Электрохимические сенсорные системы на основе органических и неорганических наноразмерных модификаторов для бесферментного определения клинически значимых соединений : диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук : 02.00.02

Эффективность первичной медико-санитарной помощи, включающей профилактику, лечение различных заболеваний, таких как диабет, сердечно- сосудистые, инфекционные и онкологические заболевания, в значительной степени зависит от правильности и своевременности постановки диагноза. В немалой степени последняя определяется доступностью и надежностью информации о состоянии больного, включая результаты анализа биологических жидкостей.
В настоящее время в клинико-диагностических центрах используют сложное, дорогостоящее, технологичное лабораторное оборудование, требующее специальных помещений и высокой квалификации обслуживающего персонала. Совершенствование инструментальных средств медицинской диагностики в значительной степени опирается на развитие концепции биосенсоров, перспективных также в мониторинге окружающей среды, фармацевтике, пищевой промышленности и др. Биосенсор позволяет проводить надежную оценку содержания аналита, обусловленную его взаимодействием с биологическим рецептором [1]. Биосенсоры — портативные устройства, привлекающие своей мобильностью, доступностью, дешевизной и предназначенные, прежде всего, для скрининга биологически важных компонентов на месте, у больного (так называемая «point-of-care diagnostics»). Подавляющее число работ, направленных на создание биосенсоров, посвящено электрохимическим методам регистрации сигнала. В большинстве случаев это потенциометрия и амперометрия. Они обладают рядом преимуществ, таких как низкие затраты на изготовление, простота конструкции, удобный для пользователя интерфейс, возможность миниатюризации, надежность измерения, достигаемые низкие пределы обнаружения и небольшие операционные объемы. Последнее особенно важно при анализе биологических проб [2 – 5]. Электрохимические биосенсоры имеют преимущества перед многими альтернативными подходами, в частности, оптическими сенсорами, для которых мутность раствора или его окраска могут в
9
значительной степени ограничивать область потенциального применения. Современный этап развития электрохимических биосенсоров характеризуется взрывным увеличением интереса к дополнительным факторам, определяющим их селективность и чувствительность, связанным с модификациями поверхности электрода как первичного преобразователя сигнала и подложки для локализации биохимического рецептора.
Однако при всех положительных качествах биосенсоров, указанных выше, они не лишены недостатков, связанных с температурной и временной нестабильностью применяемых биохимических рецепторов, их высокой стоимостью, а также с необходимостью введения в анализируемый раствор дополнительных реагентов и сигналообразующих веществ. В связи с этим в настоящее время внимание разработчиков все чаще обращается к созданию искусственных аналогов природных рецепторных структур, в том числе, ферментов. Эти работы особенно интенсифицировались в последние два десятилетия, а соответствующие синтетические аналоги получили название биомиметиков. К их числу относятся некоторые наноматериалы, органические молекулы, обладающие электрокаталитической активностью, а также полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО), имитирующие высокоспецифичное связывание аналита в комплексы по аналогии с реакциями антиген – антитело и фермент – субстрат. При этом методология создания бесферментных сенсоров на основе биомиметиков в значительной степени повторяет подходы, апробированные и отработанные на примере традиционных биосенсоров.
Последующее развитие нового поколения сенсоров на основе биомиметиков, их внедрение в практику биомедицинского анализа требуют, тем не менее, решения ряда проблем. Сегодня специалисты в области органического синтеза благодаря возможностям современной химии могут получать более разнообразные продукты по сравнению с аналогами, существующими в природе, однако структуры таких соединений зачастую не воспроизводят свойств, присущих ферментам. В случае применения, например, наноматериалов в качестве электрокатализаторов или

10
сигналообразующей метки остается проблема необходимости строгого контроля их структуры в процессе включения в состав сенсорного устройства, а также их конъюгации с конкретным аналитом. В случае применения ПМО актуальна задача повышения сродства к целевому аналиту, необходимость полного удаления молекул шаблона после формирования «молекулярных отпечатков» и повторного связывания аналита на стадии анализа. Также необходимо учитывать постепенное изменение геометрии пор и эффективности связывания в процессе нахождения ПМО в водных растворах.
Следует особо остановиться на проблемах химической безопасности при использовании наноматериалов. Требуется тщательная оценка их острой и хронической токсичности, исследование биологических взаимодействий, приводящих к возможным последствиям для живых организмов. Многообразие наноматериалов, разобщенность проводимых исследований их токсического воздействия на живой организм привели к противоречивым оценкам их безопасности. До конца не изучены механизмы индуцирования наночастицами деструктивных эффектов в клетках и организме в целом.
Необходимость синтеза, исследования и применения различных соединений и материалов, имитирующих биорецепторы, в составе электрохимических сенсоров, потребность в расширении способов их иммобилизации на поверхности индикаторного электрода/трансдьюсера и в конечном итоге разработка бесферментных биосенсоров/сенсоров, обладающих высокой селективностью, низким пределом обнаружения, широким диапазоном обнаружения и быстрым временем отклика для определения широкого круга аналитов биомедицинского назначения определяют актуальность темы диссертационной работы.
Степень разработанности темы диссертационной работы
Разработка чувствительных, селективных и стабильных бесферментных сенсоров и методов анализа является одним из наиболее активно развиваемых направлений исследования. Однако исследования в части поиска альтернативы ферментам носят фрагментарный характер. Они зачастую не учитывают

