![](https://expert-mik.ru/wp-content/themes/24author/assets/img/work/work-img.png)
Влияние хитозана на фотосенсибилизирующую активность порфиринов и их комплексов с амфифильными полимерами в фотогенерации синглетного 1О2 кислорода
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Фотосенсибилизаторы и их свойства
1.1.1. Порфирины и их свойства
1.1.2. Физико-химические свойства порфиринов
1.1.3. Ассоциация в водных и неводных растворах
1.1.4. Спектрофотометрические свойства порфиринов
1.1.5. Спектры испускания порфиринов
1.1.6. Фотосенсибилизирующая активность порфиринов
1.2. Фотодинамическая терапия (ФДТ)
1.3. Плюроники
1.3.1. Влияние различных факторов на поведение плюроников в
водной среде
1.4. Поли-N-винилпирролидон
1.4.1. Влияние температуры на поведение ПВП в водном растворе
1.5. Порфирины и амфифильные полимеры
1.5.1. Солюбилизация ФС
1.5.2. Влияние амфифильных полимеров на активность порфиринов
1.6. Хитозан – поликатион, антимикробный агент
1.6.1. Основные физико-химические характеристики хитозана
1.6.2. Использование хитозана в медицине, в том числе, при лечении
ран
1.7. Влияние поликатионов на фотокаталитические свойства
фотосенсибилизаторов
ГЛАВА 2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
2.1. Объекты исследования
2.1.1. Солюбилизация гидрофобных порфиринов
2.1.2. Получение фотосенсибилизированных систем ФС-АП-ХТ
2.1.3. Получение пленок ХТ, ПВП, ХТ-ПВП и их смесей с ДМГ для
рентгенструктурного анализа и АСМ
2.2. Исследование каталитических свойств фотосенсибилизирующих
систем в водных растворах
2.3. Методы исследования надмолекулярной структуры полимеров в
тройных системах ПФС-АП-ХТ с порфиринами в растворе и в пленках
2.3.1. Динамическое светорассеяние
2.3.2. Атомно-силовая микроскопия (АСМ)
2.3.3. Рентгеноструктурный анализ
2.3.4. ИК-спектрометрия
2.3.4. Спектрометрия
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ХИТОЗАНА НА ФОТОКАТАЛИТИЧЕСКУЮ
АКТИВНОСТЬ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПФС И КОМПЛЕКСОВ ПФС-
АП
3.1. Влияние хитозана на фотокаталитическую активность ДМГ и ХЛ
3.2. Влияние хитозана на фотокаталитическую активность комплексов
ПФС-АП
3.2.1. Особенности фотокаталитической активности комплексов ДМГ-
ПВП в присутствии ХТ20
3.2.2. Особенности фотокаталитической активности комплексов ДМГ-
АП в присутствии ХТ100
3.2.3. Особенности влияния ХТ100 на kэфф окисления триптофана в
присутствии комплексов ХЛ- АП
3.3. Влияние надмолекулярной структуры и межмолекулярных
взаимодействий полимерных компонентов в растворе на
фотосенсибилизирующую активность системы ФС-АП-ХТ
3.3.1. Влияние молекулярной массы хитозана на его структуру в
хитозансодержащих системах в твердом состоянии по данным атомно-
силовой микроскопии, рентгеноструктурного анализа
3.3.2. Влияние АП на размеры ассоциатов хитозана в растворе (метод
ДСР)
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ХИТОЗАНА НА ФОТОКАТАЛИТИЧЕСКУЮ
АКТИВНОСТЬ ГИДРОФОБНЫХ ПФС, СОЛЮБИЛИЗИРОВАННЫХ
ПЛЮРОНИКОМ F127
4.1. Фотокаталитическая активность союбилизированных ТФП и
ТФПF20 амфифильными полимерами
4.2. Влияние хитозана на фотокаталитическую активность
солюбилизированных ПФС
4.3. Размеры ассоциатов солюбилизированного плюроником F127
ТФПF20 и влияние хитозана на них (метод ДСР)
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН СРЕДЫ НА
ФОТОКАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ФС-АП – ХТ
5.1. Зависимость эффективной константы скорости фотоокисления
триптофана в присутствии системы ДМГ-ПВП-ХТ20 от температуры
5.2. Влияние уксусной кислоты на фотокаталитическую активность
порфиринов
5.3. Влияние кислоты на фотокаталитическую активность комплексов
ФС-АП
5.3.1. Влияние уксусной кислоты на фотокаталитическую активность
комплексов водорастворимых ФС с АП
5.3.2. Влияние уксусной кислоты на фотокаталитическую активность
солюбилизированных плюроником F127 гидрофобных ФС
ВЫВОДЫ
Приложение 1
ЛИТЕРАТУРА
Глава 1. Литературный обзор
В первой главе приведены современные представления о химической структуре,
фотокаталитических и спектральных характеристиках порфириновых фотосенсибилизаторов.
Рассмотрены механизм действия метода АФДТ и его преимущества перед остальными методами
лечения локальных инфекций (труднозаживающие раны, трофические язвы, диабетические стопы).
Обсуждены современные представления о свойствах и структуре хитозана. Представлена общая
характеристика амфифильных полимеров.
Глава 2. Методическая часть
2.1.Объекты исследования.
В качестве фотосенсибилизаторов использовали как водорастворимые порфирины:
динатриевую соль 3,8-ди(1-метоксиэтил)дейтеропорфирина IX (димегин, ДМГ, синтезирован
Пономаревым Г.В. в Институте биологической и медицинской химии) и три натриевую соль хлорина
е6 (ХЛ, Frontier scientific Inc.), так и гидрофобные порфирины – 5,10,15,20-тетрафенилпорфирин(ТФП)
и фторированный тетрафенил порфирин- 5,10,15,20-пентафторфенилпорфирин (ТФПF20 (Sigma-
Aldrich)). Структуры фотосенсибилизаторов представлены на рис.1.
CH3CH2
H3COCHCH3СН
CH3
CH3H3C
H 3CCHOCH3
СН CH2
NHNNHN
NHNNNH
H 3CCH3H3C
CH3
CH2CH2СН2-+
СН2COO Na
CH2CH2-+
а–СН2COO Na
COO Na+COO Na+-+б
COO Na
RR:1
NNFF
HR
R
HF
NN
FF
Rв
Рис.1 Структурные формулы порфиринов: ДМГ (а), ХЛ (б), ТФП
(в,1) ТФПF20(в, 2)
В качестве амфифильных полимеров были выбраны хорошо изученные и широко
использующиеся в медицине поли-N-винилпирролидон (ПВП, м.м. 4∙104М, Sigma-Aldrich) и тройной
блоксополимер этилен- и пропиленоксида, плюроник F127 (F127, м.м.12,6∙10-3М, BASF). В качестве
биологически активного полисахаридов использовали низкомолекулярный хитозан (ХТ20) с м.м.
2∙104Да, СД 75% (ЗАО “Биопрогресс”) и среднемолекулярный хитозан (ХТ100) с м.м. 105Да, СД 75%
(Sigma-Aldrich), а в качестве субстрата – триптофан (Sigma-Aldrich).
2.1.1 Солюбилизация гидрофобных порфиринов.
Для солюбилизации органорастворимых порфиринов (ТФП и ТФПF20) получали совместный
раствор порфирина (5 ∙10-6 моль/л) и амфифильного полимера (10-5 – 10-3 моль/л) в хлороформе. Сухой
остаток (аддукт), полученный после удаления растворителя (в роторном испарителе), растворяли в
дистиллированной воде. Степень γ солюбилизации порфирина определяли по электронным спектрам
поглощения (ЭСП) водных растворов, по IV Q полосе, не меняющей величины оптической плотности
(D) в солюбилизированном состоянии. Для каждого типа порфирина параметр γ рассчитывали как
отношение величины D выбранной полосы в ЭСП водного и исходного (хлороформного) растворов: γ
= D1/D2, где D1 и D2 – соответствующие значения оптических плотностей.
2.1.2 Получение фотосенсибилизированных систем ФС-АП-ХТ.
Тройную систему ФС-АП-ХТ получали последовательным смешением расчетных количеств
растворов 10-4 моль/л порфирина, 4-6 % раствора амфифильного полимера и 1-2 % раствора хитозана.
После добавления каждого компонента раствор перемешивался в течение 5 мин. Было показано, что
порядок смешения не влияет на фотокаталитическую активность систем.
2.1.3 Получение пленок ХТ, ПВП, ХТ-ПВП и их смесей с ДМГ для рентгенструктурного
анализа и АСМ
Для РСА пленки толщиной до 100 мкм получали при испарении водных (ПВП, ПВП-ДМГ) и
уксуснокислых, содержащих хитозан, растворов исследуемых полимеров и их смесей с ДМГ,
нанесенных на целлофановую подложку, так, чтобы в пленках массовые соотношения ХТ-ПВП
составляли от 1:2 до 1:15, для ДМГ-ХТ-ПВП 1:15:30.
