Готовая кандидатская на тему: Стимул-чувствительные системы доставки лекарств на основе полисахаридов

Список сокращений……………………………………….……………………………8
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………….10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………18
1.1 Системы контролируемой доставки лекарств на основе полимерных частиц…18
1.2 Стимул-чувствительные полимерные частицы для доставки лекарств…………18
1.2.1 Типы стимулов, используемых для контролирования доставки лекарств….19
1.2.1.1 Изменения температуры………………………………………………….……19
1.2.1.2 Световые стимулы……………………….……………………………….…….22
1.2.1.3 Изменения pH среды …………..………………….……………………..….….24
1.2.1.4 Изменения окислительно-восстановительного потенциала…………………26
1.2.2 Классификация частиц, используемых для стимул-чувствительного
высвобождения……………………….……………………….…………………27
1.2.2.1 Морфология частиц……………………….…………………………………….27
1.2.2.2 Методы получения стимул-чувствительных полимерных частиц…………..30
1.2.2.3 Природа полимеров……………………….…………………………………….31
1.3 Системы доставки лекарств на основе полисахаридов и их ключевые физико-
химические свойства……………………….………………………….……………32
1.3.1 Виды полисахаридов и особенности их использования в системах доставки
лекарств……………………….……………………….………..……………….34
1.3.1.1 Стимул-чувствительные катионные полисахариды и их модификации…….34
1.3.1.2 Стимул-чувствительные системы на основе анионных полисахаридов и их
модификации……………………….……………………….……………………36
1.3.1.3 Гибридные системы на основе полисахаридов………………………….…….41
1.3.2 Инкапсулированные формы лекарств с полисахаридами……….……………45
1.4 Методы исследования полимерных частиц, предназначенных для создания
систем доставки лекарств……………………….………………………………….47
1.4.1 Исследование физико-химических свойств разработанных носителей………47
1.4.2 Биологические исследования подтверждения безопасности и специфической
активности разрабатываемых носителей………………………………………..49
1.5 Заключительные замечания и постановка задач диссертационной работы……..49
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ……………………………………52
2.1 Характеристики исходных веществ, материалов и их подготовка……….…….52
2.2 Оборудование и статистическая обработка данных……………………….….…56
2.3 Методы синтеза …..……………………….…………………….……………….…58
2.3.1 Синтез компонентов для сборки фоточувствительных частиц………………58
2.3.1.1 Синтез N-карбоксиангидрида L-лизина…………………………………….…58
2.3.1.2 Синтез поли(L-лизина)………………….……………………….…………..…59
2.3.1.3 Деблокирование pLys (Z) ……………………….………………………………60
2.3.1.4 Синтез фоточувствительного линкера…………………………………………60
2.3.2 Синтез термочувствительных привитых сополимеров полисахаридов
(гепарина и хондроитин сульфата) с пИПААм……………………………..….60
2.3.2.1 Синтез модифицированных Boc-аминосодержащих полисахаридов……….60
2.3.2.2 Cнятие Boc-защиты модифицированных полисахаридов…………………….61
2.3.2.3 Синтез макроагента обратимой передачи цепи на основе полисахаридов….62
2.3.2.4 RAFT-полимеризация N-изопропилакриламида от макроRAFT
полисахарида……………………….……………………….……………………62
2.4 Методы исследования состава полимеров, мономеров и других компонентов для
сборки частиц……………………….……………………….………………………64
2.5 Получение наночастиц……………………….…………………….……………….67
2.5.1 Получение наночастиц хитозан-гепарин……………………….………………67
2.5.2 Получение наночастиц поли(L-лизина) и гепарина…………………………..67
2.5.3 Получение наночастиц pLys-Геп с включенным в структуру
фоточувствительным линкером………………………………………………..68
2.5.4 Получение наночастиц на основе ковалентно-сшитых привитых
сополимеров……………………….…………………….………………………69
2.5.5 Получение флуоресцентно меченых наночастиц……………………………..70
2.6 Исследование размера, заряда поверхности и морфологии наночастиц………..70
2.7 Исследование стимул-чувствительного поведения и физико-химические
характеристики полимеров и наночастиц………………….………………………71
2.7.1 pH-чувствительность наночастиц хитозан-гепарин.……….…………………71
2.7.2 Методы исследования фоточувствительности наночастиц pLys-Геп-линкер и
исходных компонентов.……….……………….……….……….………………71
2.7.2.1 Исследование фотоиндуцируемой деградации линкера……….…………….71
2.7.2.2 Исследование деградации фоточувствительного линкера с использованием
полистирольных микрочастиц……….……………….……………….………..73
2.7.2.3 Исследование фоточувствительной наносистемы pLys-Геп-линкер..……….74
2.7.3 Свойства термочувствительных частиц……….……………………….………75
