Получение и изучение биосовместимости перспективных полимерных материалов для тканевой инженерии

Хан, Елена Алексеевна Исследовательская школа химических и биомедицинских технологий (ИШХБМТ)
Бесплатно
В избранное
Работа доступна по лицензии Creative Commons:«Attribution» 4.0

Целью данной работы является изготовление и определение биосовместимости скаффолдов на основе полимеров поликапролактон, полигидроксибутират, полигидроксибутират с модификацией восстановленным оксидом графена.
В процессе исследования проводились модификация скаффолдов для улучшения адгезии и роста клеток, подбор оптимальных условий пассажа клеток и разработка протокола окрашивания для анализа биосовместимости.
В результате исследования получены полимерные скаффолды методом электроспиннинга, показано отсутствие токсического действия на клетки данных полимерных материалов, составлены протоколы по работе с клеточными линиями для детекции их адгезии на биоматериалах, установлено, что наибольшей биосовместимостью обладают полимеры, модифицированные восстановленным оксидом графена.

Введение ………………………………………………………………………………………. 14
1 Обзор литературы ………………………………………………………………………… 16
1.1 Роль тканевой инженерии в медицине…………………………………………. 16
1.3 Определение понятия «скаффолд» ……………………………………………… 18
1.4 Описание полимерных материалов …………………………………………….. 19
1.5 Пьезоэлектрический эффект биоматериалов…………………………………. 20
1.6 Графеновая модификация…………………………………………………………. 23
1.7 Электропрядение ……………………………………………………………………. 25
1.8 Биосовместимость и клеточные технологии …………………………………. 26
1.9 Методы анализа цитотоксичности ……………………………………………… 28
1.9.1 Резазуриновый тест ………………………………………………………….. 28
1.9.2 МТТ-тест ……………………………………………………………………….. 30
2 Объекты исследования ………………………………………………………………….. 33
2.1 Характеристика биологических объектов …………………………………….. 33
2.2. Описание полимерных скаффолдов……………………………………………. 34
3 Экспериментальная часть ………………………………………………………………. 35
3.1 Получение скаффолдов ……………………………………………………………. 35
3.2 Определение структуры скаффолдов ………………………………………….. 36
3.3 Пьезоэлектрические свойства полимеров …………………………………….. 37
3.4 Анализ угла смачиваемости ………………………………………………………. 38
3.5 Оценка токсичности скаффолдов с помощью резазуринового теста ….. 39
3.6 Фиксация и окраска клеток с использованием красителей……………….. 42
3.7 Флуоресцентная микроскопия …………………………………………………… 43
4 Результаты исследования……………………………………………………………….. 45
4.1 Образцы полимерных скаффолдов ……………………………………………… 45
4.2 Сканирующая электронная микроскопия …………………………………….. 45
4.3 Контактный угол смачиваемости ……………………………………………….. 47
4.4 Пьезоэлектрические характеристики материалов…………………………… 47
4.4 Влияние токсичности биоматериалов на клетки ……………………………. 48
4.5 Апробация протокола окрашивания клеток на скаффолдах ……………… 50
4.6 Подсчет и статистическая обработка полученных данных……………….. 51
5 Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и ресурсосбережение …. 54
5.1 Оценка коммерческого потенциала и перспективности проведения
научных исследований с позиции ресурсоэффективности и
ресурсосбережения………………………………………………………………………. 54
5.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования ………….. 54
5.1.2 Анализ конкурентных технических решений…………………………. 55
5.1.3 SWOT-анализ………………………………………………………………….. 58
5.1.4 Оценка готовности проекта к коммерциализации …………………… 61
4.1.5. Методы коммерциализации результатов научно-технического
исследования …………………………………………………………………………………. 63
4.1.6 Организационная структура проекта ……………………………………. 64
5.2 Планирование научно-исследовательских работ……………………………. 65
5.2.1. Структура работ в рамках научного исследования …………………. 65
5.2.2. Определение трудоемкости выполнения работ ……………………… 66