Для АСМ образцы готовили путем испарения нанесенного на предварительно подготовленную
слюду 5 мкл раствора ПВП и его смесей с ХТ и ДМГ в воде с последующим выдерживанием образца
при комнатной температуре в течение 24 часов. Образцы систем, содержащих хитозан, получали
испарением соответствующих уксуснокислых растворов. Соотношенияв пленках ХТ-ПВП
составляли от 5:1 до 1:10.
2.2 Исследование каталитических свойств фотосенсибилизирующих систем в водных
растворах
Исследование активности порфиринсодержащих полимерных систем в процессе генерации
синглетного кислорода в водной фазе проводили, используя реакцию окисления триптофана
синглетным кислородом с образованием эндопероксида триптофана. За кинетикой процесса следили
по изменению концентрации триптофана, которую определяли по значению оптической плотности
полосы поглощения (λ = 280 нм) в УФ-спектре триптофана.
Для сопоставительной оценки активности порфиринсодержащих систем в тестовой реакции
фотоокисления триптофана в водной среде вводили эффективную удельную константу скорости kэфф,
определяемую по начальному линейному участку кинетической зависимости Ci = Ci(t):
kэфф = (1/t) ·ln(C0i/Ci)/СPPS(1),
где С0i – начальная концентрация субстрата i, Ci(t) – концентрация субстрата i на момент
времени t (с) фотоокисления, СPPS – концентрация фотосенсибилизатора. Погрешность определения
kэфф составляла 10%.
2.3 Методы исследования надмолекулярной структуры полимеров в тройных
системахПФС-АП-ХТ с порфиринами в растворе и в пленках.
2.3.1. Динамическое светорассеяние. Размер частиц и Zeta потенциал полимеров (F127 и
ХТ100) и солюбилизированного F127 ТФПF20 в водных растворах в исходном состоянии, и в тройных
системах (ТФПF20-F127-ХТ100) системах определяли методом динамического светорассеяния и
электрофоретическим рассеянием света на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments
Ltd., UK), оснащенном He-Ne-лазером (λ= 633 нм) при угле 173о. ξ – потенциал измеряли с помощью
лазерной доплеровской велосиметрии путем определения электрофоретической подвижности. Для
расчета значений ξ – потенциала использовалось уравнение Генри. Для всех систем с учетом низкой
концентрации полимера использовались диэлектрическая проницаемость 78,5 и вязкость 0,8872 МПа∙с
для чистого растворителя.. Растворы фильтровали через стандартную 0,22 мкм мембрану в
оптическую ячейку (1 × 1 см). Данные обрабатывались с помощью программного обеспечения
Zetasizer Software 6.2 (Malvern Instruments Ltd., UK).
Возможные взаимодействия порфиринов с полимерами фиксировали по сдвигам полос
поглощения и флуоресценции порфиринсодержащих водных растворов с помощью
спекторофотометра Cary50 и спектрофлуориметра CaryEclipse (Varian, Австрия), соответственно.
2.3.2. Атомно-силовая микроскопия (АСМ). Исследование структуры поверхности пленок
полимеров методом АСМ проводили на микроскопе Solver P47 NT-MDT (Россия) в полуконтактной
моде в режиме топографии. Использовали кантилеверы ETALON производства NT-MDT (Россия) с
резонансной частотой 235 кГц и радиусом закругления 10 нм. Были получены изображения размерами
3×3, 6×6 и 13×13 мкм2. Для каждого образца производилось сканирование как минимум в 5-ти местах.
Топографию поверхности пленок полимеров, а также их локальные механические свойства
(Модуль Юнга) изучали также методом PeakForce QNM на атомно-силовом микроскопе MultiMode 8
(Bruker, USA) при помощи зонда RTESPA -300 производства Bruker (USA). Исследовались области
площадью 5×5 мкм.
2.3.3. Рентгеноструктурный анализ. Исследование структуры пленок полимеров методом
рентгеновской дифракции в больших и малых углах рассеяния проводили на рентгеновском
дифрактометре с координатным детектором (излучение CuKα, λ = 1.542 Å, расстояние образец-
детектор 105 мм, ширина рентгеновского пучка в плоскости образца и ширина окна детектора 4 мм).
Интенсивность рентгеновского рассеяния измеряли «на просвет» при комнатной температуре в
интервале значений модуля дифракционного вектора 0.04 нм–1 < S < 4.5 нм–1 (S=2sinθ/λ, 2θ – угол
рассеяния, λ – длина волны рентгеновского излучения).
2.3.4. ИК-спектрометрия. Выявление возможных взаимодействий полимерных
компонентов АП –ХТ системы ПФС-АП-ХТ в пленках, полученных из совместных растворов,
проводили методом ИК-спектрометрии (VARIAN FTS 800 FT-IR Scimitar Series Spectromet)
Глава 3. Влияние хитозана на фотокаталитическую активность водорастворимых ПФС
и комплексов ПФС- АП
Как было уже упомянуто, проблема использования хитозана при получении полимерных
фотосенсибилизирующих систем для АФДТ заключается в том, что в его присутствии значительно
снижается активность ПФС.
Для создания эффективных фотосенсибилизирующих систем с использованием в качестве
биологически активного компонента - хитозана, важно было установить основные черты механизма
влияния хитозана на активность ФС в генерации синглетного 1О2 кислорода в водной фазе.
Исследования проводились для образцов хитозана с низкой (~ 20кДа, ХТ20) и средней (~100
кДа, ХТ100) молекулярными массами и одинаковой (70%) степенью деацетилирования, поскольку
известно, что биоцидная активность хитозана возрастает при уменьшении молекулярной массы
полисахарида [5], так, что наибольшая антибактериальная активность и иммуностимулирующие
свойства наблюдались у хитозана с молекулярной массой от 6,5 до 150 кДа. [8].
3.1 Влияние хитозана на фотокаталитическую активность ДМГ и ХЛ
Фотокаталитическая активность ДМГ и Хл резко падает при добавлении хитозана (в интервале
концентраций 1∙10-4 - 6∙10-4М (0,001-0,1мас.% )). Для ДМГ были получены зависимости эффективной
константы скорости kэфф реакции фотоокисления триптофана от концентрации хитозана ХТ20 и ХТ100
(рис.2).
Рис. 2 Зависимость эффективной
kэфф,л/(моль*с)
константы скорости фотоокисления
триптофана, катализируемого ДМГ, от
концентрации хитозана: Мм 20 кДа (1)
и Мм 100 кДа (2). Концентрация ДМГ -
5·10-6 моль/л, концентрация триптофана
1·10-4моль/л.
1
0,00,20,40,60,81,05,85,96,0
Схт *103, моль/л
Как следует из рис.2, молекулярная масса хитозана (в выбранном интервале молекулярных
масс) не влияет на величину эффекта влияния хитозана на активность ПФС - фотокаталитическая
активность димегина в присутствии ХТ20 и ХТ100, уменьшается приблизительно в 3 раза, для хлорина
величина константы скорости уменьшается ~ в два раза. Такое падение, очевидно, связано с
процессами агрегации молекул ДМГ, происходящими в слабокислых растворах хитозана в основном
благодаря взаимодействию между отрицательно заряженными периферийными карбокси-
группировками ДМГ и протонированными свободными аминогруппами хитозана, а также за счет
поляризации молекул ДМГ при протонировании центральных NН-групп порфирина. Об образовании
агрегатов ДМГ в присутствии хитозана свидетельствуют, в частности, спектры поглощения и
флуоресценции порфирина (рис.3, а, б). Как видно из рис. 3а, где представлены электронные спектры
поглощения ДМГ в отсутствие (1) и в присутствии ХТ100 (2), при добавлении полисахарида,
происходит значительное падение оптической плотности и уширение полосы Соре, а в спектрах
флуоресценции ДМГ при этом наблюдается значительное падение интенсивности и гипсохромный
сдвиг полос, что обычно связывается с агрегацией макромолекул ДМГ вблизи протонированных
аминогрупп ХТ100 (рис. 3б) 1.
Для системы ДМГ-ХТ20 электронные спектры поглощения аналогичны спектрам системы с ХТ100
0,7
Оптическая плотность D
0,6
аб
0,5
Интенсивность
0,4
0,32
0,2675
0,1100
0,00
300400500600550600650700750
Длина волны, нмДлина волны, нм
Рис.3 Электронный спектр поглощения (а) и спектр флуоресценции (б) ДМГ(1) и ДМГ-ХТ100 (2).
Концентрация ДМГ -5·10-6моль/л, концентрация ХТ100 1·10-3моль/л.
3.2 Влияние хитозана на фотокаталитическую активность комплексов ПФС-АП
Ранее было показано, что в присутствии амфифильных полимеров ПВП, F127, ПЭО и др.,
фотокаталитическая активность водорастворимых порфиринов (ДМГ, ХЛ, фотодитазин) в реакции
окисления триптофана возрастает благодаря образованию слабосвязанных межмолекулярных
комплексов ПФС-АП. В частности, в присутствии комплексов ДМГ с ПЭГ, F127 и ПВП kэфф
фотоокисления возрастала в 1,2, 1,5 и 2 раза соответственно по сравнению с kэфф в присутствии чистого
ДМГ. Было высказано предположение, что образование комплексов ПФС-АП может уменьшить
взаимодействие между порфиринами и хитозаном, в связи с чем, далее в работе было изучено влияние
хитозана на активность комплексов ПФС-АП, причем в качестве амфифильных полимеров
использовали ПВП и F127.
