Сенсоры для обнаружения молекул с использованием оптических и электрохимических методов

В результате научного исследования были разработаны гибкие сенсоры, полученные с помощью лазерной интеграции серебряных наночастиц в полимер с последующим электрохимическим выращиванием кристаллов серебра. Сенсоры служат для детектирования кислой pH межклеточной среды раковых клеток с помощью SERS и для обнаружения биологических молекул с помощью электрохимических методов.

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………… 14

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………… 16

1.1 Раковые заболевания и их диагностика стандартными методами …………. 16

1.2 SERS как перспективный метод диагностики раковых заболеваний …….. 18

1.3 Детектирование pH и АФК как метод обнаружения раковых клеток …….. 21

1.4 Плазмонный фотокатализ молекулы 4-нитробензолтиола ……………………. 25

1.5 Влияние pH и АФК на образование молекулы DMAB …………………………. 27

1.6 Сенсоры для электрохимического детектирования адреналина ……………. 29

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………………………. 33

2.1 Объекты исследования ………………………………………………………………………. 33

2.2 Сырье и материалы …………………………………………………………………………… 33

2.3 Оборудование …………………………………………………………………………………… 33

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ …………………………………………………………. 34

3.1 Изготовление подложек AgLIMPc/AgEC/4-NBT …………………………………. 34

3.2 Культивирование клеточной линии MDA-MB-231 и отбор проб ………….. 36

3.3 Методика приготовления буфера Бриттона-Робинсона ……………………….. 37

3.4 Методика проведения SERS измерений ……………………………………………… 37

3.5 Методика проведения анализа антибактериальной активности
AgLIMPc/AgEC/4-NBT …………………………………………………………………………… 38

3.6 Методика подготовки материала для исследования подложек через кожу
……………………………………………………………………………………………………………… 39

3.7 Методика приготовления раствора адреналина …………………………………… 40

3.8 Методика изготовления электрохимического сенсора и исследование его
электрохимических свойств ……………………………………………………………………. 40
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………………………….. 41

4.1 Получение SEM и EDX изображений …………………………………………………. 41

4.2 Изучение эффективности электрохимического осаждения серебра на
AgLIMPc ……………………………………………………………………………………………….. 42

4.3 Изучение стабильности AgLIMPc/AgEC/4-NBT ………………………………….. 43

4.4 Изучение возможности повторного использования AgLIMPc/AgEC/4-NBT
……………………………………………………………………………………………………………… 45

4.5 Антибактериальная активность AgLIMPc/AgEC/4-NBT ………………………. 46

4.6 Получение спектров комбинационного рассеяния света AgLIMPc/AgEC/4-
NBT с pH буферами ……………………………………………………………………………….. 49

4.7 Получение спектров комбинационного рассеяния света AgLIMPc/AgEC/4-
NBT с межклеточной средой раковых клеток MDA-MB-231 …………………….. 51

4.8 Перспективы применения AgLIMPc/AgEC/4-NBT in vivo …………………….. 56

4.9 Детектирование адреналина на подложке AgLIMPc/AgEC/4-NBT………… 57

5. ФИНАНСОВЫЙ МЕНЕДЖМЕНТ, РЕСУРСОЭФФЕКТИВНОСТЬ И
РЕСУРСОСБЕРЕЖЕНИЕ ………………………………………………………………………….. 60

5.1 Предпроектный анализ ……………………………………………………………………… 60

5.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования ………………… 60

5.1.2 Анализ конкурентных технических решений с позиции
ресурсоэффективности и ресурсосбережения ………………………………………… 61