11
специфики измерения биологических аналитов, особенностей состава проб и методологически повторяют работы, посвященные определению заведомо более простых объектов анализа. При этом состав материалов, используемых в качестве модификаторов, остается весьма ограниченным и, как правило, не адаптируется в зависимости от природы анализируемой пробы. В частности, недостаточно исследований в области устойчивости наноматериалов в составе сенсоров, их биосовместимости с другими модификаторами, влияния формы и способа получения наноматериалов на их вклад в улучшение характеристик сенсоров. Работы по ПМО ограничены в основном определением достаточно крупных биологических молекул, таких как белки и клеточный материал. Эффективность концепции в определении низкомолекулярных аналитов – темплатов остается вопросом дальнейших изысканий. Существующие исследования бесферментных электрохимических сенсоров и биосенсоров достаточно редко ориентируются на требования массового производства и условий применения вне лабораторной базы. Таким образом, потребность в надежных, недорогих устройствах для определения широкого круга биологических параметров до сих пор не удовлетворена.
Целью работы является развитие теоретических представлений о механизме функционирования бесферментных электрохимических сенсоров и иммуносенсоров и методологических подходов к их созданию на основе наночастиц металлов и их оксидов, ряда органических модификаторов, в том числе, со свойствами ПМО для определения возбудителей инфекционных заболеваний в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биологических жидкостях пациентов, антител, а также контроля некоторых важных биохимических показателей.
Для достижения поставленной цели требовалось сформулировать и решить ряд задач:
— установить взаимосвязь между структурными, размерными и морфологическими характеристиками синтезированных индивидуальных наночастиц благородных металлов (золото, серебро) и смешанного состава,

12
оксидов никеля и железа смешанного состава, а также полимерных композитов с включением магнетита, и их функциональными характеристиками в составе электрохимических сенсоров и иммуносенсоров, включая окислительно- восстановительные превращения в водных и апротонных средах и взаимодействие с бактериальными клетками;
— разработать новые подходы для бесферментного количественного определения болезнетворных бактерий с использованием указанных наноматериалов и композитов на их основе (на примере Salmonella typhimurium, Escherichia coli и Staphylococcus aureus);
— разработать и реализовать для конкретных соединений диагностического значения (холестерин, мочевина, креатинин) концепцию бесферментного определения с использованием наночастиц благородных металлов, оксидов никеля, органических, неорганических соединений на основе сочетания электрокатализа, ионообменного концентрирования и получения молекулярных отпечатков на поверхности наночастиц оксида кремния и магнетита; исследовать электрокаталитическое поведение и предложить механизм их действия и критерии отбора для синтезированных соединений никеля и кобальта, а также наночастиц серебра, золота и оксида никеля;
— провести оценку токсического эффекта полученных и охарактеризованных наночастиц металлов и их оксидов с учетом динамики их проникновения в клетку (на примере клеточной культуры WI 38), определить соответствие между действующими концентрациями наночастиц и параметрами жизнеспособности и функциональной активности;
— предложить простые и эффективные устройства для количественного определения возбудителей инфекционных заболеваний и метаболитов (мочевина, креатинин, холестерин) в модельных растворах и реальных объектах контроля с применением разработанных технологических и методических решений;
— разработанные бесферментные электрохимические способы и сенсоры, не требующие применения дорогостоящего оборудования, организации специальных