2.7.3.1 Термо- и pH-чувствительность привитых сополимеров.……………………..75
2.7.3.2 Термочувствительность сшитых привитых сополимеров.……….………….76
2.7.3.3 Ферментативная деградация Гепарин-графт-пИПААм.……….…………….76
2.7.3.4 Исследование связывания термочувствительных полимеров с муцином……77
2.7.3.4.1 Метод изотермической титрационной калориметрии…………………….78
2.7.3.4.2 Метод микромасштабного термофореза……………………………………78
2.7.3.5 Исследование связывания термочувствительных полимеров с
дексаметазоном методом ММТ.……….……….……….……………….……..80
2.8 Создание инкапсулированных форм лекарственных препаратов на основе
разработанных полимерных систем……….……………….……………….……..81
2.8.1 pH-чувствительные системы доставки генетических конструкций………….81
2.8.1.1 Инкапсулирование олигонуклеотида……….……………….…………………81
2.8.1.2 pH-чувствительное высвобождение олигонуклеотида……….………………82
2.8.2 Фоточувствительные системы доставки генетических конструкций…………82
2.8.2.1 Инкапсулирование олигонуклеотида и плазмидной ДНК……….……………82
2.8.2.2 Фоточувствительное высвобождение олигонуклеотида из наночастиц pLys-
Геп-линкер……….……………….……………….……………….……….…….83
2.8.3 Термочувствительные системы доставки малых молекул……….……………84
2.8.3.1 Инкапсулирование дексаметазона……….……………….……………..….…84
2.8.3.2 Термочувствительное высвобождение дексаметазона……….………..……..84
2.9 Биологические свойства разработанных носителей……….……………….……..85
2.9.1 Анализ цитотоксичности……….……………….……………….……………….85
2.9.1.1 Цитотоксичность наночастиц хитозан-гепарин……….……………….……..85
2.9.1.2 Цитотоксичность pLys-Геп……….……………….……………….……………86
2.9.1.3 Цитотоксичность Геп-г-пИПААм и ХС-г-пИПААм……….………………….87
2.9.1.4 Исследование безопасности привитых сополимеров in vivo…………………87
2.9.2 Исследование способности разработанных частиц к проникновению внутрь
клеток……….……………….……………….……………….…………….……88
2.9.2.1 Проникновение наночастиц хитозан-гепарин с Cy5-миРНК, ингибирующей
выработку фактора роста эндотелия сосудов……….……………….…………88
2.9.2.2 Проникновение наночастиц Сy5-pLys-Геп……….……………….……………89
2.9.3 Исследование способности разработанных носителей доставлять лекарства в
клетки……….……………….…………………..……….……………….………90
2.9.3.1 Трансфекция ARPE-19 с использованием pH-чувствительных частиц с
пДНК……….……………….……………….……………….……………….….90
2.9.3.2 Ингибирование фактора роста эндотелия сосудов с использованием pH-
чувствительных частиц с миРНК……….……………….…………….……….90
2.9.3.3 Подавление экспрессии гена GFP фоточувствительными частицами с
миРНК……….……………….……………….……………….………………….91
2.9.3.4 Трансфекция HCE фоточувствительными частицами с пДНК……………….92
2.9.3.5 Фармакодинамический эффект снижения внутриглазного давления при
использовании термочувствительных частиц с ингибитором
карбоангидразы………………………………………………………………….92
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ………………………………………….94
3.1 Синтез компонентов для получения стимул-чувствительных полимерных
систем………………..……….……………….……………….……………….……94
3.1.1 Синтез поли(L-лизина)………………………………………………………….94
3.1.2 Синтез фоточувствительного линкера…..……….……………….…….…..….95
3.1.3 Синтез термочувствительных привитых сополимеров Геп-г-пИПААм и ХС-г-
пИПААм……………..……….……………….…………………………………96
3.1.3.1 Определение молекулярных масс и дисперсности образцов……………….99
3.1.3.2 Ферментативная деградация термочувствительных сополимеров…………101
3.2 Формирование стимул-чувствительных полимерных систем и их физико-
химические свойства……….……………….……………….……………….……102
3.2.1 Формирование pH-чувствительных частиц и исследование их
характеристик…………………………………………………………………..102
3.2.2 Формирование фоточувствительных частиц и их физико-химические
характеристики……….……………….……………….……………….………106
3.2.2.1 Получение наночастиц pLys-Геп……….……………….……………………106
3.2.2.2 Влияние включения гепарина в частицы на взаимодействие pLys с
полинуклеотидами……………………………..……….……………….……..108
3.2.2.3 Фотоиндуцируемое разложение фоточувствительного линкера……….…..109
3.2.2.4 Сборка фоточувствительных наночастиц pLys-Геп-линкер……….……….113
3.2.3 Формирование термочувствительных частиц и их физико-химические
характеристики……….……………….……………………………….………117
3.2.3.1 Изучение термочувствительных свойств привитых сополимеров…………117
3.2.3.2 Изучение термочувствительных свойств ковалентно сшитых привитых
сополимеров……….……………….……………….……………….………..122
3.2.3.3 Исследование связывания термочувствительных полимеров с муцином…..124
