Сравнительное исследование конъюгатов с ферментной и серебряной метками методами спектрофотометрии и вольтамперометрии

Подбор оптимальных условий синтеза конъюгатов с ферментной и серебряной метками. Апробация конъюгатов для определения клещевого боррелиоза методами ИФА и вольтамперометрии.

РЕФЕРАТ ………………………………………………………………………………………………… 12

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………… 18

Глава 1. Литературный обзор……………………………………………………………………. 20

1.1 Получение ферментных конъюгатов ……………………………………………… 20

1.1.1 Перйодатный метод ………………………………………………………………….. 20

1.1.2 Гомобифункциональные сшивающие реагенты …………………………. 21

1.1.3 Геторобифункциональные сшивающие реагенты ………………………. 22

1.2 Способы оценки активности конъюгатов на основе пероксидазы хрена
1.3 Синтез биоконъюгатов на основе наночастиц металлов…………………. 25

1.3.1 Не ковалентный синтез биокнъюгатов на основе наночастиц
металлов …………………………………………………………………………………………… 26

1.3.2 Способы регистрации электрохимического сигнала от наночастиц
серебра ……………………………………………………………………………………………… 29

1.4 Классификация методов ИФА ………………………………………………………. 33

1.4.1 Гомогенные методы ИФА …………………………………………………….. 35

1.4.2 Гетерогенные методы ИФА ………………………………………………….. 35

1.4.3 Конкурентный метод ИФА …………………………………………………… 36

1.4.4 Неконкурентный метод ИФА ……………………………………………….. 36

1.5 Субстраты и способы детектирования в методах ИФА ………………….. 37

1.6 Болезнь Лайма: общие сведенья и способы диагностики ………………….. 39

Глава 2 Материалы и методы исследования ……………………………………………… 41

2.1 Приборы и оборудование ………………………………………………………………… 41

2.2 Реактивы …………………………………………………………………………………………. 41

2.3 Объект исследования ………………………………………………………………………. 42
2.4 Методы исследования ……………………………………………………………………… 42

2.4.1 Методика очистки иммуноглобулинов класса IgG ………………………… 42

2.4.2 Методика получения ПХК-AТ………………………………………………………. 43

Схема получения конъюгата пероксидазы хрена с иммуноглобулинами IgG
(ПХК-AТ): ……………………………………………………………………………………………. 43

2.4.3 Методика получения наночастиц серебра ……………………………………… 43

2.4.4 Методика подбора количества наночастиц серебра по отношению к
конъюгату ПХК-АТ – тест с хлоридом натрия ………………………………………. 44

2.4.5 Методика получения ПХК-АТ*Ag………………………………………………… 46

2.4.7 Методика приготовления растворов тетраметилбензидина ……………. 46

2.4.7 Методика приготовления раствора пероксидазы хрена………………….. 47

2.4.8 Методика записи спектров поглощения ПХ, ПХК-АТ*Ag и ПХК-АТ
…………………………………………………………………………………………………………….. 47

2.4.9 Методика проведения ИФА по выявлению иммуноглобулинов класса
G к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов ……………………………. 49

2.4.10 Методика вольтамперометрического детектирования ПХК-АТ*Ag 50

Глава 3 Обсуждение результатов ……………………………………………………………… 52

3.1 Каталическая активность не конъюгированной пероксидазы хрена (ПХ)
…………………………………………………………………………………………………………….. 52

3.2 Каталическая активность ПХК-АТ ………………………………………………….. 57

3.3 Каталическая активность ПХК-АТ*Ag ……………………………………………. 62

3.4 Сравнение каталитической активности ПХ, ПХ-АТ и ПХ-АТ*Ag ……. 68

3.5 Сравнительные испытания ПХК-АТ и ПХК-АТ*Ag для определения
антител к боррелиозу ……………………………………………………………………………. 69

3.6 Вольтамперометрическое определение серебряной метки
пероксидазного конъюгата ……………………………………………………………………. 70
Глава 4 Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и
ресурсосбережение…………………………………………………………………………………… 74

4.1 Предпроектный анализ ……………………………………………………………………. 74

4.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования ……………. 74

4.1.2 Анализ конкурентных технических решений с позиции
ресурсоэффективности и ресурсосбережения…………………………………….. 75