3.2.1 Особенности фотокаталитической активности комплексов ДМГ-ПВП в
присутствии ХТ20
Влияние ПВП на фотокаталитическую активность комплекса ДМГ в присутствии ХТ20
исследовали в диапазоне концентраций ПВП – 5∙10-6 -5∙10-4 моль/л (0,06-2%), концентрация хитозана
менялась с 1∙10-4 – до 6∙10-3моль/л (на звено, 2∙10-3%-0,1%). Были получены зависимости эффективной
константы скорости фотоокисления триптофана от концентрации ПВП при разных концентрациях
ХТ20 (Рис.4).
1500
1400
1300Рис. 4. Зависимость эффективной
kэфф,л/(моль*с)
константы скорости kэфф реакции фотоокисления
триптофана, катализируемой системой ДМГ-ПВП-
ХТ20, от концентрации ПВП. 1- С(ХТ20) =0 моль/л;
2- С(ХТ20) =1·10-4 моль/л; 3- С(ХТ20) =5·10-4 моль/л;
4- С(ХТ20) =10-3 моль/л, 5- С(ХТ20) =5·10-3 моль/л
4(концентрация хитозана в расчете на звено).
5Концентрация ДМГ -5·10-6 моль/л, концентрация
триптофана 1·10-4 моль/л.
0,00,20,40,60,81,04,84,95,0
Cпвп*104,моль/л
Как видно из рис.4, зависимости kэфф от концентрации ПВП при разном содержании ХТ (в том
числе, и для чистого ДМГ, кривая 1), носят экстремальный характер: при концентрации ~ ПВП >10-4
(моль/л) величина kэфф уменьшается. Это обусловлено, очевидно «неэффективным связыванием»
порфирина молекулами ПВП, когда в результате взаимодействия с полимером молекулы триптофана
оказываются слишком удалены от ПФС.
Рост kэфф для системы ДМГ-ХТ20 при добавлении ПВП связан, очевидно с образованием
слабосвязанных комплексов ДМГ-ПВП, препятствующим связыванию ДМГ с макромолекулами
хитозана.
В то же время в слабокислых растворах ХТ20 наряду с агрегатами, в которых аминогруппы
(ответственные за связывание ПФС) участвуют в образовании межмолекулярных водородных связей
в агрегатах ХТ20, остается определенное количество свободных макромолекул [9], способных
взаимодействовать с ПФС. Такое взаимодействие, очевидно, не удается полностью исключить даже в
присутствии больших концентраций ПВП.
3.2.2Особенности фотокаталитической активности комплексовДМГ-ПВП в
присутствии ХТ100
Добавление АП в интервале концентраций от 3∙10-6 М до 1∙10-4 М (10-4%-1%), к раствору ДМГ
в присутствии ХТ100 приводит к увеличению эффективной константы скорости фотоокисления
триптофана (рис.5 a,б). Как следует из рис.5, ПВП более эффективно повышает фотокаталитическую
активность системы ДМГ в присутствии ХТ100, чем плюроник, даже при больших концентрациях
хитозана (рис.5).
В присутствии ПВП и ХТ100 значения kэфф (рис. 5a (2-5)) в изученном интервале концентраций
амфифильного полимера приближаются к значениям kэфф для комплекса ДМГ-ПВП в отсутствие
хитозана (рис. 5a). В присутствии ХТ100 при добавлении плюроника происходит «восстановление»
активности ДМГ (рис. 5б) только чуть выше уровня свободного ДМГ. Такое различие связано с рядом
факторов, прежде всего, как уже отмечалось, эффект повышения активности свободного ДМГ в
присутствии F-127 меньше, чем в присутствии ПВП [10]. Кроме того, в 0,2% уксусной кислоте
меняется структура мицелл плюроника F127, (данный аспект будет рассмотрен в главе 5), что
приводит к дополнительной агрегации порфирина в системе.
1600
а
1б1
1500
21200
14005
13005
kэфф,л/(моль*с)
12001000
11003
1000
kэфф,л/(моль*с)
8004
500400
200
0123459,89,910,00,00,20,40,60,81,04,84,95,0
СПВП *105М
СF-127 *104
Рис. 5. Зависимость эффективной константы kэфф скорости реакции фотоокисления триптофана,
катализируемой системами: ДМГ-ХТ100-ПВП (а), ДМГ-ХТ100-F-127 (б) от концентрации амфифильного полимера.
Концентрация хитозана 1 – 0 моль/л; 2- 1·10-4 моль/л; 3- 6·10-4 моль/л; 4- 10-3 моль/л, 5- 6·10-3 моль/л (концентрация
хитозана в расчете на звено). Концентрация ДМГ -5·10-6 моль/л, концентрация триптофана 1·10-4 моль/л.
Значительный (в 4-5 раз) рост эффективной константы kэфф скорости фотоокисления
триптофана в присутствии ДМГ и ХТ100 при добавлении ПВП, по-видимому, связан с частичным
связыванием молекул порфирина, ранее локализовавшихся в агрегированном состоянии вблизи
аминогрупп хитозана, с макромолекулами поливинилпирролидона. На это указывает, в том числе, рост
интенсивности всех полос в спектрах флуоресценции ДМГ в присутствии ХТ100 при добавлении ПВП.
3.2.3 Особенности влияния ХТ100 на kэфф окисления триптофана в присутствии
комплексов ХЛ- АП
Добавление ПВП и F127 к ХЛ приводит к незначительному росту фотокаталитической
активности ХЛ (рис.6 кривые 1 и 3, соответственно). Добавление ПВП в систему ХЛ – ХТ100, как и в
случае систем ДМГ-ХТ100, приводит к возрастанию kэфф, (рис.6, кривая 2). А в присутствии плюроника
F127 активность систем ХЛ-ХТ100 практически не меняется (рис.6, кривая 4).
Одна из причин такого различия связана с тем, что комплекс ХЛ с ПВП более стабилен, чем
комплекс с плюроником F127 [11]. Поскольку ХЛ, более гидрофилен по сравнению с ДМГ, он
локализуется в опушке мицелл F127, и, видимо, способен к агрегации вблизи аминогрупп хитозана.
Это следует из спектров флуоресценции ХЛ в присутствии F127 и ХТ100 (рис.7). Так, при добавлении
плюроника наблюдается батохромный сдвиг полосы флуоресценции ХЛ (кривая 1 и кривая 3), а в
присутствии ХТ100 происходит гипсохромный сдвиг полосы спектра флуоресценции ХЛ и падение ее
интенсивности (кривая 2), что говорит об агрегации молекул ХЛ. Добавление плюроника F127 к
системе ХЛ – ХТ100 не приводит к сдвигу полосы флуоресценции ХЛ, но приводит к падению
интенсивности этой полосы (кривая 4). Что может быть связано с дополнительной агрегацией хлорина
вблизи образующегося «псевдо-поликатиона» мицелл плюроника F127, образование которого будет
рассмотрено в главе 5.
1350600
130013
1250
1200
Интенсивность, у.е.
1150
kэфф,л/(моль*с)
1100400
1050
10004
850200
7004
6000
0,00,51,01,52,04,64,85,0600650700750
САП *10 ,моль/л
Длина волны, нм
Рис. 6. Зависимость эффективной константы скоростиРис.7 Спектры флуоресценции ХЛ (1), его
kэфф реакции фотоокисления триптофана, катализируемойкомплексов с ХТ100(2), комплекса ХЛ-F127 (3) и
ХЛ-ХТ100-АП, от концентрации амфифильного полимера.тройной системы: ХЛ-F127-ХТ100(4).
(1) – ХЛ-ПВП, (2) -ХЛ-ПВП –ХТ100, (3) -ХЛ- F127, (4) –
ХЛ-F27 –ХТ100. Концентрация ХЛ – 5·10-6 моль/л,
концентрация триптофана 10-4моль/л, концентрация
ХТ100- 6·10-4моль/л (0,01%масс.).
По-видимому, активность ФС в растворах, содержащих АП и ХТ, определяется не только
процессами агрегации (как ФС, так и F127 в кислых средах), но и солюбилизирующей способностью
АП. По-видимому, более гидрофобный ДМГ лучше солюбилизируется ПВП и плюроником по
сравнению с более гидрофильным ХЛ. А комплексы ХЛ с ПВП более стабильны, чем с плюроником
[12].
3.3 Влияние надмолекулярной структуры и межмолекулярных взаимодействий
полимерных компонентов в растворе на фотосенсибилизирующую активность системы ФС-АП-
ХТ
Для установления возможных взаимодействий полимерных компонентов (ХТ и АП) и его
влияния на фотосенсибилизирующую активность порфиринсодержащих фотосенсибилизирующих
систем в водных средах были использован метод ДСР. Для установления влияния структуры
полимерныхкомпонентовнафотокаталитическуюактивность порфиринсодержащих
фотосенсибилизирующих систем были использованы методы исследования твердых пленок
полимерных смесей, полученных при испарении водных (ПВП, ПВП-ДМГ) и уксуснокислых,
содержащих хитозан, растворов исследуемых полимеров и их смесей с ДМГ.