5.2.3. Разработка графика проведения научного исследования …………. 66
5.2.4 Бюджет научно-технического исследования (НТИ) ………………… 68
Автоклав паровой Tuttnauer 2340 МК………………………………………….. 70
Центрифуга Sigma 2-6E ………………………………………………………………… 70
5.3 Определение ресурсной (ресурсосберегающей), финансовой,
бюджетной, социальной и экономической эффективности исследования .. 74
6 Социальная ответственность…………………………………………………………… 77
Введение……………………………………………………………………………………. 77
6.1 Правовые и организационные вопросы обеспечения безопасности……. 77
6.2 Производственная безопасность ………………………………………………… 78
6.2.1 Анализ опасных и вредных производственных факторов …………. 79
6.2.1.1 Химические (токсические, раздражающие) …………………………. 79
6.2.1.2 Отсутствие или недостаток естественного света ………………….. 81
6.2.1.3 Превышение уровня шума ………………………………………………. 83
6.2.1.4 Отклонение показателей микроклимата ……………………………… 83
6.2.2 Анализ опасных факторов производственной среды ……………….. 84
6.2.2.1 Повышенная или пониженная температура поверхностей ……… 84
6.2.2.2 Повышенное значение напряжения в электрической цепи,
замыкание которой может произойти через тело человека……………………….. 85
6.2.3 Обоснование мероприятий по снижению уровней воздействия
опасных и вредных факторов на исследователя …………………………………….. 86
6.3 Экологическая безопасность……………………………………………………… 87
6.4 Чрезвычайные ситуации …………………………………………………………… 87
6.4.1 Пожаровзрывоопасные факторы …………………………………………. 87
6.4.2 Безопасность в чрезвычайных ситуациях ……………………………… 88
Заключение …………………………………………………………………………………… 90
Список публикаций…………………………………………………………………………. 92
Список использованной литературы …………………………………………………… 93
Приложение А ……………………………………………………………………………….. 99

В последние три десятилетия теме регенерации тканей уделяется
огромное внимание в области здравоохранения. Ключевой концепцией
тканевой инженерии является использование биоматериалов для поддержки
роста новых клеток и восстановления тканей человека. Вместо того, чтобы
быть «пассивными наблюдателями», данные биоматериалы должны
обеспечивать как физическую основу для клеток, так и сигналы, влияющие на
их поведение [1].
Дизайн биоматериалов непрерывно эволюционирует в течение
последних десятилетий. Биоматериалы могут быть адаптированы под любую
форму и применяются для обновления или восстановления функции больных,
травмированных или разрушенных тканей в организме человека.
Биоматериалы могут быть использованы для изготовления синтетических
каркасов, называемых скаффолдами, матрицами или 3D-конструкциями.
Каркасы – это трехмерные пористые твердые структуры, которые
способны взаимодействовать с клетками, обеспечивая транспорт газов,
питательных веществ и регуляторных факторов. Одним из основным свойств
является обеспечение выживания, пролиферации и, в некоторых случаях,
дифференциации клеток [2].
Целью магистерской диссертации является определение
биосовместимости полимерных скаффолдов с использованием эмбриональных
фибробластов мыши линии 3T3-L1.
Поставленные задачи:
 Изготовление полимерных скаффолдов методом
электроспиннинга;
 Оценка цитотоксичности полученных биоматериалов in vitro с
использованием клеточных культур;
 Изучение биосовместимости исходных и модифицированных
полимеров;
 Разработка протокола фиксации и окраски клеток на полимерных
скаффолдах.
Областью применения данной темы является биомедицина, химическая
технология и материаловедение.
Полимерные скаффолды применяются в качестве тканезамещающих
компонентов для тканевой инженерии и регенеративной медицины. Научная
новизна заключается в том, что данная работа впервые демонстрирует
исследования цитотоксичность и биосовместимости модифицированных
восстановленным оксидом графена скаффолдов на основе
полигидроксибутирата, который обладает пьезоэлектрическим эффектом.