4.1.3 SWOT-анализ ……………………………………………………………………………. 76

4.1.4 Оценка готовности проекта к коммерциализации ………………………. 80

4.1.5 Метод коммерциализации результатов научно-технического
исследования…………………………………………………………………………………….. 83

4.2 Инициация проекта …………………………………………………………………………. 83

4.3 Планирование управления научно-техническим проектом……………….. 85

4.3.1 Иерархическая структура работ проекта ……………………………………. 85

4.3.2 План проекта …………………………………………………………………………….. 86

4.4 Бюджет научного исследования ………………………………………………………. 88

4.4.1 Организационная структура проекта …………………………………………. 97

4.4.2 План управления коммуникациями проекта ………………………………. 97

4.4.3 Реестр рисков проекта ………………………………………………………………. 98

4.5 Определение ресурсной (ресурсосберегающей), финансовой,
бюджетной, социальной и экономической эффективности ……………………. 99

4.5.1 Оценка абсолютной эффективности исследования …………………….. 99

4.5.2 Оценка сравнительной эффективности исследования ………………. 104

Глава 5 Социальная ответственность ………………………………………………………. 108

Введение …………………………………………………………………………………………….. 108

5.1 Правовые и организационные вопросы обеспечения безопасности … 108
5.2 Производственная безопасность ……………………………………………………. 109

5.2.1 Анализ опасных и вредных производственных факторов и
обоснование мероприятий по снижению уровней их воздействия на
исследователя (работающего) ………………………………………………………….. 111

5.3 Экологическая безопасность………………………………………………………….. 119

5.3.1 Анализ влияния объекта и процесса исследования на окружающую
среду ………………………………………………………………………………………………. 119

5.3.2 Мероприятия по защите окружающей среды …………………………… 120

5.4 Безопасность в чрезвычайных ситуациях ……………………………………….. 121

5.4.1 Анализ вероятных ЧС, которые могут возникнуть в лаборатории при
проведении исследований ……………………………………………………………….. 121

5.4.2 Обоснование мероприятий по предотвращению ЧС и разработка
порядка действия в случае возникновения ЧС …………………………………. 122

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ……………………………………………………………………………………… 125

Список используемых источников ………………………………………………………….. 126

ПРИЛОЖЕНИЕ А ………………………………………………………………………………….. 130

Проведение любого исследования в химической лаборатории требует
знание техники безопасности. Перед началом работы в лаборатории нужно
провести инструктаж сотрудника по технике безопасности, рассказать про меры
устранения вероятных чрезвычайных ситуаций, а также рассказать про
правильную эксплантацию оборудования лаборатории. Так же следует обратить
внимание на факторы, негативно влияющие на окружающую среду, и провести
ряд мероприятий по их минимизации. Рабочее место сотрудника должно быть
организовано согласно требованиям ГОСТа. Отношения между сотрудником и
руководителем должны основываться на Трудовом Кодексе Российской
Федерации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенного исследования:
1) Синтезирован конъюгат ПХК-АТ методом перйодатного ковалетного
сшивания;
2) Синтезирован конъюгат ПХК-АТ*Ag;
3) Исследована каталитическая активность конъюгатов ПХК-АТ и ПХК-
АТ*Ag, в отношении ТМБ методом спектрофотомерии;
4) Проведены сравнительные испытания конъюгатов ПХК-АТ и ПХК-АТ*Ag
по определению клещевого боррелиоза методом ИФА;
5) Использован конъюгат ПХК-АТ*Ag для вольтамперометрического
определения иммуноглобулинов человека класса G к клещевому боррелиозу
через регистрацию сигнала окисления серебряной метки;
6) Сформулированы рекомендации по использованию конъюгата ПХК-
АТ*Ag для иммуноанализа антител методами спектрфотометрии и
вольтамперометрии.