3.3.1 Влияние молекулярной массы хитозана на его структуру в хитозансодержащих
системах в твердом состоянии по данным атомно-силовой микроскопии, рентгеноструктурного
анализа.
Рентгеноструктурный анализ
По данным РСА структура изученных образцов хитозана зависит от его молекулярной массы.
В частности, на дифрактограмме порошка ХТ20 наблюдаются узкие дифракционные максимумы в
широком интервале углов рассеяния. Это свидетельствует о совершенной крупнокристаллической
структуре ХТ20. В то же время, на дифрактограмме порошка ХТ100 наблюдаются два размытых
дифракционных пика при S ≈ 1, 1.3 и 2.2 нм–1. Следовательно, низкомолекулярный хитозан отличается
от ХТ100 типом кристаллической решетки и высокой степенью упорядоченности структуры.
Аналогичная картина наблюдалась и на дифрактограммах пленок, полученных из подкисленных
водных растворов ХТ20 и ХТ100.
Для выявления существования возможных взаимодействий между макромолекулами ПВП и
ХТ100 были получены дифрактограммы пленок смесей ХТ100-ПВП в соотношении 1:2 (рис.8).
Оказалось, что дифрактограмма пленки ХТ100–ПВП (1:2), полученной из совместного раствора
полимеров (экспериментальная дифрактограмма) (рис. 8, кривая 1) отличается от модельной
дифрактограммы, полученной сложением интенсивностей дифрактограмм ХТ100 и ПВП, взятых в
пропорции содержания этих полимеров в композитной пленке (модельная пленка, рис. 8, кривая 2).
Как видно из такого сравнения, для пленки ХТ100–ПВП в области больших углов рассеяния
интенсивности рассеяния ХТ100 и ПВП складываются примерно аддитивно, но в малых углах
рассеяния экспериментальная интенсивность рассеяния такой пленкой (рис. 8, кривая 1) во много раз
превышает модельную интенсивность (рис. 8, кривая 2) и, соответственно, экспериментальные
интенсивности пленок ПВП и хитозана. Вероятно, это объясняется тем, что ПВП и хитозан образуют
двухфазную пленку с отдельными фазами ПВП и хитозана, за счет контраста в плотности которых и
возникает сильное малоугловое рассеяние.
Рис. 8 – (1) экспериментальная дифрактограмма пленки
хитозан–ПВП (1:2).2 – модельная дифрактограмма,
полученная из дифрактограмм пленки хитозана и пленки
ПВП. Логарифмический масштаб по оси абсцисс.
Атомно-силовая микроскопия.
Методом АСМ в режиме топографии исследованы участки поверхности тонких пленок
хитозана и ХТ-ПВП, полученных при высыхании на слюде подкисленных водных растворов,
соответствующих составов. Оказалось, что структура поверхности тонких пленок хитозана зависит от
его молекулярной массы. Так, участки поверхности ХТ100 визуализируются в виде нерегулярно
расположенных мелких глобул, а ХТ20 кристаллизуется на подложке в виде дендритоподобных
структур.
Дополнительно в режиме PeakForce QNM были измерены локальные механические
характеристики (деформация, модуль Юнга и адгезия) пленок ХТ100-ПВП толщиной 100 нм, на
участках размером 5×5 мкм (рис.9, а-в). На поверхности этих пленок образуются
микронеоднородности и наблюдается разделение фаз на наномасштабах. Оказалось, что локальные
механические характеристики поверхности пленки в микронеоднородностях отличаются, что
подтверждает существование двух фаз. Иными словами, ПВП и хитозан не смешиваются на
молекулярном уровне, а существуют в виде двух независимых микрофаз. Значения модуля Юнга для
мягкой фазы 1,8 ГПа, для более твердой 2,4 ГПа, что соответствует модулю Юнга пленки ХТ100.
абв
Рис. 9 АСМ-изобржения полученные в режиме PeakForce QNM участка поверхности пленки ХТ100-
ПВП, полученной при испарении раствора, содержащего полимеры (при массовом их соотношении 1:2,
соответственно), топография (а), модуль Юнга (б) и деформация (в).
3.3.2. Влияние АП на размеры ассоциатов хитозана в растворе (метод ДСР).
Для выявления возможных процессов комплексообразования в системах ПФС – ХТ –АП методом
ДСР были исследованы размеры частиц (ассоциатов) в растворах исходных полимеров (F127, ПВП,
ХТ100 ) и смесей АП – ХТ и ПФС- ХТ в зависимости от концентрации реагентов. Оказалось, что
размеры ассоциатов, образующихся в растворах исходных полимеров, не зависят от их концентрации.
По данным ДСР средний диаметр ( d ) молекул ХТ100, свободного F127 и ПВП оказались равны
90 нм, 7нм и 9 нм, соответственно (табл. 1 №. 5, 1, 4), что соответствует литературным данным. Для
ХТ100 наблюдается большая разница между размерами частиц в растворе (табл. 1 №. 5, 6), что связано,
очевидно, с большой молекулярной массой исходного хитозана (100кДа). В частности, согласно [13],
в растворах хитозанов с М.м.~ 100 кДа могут быть аccоциаты, не удаляемые фильтрованием или
седиментацией за счет дальнейшего взаимодействия низкомолекулярных агрегатов (после удаления
больших агрегатов) и образования более крупных частиц, поcкольку пpиcутcтвие таких агpегатов
наблюдалоcь и в отфильтpованныx pаcтвоpаx низкомолекуляpных xитозанов[14].
В растворах смеси полимеров АП-ХТ100, как следует из табл.1 (№.7,8), распределение частиц по
размерам соответствует такому же распределению в растворах исходных полимеров (Таблица 1, №.
1,4,6). Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что взаимодействие между АП и ХТ100 в
растворе 0,2% уксусной кислоты практически отсутствует.
Таблица 1. Распределение по размерам ассоциатов в водных и уксуснокислых
растворах ХТ100, АП, ХТ100-АП, ТФПF20-F127, ТФПF20-F127-ХТ100 при разных
концентрациях компонентов.
№Состав раствораd , нмξ-potential, mV
Peak1 Peak2 Peak3
1F127 2%*6.956
2F127 1%7.262-8
3F127 1%+CH3COOH (1%)7.653396+5
4ПВП 1%*9165
5ХТ100 0,05%89960+53
6ХТ100 0,2%*112790
7ХТ100 (0,2%)-F127 2%*6.8501250
8ХТ100 (0,2%)-ПВП 1%*10.41541320
9ТФПF20+F127(1%)6.646490+4
10ТФПF20+F127(1%)+ ХТ100 0,05%850405+36
*Относительная ошибка измерений составляла не более 5 %
Глава 4. Влияние хитозана на фотокаталитическую активность гидрофобных ПФС,
солюбилизированных плюроником F127
В настоящее время в антимикробной ФДТ (где от ФС не требуется высокой интенсивности
полос поглощения в «красной» области спектра), используют синтетические производные
тетрафенилпорфиринов (ТФП) – наиболее изученный класс гидрофобных порфиринов. Используют в
АФДТ, в частности, гидрированный аналог ТФП, 5,10,15,20-тетра(3-гидроксифенил) хлорин
(темопорфин) – в составе препарата, выпускаемого под названием “Foscan”.Тетрафенилпорфирины
обладают наиболее высоким из всех ФС квантовым выходом фотогенерации синглетного кислорода
(ФΔ ~0.6–0.8) при возбуждении светом с λ = 400 нм, при этом методы синтеза ТФП и его производных
достаточно просты. используют,
Интерес к фторзамещенным тетрафенилпорфиринам обусловлен как высоким квантовым
выходом (ФΔ) генерации 1О2, так и повышенной фотостабильностью по сравнению с незамещенными
ПФС [15].
4.1. Фотокаталитическая активность союбилизированных ТФП и ТФПF20
амфифильными полимерами.
Для использования в ФДТ гидрофобные порфирины и их аналоги переводят в
водорастворимую форму. Одним из способов перевода в водорастворимую форму ФС является
солюбилизация амфифильными полимерами, в частности, плюроником F-127, одним из наиболее
нетоксичных и эффективных ПАВ.
1800
1600
kэфф,л/(моль*с)
Рис.10Зависимостьэффективной
1400константы скорости kэфф реакции
фотоокислениятриптофана,
катализируемаяТФП-F127 (1),
1200ТФПF20-F127 (2) от концентрации
плюроника F127. СПФС=5·10-6М
1000
0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0 9,810,0
СF127 *104, М
Как следует из рис.10, характеры зависимостей эффективной константы скорости kэфф
фотоокисления триптофана от концентрации плюроника для ТФП и фторсодержащего ТФП заметно
отличаются, что связано с существенно большей гидрофобностью незамещенного ТФП.
Действительно, для получения эффективных водорастворимых фотосенсибилизирующих систем на
его основе требуется ~ в 20! раз большая концентрация плюроника чем для фторсодержащего ТФП
той же исходной концентрации.