1 Обзор литературы
1.1 Роль тканевой инженерии в медицине
Травмы и заболевания могут привести к повреждению и дегенерации
тканей в организме человека, что требует лечения для облегчения их
восстановления, замены или регенерации. Текущий золотой стандарт лечения
– использование аутотрансплантатов (костные трансплантаты, взятые из
донорского участка в реципиентный участок во время операции); однако
недостатками являются ограниченное количество доноров, длительное время
операции, риск заражения донорского участка. Аллотрансплантаты – второй
наиболее распространенный подход к костной пластике, при котором костная
ткань пересаживается от донора, часто от трупа [3]. По сравнению с
аутотрансплантатами, аллотрансплантаты менее дороги, но обладают
пониженными остеоиндуктивными свойствами из-за отсутствия клеточного
компонента в их составе [4,5]. Аллотрансплантаты, вероятно, будут
гистосовместимы, но они могут быть иммуногенными и могут передавать
инфекции [6]. В результате наблюдается растущий интерес и многочисленные
попытки разработать синтетические кости, заменители трансплантата, для
сокращения использования аутотрансплантатов и аллотрансплантатов в
хирургических операциях [3].
Первые сообщения о попытках восстановить потерянную или
поврежденную кость с использованием лабораторных материалов относятся к
началу девятнадцатого века, когда хирурги начали исследовать использование
фосфатов кальция в качестве костных трансплантатов. С тех пор имплантаты,
используемые для лечения костных дефектов, эволюционировали от
имплантатов, предназначенных для замены утраченной кости простым
заполнением объема дефекта биологически инертным веществом, до
стратегий регенерации функциональной костной ткани с использованием
биологически активных (биоактивных) материалов. В последующие годы
были введены различные типы материалов, и инженерия костной ткани в
конечном итоге стала независимой областью исследований в 1990-х годах.
Сегодня достижения в области синтеза и обработки материалов, а также наше
более глубокое понимание биологии и структуры костей открывают новые
возможности для разработки все более сложных материалов для инженерии
костной ткани [7].
Тканевая инженерия определяется как конвергенция передовых наук о
материалах, науках о стволовых клетках, физике, биологии развития и
клинической трансляции для регенерации сложных тканей и систем органов.
[5] Этот трансдисциплинарный подход основан на сочетании последних
достижений, достигнутых в каждой из этих разрозненных областей, с
клинической перспективой для разработки высокотрансляционных
технологий для регенерации сложных тканей и органов. В этих различных
областях передовая наука о материалах и инженерия являются неотъемлемой
частью разработки интеллектуальных биоматериалов, которые могут
модулировать клеточные функции и использовать врожденный
регенеративный потенциал организма [3].
1.2 Инженерия костной ткани
Целью инженерии костной ткани является оптимизация ресурсов
инженерии материалов и биологических наук для улучшения регенерации
новой кости. Она включает использование биоматериалов для лечения
дефектов костей вследствие переломов, остеопороза, остеоартрита,
новообразований в виде целых протезов, каркасов, гидрогелей и клеток. Был
обнаружен ряд успешных результатов на животных моделях заушных тромбов
с использованием биоматериалов и клеток, взятых от первичных взрослых
остеобластов до мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
Регенерация костей – сложный и комплексный процесс, который инициирует
миграцию и рекрутирование клеток-остеопрогениторов, сопровождающихся
их пролиферацией, дифференцировкой, образованием матрикса и
обновлением костей [8].
Фиксация перелома кости обычно проходит в пять этапов. Сначала
идет фаза, в которой клетки покоились на поверхности участков перелома,
позже некоторые клетки могут рассасываться в пределах участка
расположения. Этот процесс резорбции осуществляется клетками
остеокластов. Как правило, реконструкция кости – это процесс, который
продолжается всю жизнь. Слабая кость заменяется новой в течение года. В
процессе ремоделирования перелом также заживает. В случае, когда
образование кости и резорбция кости не уравновешиваются друг с другом,
возникают дефекты кости, например, остеопороз. В основном есть два вида
клеток, которые отвечают за формирование костей и их разрушение. Эти
клетки называются остеобластами и остеокластами соответственно [9].
Поставка кальция также создает взаимодействие между остеокластами и
клетками остеобластов в местах ремоделирования. Начальные фазы процесса
ремоделирования кости происходят за недели, а полный процесс
ремоделирования – за месяцы. В зависимости от возраста, пола, образа жизни
и расположения кости скорость их заживления также различается [10].