1. Иммуноглобулины I Под ред. Г. Литман, Р. Гуд. — М.: Мир, 1981.
2. Теория и практика иммуноферментного анализа. / Т 33 А.М Егоров, А.П
Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М Гаврилова – М.: Высш. шк., 1991,-288 с.
3. И. В. Березин, А. А. Клесов. Практический курс химической и
ферментативной кинетики. — М.: Изд-во МГУ, 1976.
4. С. Д. Варфоломеев, С. В. Зайцев. Кинетические методы в биохимических
исследованиях. — М.: МГУ, 1982.
5. Jiang, Bing; Duan, Demin; Gao, Lizeng; Zhou, Mengjie; Fan, Kelong; Tang,
Yan; Xi, Juqun; Bi, Yuhai; Tong, Zhou; Gao, George Fu; Xie, Ni; Tang, Aifa;
Nie, Guohui; Liang, Minmin; Yan, Xiyun (2018). Standardized assays for
determining the catalytic activity and kinetics of peroxidase-like nanozymes.
Nature Protocols, (), –. doi:10.1038/s41596-018-0001-1
6. Vineh, M. B., Saboury, A. A., Poostchi, A. A., Rashid, A. M. & Parivar, K.
Stability and activity improvement of horseradish peroxidase by covalent
immobilization on functionalized reduced graphene oxide and biodegradation of
high phenol concentration. Int. J. Biol. Macromol. 17, 32776–32779 (2017).
7. Sidorov I.A., Prabakaran P., Dimitrov D.S. Non-covalent conjugation of
nanoparticles to antibodies via electrostatic interactions – A computational model
// J. Comput. Theor. Nanosci. American Scientific Publishers, 2007. Vol. 4, № 6.
P. 1103–1107.
8. Tanaka R. et al. A novel enhancement assay for immunochromatographic test
strips using gold nanoparticles // Anal. Bioanal. Chem. 2006. Vol. 385, № 8. P.
1414–1420.
9. Sokolov K. et al. Real-time vital optical imaging of precancer using anti-
epidermal growth factor receptor antibodies conjugated to gold nanoparticles //
Cancer Res. American Association for Cancer Research, 2003. Vol. 63, № 9. P.
1999–2004.
10.Szymanski M.S., Porter R.A. Preparation and quality control of silver
nanoparticle-antibody conjugate for use in electrochemical immunoassays // J.
Immunol. Methods. Elsevier, 2013. Vol. 387, № 1–2. P. 262–269.
11.Wan Y. et al. Highly Specific Electrochemical Analysis of Cancer Cells using
Multi-Nanoparticle Labeling // Angew. Chemie Int. Ed. 2014. Vol. 53, № 48. P.
13145–13149.
12.Walkey C.D. et al. Nanoparticle size and surface chemistry determine serum
protein adsorption and macrophage uptake // J. Am. Chem. Soc. 2012. Vol. 134,
№ 4. P. 2139–2147.
13.Verma A., Stellacci F. Effect of surface properties on nanoparticle-cell
interactions // Small. 2010. Vol. 6, № 1. P. 12–21.
14.Mitragotri S., Burke P.A., Langer R. Overcoming the challenges in administering
biopharmaceuticals: Formulation and delivery strategies // Nature Reviews Drug
Discovery. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 13, № 9. P. 655–672.
15.Христунова Е.П. Разработка электрохимического иммуносенсора на основе
наночастиц серебра для определения антител к вирусу клещевого
энцефалита. : дис. … канд. хим. наук : 02.00.02 / Христунова Екатерина
Петровна – Томск, 2020 – 120 с.
16.Mazzucchelli S. et al. Dependence of nanoparticle-cell recognition efficiency on
the surface orientation of scFv targeting ligands // Biomater. Sci. Royal Society
of Chemistry, 2013. Vol. 1, № 7. P. 728–735.
17. Общая фармакопейная статья метод иммуноферментного анализа.
ОФС.1.7.2.0033.15 Метод иммуноферментного анализа /
https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-7-2-0033-15-metod-immunofermentnogo-
analiza/ доступ свободный, дата обращения 15.04.2021.
18.Иммуноферментный анализ /Под ред. Г. Г. Нго, Г. М. Леикофф. — М.:
Мир, 1988.
19.Нго Г.Г., Ленкофф Г.М.(ред.) Иммуноферментный анализ. – М.: Мир, 1988.
– 446 с.
20.Ванеева Л.И., Гридчина И.Ю., Пантелеев О.А. и др. Изучение сорбционной
способности полистироловых планшетов, используемых в ИФА.// ЖМЭИ.
– 1986. – №9. – С. 44 – 48.
