Разработка иммуноферментной тест-системы для анализа иммуногенности вакцины против вирусного гепатита А
Разработка качественного непрямого метода иммуноферментного анализа для выявления титра антител, специфичных к вирусу гепатита А, у вакцинированных мышей
Введение 14
Глава 1 Литературный обзор 17
1.1 Гепатит А –
1.1.1 История открытия, симптомы болезни и ее эпидемиология в настоящее время –
1.1.2 Cтроение вириона 21
1.1.3 Номенклатура и организация генома 24
1.2 Вакцины против ВГА 26
1.2.1 Характеристика вакцины АЛЬГАВАК® М 30
1.2.2 Характеристика стандарта препарата вакцины против ВГА 31
1.2.3 Основные требования, предъявляемые к контролю качества вакцины для
профилактики гепатита А 32
1.3 Твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) 34
1.4 Белковый электрофорез в полиакриламидном геле 37
Глава 2 Материалы и методы исследования 40
2.1 Оборудование –
2.2 Материалы 42
2.3 Реактивы и биологический материал –
2.4 Объекты исследования 44
2.5 Методы –
2.5.1 Получение антигена ВГА –
2.5.2 Иммунизация мышей –
2.5.3 Иммунизация кроликов 45
2.5.4 Метод очистки препаратов иммуноглобулинов (IgG) животных каприловой кислотой
с последующим высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония 46
2.5.5 Метод дополнительной очистки препаратов иммуноглобулинов (IgG) кроликов с
использование аффиной хроматографии –
2.5.6 Белковый электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия
(ПААГ-SDS) 47
Глава 3 Результаты исследования и их обсуждение 52
3.1 Характеристика непрямого ТИФА (формат I) 53
3.2 Характеристика непрямого «сэндвич» ТИФА (формат II) 54
3.3 Характеристика антигена ВГА –
3.4 Получение высокотитражных специфических сывороток экспериментальных
животных 56
3.5 Получение препарата очищенных IgG коликов и мышей 60
3.6 Отработка оптимальных условий для проведения ТИФА I 63
3.6.1 Выбор полистироловых планшетов для сорбции антигена ВГА/иммуноглобулинов IgG –
3.6.2 Подбор буферного раствора для сорбции антигена ВГА на планшетах для ТИФА 64
3.6.3 Отработка температурно-временных условий сорбции антигеном ВГА на полистироловых
планшетах 65
3.6.4 Отработка концентрации антигена ВГА, сорбированного на планшет для титрования –
3.7 Отработка оптимальных условий для проведения ТИФА II 66
3.8 Апробация определения антител против ВГА в сыворотке крови мышей с
использованием ТИФА I и II 70
Глава 4 Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и ресурсосбережение 73
4.1 Предпроектный анализ –
4.2 Диаграмма Исикавы –
4.3 Метод коммерциализации результатов научно-технического исследования 75
4.4 Инициация проекта –
4.5 Планирование управления научно-техническим проектом 76
4.6 Бюджет научного исследования 79
Глава 5 Социальная ответственность 86
5.1 Правовые и организационные вопросы обеспечения безопасности –
5.1.1 Правовые нормы трудового законодательства –
5.1.2 Организационные мероприятия при компоновке рабочей зоны 87
5.2 Производственная безопасность 89
5.3 Экологическая безопасность 97
5.4 Безопасность в чрезвычайных ситуациях 100
Заключение 104
Список использованных источников 105
Приложение А 112
Вирус гепатита А циркулирует повсеместно на всех континентах и вызывает одно из самых распространенных заболеваний человека – вирусный гепатит А (ВГА). В мире ежегодно регистрируется около 1,5 млн случаев заражения ВГА [1;2].
В отличие от гепатита В и С инфицирование гепатитом А не приводит к развитию хронической болезни печени и редко заканчивается смертельным исходом, но может вызывать симптомы, ослабляющие здоровье, и молниеносный гепатит (острую печеночную недостаточность), который зачастую является смертельным.
Отдельные случаи заболевания и эпидемии гепатита А происходят во всем мире и имеют тенденцию к цикличности [3].
Специального лечения гепатита А не существует. Восстановление после симптомов инфекции может быть медленным и занимать несколько недель или месяцев.
Наиболее эффективные средства борьбы с гепатитом А — это улучшение санитарии, повышение безопасности пищевых продуктов и расширение охвата вакцинацией.
В настоящее время на международном рынке имеются несколько инъекционных вакцин против ВГА на основе инактивированных и очищенных препаратов ВГА (названия: Havrix, Avaxim, Vaqta), производства Бельгии, Франции и США, соответственно. Вакцины лицензированы для детей в возрасте от одного года и старше. Содержание вирусного антигена различается между вакцинами, однако все они считаются безопасными и иммуногенными. Вакцины похожи друг на друга в плане эффективности и набора побочных эффектов, отличия заключаются в степени очистки и концентрации вирусного антигена [4]. Эти вакцины зарегистрированы и для применения на территории РФ.