3.2.3.3.1 Метод изотермической титрационной микрокалориметрии……….…….125
3.2.3.3.2 Метод микромасштабного термофореза……….……………….………….127
3.2.3.4 Исследование связывания термочувствительных полимеров с
дексаметазоном методом ММТ……….……………….…………….………..129
3.3 Использование разработанных стимул-чувствительных полимеров для создания
систем доставки лекарств……….……………….……………….……………….132
3.3.1 pH-чувствительные частицы: инкапсулирование и высвобождение
олигонуклеотида……….……………….……………….……………….…….132
3.3.2 Фоточувствительные частицы: инкапсулирование высвобождение пДНК и
миРНК……….……………….……………….……………….………………..134
3.3.3 Термочувствительные частицы: инкапсулирование и высвобождение
дексаметазона фосфата……….……………….………….……………….……136
3.4 Биологические свойства разработанных носителей……….……………….….139
3.4.1 Цитотоксичность стимул-чувствительных полимерных систем…………….139
3.4.1.1 Цитотоксичность pH-чувствительных частиц……….……………….…..…139
3.4.1.2 Цитотоксичность фоточувствительных частиц……….……………….……141
3.4.1.3 Цитотоксичность термочувствительных сополимеров……….…………….142
3.4.2 Исследование способности разработанных наночастиц к проникновению
внутрь клеток……….……………….……………….……………….………..144
3.4.3 Исследование способности полимерных носителей доставлять лекарства в
клетки и ткани……….……………….……………….……………….……….145
3.4.3.1 Трансфекция ARPE-19 с использованием pH-чувствительных частиц с
инкапсулированной пДНК……….……………….……………..…….………145
3.4.3.2 Ингибирование фактора роста эндотелия сосудов с использованием pH-
чувствительных частиц с миРНК……….…………………………….………148
3.4.3.3 Подавление экспрессии гена GFP фоточувствительными частицами в
комплексе с миРНК……….……………….…………….…………….……….150
3.4.3.4 Трансфекция HCE фоточувствительными частицами в комплексе с
пДНК…..……….……………….……………….……………….……………..151
3.4.3.5 Фармакодинамический эффект снижения внутриглазного давления при
использовании термочувствительных частиц с инкапсулированным
ингибитором карбоангидразы……….……………….……………….………152
ВЫВОДЫ……….……………….……………….…..………….……………….……154
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……….……………….……………….……………….….155
БЛАГОДАРНОСТИ……….……………….……………….…………….……………173

Во ВВЕДЕНИИ обоснована актуальность выбранной темы, сформулированы цели
и задачи работы, отражены научная новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены основные положения, выносимые на защиту.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Обзор содержит анализ современного состояния исследований в области создания и применения стимул-чувствительных систем доставки биологически активных веществ. Классифицированы типы стимул-чувствительных систем доставки БАВ. Рассматриваются основные методы получения и характеризации стимул-чувствительных носителей на основе или с использованием природных полисахаридов (катионных, анионных и их модификаций). Обсуждается влияние их физико-химических характеристик на биологические свойства систем доставки. Обсуждаются проблемы формирования инкапсулированных форм БАВ с полисахаридами, а также необходимые методы исследования стимул-чувствительных систем для их практического применения. Формулируется постановка задач диссертационной работы.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава содержит описание методов получения pH-чувствительных систем на основе интерполиэлектролитного комплекса хитозан-гепарин и фоточувствительных систем на основе интерполиэлектролитного комплекса поли(L-лизина) с гепарином, сшитых фоточувствительным линкером на основе 4-бромметил-3-нитробензойной кислоты, методов модификации природных анионных гликозаминогликанов гепарина и хондроитин сульфата с целью синтеза термочувствительных привитых сополимеров с поли-(N- изопропилакриламидом) на их основе. Приведены методы оценки состава поли(L-лизина), фоточувствительного линкера, полисахаридов и привитых сополимеров. Описаны методы исследования физико-химических и биологических свойств формируемых полимерных частиц, способы модификации поверхности частиц и методики инкапсулирования биологически активных молекул.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Были разработаны биосовместимые гидрогелевые полиэлектролитные системы на основе комплексов хитозан-гепарин, способные к pH-чувствительному высвобождению лекарств при pH ниже 6. Показано влияние сильного конкурентного негелеобразующего полианиона гепарина на скорость высвобождения олигонуклеотида, миРНК, пДНК.