1.3 Определение понятия «скаффолд»
Скаффолд – одно из лучших решений для фиксации переломов костей
при тяжелых травмах. Скаффолды представляют собой высокопористые
трехмерные структуры, сделанные из биоматериалов, которые используются
для функциональной и структурной замены или регенерации естественных
тканей человеческого тела. Могут быть созданы разной формы, способны
имитировать природный внеклеточный матрикс кости и создавать трехмерную
(3D) атмосферу, в которой клетки прикрепляются и пролиферируют. Целью
каркасов является обеспечение такой активности клеток, как миграция,
пролиферация, прикрепление и дифференциация, а также для обеспечения
транспортировки кислорода и питательных веществ.
В идеале скаффолд должен иметь следующие характеристики:
 трехмерный и высокопористый с взаимосвязанной сетью пор для
роста клеток, потокового транспорта питательных веществ и метаболических
отходов;
 биосовместимые и биорезорбируемые с контролируемой
скоростью разложения и резорбции, чтобы соответствовать росту клеток и
тканей in vitro или in vivo;
 подходящая химия поверхности для прикрепления, миграции,
пролиферации и дифференциации клеток;
 механические свойства, соответствующие свойствам тканей в
месте имплантации [1].

В ходе исследования был проведен анализ литературы по изучению
скаффолдов, материалов для их изготовления, а также технологий работы с
клеточными культурами. Экспериментальная часть включала исследование
цитотоксичности и биосовместимости исходных и модифицированных
скаффолдов на основе полимеров PCL, PHB, PHB+rGO.
Для оценки биоматериалов на цитотоксичность на эмбриональных
фибробластах мыши линии 3T3-L1 использовались колориметрические
методы (резазуриновый и МТТ тесты).
В процессе исследования был разработан оптимизированный протокол
окрашивания флуоресцентными красителями клеток для визуализации их
роста на поверхности 3D-скаффолдов.
Оценка пролиферации клеток на различных скаффолдах показала, что
оптимальной для роста клеток поверхностью обладает полимер PHB
модифицированный восстановленным оксидом графена. Рост клеток на
модифицированных скаффолдах почти в 11 раз выше, чем на
немодифицированных полимерах.
Данный эффект предположительно связан с изменением поверхности
скаффолдов. Более высокая гидрофильность и шероховатость
модифицированного материала облегчает прикрепление и способствует росту
клеток на нем.
Была проведена оценка конкурентоспособности технических решений,
а также составлен график проведения научного исследования. Исходя из
полученных расчетов в разделе «Финансовый менеджмент,
ресурсоэффективность и ресурсосбережение», данное исследование
соответствует современным требованиям финансовой и ресурсной
эффективности.
Проведен анализ опасных и вредных факторов при разработке и
эксплуатации проектированного решения. Вопросы безопасности были
рассмотрены в соответствии с нормативными документами ГОСТ и СанПиН.
Произведен расчет вредного фактора – недостаточной освещенности.
Подсчитано, что освещенность соответствует санитарным нормам.
Исследование проведено с учетом требований безопасности, предъявляемых
инженеру со стороны социальной ответственности.
По результатам исследований сделаны следующие выводы:
• Получены полимерные скаффолды PCL, PHB и PHB (+ reduced
graphene oxide) методом электроспиннинга;
• Установлено отсутствие токсического действия материалов PCL,
PHB и PHB+rGO в эксперименте In vitro;
• Изучена биосовместимость скаффолдов, изготовленных из PCL,
PHB и PHB+rGO на клеточных культурах, показана более высокая
пролиферативная активность клеток на модифицированном скаффолде
PHB+rGO;
• Разработан протокол фиксации и окраски клеток на 3D каркасах с
использованием флуоресцентных красителей.
Список публикаций
1. Хан Е. А. Влияние модификации поверхности полимерных скэффолдов
на их адгезивное свойство // Химия и химическая технология в XXI
веке: материалы XXII Международной научно-практической
конференции студентов и молодых ученых , Томск, 17-21 Мая 2021. –
Томск: ТПУ, 2021 – C. 372-373;
2. Хан Е. А., Плотников Е.В., Сурменева М.А., Сурменев Р. А. Оценка
свойства биосовместимости полимерных скэффолдов на основе
клеточных технологий // Сборник трудов международной конференции
по науке и технологиям «Россия-Корея-СНГ», Москва, 19–21 октября
2020 г. – Новосибирск: Изд-во НГТУ, 2020. – С. 65-69;
3. Хан Е. А. Оценка биосовместимости скэффолдов с использованием
эмбриональных фибробластов // Химия и химическая технология в XXI
веке: материалы XXI Международной научно-практической
конференции студентов и молодых ученых , Томск, 21-24 Сентября
2020. – Томск: ТПУ, 2020 – C. 333-334.