В РФ с 1997 г. по 2011 г. выпускалась отечественная вакцина «ГЕП-А-ин- ВАК», которая стимулировала образование в организме специфических антител,
14
обеспечивая длительный иммунитет. По своим качествам вакцина не отличалась от зарубежных аналогов, профилактическая эффективность составляла 98% [5;6]. С 2011 г. АО «Вектор-Биальгам» выпускает вакцину АЛЬГАВАК®М на основе нового штамма HAV, который отличается более высокой продуктивностью накопления вирусного урожая на перевиваемой культуре клеток линии 4647 при более коротком сроке культивирования. Вирусный штамм аттестован и лицензирован для производства вакцины, инактивированной формалином и сорбированной на гидроокиси алюминия [7].
Такая вакцина должна быть безопасна и содержать большое количество вирусного антигена, чтобы вызвать иммунный ответ и образование антител.
Главная проблема технологии производства инактивированных вакцин и состоит в том, чтобы в дозу было включено достаточное количество вирусного антигена.
Для оценки потенции иммуногенности вакцин необходимо количественное измерение содержания антигена в производственных партиях.
Согласно требованиям фармакопейной статьи ФС.3.31.0029.15 (ГФ XIII) для определения содержания антигена в полуфабрикатных продуктах в промежуточных стадиях производства и готовой вакцине и при определении индукции антител при исследовании иммунного ответа на введение препарата группе экспериментальных животных применяют метод твердофазного иммуноферментного анализа.
ИФА тест-системы могут быть коммерческого или внутреннего производства самих производителей вакцин. Для разработки или усовершенствования имеющихся тест-систем внутреннего производства также необходимы компоненты, коммерческого или внутреннего производства.
Целью данной работы являлась разработка качественного непрямого метода иммуноферментного анализа антител, специфичных к вирусу гепатита А у вакцинированных мышей.
В разделе «Социальная ответственность» были рассмотрены требования
безопасности, связанные с работой в лаборатории. Проанализированы вредные
и опасные производственные факторы. Выявлены предполагаемые источники
загрязнения окружающей среды. Также проведен анализ возможных
чрезвычайных ситуаций, которые могут возникнуть при проведении научно-
исследовательских работ.
Полученные результаты раздела содержат в себе основные рекомендации и
указания, обеспечивающие безопасность технологического процесса и
эксплуатации оборудования, и, требующие четкого их соблюдения.
Заключение
По результатам проведенного исследования:
1.Разработана схема иммунизации мышей и кроликов для получения
высокотитражных сывороток к вирусу гепатита А.
2. Получены вирусспецифические иммуноглобулины (IgG кролика и IgG
мыши) методами осаждения каприловой кислотой с высаливанием сульфатом
аммония и препаритивной хроматографией.
3. Отработаны условия постановки непрямого твердофазного
иммуноферментного анализа (ТИФА, формат I) и непрямого «сэндвич»
твердофазного иммуноферментного анализа («сэндвич» ТИФА, формат II) при
сорбции вирусспецифического биологического материала (антиген
ВГА/иммуноглобулинов IgG кролика):
• оптимальными условиями при разработке модельной тест-системы для
определения антител против ВГА в ТИФА I являются: проведение сорбции
антигена ВГА в разведении 1:100 в КБР рН 9,6±0,1 на планшетах для
титрования фирмы Costar (США), сорбцию необходимо проводить от 18 до
20 ч при +2-8°С или при +18-25°С;
• оптимальными условиями при разработке модельной тест-системы для
определения антител против ВГА в ТИФА II являются: проведение сорбции
IgG кролика в разведении 1:2000 в ФСБ рН 7,5±0,3, разведение антигена в
1% растворе казеина 1:100, использование планшетов для титрования
фирмы Costar (США), сорбцию необходимо проводить 4 ч при
+37,0°С±0,4°С.
4. Проведены сравнительные исследования по эффективности применения
двух форматов иммуноферментного анализа антител к вирусу гепатита А: ТИФА
I и ТИФА II.
Проведена оценка экономической эффективности данного процесса и
рассмотрено воздействие разработанных аспектов деятельности с точки зрения
социальной ответственности на человека и окружающую среду.
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.9 (343 отзыва)
4.2 (25 отзывов)
5 (22 отзыва)
4.9 (37 отзывов)
4.9 (66 отзывов)
4.1 (20 отзывов)
5 (428 отзывов)
5 (21 отзыв)
4.9 (5 отзывов)