Получены интерполиэлектролитные системы на основе поли(L-лизина) и гепарина, сшитые фоточувствительным линкером, способным к разрушению, приводящему к высвобождению лекарств (олигонуклеотида, пДНК) из частиц под воздействием УФ- излучения в области 320-360 нм. Синтезирован фоточувствительный линкер, изучена скорость УФ-деградации линкера. Показано влияние сшивки полимеров фоточувствительным линкером на физико-химические и биологические свойства полученных систем.
Разработаны гидрофильные наночастицы, способные удерживать БАВ при попадании в физиологические условия (на роговицу глаза) за счет термочувствительного захвата лекарства и мукоадгезивных свойств носителя. Был синтезирован ряд ранее не описанных в литературе гидрофильных привитых сополимеров гепарин-графт-поли(N- изопропилакриламид) и хондроитин сульфат-графт-поли(N-изопропилакриламид) с различной плотностью и длиной привитых цепей пИПААм с использованием метода RAFT- полимеризации. Проведено изучение термочувствительных свойств сополимеров в зависимости от молекулярной массы, концентрации и pH. Получены биосовместимые несшитые и сшитые частицы на основе графт-сополимеров, проведен сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств данных систем, в особенности, их чувствительности к изменению температуры, способности связывать и высвобождать офтальмологические препараты, а также наличия мукоадгезивных свойств.
3.1 Синтез компонентов для создания стимул-чувствительных систем
3.1.1 Синтез поли-L-лизина
Для получения фоточувствительных частиц на основе интерполиэлектролитного
комплекса (ИПЭК) в качестве поликатиона использовали поли(L-лизин). Наличие положительного заряда обуславливает электростатические взаимодействия с полиэлектролитом, несущим отрицательный заряд.
N-карбоксиангидрид (N-КА) ε-карбоксибензил-L-лизина был получен методом циклизации Lys(Z) при его взаимодействии с фосгеном, выделяющимся в реакционной смеси из трифосгена (Рис. 1 а). С целью предотвращения протекания побочных реакций использовали защищенное по аминогруппе производное лизина Lys(Z). Для связывания выделяющегося в процессе реакции HCl и предотвращения побочных реакций в реакционную смесь добавляли акцептор α-пинен. Выход N-KA ε-карбоксибензил-L-лизина составил 83%.
Синтез pLys различной молекулярной массы (ММ) осуществляли методом полимеризации с раскрытием цикла N-KA аминокислоты (Рис. 1 б). С целью контроля молекулярной массы использовали различные соотношения концентрации мономера и инициатора, что позволило получить гомополимеры pLys(Z) c заданной длиной цепи и характеризующиеся низкой дисперсностью (Рис. 1 г). После получения конечного продукта Z-защиту снимали обработкой полимера трифторуксусной и трифторметансульфокислотой (Рис. 1 в).
Рисунок 1 − Схема синтеза N-карбоксиангидрида ε-карбоксибензил-L-лизина (а), полимеризации N-КА Lys(Z) (б), реакции обрыва цепи и деблокирования ε-аминогруппы pLys(Z). Молекулярно-массовые характеристики pLys, определенные методом ГПХ с использованием пММА стандартов (г).
3.1.2 Синтез фоточувствительного линкера
Для получения линкера, способного взаимодействовать как с аминогруппами pLys,
так и с карбоксильными группами гепарина, 4-бромметил-3-нитробензойную кислоту модифицировали моно-Boc-защищенным этилендиамином, проводя реакцию
нуклеофильного замещения брома.
Рисунок 2 − Синтез фоточувствительного линкера, содержащего Boc-защищенную аминогруппу.
3.1.3 Синтез термочувствительных привитых сополимеров Геп-г-пИПААм и ХС-г-пИПААм Синтезированы привитые сополимеры Геп-г-пИПААм и ХС-г-пИПААм методом RAFT-полимеризации с подходом «графтирование от» (Рис. 3). В качестве основной цепи
в сополимере выступал полисахарид, к которому прививались цепи пИПААм различной длины. Эффективность модификации полисахаридов RAFT-агентом составила для
гепарина 75%, для хондроитин сульфата – 100 %. Повышенная эффективность модификации хондроитин сульфата, вероятно, обусловлена меньшим количеством отрицательно заряженных сульфогрупп в его структуре, которые, в свою очередь, могут препятствовать более эффективной модификации гепарина. Таким образом, установлено, что одна полимерная цепь гепарина содержит примерно 20 RAFT-агентов, в то время как одна молекула хондроитин сульфата – 28-30.