4.2 Влияние хитозана на фотокаталитическую активность солюбилизированных ПФС
В таблице 2 представлены эффективные константы скорости реакции окисления триптофана,
катализируемой солюбилизированными плюроником F127 гидрофобными порфиринами ТФП и
ТФПF20 в присутствии и отсутствии ХТ100. Оказалось, хитозан практически не влияет на
фотокаталитическую активность солюбилизированного ТФП. В то же время в случае ТФПF20,
солюбилизированного F127, добавление хитозана приводит к некоторому росту kэфф (Таблица 2). Это,
очевидно, связано, с влиянием уксусной кислоты на активность порфиринов, что будет рассмотрено
далее (см. раздел 5).
Таблица 2. Эффективные константы скорости реакции фотоокисления триптофана в
присутствии систем ФС-АП-ХТ100
kэфф·10-3, моль/л·с
ТФПТФПF20
С F127 C хт10006·10-5М 10-4М06·10-4М 10-3М 6·10-3М
10-5М1,6
5·10 М
-5
1,01,91,92,02,0
10-4М1,41,51,31,82,02,32,2
5·10 М
-4
1,71,71,51,72,12,32,3
10-3М1,82,01,81,7
*Относительная ошибка измерений составляла не более 10 %
4.3. Размеры ассоциатов солюбилизированного плюроником F127 ТФПF20 и влияние
хитозана на них (метод ДСР).
Для установления характера взаимодействий между компонентами системы ТФПF20 – F127 –
ХТ100 в растворе были измерены ξ-потенциалы растворов F127 и ХТ100 , а также ТФПF20
солюбилизированного F127, в отсутствие и присутствии ХТ100 (табл1). Из табл. видно, что F127 в
нейтральном растворе характеризуется низким отрицательным значением ξ-потенциала (-8 mV). В
уксуснокислом растворе ξ-потенциал F127 сохраняет малое значение, однако, его знак меняется на
противоположный (+5mV), что говорит об образовании псевдо-поликатиона мицелл плюроника в
уксусной кислоте. Молекулы хитозана высокой степени деацетилирования характеризуются в кислой
среде высоким положительным зарядом, вследствие протонирования аминогрупп (+53 mV).
Солюбилммизаци плюроником ТФПF20F практически не меняет ξ-потенциал мицелл (+4 mV),. В
тройной системе ТФПF20+F127(1%)+ ХТ100 величина ξ-потенциала составляет +36 mV,то есть
значительно ниже, чем у свободного хитозана. Этот эффект может свидетельствовать о
взаимодействии хитозана с мицеллами ТФПF20+F127(1%). Маловероятно, что взаимодействие
полисахарида и плюроника в кислой среде имеет электростатическую природу, так как оба компонента
несут одноименный заряд. Наиболее вероятно, что такое взаимодействие носит гидрофобный характер
(доступная гидрофобная поверхность молекулы хитозана составляет ≈ 50%), а понижение
поверхностного заряда продукта взаимодействия обусловлено перестройкой поверхности мицеллы в
новых условиях.
Как видно из рис.11 для ТФПF20, солюбилизированного F127 в присутствии ХТ100 происходит
изменение характерных размеров ассоциатов порфирина (табл.1 № 9, 10). Такие изменения, как было
указано выше, могут быть связаны с взаимодействием мицелл плюроника с макромолекулами
хитозана. Очевидно, что наличие гидрофобных ФС в мицеллах плюроника способствует гидрофобным
взаимодействиям в системе мицеллы плюроника – макромолекулами хитозана.
Интенсивность ,%
3
1101001000
d, нм
Рис.11 Распределение по размерам ассоциатов в водных и
уксуснокислых растворах ТФПF20-F127 (1), ХТ100(2),
ТФПF20-F127-ХТ100(3).
Глава 5. Влияние температуры и рН среды на фотокаталитическую активность системы ФС-
АП – ХТ
Для установления оптимальных условий проведения АФДТ с системами ПФС-АП-ХТ было изучено
влияние температуры и рН среды на величину эффективной константы скорости фотоокисления
триптофана
5.1. Зависимость эффективной константы скорости фотоокисления триптофана в
присутствии системы ДМГ-ПВП-ХТ20 от температуры
Как уже упоминалось, растворенный в кислой среде протонированный хитозан является
поликатионом (рКа – 6,5) и на его конформацию, в значительной степени определяющую его
способность взаимодействовать с амфифильными полимерами и ФС, влияет, помимо концентрации
компонентов, температура и рН среды.
Из рис.12 следует, что фотокаталитическая активность порфирина (ДМГ) несколько растет с
увеличением температуры (рис.12, кривая 1), что вызвано увеличением растворимости порфирина.
Для комплексов порфирина с ПВП температурные зависимости kэфф носят экстремальный характер,
причем максимальные значения kэфф наблюдаются при 20-30оС. Максимальные значения kэфф
наблюдаются для комплекса ДМГ-ПВП при 20оС и концентрации ПВП 10-4моль/л. Такие сложные
температурные зависимости для kэфф порфирин-полимерных комплексов от температуры
определяются конформационными перестройками надмолекулярной структуры полисахарида и АП и,
возможно, изменением структуры ассоциатов ПВП. В частности, известно[16], что с увеличением
температуры выше 30оС происходит дегидратация ПВП, что в свою очередь может являться причиной
падения эффективной константы скорости окисления kэфф с увеличением температуры (рис. 12, кривые
2-4).
2000
1800
1600Рис.12.Зависимостиэффективной
константы kэфф скорости окисления
триптофана (10-4моль/л), катализируемого
1400
3комплексом ДМГ -ПВП, от t при разных
kэфф
1200
концентрациях полимера: 0 моль/л (1);
1000
1·10-5 моль/л (2); 5·10-5 моль/л (3); 1·10-4
моль/л (4).
10152025303540
Т, С
На фотокаталитическую активность ДМГ, агрегированного вблизи макромолекул ХТ20
температура практически не влияет (рис.13, кривая 1). Другими словами, повышение температуры в
данном случае не вызывает разагрегации порфирина, связанного с протонированными аминогруппами
макромолекул ХТ.
В тройной системе ДМГ-ПВП-ХТ20 температурные зависимости kэфф носят сложный характер
(рис.13), причем величины kэфф зависят от концентрации ПВП (рис.13 кривые 2-4). По-видимому,
падение величины kэфф при температурах ≥ 30°С связан с вышеупомянутой дегидратацией молекул
ПВП. Здесь следует подчеркнуть, что фиксируемый немонотонный характер исследуемых
температурных зависимостей указывает на происходящие в рассматриваемой тройной системе
сложные температурно-зависимые конформационные перестройки при изменении относительной
доли компонентов в таких системах. Важно, что максимальная активность комплексов порфирин-
амфифильный полимер-полисахарид наблюдаются во всех случаях при комнатной температуре,
наиболее комфортной для пациента.
650
5504Рис. 13. Зависимости эффективной константы
kэфф скорости окисления триптофана (10-
kэфф,л/(моль*с)
моль/л), катализируемого комплексом ДМГ
400– ПВП-ХТ20, от температуры при разных
3503концентрациях ПВП: 0 моль/л (1); 10-5 моль/л
(2); 5 ∙10-5 моль/л (3); 10-4 моль/л (4); 5 ∙10-4
2моль/л (5). Концентрация ХТ20 10-4моль/л.
1
2025303540
t, С
5.2. Влияние уксусной кислоты на фотокаталитическую активность порфиринов
Поскольку растворимость хитозана в водной среде незначительна, для приготовления водных
растворов ХТ обычно используют 2% уксусную кислоту. В то же время в связи с тем, что
порфириновые фотосенсибилизаторы обладают одновременно основными и очень слабыми
кислотными свойствами, в данной работе исследовано влияние кислотности среды на состояние и
фотокаталитическую активность ФС и комплексов ФС с АП в реакции окисления триптофана. В
кислой среде происходит протонирование тетрапиррольных макроциклов, которое может приводить
к изменению квантового выхода генерации синглетного кислорода порфирином [12]. Следует
отметить, что процесс протонировния многостадиен и в зависимости от кислотности среды можно
получить как моно-, так и дипротнированные порфирины, находящиеся в равновесии друг с другом и
с нейтральной формой. Одним из методов определения присутствия протонированных форм
порфиринов в растворе является анализ их спектров поглощения и флуоресценции. В частности, для
моно- и ди-протонированных форм порфирина наблюдаются батохромные сдвиги максимумов полосы
Соре (относительно соответствующего максимума полосы Соре непротонированной формы
порфирина) [17].
В связи с вышесказанным было определено соотношение протонированных и
непротонированных форм порфирина в зависимости от концентрации уксусной кислоты в растворе
путем анализа соответствующих ЭСП ДМГ и ХЛ. При малом количестве уксусной кислоты (0,02%)
происходит агрегация порфиринов, что выражается в сильном падении оптической плотности полосы
Соре и ее уширении (рис. 14, кривая 2).
400нм
1,5
Оптическая плотность, D
1,0
Рис. 14 ЭСП ДМГ в уксусной
40,07550кислоте, где концентрация СН3СООН
0,06
390нм0,05
– 0%(1); 0,02% (2); 0,2% (3); 0,3%(4);
130,042% (5).