5.1.3 SWOT-анализ………………………………………………………………………………. 62

5.1.4 Оценка готовности проекта к коммерциализации ………………………….. 64

5.2 Инициация проекта …………………………………………………………………………… 65

5.2.1 Цели и результаты проекта …………………………………………………………… 65
5.2.2 Организационная структура проекта …………………………………………….. 66
5.3 Бюджет научного исследования …………………………………………………………. 68
5.3.1 Сырье, материалы, специальное оборудование, покупные изделия …. 68
5.3.2 Расчет затрат на оборудование для научно-экспериментальных работ
…………………………………………………………………………………………………………… 69
5.3.3 Основная заработная плата исполнителей темы …………………………….. 70
5.3.4 Дополнительная заработная плата исполнителей темы …………………… 71
5.3.5 Отчисления во внебюджетные фонды …………………………………………… 72
5.3.6 Накладные расходы ……………………………………………………………………… 72
5.3.7 Формирование бюджета затрат научно-исследовательского проекта . 73
5.3.8 Оценка сравнительной эффективности исследования …………………….. 73
5.4 Заключение по разделу …………………………………………………………………… 74
6. СОЦИАЛЬНАЯ ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ………………………………………………… 76
6.1 Правовые и организационные вопросы обеспечения безопасности ………. 77
6.1.1 Специальные (характерные для проектируемой рабочей зоны)
правовые нормы трудового законодательства ……………………………………….. 77
6.1.2 Организационные мероприятия при компоновке рабочей зоны ………. 78
6.2 Производственная безопасность ………………………………………………………… 80
6.2.1 Анализ вредных факторов производственной среды ………………………. 81
6.2.2 Анализ опасных факторов производственной среды ………………………. 87
6.2.3 Обоснование мероприятий по снижению уровней воздействия опасных
и вредных факторов на исследователя ………………………………………………….. 92
6.3 Экологическая безопасность ……………………………………………………………… 93
6.4 Безопасность в чрезвычайных ситуациях ……………………………………………. 94
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………………………………………………………………………………… 97
Список публикаций …………………………………………………………………………………… 99
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ …………………………………….. 100
Приложение А ………………………………………………………………………………………… 107

Целью данной работы была разработка сенсоров для обнаружения
молекул с использованием оптических и электрохимических методов путем
отслеживания изменений в плазмон-индуцированных каталитических реакциях.
В настоящем исследовании была изучена фотокаталитическая реакция
перехода молекулы 4-NBT в 4-ABT и DMAB на частицах серебра, которая, как
предполагается, зависит от pH среды.
В результате научного исследования нами были разработаны сенсоры,
которые обладают рядом преимуществ по сравнению с другими подобными
устройствами. Разработанные сенсоры получены с помощью лазерной
интеграции наночастиц серебра в полимер ПЭТ, благодаря чему удалось
создать электропроводящий композит применимый в гибкой электронике. Для
усиления SERS сигналов на подложках были электрохимически выращены
серебряные дендриты с большой площадью поверхности, структура которых
была изучена с помощью СЭМ и EDX.
Для возможного создания носимых датчиков для отслеживания наличия
раковых клеток в организме человека был проведен тест на антибактериальную
активность сенсоров. Для целей введения изготавливаемых устройств под
кожу, они должны обеспечивать защиту от антибактериальной инфекции.
Результаты показали проявление токсического эффекта по отношению к
грамположительным и грамотрицательным бактериям.
Функционализация подложек монослоем 4-NBT позволила создать
химически стабильные молекулярно-плазмонные структуры в течение
нескольких дней. Механическая стабильность была доказана путем помещения
сенсора в ультразвуковую ванну на несколько минут. В результате
колебательные спектры комбинационного рассеяния показали незначительное
падение уровня сигнала, временную и механическую стабильность
изготавливаемых сенсоров, что говорит о возможности их повторного
использования.
Чувствительный механизм разработанных устройств включает в себя
плазмонное усиление молекулярного зонда 4-NBT и отслеживание его
колебательного спектра. Так, например, нами были получены спектры
комбинационного рассеяния света межклеточной среды раковых клеток,
которая отличалась значениями pH в зависимости от дня культивирования. В
результате было установлено, что чем ниже значение pH межклеточной среды,
тем сильнее происходит реакция димеризации 4-NBT и образование 4-ABT с
появлением характеристических пиков. Полученные результаты исследования
могут быть использованы для изучения патологий, связанных с раковыми
заболеваниями.
Кроме того, были показаны электрохимические свойства проводимых
подложек для обнаружения молекулы адреналина в различных концентрациях.
Результаты демонстрируют, что полученные сенсоры AgLIMPc/AgEC/4-NBT
электрохимически чувствительны и дают окислительный отклик при
концентрации адреналина 0,52 мМ и выше.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Написана научная статья на английском языке «Molecular plasmonic
three-dimensional forests: Chemical sensors compatible with flexible
electronics and photocatalysis», которая подана на публикацию в журнал с
квартилем Q1.
2. Гридина М.В. «Оценка влияния микробиоты пациентов с болезнью
Паркинсона на экспрессионный профиль клеток нейробластомы в
эксперименте in vitro» // Материалы Всероссийской итоговой 78-ой
студенческой научной конференции им. Н. И. Пирогова. – Томск: Изд.
СибГМУ, 2019г. – С. 489
3. Перекуча Н.А., Гридина М.В., Иккерт О.П. «Определение
цитотоксического эффекта микроорганизмов, выделенных из пациентов с
болезнью Паркинсона, на клеточной линии U251» // Перспективы
развития фундаментальных наук: сборник трудов XVI Международной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Томск, 23–26
апреля 2019 г.): в 7 т. Т. 4: Биология и фундаментальная медицина / под
ред. И.А. Курзиной, Г.А. Вороновой. – Томск: Издательский Дом
Томского государственного университета, 2019. – 187 с.