1.O’Brien F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering //
Materials Today – 2011, Vol. 14(3), P.88–95;
2.Dhandayuthapani B., Yoshida Y., Maekawa T., Kumar D. S. Polymeric
Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review // Internat. Jour. of Polym.
Scien. – 2011, P.1–19;
3.Slutsky D. Bone Graft Substitutes / Principles and Practice of Wrist
Surgery – 2010, Imprint: Saunders, P.277–288;
4.Sung H-J., Meredith C., Johnson C. The effect of scaffold degradation
rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis // Biomaterials – 2004, Vol.
24. P.5735–5742;
5.Santoro M., Shah S.R., Walker J.L. Poly(lactic acid) nanofibrous
scaffolds for tissue engineering // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2016. Vol. 107. P. 206-
212;
6.Bose S., Sarkar N. Natural Medicinal Compounds in Bone Tissue
Engineering // Trends in Biotechnology – 2019, Vol. 38(4), P.404-417;
7.Koons G. L., Diba M., Mikos A. G. Materials design for bone-tissue
engineering // Nature Reviews Materials – 2020, Vol. 5, P.584-603;
8.Kargozar S., Mozafari M., Hamzehlou S., Brouki Milan P., Kim H.-
W., Baino F. Bone Tissue Engineering Using Human Cells: A Comprehensive
Review on Recent Trends, Current Prospects, and Recommendations // Applied
Sciences – 2019, Vol. 9(1), P.174;
9.Langdahl, B., Ferrari, S., & Dempster, D. W. Bone modeling and
remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis //
Therap. Adv. in Mus.Dis. – 2016, Vol. 8(6), P.225–235;
10. Prasad A. State of art review on bioabsorbable polymeric scaffolds for
bone tissue engineering // Materials today proceedings – 2021, Vol. 44, Part 1,
P.1391-1400;
11. Ribeiro C. et al. Piezoelectric polymers as biomaterials for tissue
engineering applications // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces – 2015. – Т. 136.
– P.46-55;
12. Cho S. J., Jung S. M., Kang M., Shin H. S., Youk J. H. Preparation of
hydrophilic PCL nanofiber scaffolds via electrospinning of PCL/PVP- b -PCL block
copolymers for enhanced cell biocompatibility // Polymer – 2015, Vol. 69, P.95–
102;
13. Sadat-Shojai M., Khorasani M.-T., Jamshidi A. A new strategy for
fabrication of bone scaffolds using electrospun nano-HAp/PHB fibers and protein
hydrogels // Chem. Engin. Journal – 2016, Vol. 289, P.38–47;
14. Yang C. E. What is the piezoelectric effect? / Electronic design. – Sept.
2016;
15. Heywang W., Lubitz K., Wersing W. (ed.). Piezoelectricity: evolution
and future of a technology. – Springer Science & Business Media, 2008. – P. 114;
16. Tandon B., Blaker J. J., Cartmell S. H. Piezoelectric materials as
stimulatory biomedical materials and scaffolds for bone repair // Acta Biomaterialia
– 2018, Vol. 73, P.1–20;
17. Chorsi M. T., Curry E. J., Chorsi H. T., Das R., Baroody J., Nguyen T.
D. Piezoelectric Biomaterials for Sensors and Actuators // Advanced Materials –
2018, P.1802084;
18. Allen M. J., Tung V. C., Kaner R. B. Honeycomb Carbon: A Review of
Graphene // Chemical Reviews – 2010, Vol.110(1), P.132–145;
19. Daneshmandi L., Barajaa M., Tahmasbi Rad A., Sydlik S. A.,
Laurencin C. T. Graphene‐ Based Biomaterials for Bone Regenerative Engineering:
A Comprehensive Review of the Field and Considerations Regarding
Biocompatibility and Biodegradation // Advanced Healthcare Materials – 2020,
P.2001414;
20. Pei S., Cheng H.-M. The reduction of graphene oxide // Carbon – 2012,
Vol. 50(9), P.3210–3228;
21. Yarin A. L., Koombhongse S., Reneker D. H. Taylor cone and jetting
from liquid droplets in electrospinning of nanofibers // Jour. of Appl. Phys. – 2001,
Vol. 90(9), P.4836–4846;
22. Ratner B. D. The Biocompatibility of Implant Materials // Host
Response to Biomaterials – 2015, P.37–51;
23. Anderson J. M. Biocompatibility // Polymer Science: A Comprehensive
Reference – 2012, P.363–383;
24. Schmid-Schönbein G. W. Analysis of inflammation // Ann. Rev. of
Biom. Eng. – 2006, Vol. 8(1), P.93–151;
25. Frens G., Kolloid Z. Controlled Nucleation for the Regulation of the
Particle Size in Monodisperse Gold Suspension // Nat. Phys. Science – 1973, Vol.
