на заседании кафедры «Микробиология, биотехнология и химия» (протокол No 16 от 28 апреля 2020 г.). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам выделения и очистки экзополисахаридов, изучению их химического состава, физико-химических и биологических свойств. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы. При проведении исследования и изложения материала были применены общенаучные методы: теоретико- методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа. Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Оптимальными условиями культивирования для продукции экзополисахаридов L. lactis В-1662 и S. thermophilus являются: инкубирование на модифицированной питательной среде A.Welman с соавт.

8
(2003) с сахарозой рН 5,5, время культивирования 48 ч при 27 °С и 38 °С соответственно.
2. Выделенные из культуральной жидкости ЭПС L. lactis В-1662 и S.thermophilus представлены одной нейтральной фракцией с молекулярными массами 10 кДа и 20 кДа соответственно. ЭПС L. lactis В-1662, состоит из глюкозы, ксилозы в соотношении 1:1 и следовых количеств рамнозы (5,8%); обладает вязкостью 1,3 мм 2/с. ЭПС S. thermophilus, состоит из рамнозы, галактозы, маннозы в соотношении 1:2:1 с присутствием следов глюкозы (4,4%); обладает вязкостью 1,23 мм2/с.
3. Экзополисахариды L. lactis В-1662 и S. thermophilus обладают ранозаживляющим действием при ожогах у крыс, более выраженный эффект проявляет ЭПС S. thermophilus.
4. Добавление ЭПС S. thermophilus в корм сельскохозяйственной птицы способствует увеличению массы тела и количества молочнокислых бактерий у них.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».
Степень достоверности и апробация работы
Степень достоверности результатов обеспечена использованием стандартных биологических, микробиологических, биохимических, физико- химических методов исследований и методов статистической обработки данных.
Материалы диссертации были представлены на: конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно- исследовательской, учебно-методической и воспитательной работы (Саратов, 2011; 2015-2018); IV Всероссийской школе – конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2011); «Международной научно- практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы»

9
(Саратов, 2014); Всероссийском конкурсе научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2015» (Москва, 2015), Ежегодной Международной научно-практической конференции «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, 2015); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, пищевых и биотехнологий» (Саратов, 2016); VIII Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2016); Международной научно-практической конференции «Инновации в пищевой технологии, биотехнологии и химии». (Саратов, 2017); 1-м Российском микробиологическом конгрессе (Москва, 2017); IV Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (Москва, 2017); 22-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2018); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы пищевых и биотехнологии» (Саратов, 2019); Национальной научно-практической конференции «Зыкинские чтения» (Саратов, 2020); 24-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2020); Международной научной конференции PLAMIC 2020 «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» (Саратов, 2020).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в журнале, индексируемом в международной базе данных Scopus и 1 патент.
Личный вклад соискателя состоит в подготовке и проведении научных исследований на всех этапах выполнения диссертационной работы, трактовке полученных результатов, оформлении патента и подготовке публикаций, участии в конференциях. Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста и включает 7 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 230 наименований, в том числе 99 отечественных, 131 зарубежных.