Рисунок 3 − Схема cинтеза сополимеров на основе гепарина и хондроитин сульфата с привитыми цепями пИПААм.
Ряд сополимеров Геп-г-пИПААм и ХС-г-пИПААм синтезировали с использованием различных соотношений мономер:макро-RAFT:инициатор ([ИПААм]o:[макро-RAFT]o:[I]o), при этом также варьировали время реакции (Табл. 1). Относительную молекулярную массу полученных графт-сополимеров определяли методами ГПХ, а также статического рассеяния света (СРС). Рассчитанный состав сополимеров может быть выражен следующим образом: плотность прививки составляет 75% (для гепарина) и 100% (для хондроитин сульфата), или 20 2 и 28 2, соответственно, привитых цепей пИПААм на одну цепь полисахарида; при этом длина привитой цепи составляла 9-14 звеньев ИПААм.
Для определения % содержания полисахаридов в синтезированных графт- сополимерах использовали катионный краситель Азур А. Содержание полисахарида снижалось с увеличением степени полимеризации ИПААм. Содержание полисахаридов, в целом, согласуется с изменением молекулярной массы для сополимеров.
Таблица 1 − Условия RAFT-полимеризации ИПААм от Геп-макро-RAFT и ХС-макро-RAFT, а также молекулярно-массовые характеристики полученных сополимеров Геп-г-пИПААм, определенные методом ГПХ (в воде) и СРС (в воде).
[ИПААм]o: χ, [макро- t, ч %*
RAFT]o: [I]o
50:1:0.2 24
50:1:0.2 48 100:1:0.2 24 100:1:0.2 48
ГПХ**
СРС
% ПСХ в сополи
Число привиты х цепей
Длина привиты х цепей мере*** пИПААм пИПААм
**** *****
Mw 10-3
Ð
Mw 10-3
Rh-D, нм
No
Г-1 Г-2 Г-3 Г-4
Гепарин-графт-пИПААм
47. 27. 1.11 – 04
56. 34. 1.17 – 58
47. 29. 1.31 – 07
55. 38. 1.17 – 08
– 40.6
– 27.3
– 34.9 20 2 9 2 – 14.8 20 2 13 2

10
Г-5 Геп
100:1:0.2
58. 41. 1.20
07 8.21.3
22 2 14 2
30 3 11 2 28 2 13 2
41.0 6.5 10.0 12. 1.13 14.5 2.5
6 2.9 0.5 Хондроитин сульфат-графт-пИПААм
Х-4 100:1:0.2 48 53. 34. 1.11 86
58. 47.
Х-5 100:1:0.2 72 9 8 1.13
ХС 14. 1.17 8
39.0 5.5 11.6 7.81.1
49.0

10.1 16.6 3.3
8.6
2.1 8.0
2.9 0.5
* Конверсия мономера
** в воде, пуллуланы в качестве стандартов
*** Содержание полисахарида (ПСХ) определено по реакции с красителем Азур А **** Определено спектрофотометрически
***** Определено по спектрам ЯМР 1H
3.2.1 Формирование стимул-чувствительных полимерных систем и их физико- химические свойства
3.2.1 Формирование pH-чувствительных частиц и исследование их характеристик Хитозан является известным поликатионным pH-чувствительным вектором для доставки нуклеиновых кислот в клетки. При этом, в ряде исследований было показано, что сильное взаимодействие первичных аминогрупп хитозана с отрицательно заряженными группами нуклеиновых кислот затрудняет и замедляет их дальнейшее внутриклеточное
высвобождение.
В данной работе в состав полиплексов нуклеиновых кислот с хитозаном (ММ
330000; степень деацетилирования 85 %) дополнительно вводили сильный полианион – гепарин, для облегчения высвобождения генетических конструкций внутри клеток при рН ниже 6 за счёт конкурентных взаимодействий между гепарином и нуклеиновой кислотой.
Для оптимизации размеров и -потенциала частиц варьировали мольные соотношения заряженных групп хитозана и гепарина. На Рис. 4 показано, что при 4-х и 6- ти кратном избытке аминогрупп хитозана частицы обладают наименьшим диаметром и достаточным положительным -потенциалом, необходимым для стабилизации системы за счёт электростатического отталкивания частиц.