1. Zhao N, Pan Y, Cheng Z, Liu H. Gold nanoparticles for cancer theranostics —
A brief update. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2016. p.
1630004. doi:10.1142/s1793545816300044
2. Heidari A (2018) Enhancing the Raman Scattering for Diagnosis and
Treatment of Human Cancer Cells, Tissues and Tumors Using Cadmium
Oxide(CdO)Nanoparticles.JToxicolRiskAssess4:012.
doi.org/10.23937/2572-4061.1510012Accepted:September26,2018:
Published: Septem
3. Koltai T. Cancer: fundamentals behind pH targeting and the double-edged
approach. Onco Targets Ther. 2016;9: 6343–6360.
4. Eurostat. Causes of death – deaths by country of residence and occurrence
[hlth_cd_aro] (Last update 05-03-2020, Extracted on 10.03.2020)
5. Anand P, Kunnumakkara AB, Sundaram C, Harikumar KB, Tharakan ST, Lai
OS, Sung B, Aggarwal BB: Cancer is a preventable disease that requires major
lifestyle changes. Pharm Res. 2008, 25: 2097-2116. 10.1007/s11095-008-9661-
9.
6. Hussain, S., Hofseth, L. & Harris, C. Radical causes of cancer. Nat Rev Cancer
3, 276–285 (2003). https://doi.org/10.1038/nrc1046
7. Szent-Gyorgyi A: The living state and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1977,
74: 2844-2847. 10.1073/pnas.74.7.2844.
8. Ferlay J, Ervik M, Lam F, Colombet M, Mery L, Piñeros M, et al. Global
Cancer Observatory: Cancer Today. Lyon: International Agency for Research
on Cancer; 2020 (https://gco.iarc.fr/today, по состоянию на февраль 2021г.).
9. Zhao N, Pan Y, Cheng Z, Liu H. Gold nanoparticles for cancer theranostics —
A brief update. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2016. p.
1630004. doi:10.1142/s1793545816300044
10. Guide to cancer early diagnosis. Geneva: World Health Organization; 2017.
Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO.
11. Blanco-Formoso, M. & Alvarez-Puebla, R. A. Cancer Diagnosis through
SERS and Other Related Techniques. Int. J. Mol. Sci. 21, (2020).
12. Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, Southgate J, Smith B, Selby P.
Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-
polymerasechainreaction.BrJCancer.1995;71(2):278-281.
doi:10.1038/bjc.1995.56
13. Yamaguchi K, Takagi Y, Aoki S, Futamura M, Saji S. Significant detection of
circulating cancer cells in the blood by reverse transcriptase-polymerase chain
reaction during colorectal cancer resection. Ann Surg. 2000;232(1):58-65.
doi:10.1097/00000658-200007000-00009.
14. Vendrell, M., Maiti, K. K., Dhaliwal, K. & Chang, Y.-T. Surface-enhanced
Raman scattering in cancer detection and imaging. Trends Biotechnol. 31,
249–257 (2013).
15. Bodelón, Gustavo et al. “Detection and imaging of quorum sensing in
Pseudomonas aeruginosa biofilm communities by surface-enhanced resonance
Raman scattering.” Nature materials vol. 15,11 (2016): 1203-1211.
doi:10.1038/nmat4720.
16. Howes PD, Chandrawati R, Stevens MM. Colloidal nanoparticles as advanced
biological sensors. Science. 2014;346:1247390–1247390
17. Banaei, N. et al. “Multiplex detection of pancreatic cancer biomarkers using a
SERS-based immunoassay.” Nanotechnology 28 45 (2017): 455101 .
18. Plou, Javier & García, Isabel & Charconnet, Mathias & Astobiza, Ianire &
García Astrain, Clara & Matricardi, Cristiano & Mihi, Agustin & Carracedo,
Arkaitz & Liz-Marzán, Luis. (2020). Multiplex SERS Detection of Metabolic
Alterations in Tumor Extracellular Media. Advanced Functional Materials. 30.
1910335. 10.1002/adfm.201910335.
19. Damaghi M, Wojtkowiak JW, Gillies RJ. pH sensing and regulation in cancer.
Frontiers in Physiology. 2013. doi:10.3389/fphys.2013.00370
20. New technology for the detection of pH. J Biochem Biophys Methods.
2005;63: 1–9.
21. Zhao M, Guo Y-S, Xu W-N, Zhao Y-F, Xie H-Y, Li H-J, et al. Far-red to
near-infrared fluorescent probes based on silicon-substituted xanthene dyes for