21.Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ // Соросовский
образовательный ж. № 12, 1999, с. 9-15
22.Чумак Р.М. Иммуноферментный анализ и рекомбинантные антигены //
Лабораторная диагностика. – 1999. – №3. – С. 3 – 6.
23.Esser P., Knudsen H., Nielsen V.et al. Solid Phase Guide. – Denmark:Nunc,
1999. – 50 p.
24.Иммунологические методы исследований / Под ред. И. Лефковитса, Б. Пер-
ниса, —М.: Мир, 1988.
25.Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure
labels: A review / Xiaomei Pei, Bing Zhang, Juan Tang, Bingqian Liu, Wenqiang
Lai, Dianping Tang // Analytica Chimica Acta. – 2013. – Vol. 758, Р. 1-18.
26.Иванская Н.В. Практическое пособие по иммуноферментному анализу. –
М.: Киев, 2003.
27.Введение в иммунологию / Л. В. Ирвинг, Е. X. Лерой, Б, В. Уильям.— М.:
Высшая школа, 1983.
28.Раевская Г.Е, Певец М.Я., Пилипенко В.Г., Ростопира Н.М., Ткачикова Л.
Получение пероксидазной конъюгатов для выявления ВИЧ-специфических
антител методом иммуноферментного анализа // Иммунология и
аллергология, 2002, № 2-3, С.39-42.
29.Гончаренко В.С., Раевская Е., Касьяненко Т.В., Ганова Л.А., Шимко Н.М.
сравнительное изучение использование в-фенилендиамину и
тетраметилбензидина в иммуноферментном анализе для диагностики ВИЧ-
инфекции, гепатитов В и С и сифилиса // Иммунология и аллергология,
2002, № 4, с.18-21.
30.Неизотопные методы иммуноанализа//Итоги науки и техники. — М.:
ВИНИТИ, 1987. Сер. Биотехнология. Т. 3.
31.Кишкин А.А Иммунологические и серологические исследования в
клинической практике. – М.: ООО «Медицинское информационное
агентство», 2006. -536 с.
32.Карпищенко А. И. (ред.) Медицинская лабораторная диагностика
(программы и алгоритмы): Справочник. –СПБ.: Интермедика, 1997.- 304 с.
33.Трудовой кодекс Российской Федерации от 30 декабря 2011 г. № 197-ФЗ (с
изм. от 5 апреля 2021 г.)
34.ГОСТ 12.1.005-88. Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие
санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны (с
Изменением N 1)
35.ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда (ССБТ).
Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с
Изменениями N 1,2)
36.СанПиН 2.2.4.548-96. Гигиенические требования к микроклимату
производственных помещений
37.ГОСТ 12.1.003-83. Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Шум.
Общие требования безопасности (с Изменением N 1)
38.СП 52.13330.2016. Естественное и искусственное освещение.
Актуализированная редакция СНиП 23-05-95
39.ГОСТ Р 12.1.019-2017. Система стандартов безопасности труда (ССБТ).
Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
40.ТР ТС 019/2011Технический регламент «О безопасности средств
индивидуальной защиты» (с изменениями на 28 мая 2019).
41. ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие
требования безопасности.
42.СН 2.2.4/2.1.8.562–96. Шум на рабочих местах, в помещениях жилых,
общественных зданий и на территории застройки.
43.СП 52.13330.2016 Естественное и искусственное освещение.
Актуализированная редакция СНиП 23-05-95.
44.Строительные нормы и правила СНиП 23-05-95. Естественное и
искусственное освещение (утв. постановлением Минстроя РФ от 2 августа
1995 г. N 18-78) (с изменениями от 29 мая 2003 г.).
45.СанПиН 1.2.3685-21. «Гигиенические нормативы и требования к
обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов
среды обитания»
46. Методические указания «Расчет времени эвакуации при пожаре»
47.ГОСТ Р 22.0.07-95. Безопасность в чрезвычайных ситуациях. Источники
техногенных чрезвычайных ситуаций. Классификация и номенклатура
поражающих факторов и их параметров
48.Synthesis and Study of Silver Nanoparticles / W Sally D. Solomon, Mozghan
Bahadory, Aravindan V. Jeyarajasingam, Susan et al. // Journal of Chemical
Education. – 2007. – Vol. 84, № 2, P. 322-328.