1000
747 750
500 250
311 176 192 307 334
1088
60 40 20
31.9 35.5 40.1 41.6 16.3
4.5 00
1:1 2:1 4:1 6:1 8:1 16:132:1 Хит [NH3+] : Геп [SO3H-]
1:1 2:1 4:1 6:1 8:1 16:1 Хит [NH3+] : Геп [SO3H-]
Рисунок 4 – Гидродинамический размер (а) и -потенциал (б) полиэлектролитных комплексов хитозан-гепарин при различных мольных соотношениях заряженных групп.
3.2.2 Формирование фоточувствительных частиц и их физико-химические характеристики
3.2.2.1 Получение наночастиц pLys-Геп
Поли(L-лизин), в отличие от хитозана, является более сильным негелеобразующим
поликатионом, способным образовывать более стабильные частицы и обеспечивающим более эффективное связывание с нуклеиновыми кислотами. Усилить контроль
Dh, нм
z-потенциал, мВ

11
внутриклеточного высвобождения генетического материала из полиплексов на основе поли(L-лизина) и гепарина возможно путем включения низкомолекулярного фоточувствительного линкера, деградация которого приводит к декомпактизации частиц и высвобождению генетического препарата.
С целью оптимизации характеристик полиплексов исследовали влияние молекулярной массы pLys и мольных соотношений заряженных групп pLys и Геп на размер и -потенциал частиц (Рис. 5). Наблюдался рост гидродинамического диаметра полиплексов при использовании pLys с большей молекулярной массой. При этом добавление избытка гепарина приводило к уменьшению размеров частиц. Все частицы обладали отрицательным -потенциалом, что свидетельствует о присутствии гепарина во внешнем слое частиц. Для дальнейших исследований использовали оптимальные мольные соотношения pLys:гепарин 1:3.
Рисунок 5
потенциал комплексов.
8 кДа
8 кДа
13 кДа
20 кДа
43 кДа
71 кДа
71 кДа
400 300 200 100
0 -20 -40 -60
[Lys-NH3+]:[Геп-SO3-], моль:моль 13 кДа 20 кДа 43 кДа
[Lys-NH3+]:[Геп-SO3-], моль:моль
3.2.2.2 Влияние гепарина на взаимодействие пДНК с pLys
Роль гепарина как конкурентного полианиона во взаимодействии pLys с пДНК
оценивали по методу вытеснения бромистого этидия (EtBr). Обнаружено, что конденсация ДНК с pLys приводит к частичному вытеснению данного реагента, вызывая уменьшение сигнала флуоресценции при 590 нм (Рис. 6 а). Добавление гепарина к комплексу pLys с ДНК приводит к вытеснению ДНК и связыванию ее с EtBr, что проявляется в более высокой флуоресценции (Рис. 5 а). Из полученных данных видно, что конденсация ДНК с ИПЭК pLys-Геп затруднена, а добавление избытка гепарина к уже сформированному комплексу приводит к вытеснению ДНК из комплекса с pLys (Рис. 5 б).
100 80 60 40 20 0
(а)
50
(б)
pLys
pLys + Геп (х4) pLys + Геп (х8)
pLys
pLys + Геп (х4) pLys + Геп (х8)
0.1 1 10
+ / – зарядовое соотношение
0 50 100 150 t, мин
Рисунок 6 – Тест с EtBr: (а) влияние гепарина на конденсацию пДНК с pLys (соотношение зарядов +/- определяется молярным соотношением NH3+ групп лизина и PO4- групп пДНК). Гепарин использовали в количестве, позволяющем получить 4- и 8-кратный молярный избыток SO3- групп по отношению к NH3+ группам лизина; (б) скорость вытеснения пДНК из ИПЭК с pLys после добавления избытка гепарина, полученного при различных
– Влияние молекулярной
массы и молярных соотношений заряженных групп pLys и гепарина на
гидродинамический размер и –
1.5 0.8
0.3 0.2
0.3 0.2
1.5 0.8
0.1
0.3 0.2
1.5 0.8
0.1
0.3 0.2
1.5 0.8
0.1
0.3 0.2
1.5 0.8
0.1
1.5 0.8
0.3 0.2
0.1
0.3 0.2
1.5 0.8
0.1
1.5 0.8
0.3 0.2
0.1
0.3 0.2
1.5 0.8
0.1
1.5 0.8
0.3 0.2
0.1
0.1
Флуоресценция, %
Флуоресценция, %
z-потенциал, мВ Dh, нм
соотношениях pLys:Геп. За 100% принималась флуоресценция пДНК, связанной с EtBr в контрольном образце.
3.2.2.3 Фотоиндуцируемое разложение фоточувствительного (ФЧ) линкера
Среди ФЧ-линкеров широко используются 4-бромметил-3-нитробензойная кислота и ее производные благодаря их способности к фоторазложению при воздействии УФ- излучения в диапазоне длин волн от 300 до 400 нм. Согласно литературным данным, фотоиндуцированное разложение 4-бромметил-3-нитробензойной кислоты и ее производных должно приводить к образованию альдегида, который может быть обнаружен методом 1H ЯМР и количественно оценен реакцией с альдегид-специфическим реагентом
Шиффа (Рис. 7).