0,50,03
0,02
0,01
20,00
500600
0,0
300400500600
Длина волны, нм
В ЭСП ДМГ с увеличением концентрации уксусной кислоты (от 0,02% до 2%) происходит
батохромный сдвиг полосы Соре на 10 нм, и рост ее интенсивности, что, очевидно, связано с
образованием монопротонированной формы ДМГ, доля которой растет с увеличением концентрации
кислоты в растворе. Для ХЛ изменения в ЭСП менее значительны. Так, в ЭСП хлорина при небольших
концентрациях уксусной кислоты, наблюдается небольшой гипсохромный сдвиг с образование плеча
при 640 нм (I Q полоса). Очевидно, в случае хлорина образуются также монопротонированные формы,
но в меньших количествах, чем в случае ДМГ. Это связано с существенно большей величиной
константы ионизации хлоринов по сравнению с порфиринами (например, для хлорофилловой кислоты
K=2,3·10-15, а для дейтеропорфирина K=7,1·10-16). Это означает, что для полного протонирования
молекул хлоринов необходимы более низкие значения рН.
Действительно в растворах соляной кислоты (0,2 – 2)Н в спектрах поглощения обоих
порфиринов происходит дополнительный батохромный сдвиг полосы Соре на 5 нм, что говорит об
образовании дипротонированной формы порфирина в 2Н HCL.
При этом оказалось, что при увеличении концентрации уксусной кислоты
фотокаталитическая активность ДМГ возрастает в 1.4 раза (рис.15, кривая 1), а фотокаталитическая
активность ХЛ уменьшается в 1.2 раза (рис.15, кривая 2).
1250
1200
1150
kэфф,л/(моль*с)
1100
1050
10002
0,000,020,040,060,080,100,120,140,160,180,20
Концентрация CH3COOH, %
Рис.15. Зависимость эффективной константы скорости реакции фотоокисления триптофана катализируемого
ФС: ДМГ (1) и ХЛ (2) от концентрации уксусной кислоты. Концентрация ФС -5·10-6 моль/л, концентрация триптофана
1·10-4моль/л
Увеличение активности ДМГ в присутствии уксусной кислоты связано с увеличением
квантового выхода генерации синглетного кислорода для протонированных форм порфиринов и
соответствующим образом в кислой среде для хлоринов наблюдается уменьшение квантового выхода
генерации синглетного кислорода для хлоринов [12].
5.3. Влияние кислоты на фотокаталитическую активность комплексов ФС-АП.
5.3.1.Влияние уксусной кислоты на фотокаталитическую активность комплексов
водорастворимых ФС с АП
В присутствии уксусной кислоты, как следует из рис.16, для всех систем ФС-АП наблюдается
падение в разной степени фотокаталитической активности (кривые 1- 4). При этом, из рис.16 следует,
что в кислой среде характер зависимостей kэфф от концентрации кислоты определяется структурой
полимера.
1500
1400Рис.16.Зависимость
1300
эффективнойконстанты
скоростиреакции
kэфф,л/(моль*с)
1200
фотоокислениятриптофана
катализируемого комплексами
1100
10003ДМГ-ПВП (1), ДМГ-F-127 (2),
900ХЛ-ПВП (3) и ХЛ-F-127 (4) от
8004концентрацииуксусной
700кислоты. Концентрация ПФС –
6005·10-6М,концентрация
5002полимеров: ПВП – 5·10-5М, F-
400127 – 5·10-5М.
0,000,010,020,030,040,1950,200
Концентрация CH3COOH, %
Действительно, для комплексов ФС- F-127 (рис. 16 кривые 2, 4) уже при концентрации
СН3СООН 0,005% наблюдается падение значений эффективной константы скорости kэфф, – в 1,6 -2
раза для ХЛ и ДМГ, соответственно. В то же время активность комплексов ДМГ и ХЛ с ПВП в
фотоокислении триптофана в присутствии уксусной кислоты (0,02-0,2%) в растворе меняется
незначительно (рис.16, кривые 1, 3), поскольку надмолекулярная структура ПВП практически не
зависит от рН среды [12]. В случае плюроника, по-видимому, в подкисленной среде происходит
агрегация мицелл F-127 [18], что приводит к увеличению размеров полимерных ассоциатов и
уплотнению мицелл. Можно полагать, что в результате таких процессов происходит формирование
псевдо-поликатиона, что приводит к агрегации ФС и снижению значений эффективной константы
скорости kэфф окисления субстрата. Как уже упоминалось, (см. Табл. 1 № 3 и раздел 4.3), образование
полимерных ассоциатов и формирование псевдо-поликатиона в растворе плюроника в присутствии
уксусной кислоты подтверждено данными ДСР.
5.3.2 Влияниеуксуснойкислотынафотокаталитическуюактивность
солюбилизированных плюроником F127 гидрофобных ФС
Добавление кислоты не ведет к уменьшению фотокаталитической активность комплексов ТФП
и ТФПF20 c F127, в отличие от таких же комплексов плюроника с водорастворимыми порфиринами.
Поскольку эти тетрафенилпорфирины гидрофобны и при солюбилизации плюроником F127
локализуются в ядре мицеллы, то изменение кислотности раствора практически не влияет на их
состояние. В случае комплекса ТФП-F127 изменения его активности в присутствии уксусной кислоты
практически не наблюдается (рис. 17а), а для комплекса ТФПF20-F127 виден небольшой рост
активности (рис.17б). Такие различия в фотосенсибилизирующих свойствах гидрофобных ФС могут
быть связаны с разной степенью агрегированности солюбилизированных тетрафенилпорфиринов.
Очевидно, ТФПF20 менее агрегирован и, следовательно, более равномерно распределен в мицеллах
плюроника. По-видимому, причиной меньшей агрегированности ТФПF20 при солюбилизации
является наличие атомов фтора, которое обеспечивает лучшее связывание с плюроником. Возможно,
в этом случае, добавление кислоты, обычно приводящее к «слипанию» мицелл плюроника[18], в
данном случае ведет к эффективному концентрированию ТФПF20 и субстрата и некоторому росту
активности. Тогда как в случае ТФП (менее разагрегированному по сравнению с ТФПF20)
взаимодействие мицелл не приводит к эффективному концентрированию ФС. Неизменность
состояния самих ФС подтверждается отсутствием изменений в ЭСП и спектрах флуоресценции
солюбилизированных тетрафенилпорфиринов при добавлении хитозана.
2150
б
а
1800
17502100
17003
kэфф,л/(моль*с)
2050
kэфф,л/(моль*с)
1650
2000
1600
15501950
15001900
1450
1850
1400
1800
1350
13001750
1250
0,000,040,080,120,160,20
0,000,050,100,150,20
Ссн3соон , %ССН3СООН, %
Рис.17 Зависимость эффективной константы скорости реакции фотоокисления триптофана катализируемой ПФС-
F127 (ПФС: ТФП (а) и ТФПF20(б)) от концентрации уксусной кислоты, где СF127=10-3М (1); 10-4М (2); 5·10-5М (3).
СПФС=5·10-6М
Приложение 1.
In vivo эксперименты по фотодинамическому воздействию с использованием комплексов
фотодитазин-хитозан-поливинилпирролидон при лечении модельных ранах у лабораторных
животных.
Исследования были выполнены на животных (23 крысы), разделенных на 6 групп, по 3-4 крысы
в каждой, в зависимости от способа обработки раны в каждой группе (Таблица 3). Экспериментальные
группы I–V служили в качестве контроля для базовой экспериментальной группы VI. В исследовании
использовали модель полнослойной плоской раны с тефлоновыми ограничительными кольцами,
описанной в работе [19].
Таблица 3. Распределение животных по группам
ГруппаIIIIIIIVVVI
Обработканет ХТФД+hν ФД-ХТ+hνФД-ПВП+hνФД-ПВП-ХТ+hν
Показано, что добавление хитозана в раствор фотодитазина (IV группа) практически не
уменьшало геморрагический эффект ФДТ с применением фотодитазина, который был ранее
обнаружен. На основании внешних клинических признаков и результатов гистологических
исследований, было показано, что ФДТ с применением композиции фотодитазин-ПВП-хитозан
(группа VI) оказывает заметное противовоспалительное и прорегенеративное действие. Введение
хитозана в комплекс фотодитазин –ПВП (VI группа) снижало гистотоксичность фотодитазина по
сравнению с бинарной системой фотодитазин-ПВП (V группа), о чем свидетельствовало отсутствие
геморрагической реакции в ранах экспериментальной группы VI. Применение ФДТ с использованием
комплексов фотодитазина с ПВП и ХТ усиливало антибактериальный эффект в большей степени, чем
комплекс фотодитазин-хитозан (IV группа), так как в ране не было обнаружено бактериальных клеток.
В то же время нами были обнаружены бактериальные клетки в ранах I-V. Показано,что тройной
комплекс фотодитазин-ПВП-хитозан в большей степени снижает активность воспалительных
процессов и усиливает пролиферацию фибробластов, неоангиогенез, рост и созревание
грануляционной ткани по сравнению с комплексом фотодитазин-ПВП.