13
помещений, дорогостоящих реагентов для прямого определения клинически важных показателей, должны совпадать или превосходить аналоги, применяемые в медицинской диагностике по аналитическим характеристикам.
Научная новизна работы
1. Развита концепция применения наночастиц переходных металлов/оксидов, соединений органической и неорганической природы в качестве электрокатализаторов, сигналообразующих меток в электрохимических бесферментных вариантах биоанализа, устанавливающая алгоритмы направленного выбора, синтеза и модификации наноматериалов для решения конкретных аналитических задач, связанных с определением органических соединений диагностического значения и созданием соответствующих способов и электрохимических бесферментных сенсоров и иммуносенсоров.
2. Количественно охарактеризована связь между природой наноматериалов, способом их получения и электрокаталитической активностью и чувствительностью определения различных аналитов на примере наночастиц серебра, золота смешанного состава, оксида никеля (II), органических соединений никеля (II), тиоцианата калия, хлоридов никеля (II) и кобальта (II) в окислении мочевины, креатинина, холестерина. Исследована кинетика электродных реакций и влияние различных факторов на активность применяемых электрокатализаторов.
3. Выявлены закономерности, связывающие условия синтеза наночастиц, нанокомпозитов магнетита с различным поверхностным покрытием на размерные, морфологические параметры, седиментационную устойчивость и электрохимическую активность получаемых наноматериалов.
4. Изучены особенности окислительно-восстановительных превращений наночастиц, нанокомпозитов магнетита – сигналообразующих меток для количественного определения инфекционных агентов, в водных и апротонных средах. Установлена связь электрохимических параметров процессов и характера превращений магнетита, предложены возможные схемы протекания электродных

14
реакций наночастиц Fe3O4, выбраны рабочие условия формирования сигнала, обусловленного указанным наноматериалом, в водных и апротонных средах.
5. Предложены новые варианты бесферментных электрохимических способов количественного анализа инфекционных агентов и некоторых биохимических параметров.
Новизна предлагаемых подходов подтверждена 6 патентами РФ.
Теоретическая и практическая значимость работы
1. Разработано новое поколение бесферментных сенсоров на основе наночастиц серебра, золота, оксида никеля (II), органических соединений никеля (II), различающихся составом, способом получения и введением в состав сенсора, применяемых в качестве катализаторов в электрохимическом окислении мочевины, креатинина, холестерина.
2. Разработаны новые варианты электрохимических способов количественного определения мочевины, креатинина и холестерина с использованием наночастиц оксидов никеля, серебра, золота, их сплавов, наночастиц типа ядро-оболочка с различным соотношением золота и серебра, органических соединений никеля (II), тиоцианата калия, хлоридов никеля (II) и кобальта (II) в качестве катализаторов окисления аналита, ПМО на креатинин и холестерин или ионообменный сорбент при определении мочевины, обеспечивающих селективность определения.
3. Разработаны новые бесферментные электрохимические иммуносенсоры и гибридные варианты вольтамперометрических способов для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus В -1266 с использованием в качестве прямых сигналообразующих меток нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4 с различным, в том числе электроактивным, покрытием и бактерий Salmonella typhimurium SL 7207 с использованием наночастиц магнетита.
4. Разработан новый подход к количественному определению антигенов вирусов методом бесферментного электрохимического иммуноанализа с

15
использованием конъюгатов антител с нанокомпозитными частицами на основе магнетита.
5. Разработаны и запатентованы алгоритмы, устройства для проведения количественного определения содержания возбудителей инфекционных заболеваний, а также мочевины, креатинина и холестерина. Проведенные испытания по сравнительному определению содержания инфекционных агентов, мочевины, креатинина, холестерина в модельных и реальных объектах с использованием разработанных бесферментных электрохимических иммуно- сенсоров, вариантов и традиционно используемых в медицинской диагностике методов показали, что предложенные разработки соответствуют по чувствительности, селективности референсным лабораторным методам анализа, но имеют преимущества в простоте использования и стоимости. В дальнейшем они могут быть переведены в форму портативных устройств.
6. Развита методология электроанализа наночастиц после их проникновения в клетки и связи этого параметра с жизнеспособностью и изменением цитокинного статуса клеток.
7. Получены акты испытаний (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск), подтверждающие возможность применения предложенных бесферментных электрохимических вариантов способов иммуноанализа и иммуносенсоров для количественного определения патогенных микроорганизмов.
8. Результаты работы использованы ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора при выполнении Федеральной целевой программы “Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 – 2010 годы” для разработки нормативно-методического обеспечения и средств контроля содержания наночастиц на объектах производственной сферы. Получен соответствующий акт испытаний.
Методология и методы диссертационного исследования. В рамках проведенных исследований применяли методы циклической вольтамперометрии