При использовании лазеров мощностью 0.8 и 3 Вт/см2 эффективность деструкции
образцов была примерно одинакова. С увеличением времени облучения количество образующегося продукта деструкции линкера – 3-нитро-4-формилбензойной кислоты возрастало и после 45 мин облучения зависимость выходит на плато (Рис. 7).
Рисунок 7 – Схема распада 4-(((2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этил)-амино)метил)-3- нитробезойной кислоты под действием УФ-излучения. Схема взаимодействия продукта – 3-нитро-4-формилбензойной кислоты с фуксинсернистой кислотой (реактивом Шиффа). Влияние продолжительности облучения и мощности лазера на эффективность фотоиндуцированного разложения линкера с длиной волны 325 нм в ДМСО (б).
3.2.2.4 Сборка фоточувствительных наночастиц pLys-Геп-линкер
Сборку фоточувствительных частиц осуществляли за счет ковалентной
иммобилизации линкера на основе 4-бромметил-3-нитробензойной кислоты, содержащей карбоксильную группу, к pLys по реакции активированных эфиров. После снятия Boc- защиты с аминогруппы линкера (Рис.2) получали полиплексы посредством инкапсулирования нуклеиновой кислоты. Затем, на поверхности полиплексов ковалентно иммобилизовали гепарин по реакции активированных эфиров. Включение фоточувствительного линкера ограничивает подвижность макромолекул и препятствует высвобождению инкапсулированных нуклеиновых кислот . Воздействие УФ-светом приводит к разложению линкера, увеличению подвижности макромолекул и вытеснению нуклеиновых кислот гепарином.
3.2.3 Формирование термочувствительных несшитых и сшитых частиц и их физико- химические характеристики
На основе синтезированных сополимеров были получены два типа частиц: несшитые и сшитые. Получение несшитых частиц происходило за счет самоорганизации сополимеров при повышении температуры от 27 до 35 С (Рис. 9 а). При температуре фазового перехода боковые привитые цепи пИПААм компактизируются и весь раствор сополимера переходит в коллоидную форму за счёт фазового разделения и увеличения роли гидрофобных взаимодействий между цепями пИПААм (Рис. 8 в).
Графтирование пИПААм от Геп и ХС приводит к наличию концевых тритиокарбонатных групп RAFT в привитых макромолекулах. С целью получения
100
0.8 Вт/см2
80 60 40 20
3.0 Вт/см2
5 15 30 45 60
продолжительность облучения, мин
Эффективность фото-разложения, %
ковалентно сшитых наночастиц проводили восстановление RAFT на концах привитых цепей пИПААм с образованием сульфгидрильных групп, количество которых определяли с использованием реактива Эллмана. Полученные сульфгидрильные группы частично или полностью (от 10 до 100%) окисляли с образованием дисульфидно-сшитых графт- сополимеров (Рис. 8 б). Ковалентно сшитые сополимеры формируют более стабильные наночастицы с большим диаметром. При температуре фазового перехода сшитые частицы не агрегируют, а наоборот, обратимо сжимаются, что, вероятно, обусловлено коллапсом привитых цепей пИПААм (Рис. 8 г).
Рисунок 8 – Схематичное представление термочувствительных Геп-г-пИПААм и ХС-г- пИПААм наногелей, образованных самоорганизацией в водных растворах (а) и ковалентно сшитых дисульфидными связями (б). Влияние температуры на гидродинамические характеристики несшитых (в) и сшитых (г) частиц с различной степенью сшивки.
3.2.3.1 Изучение термочувствительных свойств привитых сополимеров
Методами динамического рассеяния света и турбидиметрии были определены начальные и конечные температуры фазового перехода, а также ширина фазового перехода сополимеров. Температурные зависимости относительной интенсивности рассеянного света и интенсивности оптического пропускания для сополимеров Геп-г- пИПААм и ХС-г-пИПААм показаны при различных концентрациях полимеров в растворе. Обнаружено, что при понижении концентрации Геп-г-пИПААм в растворе температура фазового перехода смещается в область более высоких значений. При понижении концентрации ХС-г-пИПААм интервал фазового перехода становится шире, однако, начальная температура фазового перехода Т1 изменяется незначительно. Вероятно, наблюдаемая разница в термочувствительном поведении сополимеров обусловлена
большей плотностью прививки пИПААм в случае сополимеров хондроитин сульфата.