Действительно, толщина грануляционной ткани в ранах VI группы на четвертые сутки
наблюдения составила 350 ± 50 мкм, при этом в V группе она составляла 206 ± 50 мкм, а в IV группе
толщина незрелой грануляционной ткани составляла (160-180) ± 50 мкм.
ВЫВОДЫ
1. Впервые получены тройные фотосенсибилизирующие системы на основе водорастворимых
порфиринов (ДМГ, ХЛ), амфифильных полимеров ( плюроник F127, ПВП) и хитозана разной
мол.массы, обладающие высокой активностью в генерации синглетного кислорода.
2. Показано, что фотосенсибилизирующая активность водорастворимых порфиринов в тройных
системах с хитозаном и амфифильным полимером определяется природой АП. Наибольшую
активность проявляли комплексы ДМГ и Хл с ПВП.
3. Показано, что уксусная кислота (использующаяся для растворения хитозана) снижает активность
комплексов ФС – плюроник из-за разрушения мицеллярной структуры плюроника и практически не
влияет на активность комплексов ФС-ПВП благодаря стабильности надмолекулярной структуры
ПВП в кислой среде.
4. Показано, что фотокаталитическая активность тройных композиций (ФС-АП-ХТ20), полученных
на основе низкомолекулярного хитозана, не превышает активность исходного ФС, в то время как
аналогичные системы на основе среднемолекулярного хитозана превышают по активности исходный
ФС в 1,5- 2 раза, что связано с разной супрамолекулярной структурой ХТ20 и ХТ100 в водных
растворах.
5. Показано, что гидрофобные порфирины – ТФП и ТФПF20, солюбилизированные F127, обладают
высокой фотокаталитической активностью в присутствии хитозана, что связано со стабилизацией
мицеллярной структуры плюроников в растворах уксусной кислоты при солюбилизации
гидрофобных соединений.
6. Методами РСА и АСМ было показано, что хитозан и ПВП в пленках, полученных при испарении
уксуснокислых водных растворов, содержащих системы ДМГ-ПВП-ХТ, не образуют общей фазы,
при этом порфирин преимущественно локализуется в мелкодисперном виде в фазе ПВП
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]L. Huang, Y. Xuan, Y. Koide, T. Zhiyentayev, M. Tanaka, and M. R. Hamblin, “Type I and Type II mechanisms of
antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria,” Lasers Surg. Med.,
vol. 44, no. 6, pp. 490–499, Aug. 2012, doi: 10.1002/lsm.22045.
[2]Y. Nitzan, M. Gutterman, Z. Malik, and B. Ehrenberg, “INACTIVATION OF GRAM-NEGATIVE BACTERIA BY
PHOTOSENSITIZED PORPHYRINS,” Photochem. Photobiol., vol. 55, no. 1, pp. 89–96, Jan. 1992, doi: 10.1111/j.1751-
1097.1992.tb04213.x.
[3]M. R. Hamblin and T. Hasan, “Photodynamic therapy: A new antimicrobial approach to infectious disease?,” Photochem.
Photobiol. Sci., vol. 3, no. 5, pp. 436–450, 2004, doi: 10.1039/b311900a.
[4]A. Muxika, A. Etxabide, J. Uranga, P. Guerrero, and K. de la Caba, “Chitosan as a bioactive polymer: Processing,
properties and applications,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 105, pp. 1358–1368, 2017, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.07.087.
[5]Д. A. Бузинова и A. Б. Шиповская, “Сорбционные И Бактерицидные Свойства Пленок Хитозана,” Известия
Саратовского Университета. Новая Серия. Серия Химия. Биология. Экология, том. 8, № 2, 2008.
[6]N. N. Glagolev, S. Z. Rogovina, A. B. Solov’eva, N. A. Aksenova, and S. L. Kotova, “Photocatalytic activity of water-
soluble tetrapyrrole compounds in the presence of amino-containing polymers,” Russ. J. Phys. Chem. A, vol. 80, no. 1
SUPPL., pp. 72–76, 2006, doi: 10.1134/S0036024406130127.
[7]J. R. Wagner, H. Ali, Ré. Langlois, N. Brasseur, and J. E. Ller, “BIOLOGICAL ACTIVITIES OF
PHTHALOCYANINES—VI. PHOTOOXIDATION OF L-TRYPTOPHAN BY SELECTIVELY SULFONATED
GALLIUM PHTHALOCYANINES: SINGLET OXYGEN YIELDS AND EFFECT OF AGGREGATION,” Photochem.
Photobiol., vol. 45, no. 5, pp. 587–594, May 1987, doi: 10.1111/j.1751-1097.1987.tb07384.x.
[8]Э. В. Попова, Н.С. Домнина, Н.М. Коваленко, Е.А. Борисова, Л.Е. Колесников, С.Л. Тютерев, “Биологическая
активность хитозана с разной молекулярной массой” Вестник защиты растений, том. 3, № 93, сс. 28–33, 2017.
[9]В. Н. Давыдова, И. М. Ермак, “Конформация Молекул Хитозана В Водных Растворах,” Биофизика, том. 63, № 4,
с. 648–660, 2018, doi: 10.1134/s0006302918040038.
[10]Ю. А. Горох и др., “Влияние амфифильных полимеров на фотокаталитическую активность водорастворимых
порфириновых фотосенсибилизаторов,” Журнал Физической Химии, том. 85, № 5, сс. 959–963, 2011.
[11]T. M. Zhiyentayev et al., “Complexes of chlorin e6 with pluronics and polyvinylpyrrolidone: Structure and photodynamic
activity in cell culture,” Photochem. Photobiol., vol. 90, no. 1, pp. 171–182, 2014, doi: 10.1111/php.12181.
[12]М.В. Пархоц, В.А. Галиевский, А.С. Сташевский, Т.В. Трухачева, Б.М. Джагаров, “Динамика и эффективность
фотосенсибилизированного образования синглетного кислорода хлорином е6: влияние рН раствора и
поливинилпирролидона,” Оптика и спектроскопия, том. 107, № 6, с. 1026-1032, 2009, doi:
10.1134/S0030400X09120200.
[13]M. W. Anthonsen, K. M. Vårum, A. M. Hermansson, O. Smidsrød, and D. A. Brant, “Aggregates in acidic solutions of
chitosans detected by static laser light scattering,” Carbohydr. Polym., 1994, doi: 10.1016/0144-8617(94)90157-0.
[14]I. V. Blagodatskikh et al., “Short chain chitosan solutions: self-assembly and aggregates disruption effects,” J. Polym.
Res., vol. 20, no. 2, p. 73, Feb. 2013, doi: 10.1007/s10965-013-0073-0.
[15]S. G. DiMagno, J. C. Biffinger, and H. Sun, “Fluorinated Porphyrins and Corroles: Synthesis, Electrochemistry, and
Applications,” in Fluorine in Heterocyclic Chemistry Volume 1, Cham: Springer International Publishing, 2014, pp. 589–
620.
[16]Ю.Э.Кирш, Поли-N-винилпирролидон и другие поли-N-виниламиды : Синтез и физ.-хим. свойства. Москва: Наука,
1998.
[17]M. M. Kruk, A. S. Starukhin, and W. Maes, “Influence of macrocycle protonation on the photophysical properties of
porphyrins,” Macroheterocycles, vol. 4, no. 2, pp. 69–79, 2011, doi: 10.6060/mhc2011.2.01.
[18]B. Yang et al., “Effect of acid on the aggregation of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)
block copolymers,” J. Phys. Chem. B, vol. 110, no. 46, pp. 23068–23074, 2006, doi: 10.1021/jp0634149.
[19]A. B. Shipovskaya, D. A. Rudenko, V. I. Fomina, and N. V Ostrovsky, “Structure and propperties of chitosan-based films
for biomedical purposes,” Eur. J. Nat. Hist., no. 6, pp. 7–12, 2012.
В последние годы наблюдается серьезный рост приобретенной
резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, прежде
всего к антибиотикам. Это приводит к невозможности использования целых
групп таких препаратов для лечения инфекций, вызванных
антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов. Полноценной
альтернативой антибиотикотерапии при лечении локальных инфекций
(труднозаживающие раны, трофические язвы, диабетические стопы) может
оказаться антибактериальная фотодинамическая терапия (АФДТ),
реализующая окислительную деструкцию патогенных микроорганизмов при
воздействии лазерного излучения на предварительно обработанные
фотосенсибилизатором (как правило, порфириновым ФС, ПФС) пораженные
области тканей. В настоящее время порфирины широко используются в
качестве фотосенсибилизаторов в фотодинамической терапии благодаря их
малой токсичности и высокой эффективности в фотогенерации активных
форм кислорода (АФК), прежде всего, синглетного 1О2 кислорода.
Важным преимуществом АФДТ является многовариантность
характера окислительной деструкции микробных клеток-мишеней, что
препятствует выработке устойчивости к последующим циклам
фотодинамических воздействий [1],[2].
Среди микробных патогенов наиболее серьезной лекарственной
устойчивостью обладают грамотрицательные бактерии, а потому лечить
заболевания, вызванные такой микрофлорой, чрезвычайно трудно [3],[4].