16
(ЦВА), хроноамперо- и хронопотенциометрии, электрохимической импедансной спектроскопии, спектрофотометрии. Для анализа размеров и морфологии наноматериалов применяли сканирующую электронную микроскопию, состав определяли с использованием ИК – спектроскопии. Для характеристик поверхности сенсоров использовали растровую электронную микроскопию. Взаимодействие наноматериалов с клетками изучали просвечивающим электронным микроскопом.
Основные положения, выносимые на защиту:
Результаты исследований структуры, состава, размерных и морфологических параметров наночастиц золота, серебра смешанного состава, оксидов никеля (II), железа (II, III), а также нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4 и различного покрытия (электроактивного и неэлектроактивного) и влияние этих характеристик на электрохимическое поведение и электрокаталитические свойства наноматериалов в протогенных и апротонных средах.
Результаты изучения седиментационной устойчивости, характера окислительно-восстановительных превращений в водной и апротонной средах, скорости процесса проникновения в бактериальные клетки синтезированных наноматериалов.
Закономерности влияния различных факторов на электрохимическое поведение изученных электрокатализаторов, иммобилизованных на поверхности рабочего электрода или введенных в объем раствора, а также генерируемый ими аналитический сигнал при количественном определении мочевины, креатинина и холестерина.
Результаты исследования влияния размеров, формы и морфологии ПМО холестерина на поверхности наночастиц оксида кремния и магнетита и ПМО креатинина на их способность к селективному «захвату» холестерина и креатинина.
Кинетика взаимодействия наночастиц Fe3O4, полимерных нанокомпозитов на основе Fe3O4 с бактериальными клетками (клеточная культура WI 38).

17
Концепция гибридных бесферментных электрохимических способов иммуноанализа для количественного определения патогенных микроорганизмов/антигена вирусов, включающих этапы магнитного отделения и магнитного концентрирования конъюгатов с наночастицами/нанокомпозитами для уменьшения времени измерения и увеличения его чувствительности.
Алгоритмы и устройства проведения количественного определения содержания возбудителей инфекционных заболеваний, мочевины, креатинина и холестерина в модельных растворах и реальных пробах.
Результаты анализа реальных и модельных образцов на содержание инфекционных агентов и биохимических показателей, а также их сравнение с аналогичными результатами референсных лабораторных методов.
Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность полученных результатов определяется применением в работе совокупностью современных физико-химических методов исследования и высокотехнологичного оборудования, а также статической обработкой полученных результатов и подтверждения сравнением результатов количественного определения инфекционных агентов и биохимических показателей в модельных смесях и реальных пробах, полученных с использованием разработанных бесферментных электрохимических способов, сенсоров и референсных лабораторных методов. Получены акты испытаний: ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск и ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора, г. Екатеринбург.
Основные положения диссертационной работы доложены на 6, 7 и 9 – м симпозиумах «Биосенсоры и биоаналитическая техника в экологическом и клиническом анализе» (Рим, Италия, 2004 г.; Кушадаси, Турция, 2006 г.; Монреаль, Канада, 2009 г.); на Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS- 2006 (Москва, Россия, 200 4г.); на научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве (Томск, Россия, 2007 г.); на XVIII, XX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии

18
(Москва, Екатеринбург, Россия, 2007, 2016 гг.); на VII, VIII и IX Всероссийских конференциях по электрохимическим методам анализа с международным участием «Электрохимические методы анализа» (Уфа, Екатеринбург, Россия, 2008, 2012, 2016 гг.); на III Всероссийской конференции по наноматериалам «НАНО-2009» (Екатеринбург, Россия, 2009 г.); на III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009 г.); на XV конференции по электроанализу (Инсбрук, Австрия, 2009 г.); на Съезде аналитиков России (Москва (пансионат «Клязьма»), Россия, 2010 г.); на симпозиуме с международным участием «Теория и практика электроаналитической химии (Томск, Россия, 2010 г.); на 9 – м заседании «Международного общества по электрохимии, электрохимическим датчикам: от наномасштабного проектирования до промышленного применения» (Турку, Финляндия, 2011 г.); на III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии (Краснодар, Россия, 2011 г.); на конференции «Наноформация-2012» (Барселона, Испания, 2012 г.); на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, Россия, 2013 г.); на 15 Международной конференции по электроанализу «ESEAC» (Мальме, Швеция, 2014 г.); на конференции «Анализ лекарственных препаратов 2014» (Льеж, Бельгия, 2014 г.); на конференции «Электроанализ 2015» (Бордо, Франция, 2015 г.); на конференции «Химический анализ и медицина» (Москва, Россия, 2015 г.); на Международной конференции «Последние достижения в анализе пищевых продуктов» (Прага, Чехия, 2015г.).
Публикации. Основные результаты по материалам диссертации опубликованы в 19 статьях в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 главах коллективных монографий, 6 патентах РФ и более чем в 100 тезисах докладов в материалах всероссийских и международных научных конференций.
Личный вклад автора в исследования, проводимые в рамках диссертационной работы, заключается в обосновании теоретических представлений и новых методологических подходов к созданию вариантов