241, P.20-22;
26. Präbst K., Engelhardt H., Ringgeler S. Basic Colorimetric Proliferation
Assays: MTT, WST, and Resazurin // Cell Viability Assays – 2017, Vol. 1601, P.1–
17;
27. Gerlier D., Thomasset N. Use of MTT colorimetric assay to measure
cell activation // Jour. of Immun. Methods – 1986, Vol. 94(1-2), P.57–63.
28. Kuete V., Karaosmanoğlu O., Sivas H. Anticancer Activities of African
Medicinal Spices and Vegetables // Medic. Spices and Veget. from Africa – 2017,
P.271–297;
29. Maines M. D. Heme Oxygenase 1 Transgenic Mice as a Model to
Study Neuroprotection // Red. Cell Biol. and Gen. Part B – 2002, P.374–388;
30. Среды для культивирования клеток. [Электронный ресурс]. –
Режим доступа: https://www.dia-m.ru/page.php?pageid=51577 (дата обращения:
15.04.2022);
31. Azimi B., Milazzo M., Lazzeri A., Berrettini S. Electrospinning
Piezoelectric Fibers for Biocompatible Devices // Advanced Healthcare Materials –
2019, P. 1901287;
32. Mandal B. B., Gil E. S., Panilaitis B., Kaplan D. L. Laminar Silk
Scaffolds for Aligned Tissue Fabrication // Macromolecular Bioscience – 2012, Vol.
13(1), P.48–58;
33. Сайфитдинова А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для
анализа биологических образцов. Учебно-методическое пособие. – 2-е изд.,
испр. и доп. – СПб.: 2011, с. 110;
34. McCarthy L.R. and Senne J.E. Evaluation of acridine orange stain for
detection of microorganisms in blood cultures // J. Clin. Microbiol – 1980, Vol. 11,
P.281-285;
35. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К. Уотсон Дж.
Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. М75 и доп. Т. 2.:
Пер. с англ.- М.: Мир, 1993, с. 539;
36. Lichtman J. W., Conchello J.-A. Fluorescence microscopy // Nature
Methods – 2005, Vol. 2(12), P.910–919;
37. Fukada E., Ando Y. Piezoelectric properties of poly-β-hydroxybutyrate
and copolymers of β-hydroxybutyrate and β-hydroxyvalerate //International Journal
of Biological Macromolecules. – 1986. – Т. 8. – №. 6. – С. 361-366.
38. Risbud M.V., Bhonde R. R. Polyacrylamide-Chitosan Hydrogels: In
Vitro Biocompatibility and Sustained Antibiotic Release Studies // Drug Delivery –
2000, Vol. 7(2), P.69-75;
39. Yang X., Yang K., Wu S., Chen X. Cytotoxicity and wound healing
properties of PVA/ws-chitosan/glycerol hydrogels made by irradiation followed by
freeze–thawing // Radiat. Phys. and Chem. Vol. 79(5) – 2010, P. 606-611;
40. СтандартныезначениякритерияСтьюдента.[Электронный
ресурс]. – Режим доступа: http://kebc.papt59.host.ru/Upload/statistik/tab_st.htm
(дата обращения 20.04.2021);
41. “Трудовой кодекс Российской Федерации” от 30.12.2001 N 197- ФЗ
(ред. от 01.04.2019);
42. Федеральный закон от 22 июля 2008 г. N123–ФЗ Технический
регламент о требованиях пожарной безопасности [Электронный ресурс]. –
Режим доступа http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_148963/;
43. Технический регламент от 24 декабря 2009 г. О безопасности
средств индивидуальной защиты. Утв. постановлением Правительства РФ N
1213 [Электронныйресурс].–2009. -Режимдоступа:
http://www.rg.ru/2010/03/30/tehreg–site–dok.html;
44. ГОСТ 12.0.003-15. ССБТ Опасные и вредные производственные
факторы. Классификация. – М.: ИПК Из-во стандартов, 2015.-4;
45. ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда.
Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности.
[Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/5200233;
46. СанПиН 1.2.3685-21 “Гигиенические нормативы и требования к
обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды
обитания”.[Электронныйресурс].–Режимдоступа:
https://docs.cntd.ru/document/573500115 ;
47. ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда (ССБТ).
Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны (с
Изменением N 1) .- М.: ИПК Изд-во стандартов, 1974. – 4 с.;
48. ГОСТ12.1.038-82ССБТ.Электробезопасность.Предельно
допустимые значения напряжений прикосновения и токов (с изменением №1).
[Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/gost-12-1-
038-82-ssbt ;
49. СП 52.13330.2016. Свод правил. Естественное и искусственное
освещение.[Электронныйресурс].–Режимдоступа:
https://docs.cntd.ru/document/456054197 ;
50. ГОСТ17.1.3.13-86.Охрана природы.Гидросфера.Общие
требования к охране поверхностных вод от загрязнений. [Электронный
ресурс].–Режимдоступа:
www.consultant.ru/cons/cgi/online.cgi?req=doc&base=OTN&n=8515;
51. Федеральный закон от 22 июля 2008 г. N123–ФЗ Технический
регламент о требованиях пожарной безопасности [Электронный ресурс].–
Режим доступа http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_148963/;
52. ГОСТ 22.0.07-95. Безопасность в чрезвычайных ситуациях.
Источникитехногенныхчрезвычайныхситуаций.Классификацияи
номенклатура поражающих факторов и их параметров. – М.: Госстандарт
России, 1995.

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?
Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

    Нажимая на кнопку, я соглашаюсь на обработку персональных данных и с правилами пользования Платформой

    Последние выполненные заказы

    Хочешь уникальную работу?

    Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

    Александра С.
    5 (91 отзыв)
    Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повы... Читать все
    Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повышении уникальности текста и оформлении библиографических ссылок по ГОСТу.
    #Кандидатские #Магистерские
    132 Выполненных работы
    Елена Л. РЭУ им. Г. В. Плеханова 2009, Управления и коммерции, пре...
    4.8 (211 отзывов)
    Работа пишется на основе учебников и научных статей, диссертаций, данных официальной статистики. Все источники актуальные за последние 3-5 лет.Активно и уместно исполь... Читать все
    Работа пишется на основе учебников и научных статей, диссертаций, данных официальной статистики. Все источники актуальные за последние 3-5 лет.Активно и уместно использую в работе графический материал (графики рисунки, диаграммы) и таблицы.
    #Кандидатские #Магистерские
    362 Выполненных работы
    Дмитрий К. преподаватель, кандидат наук
    5 (1241 отзыв)
    Окончил КазГУ с красным дипломом в 1985 г., после окончания работал в Институте Ядерной Физики, защитил кандидатскую диссертацию в 1991 г. Работы для студентов выполня... Читать все
    Окончил КазГУ с красным дипломом в 1985 г., после окончания работал в Институте Ядерной Физики, защитил кандидатскую диссертацию в 1991 г. Работы для студентов выполняю уже 30 лет.
