Разработка иммуноферментной тест-системы для анализа иммуногенности вакцины против вирусного гепатита А

Разработка качественного непрямого метода иммуноферментного анализа для выявления титра антител, специфичных к вирусу гепатита А, у вакцинированных мышей

Введение 14
Глава 1 Литературный обзор 17
1.1 Гепатит А –
1.1.1 История открытия, симптомы болезни и ее эпидемиология в настоящее время –
1.1.2 Cтроение вириона 21
1.1.3 Номенклатура и организация генома 24
1.2 Вакцины против ВГА 26
1.2.1 Характеристика вакцины АЛЬГАВАК® М 30
1.2.2 Характеристика стандарта препарата вакцины против ВГА 31
1.2.3 Основные требования, предъявляемые к контролю качества вакцины для
профилактики гепатита А 32
1.3 Твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) 34
1.4 Белковый электрофорез в полиакриламидном геле 37
Глава 2 Материалы и методы исследования 40
2.1 Оборудование –
2.2 Материалы 42
2.3 Реактивы и биологический материал –
2.4 Объекты исследования 44
2.5 Методы –
2.5.1 Получение антигена ВГА –
2.5.2 Иммунизация мышей –
2.5.3 Иммунизация кроликов 45
2.5.4 Метод очистки препаратов иммуноглобулинов (IgG) животных каприловой кислотой
с последующим высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония 46
2.5.5 Метод дополнительной очистки препаратов иммуноглобулинов (IgG) кроликов с
использование аффиной хроматографии –
2.5.6 Белковый электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия
(ПААГ-SDS) 47
Глава 3 Результаты исследования и их обсуждение 52
3.1 Характеристика непрямого ТИФА (формат I) 53
3.2 Характеристика непрямого «сэндвич» ТИФА (формат II) 54
3.3 Характеристика антигена ВГА –
3.4 Получение высокотитражных специфических сывороток экспериментальных
животных 56
3.5 Получение препарата очищенных IgG коликов и мышей 60
3.6 Отработка оптимальных условий для проведения ТИФА I 63
3.6.1 Выбор полистироловых планшетов для сорбции антигена ВГА/иммуноглобулинов IgG –
3.6.2 Подбор буферного раствора для сорбции антигена ВГА на планшетах для ТИФА 64
3.6.3 Отработка температурно-временных условий сорбции антигеном ВГА на полистироловых
планшетах 65
3.6.4 Отработка концентрации антигена ВГА, сорбированного на планшет для титрования –
3.7 Отработка оптимальных условий для проведения ТИФА II 66
3.8 Апробация определения антител против ВГА в сыворотке крови мышей с
использованием ТИФА I и II 70
Глава 4 Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и ресурсосбережение 73
4.1 Предпроектный анализ –
4.2 Диаграмма Исикавы –
4.3 Метод коммерциализации результатов научно-технического исследования 75
4.4 Инициация проекта –
4.5 Планирование управления научно-техническим проектом 76
4.6 Бюджет научного исследования 79
Глава 5 Социальная ответственность 86
5.1 Правовые и организационные вопросы обеспечения безопасности –
5.1.1 Правовые нормы трудового законодательства –
5.1.2 Организационные мероприятия при компоновке рабочей зоны 87
5.2 Производственная безопасность 89
5.3 Экологическая безопасность 97
5.4 Безопасность в чрезвычайных ситуациях 100
Заключение 104
Список использованных источников 105
Приложение А 112

В разделе «Социальная ответственность» были рассмотрены требования
безопасности, связанные с работой в лаборатории. Проанализированы вредные
и опасные производственные факторы. Выявлены предполагаемые источники
загрязнения окружающей среды. Также проведен анализ возможных
чрезвычайных ситуаций, которые могут возникнуть при проведении научно-
исследовательских работ.
Полученные результаты раздела содержат в себе основные рекомендации и
указания, обеспечивающие безопасность технологического процесса и
эксплуатации оборудования, и, требующие четкого их соблюдения.
Заключение
По результатам проведенного исследования:
1.Разработана схема иммунизации мышей и кроликов для получения
высокотитражных сывороток к вирусу гепатита А.
2. Получены вирусспецифические иммуноглобулины (IgG кролика и IgG
мыши) методами осаждения каприловой кислотой с высаливанием сульфатом
аммония и препаритивной хроматографией.
3. Отработаны условия постановки непрямого твердофазного
иммуноферментного анализа (ТИФА, формат I) и непрямого «сэндвич»
твердофазного иммуноферментного анализа («сэндвич» ТИФА, формат II) при
сорбции вирусспецифического биологического материала (антиген
ВГА/иммуноглобулинов IgG кролика):
• оптимальными условиями при разработке модельной тест-системы для
определения антител против ВГА в ТИФА I являются: проведение сорбции
антигена ВГА в разведении 1:100 в КБР рН 9,6±0,1 на планшетах для
титрования фирмы Costar (США), сорбцию необходимо проводить от 18 до
20 ч при +2-8°С или при +18-25°С;
• оптимальными условиями при разработке модельной тест-системы для
определения антител против ВГА в ТИФА II являются: проведение сорбции
IgG кролика в разведении 1:2000 в ФСБ рН 7,5±0,3, разведение антигена в
1% растворе казеина 1:100, использование планшетов для титрования
фирмы Costar (США), сорбцию необходимо проводить 4 ч при
+37,0°С±0,4°С.
4. Проведены сравнительные исследования по эффективности применения
двух форматов иммуноферментного анализа антител к вирусу гепатита А: ТИФА
I и ТИФА II.
Проведена оценка экономической эффективности данного процесса и
рассмотрено воздействие разработанных аспектов деятельности с точки зрения
социальной ответственности на человека и окружающую среду.