Они так же считаются наиболее устойчивыми и к фотодинамическим
воздействиям[5], что связано с наличием в структуре клеточной стенки
грамотрицательных бактерий внешней мембраны и низкой ее
проницаемостью для красителей. Основные компоненты мембраны – белки и
липополисахариды (ЛПС), несущие отрицательный заряд. Повысить
чувствительность грамотрицательных бактерий к ФС можно их обработкой
заряженными поликатионами [6], в результате чего происходит
высвобождение ЛПС, дезинтеграция внешней мембраны и, соответственно,
увеличение ее проницаемости для фотосенсибилизатора. В этой связи
катионные ФС оказались наиболее эффективны при АФДТ в отношении
грамотрицательных бактерий.
Для повышения эффективности АФДТ в последнее время
фотосенсибилизаторы используют в составе т.н. коньюгатов – молекул ФС,
ковалентно связанных с фрагментами синтетических или природных
полимеров (антителами, аминокислотами, липосомами, фрагментами
полимеров и биополимеров) [7], способствующих проникновению ФС в
клетку. Так, было показано, что связывание дейтеропорфирина с
поликатионным пептидом полимиксином B способствует проникновению
образующегося комплекса через мембрану грамотрицательных бактерий [5],
а использование конъюгатов анионных красителей (фталоцианинов) с
катионным полилизином приводит к повышению их фотобактерицидной
активности [6].
Одним из поликатионных носителей, широко использующихся в
медицинских целях, является природный полисахарид хитозан (ХТ) –
нетоксичный, биосовместимый биополимер, обладающий бактерицидными
свойствами. Катионная природа хитозана обусловливает его способность
взаимодействовать с синтетическими или природными полимерами,
содержащими отрицательные заряды. Это свойство позволяет ему легко
связываться с внешней стороной клеточных мембран живых организмов
(белками, гликопротеинами, отрицательно заряженными фосфолипидами)
[8]. Бактерицидность хитозана позволяет использовать композиции на его
основе при лечении ран и ожогов [9]. Однако использованию хитозана в
качестве носителя для ФС при получении полимерных
фотосенсибилизирующих систем для ФДТ и АФДТ препятствует агрегация
молекул порфиринов вблизи протонированных аминогрупп хитозана, что
приводит к падению активности порфиринов в присутствии хитозана в
процессах генерации активных форм кислорода, в частности, в модельных
процессах фотоокисления[10].
В то же время было показано, что тройные блок-сополимеры этилен-
и пропиленоксида (плюроники) с поверхностно-активными свойствами могут
повышать активность водорастворимых ПФС в процессах фотоокисления,
что связано с солюбилизацией ПФС мицеллами плюроников и происходящей
при этом разагрегацией ассоциатов порфиринов, в виде которых порфирины
обычно присутствуют в растворах. Этот процесс приводит к повышению
удельной (приходящейся на единичный фотосенсибилизирующий комплекс)
эффективной константы скорости фотоокисления триптофана (модельной
реакции, использующейся для тестирования активности ФС в генерации 1О2)
[11]. Однако в присутствии хитозана этот эффект практически исчезает, и
фотокаталитическая активность ПФС не достигает уровня активности
несолюбилизированного порфирина. В настоящей работе предложен
механизм взаимодействия водорастворимых фотосенсибилизаторов,
амфифильных полимеров и хитозана.
Диссертационная работа является частью плановых исследований,
проводимых в ФИЦ ХФ РАН по теме «Создание новых полимерных,
гибридных и композиционных материалов и их модифицирование с целью
широкого практического применения»
Целью настоящей работы является создание порфиринсодержащих
полимер-полимерных систем на основе хитозана и амфифильных полимеров
(АП), обладающих высокой фотосенсибилизирующей активностью для
антимикробной фотодинамической терапии, и исследование их свойств в
фотогенерации АФК в модельных условиях. В качестве ФС были выбраны
порфирины различной природы: водорастворимые – димегин, проходящий в
настоящее время клинико-биологические испытания, хлорин е6 – аналог
используемого в медицине препарата «Фотодитазин», а также гидрофобные
тетрафенилпорфирины, с высоким квантовым выходом фотогенерации 1О2.
Присутствие хитозана, обладающего собственными бактерицидными
свойствами, в разрабатываемой полимер-полимерной ФС- системе позволяет
эффективно использовать ее при АФДТ в отношении локальных инфекций,
вызванных, в том числе, грамотрицательными бактериями.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить
следующие основные задачи:
– определить фотокаталитическую активность двойных (ФС – АП),
(ФС – ХТ) и тройных (ФС-АП-ХТ) систем в модельной реакции
фотоокисления триптофана в воде в зависимости от природы ФС и АП, а
также соотношения компонентов;
– определить влияние природы порфирина, амфифильного полимера и
молекулярной массы хитозана на фотокаталитическую активность ФС-АП-
ХТ в реакции фотоокисления триптофана;
– установить влияние условий проведения процесса (температура, рН
среды) на каталитическую активность порфиринов и их комплексов с
полимерами в реакции фотоокисления триптофана
– установить влияние надмолекулярной структуры полимерных
компонентов тройной системы ФС-АП-ХТ на активность ФС;
– предложить возможный механизм влияния АП и ХТ на
фотоактивность гидрофобных и водорастворимых ФС;
– провести предварительные исследования эффективности
разрабатываемой системы при АФДТ модельных ран у лабораторных
животных.
Научная новизна работы.
Впервые показано, что использование хитозана с молекулярной
массой 50≤ХТ≤150КDа и поливинилпирролидона в системе ФС-АП-ХТ,
позволяет получать высокоэффективные полимерные фотосенсибилизаторы,
в 1,5 -2 раза превосходящие по активности исходный ФС.
Установлено, что основными факторами, влияющими на активность
систем ФС-АП-ХТ, является молекулярная масса хитозана и стабильность
надмолекулярной структурной организации АП в присутствии растворенного
хитозана, что позволяет практически полностью предотвратить
взаимодействие хитозана и порфирина, приводящее к падению
фотокаталитической активности системы. Показано, что разрушение
мицеллярной структуры плюроника в водных растворах хитозана (рН ~ 2,8-
3,5), приводило к падению фотокаталитической активности комплексов ФС-
F127 в присутствии хитозана, а устойчивость надмолекулярной структуры
ПВП в тех же условиях определяло высокую фотокаталитическую
активность систем ФС-ПВП-ХТ.
Показано, что гидрофобные порфирины – ТФП и ТФПF20,
солюбилизированные F127, обладают высокой фотокаталитической
активностью в присутствии хитозана, что связано со стабилизацией
мицеллярной структуры плюроников при солюбилизации гидрофобных
соединений.
Методами РСА и АСМ показано, что хитозан и ПВП в пленках,
полученных при испарении водных растворов, содержащих системы ДМГ-
ПВП-ХТ не образуют общей фазы, при этом порфирин преимущественно
локализуется в мелкодисперном виде в фазе ПВП.
Практическая значимость
Полученные данные могут быть использованы при разработке
порфиринсодержащих препаратов для антимикробной фотодинамической
терапии локализованных инфекций (длительно незаживающих ран,
осложненных ожогов, трофических язв) значительно более эффективных,
чем обычно используемые фотосенсибилизаторы и с дополнительной
бактерицидностью за счет использования природного полисахарида –
хитозана.
Положения, выносимые на защиту
1. Установленные зависимости константы скорости реакции
фотоокисления триптофана в присутствии систем ФС-АП-ХТ от
концентрации амфифильного полимера, соотношения полимерных
компонентов в системе и природы порфирина.
2. Данные ДСР по размерам молекул и ассоциатов в растворах
чистых полимеров (АП, ХТ), смеси полимеров (ХТ-АП) и тройных
систем ФС-АП-ХТ.
3. Установленные зависимости константы скорости фотоокисления
триптофана в присутствии систем ФС-АП-ХТ от температуры и рН
среды для получения оптимальных составов тройных систем при
проведении ФДТ процедур
4. Данные АСМ и РСА по надмолекулярной структуре пленок ХТ,
ХТ-АП, ДМГ-ПВП-ХТ, полученных при испарении
соответствующих водных растворов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей в
журналах, рекомендованных ВАК, и 6 тезисов докладов в материалах
Международных и Российских конференций. В совместных работах автор
принимал участие в подготовке и проведении экспериментальных
исследований, в обсуждении и обработке полученных результатов,
написании и подготовке работ к печати.
Апробация работы. Основные результаты работы были
представлены на XI International Conference on Chemistry for Young Scientists
“Mendeleev 2019” (Санкт-Петербург, 2019), 26th ANNUAL
INTERNATIONAL LASER PHYSICS WORKSHOP (Англия, 2017), XX
Менделеевском съезде (Екатеренбург, 2016), XXII Всероссийской
конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Республика
Марий Эл, пансионат «Яльчик», 2015), XXI, XXII ежегодных научных
конференциях отдела полимеров и композиционных материалов ФИЦХФ
РАН (Москва, 2020, 2021).
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, методической части, описания и обсуждения результатов,
заключения, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена
на 127 страницах, содержит 41 рисунок, 8 таблиц и 174 библиографические
ссылки.
![](https://expert-mik.ru/wp-content/themes/24author/assets/img/signup-document.png)
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!