19
бесферментных электрохимических способов и сенсоров с применением в качестве альтернативы ферментам веществ и материалов небиологической природы и совершенствованию методов электроанализа для исследования цитотоксичности наноматериалов. Работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состояли в постановке целей и решении основных задач, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов, разработке методик и алгоритмов количественного анализа некоторых инфекционных агентов и биохимических показателей. Предложенные новые подходы в совокупности с высокой чувствительностью и селективностью, оперативностью получения результатов анализа позволили создать принципиально новые варианты бесферментных электрохимических способов анализа и типы бесферментных иммуносенсоров/сенсоров, не уступающие по своим характеристикам биосенсорам, но существенно более дешевые и лишенные известных недостатков последних (нестабильность ферментов, необходимость использования специального субстрата, обеспечивающего протекание сигналообразующей реакции).
Работа выполнена при финансовой поддержке: INCO – Copernicus (проект No ERBIC 15CT-960804, 1998 – 2001 гг.), INTAS (проект No 00-273, 2001 – 2004 гг.), МНТЦ (проект No 3230, 2007 – 2008 гг.), Российского Фонда Фундаментальных Исследований (06-03-08141-офи, 07-03-96068-р_урал_а, 09-03-12242-офи_м, 14-03-01017_а), в рамках заданий Министерства промышленности и науки Свердловской области «Нанотехнологии в био- и химических сенсорах для мониторинга окружающей среды и здоровья человека» (2008 – 2010 гг.), Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно – технической сфере (2005 – 2006 гг.), в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературных источников, приложений. Текст диссертации изложен на 343 страницах, содержит 98 рисунков, 13 схем, 67 таблиц, 3 приложения и 388 библиографических ссылок.

20
Во введении сформулирована актуальность и степень разработанности темы диссертационной работы, поставлены цели и задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость, а также положения, выносимые на защиту .
В первой главе представлен обзор литературы, посвященной основным достижениям в области разработки биосенсоров для распознавания широкого круга аналитов с различными методами детектирования. Приведена критическая оценка биосенсоров на основе ферментов. Обоснована необходимость изучения и разработки бесферментных иммуносенсоров/сенсоров.
Во второй главе представлены сведения о материалах, методиках диссертационного исследования, а также реактивах, материалах, применяемой инструментальной базе.
Третья глава посвящена разработке алгоритмов нескольких вариантов бесферментного электрохимического иммуноанализа (иммуносенсоров) для количественного определения некоторых микроорганизмов и антигена вируса кори. Представлены результаты исследования структуры, состава, размерных и морфологических параметров, седиментационной устойчивости наночастиц магнетита и нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4 с различным покрытием, влияния этих характеристик на окислительно-восстановительное поведение наноматериалов в протонных и апротонных средах, возможности применения в качестве сигналообразующей метки. Продемонстрированы результаты анализа реальных и модельных образцов на содержание бактериальных клеток с использованием разработанных способов и подтвержденные данными референсных лабораторных методов.
В четвертой главе приведены экспериментальные данные по разработке алгоритмов и устройств различных вариантов бесферментных электрохимических способов количественного определения мочевины, креатинина, холестерина с использованием электрокатализаторов (соединения Ni (II), Co (II) органической и неорганической природы, нанооксиды никеля (II), наночастицы серебра, золота,

21
наносплавы, наночастицы типа ядро-оболочка) и ПМО креатинина, холестерина, обеспечивающие селективность определения этих веществ или ионообменного сорбента при анализе мочевины. Показано влияние различных факторов на электрохимическое поведение изучаемых электрокатализаторов и генерируемый ими аналитический сигнал, иммобилизованных на поверхности рабочего электрода или объеме раствора, в присутствии мочевины, креатинина, холестерина. Представлены результаты исследования влияния размеров, формы и морфологии ПМО холестерина на поверхности наночастиц оксида кремния и магнетита, а также ПМО креатинина на их способность к селективному «захвату» холестерина и креатинина.
В пятой главе обсуждены вопросы токсического воздействия наноматериалов на живой организм. Показана возможность применения методов электроанализа к исследованию накопления наночастиц в клетках, взаимосвязи этого параметра с жизнеспособностью клеток, изменением цитокинного статуса клеток.
В приложениях к диссертации представлены акты испытаний.