sensing and imaging. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2020. p. 115704.
doi:10.1016/j.trac.2019.115704
22. Ye X, Xiang Y, Wang Q, Li Z, Liu Z. A Red Emissive Two‐Photon
Fluorescence Probe Based on Carbon Dots for Intracellular pH Detection.
Small. 2019. p. 1901673. doi:10.1002/smll.201901673
23. Kai Cui, Chenchen Fan, Gaoxian Chen, Yuanyuan Qiu, Mingwang Li, Miao
Lin, Jian-Bo Wan, Changsi Cai, Zeyu Xiao. para-Aminothiophenol Radical
Reaction-Functionalized Gold Nanoprobe for One-to-All Detection of Five
ReactiveOxygenSpeciesInVivo.AnalyticalChemistry2018,90
(20),1213712144.https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b03116
24. Pan C, Li X, Sun J, Li Z, Zhang L, Qian W, et al. A Multiplexed SERS-Active
Microneedle for Simultaneous Redox Potential and pH Measurements in Rat
Joints.ACSAppliedBioMaterials.2019.pp.2102–2108.
doi:10.1021/acsabm.9b00117
25. Chen P, Wang Z, Zong S, Chen H, Zhu D, Zhong Y, et al. A wide range
optical pH sensor for living cells using Au@Ag nanoparticles functionalized
carbon nanotubes based on SERS signals. Anal Bioanal Chem. 2014;406:
6337–6346.
26. Zong S, Wang Z, Yang J, Cui Y (2011) Intracellular pH sensing using p-
aminothiophenol functionalized gold nanorods with low cytotoxicity. Anal
Chem 83(11):4178–4183. doi:10.1021/ac200467z.
27. Mengxi Xu, Xin Ma, Ting Wei, Zhi-Xuan Lu, and Bin Ren. In Situ Imaging of
Live-Cell Extracellular pH during Cell Apoptosis with Surface-Enhanced
Raman Spectroscopy. Anal. Chem. 2018, 90, 13922−13928.
28. Фотокатализ // Википедия. [2020]. Дата обновления: 28.12.2020. URL:
https://ru.wikipedia.org/?curid=542192&oldid=111360686 (дата обращения:
24.03.2021).
29. Golubev AA, Khlebtsov BN, Rodriguez RD, Chen Y, Zahn DRT. Plasmonic
Heating Plays a Dominant Role in the Plasmon-Induced Photocatalytic
Reduction of 4-Nitrobenzenethiol. The Journal of Physical Chemistry C. 2018.
pp. 5657–5663. doi:10.1021/acs.jpcc.7b12101.
30. Boerigter, C., Aslam, U. & Linic, S. Mechanism of Charge Transfer from
Plasmonic Nanostructures to Chemically Attached Materials. ACS Nano 10,
6108–6115 (2016).
31. Jingang Wang, Yong Dong, Yuanzuo Li, Zhenglong Zhang, Fengcai Ma. pH-
Dependent plasmonic catalysis of 4-nitrobenzenethiol in aqueous environment.
SpectrochimicaActaPartA:MolecularandBiomolecular
Spectroscopy,Volume153,2016,Pages542-545,ISSN1386-1425,
https://doi.org/10.1016/j.saa.2015.09.033.
32. Heather Price. Air Analysis | Field Portable Instruments for the Measurement
of Airborne Hazards. Editor(s): Paul Worsfold, Colin Poole, Alan Townshend,
Manuel Miró, Encyclopedia of Analytical Science (Third Edition). Academic
Press 2019, Pages 40-43, ISBN 9780081019849, https://doi.org/10.1016/B978-
0-12-409547-2.12680-0.
33. F.R. Simões, M.G. Xavier. Electrochemical Sensors. Editor(s): Alessandra L.
Da Róz, Marystela Ferreira, Fábio de Lima Leite, Osvaldo N. Oliveira. In
Micro and Nano Technologies, Nanoscience and its Applications. William
AndrewPublishing,2017.Pages155-178,ISBN9780323497800,
https://doi.org/10.1016/B978-0-323-49780-0.00006-5.
34. Ewa Wierzbicka, Grzegorz D. Sulka. Fabrication of highly ordered
nanoporous thin Au films and their application for electrochemical
determination of epinephrine. Sensors and Actuators B: Chemical. Volume
222,2016.Pages270-279,ISSN0925-4005,
https://doi.org/10.1016/j.snb.2015.08.066.
35. Rodriguez, R. D., Shchadenko, S., Murastov, G., Lipovka, A., Fatkullin, M.,
Petrov, I., Tran, T. H., Khalelov, A., Saqib, M., Villa, N. E., Bogoslovskiy, V.,
Wang, Y., Hu, C. G., Zinovyev, A., Sheng, W., Chen, J. J., Amin, I., &
Sheremet, E. Ultra-Robust Flexible Electronics By Laser-Driven Polymer-
NanomaterialsIntegration. AdvancedFunctional
Materials. Https://Doi.Org/10.1002/Adfm.202008818