    #Кандидатские #Магистерские
    2271 Выполненная работа
    Анастасия Л. аспирант
    5 (8 отзывов)
    Работаю в сфере метрологического обеспечения. Защищаю кандидатскую диссертацию. Основной профиль: Метрология, стандартизация и сертификация. Оптико-электронное прибост... Читать все
    Работаю в сфере метрологического обеспечения. Защищаю кандидатскую диссертацию. Основной профиль: Метрология, стандартизация и сертификация. Оптико-электронное прибостроение, управление качеством
    #Кандидатские #Магистерские
    10 Выполненных работ
    Петр П. кандидат наук
    4.2 (25 отзывов)
    Выполняю различные работы на заказ с 2014 года. В основном, курсовые проекты, дипломные и выпускные квалификационные работы бакалавриата, специалитета. Имею опыт напис... Читать все
    Выполняю различные работы на заказ с 2014 года. В основном, курсовые проекты, дипломные и выпускные квалификационные работы бакалавриата, специалитета. Имею опыт написания магистерских диссертаций. Направление - связь, телекоммуникации, информационная безопасность, информационные технологии, экономика. Пишу научные статьи уровня ВАК и РИНЦ. Работаю техническим директором интернет-провайдера, имею опыт работы ведущим сотрудником отдела информационной безопасности филиала одного из крупнейших банков. Образование - высшее профессиональное (в 2006 году окончил военную Академию связи в г. Санкт-Петербурге), послевузовское профессиональное (в 2018 году окончил аспирантуру Уральского федерального университета). Защитил диссертацию на соискание степени "кандидат технических наук" в 2020 году. В качестве хобби преподаю. Дисциплины - сети ЭВМ и телекоммуникации, информационная безопасность объектов критической информационной инфраструктуры.
    #Кандидатские #Магистерские
    33 Выполненных работы
    Анна Н. Государственный университет управления 2021, Экономика и ...
    0 (13 отзывов)
    Закончила ГУУ с отличием "Бухгалтерский учет, анализ и аудит". Выполнить разные работы: от рефератов до диссертаций. Также пишу доклады, делаю презентации, повышаю уни... Читать все
    Закончила ГУУ с отличием "Бухгалтерский учет, анализ и аудит". Выполнить разные работы: от рефератов до диссертаций. Также пишу доклады, делаю презентации, повышаю уникальности с нуля. Все работы оформляю в соответствии с ГОСТ.
    #Кандидатские #Магистерские
    0 Выполненных работ
    Анастасия Б.
    5 (145 отзывов)
    Опыт в написании студенческих работ (дипломные работы, магистерские диссертации, повышение уникальности текста, курсовые работы, научные статьи и т.д.) по экономическо... Читать все
    Опыт в написании студенческих работ (дипломные работы, магистерские диссертации, повышение уникальности текста, курсовые работы, научные статьи и т.д.) по экономическому и гуманитарному направлениях свыше 8 лет на различных площадках.
    #Кандидатские #Магистерские
    224 Выполненных работы
    Ольга Р. доктор, профессор
    4.2 (13 отзывов)
    Преподаватель ВУЗа, опыт выполнения студенческих работ на заказ (от рефератов до диссертаций): 20 лет. Образование высшее . Все заказы выполняются в заранее согласован... Читать все
    Преподаватель ВУЗа, опыт выполнения студенческих работ на заказ (от рефератов до диссертаций): 20 лет. Образование высшее . Все заказы выполняются в заранее согласованные сроки и при необходимости дорабатываются по рекомендациям научного руководителя (преподавателя). Буду рада плодотворному и взаимовыгодному сотрудничеству!!! К каждой работе подхожу индивидуально! Всегда готова по любому вопросу договориться с заказчиком! Все работы проверяю на антиплагиат.ру по умолчанию, если в заказе не стоит иное и если это заранее не обговорено!!!
    #Кандидатские #Магистерские
    21 Выполненная работа
    Дмитрий Л. КНЭУ 2015, Экономики и управления, выпускник
    4.8 (2878 отзывов)
    Занимаю 1 место в рейтинге исполнителей по категориям работ "Научные статьи" и "Эссе". Пишу дипломные работы и магистерские диссертации.
    Занимаю 1 место в рейтинге исполнителей по категориям работ "Научные статьи" и "Эссе". Пишу дипломные работы и магистерские диссертации.
    #Кандидатские #Магистерские
    5125 Выполненных работ

    Другие учебные работы по предмету

    Математическое моделирование процесса производства автомобильных бензинов
    📅 2021год
    🏢 Национальный исследовательский Томский политехнический университет (ТПУ)
    Модификация атактического полипропилена
    📅 2018год
    🏢 Национальный исследовательский Томский политехнический университет (ТПУ)
    Исследование золы Северской ТЭЦ как наполнителя в серные композиционные материалы
    📅 2018год
    🏢 Национальный исследовательский Томский политехнический университет (ТПУ)