Рисунок 9 − Температурные зависимости относительной интенсивности рассеянного света и интенсивности оптического пропускания для сополимера Геп-г-пИПААм (образец Г-5) в воде при с = 3.2 мг/мл (а); с = 1.5 мг/мл (б) и с = 0.4 мг/мл (в); ХС-г-пИПААм (образец X-5) в воде при с = 4.7 мг/мл (г); с = 1.5 мг/мл (д) и с = 0.5 мг/мл (е).

Изучено влияние pH на термочувствительное поведение графт-сополимеров (Рис.10). Показано, что повышение pH раствора сополимеров гепарина приводит к смещению начальной температуры фазового разделения в область более высоких значений и увеличению интервала фазового перехода. В кислой среде происходит более резкий фазовый переход при более низких температурах, что, вероятно, обусловлено присутствием ионизирующих сульфогрупп гепарина, pKa которых имеет значения около 2. Можно предположить, что в нейтральных условиях заряженные группы гепарина обеспечивают гидрофильность сополимера, а при pH 1.5 сополимер находится в метастабильном состоянии, что способствует фазовому разделению.
Для сополимеров хондроитин сульфата наблюдается обратная зависимость: при увеличении pH температура фазового перехода смещается в область более низких значений, а интервал фазового перехода сужается. Согласно литературным данным, для гомополимера пИПААм наблюдается аналогичное влияние pH на температуры фазового перехода T1 и T2. Вероятно, в случае сополимеров хондроитин сульфата значительное влияние на pH-чувствительность оказывает присутствие большего количества привитых цепей пИПААм и меньшего количества сульфогрупп хондроитин сульфата.
Рисунок 10 − Изменения интенсивности светорассеяния (I/I21) и пропускания (I*/I*21) Г-5, измеренные в растворах с различным pH (c = 1.5 мг/мл). T1 – начальная температура фазового разделения, T2 – конечная температура фазового разделения, dT – интервал между T1 и T2.
3.2.3.2 Исследование связывания термочувствительных полимеров с муцином
Улучшение биодоступности БАВ, в первую очередь, обеспечивается увеличением времени пребывания полимерного носителя на поверхности глаза, что связано со снижением скорости физиологичного дренажа за счет повышенной вязкости и мукоадгезивных свойств полимеров. Мукоадгезия генерируется образованием ковалентных или супрамолекулярных взаимодействий, включающих образование водородных, а также гидрофобных и электростатических связей. На мукоадгезивные свойства полимеров влияют их физико-химические характеристики: молекулярная масса, баланс гидрофильных и гидрофобных групп, гибкость и пространственная конформация полимерной цепи, заряд поверхности, гидродинамический размер макромолекул, концентрация и стабильность в физиологических средах. Кроме того, влияние оказывает окружающая среда (pH, ионная сила раствора) и физиологические параметры (толщина и расположение слизистого слоя, скорость обновления слизи, наличие патологических
состояний.
3.2.3.2.1 Метод изотермической титрационной микрокалориметри
Мукоадгезивные свойства полученных носителей, а именно, связывание полимеров
с гликопротеином муцином, исследовали с применением метода изотермической калориметрии (ИТК), основанного на измерении тепла, выделяющегося или поглощающегося в процессе связывания биомолекул. Метод ИТК позволяет определить полный термодинамический профиль молекулярного взаимодействия (константы диссоциации, стехиометрию взаимодействия, изменение энтальпии и энтропии), сродство и механизм взаимодействия. Для взаимодействия несшитых сополимеров с муцином с использованием двух моделей были определены константы диссоциации комплекса и полумаксимальные эффективные концентрации сополимеров, коэффициенты стехиометрии взаимодействия (Рис. 11). Полученные данные свидетельствуют о высоком сродстве полимеров к муцину.

-7
-6 log[муцин], M
-4 35oC
EC50 » 10-9 М
-10 -9 -8 -7
log[муцин], М
25oC 30 15
-5
30oC 0 33oC -15 o -30 35 C -45 -60 -75
-9 -8 -7 33oC o
-30
EC50 » 10
М
теплового
инъекции
полимера
концентрации в ячейке в ходе калориметрического эксперимента для системы Геп-г-пИПААм (а) и ХС-г-пИПААм (б) с муцином. Параметры связывания, рассчитанные по данным ИТК для систем привитых сополимеров с муцином (в).
3.2.3.2.2 Методмикромасштабноготермофореза
Взаимодействие сополимеров с муцином было впервые исследовано с
использованием метода микромасштабного термофореза (ММТ), позволяющего получить количественные параметры связывания, а именно, полумаксимальные эффективные концентрации одного из взаимодействующих партнеров. Метод основан на измерении подвижности молекул в тепловом поле до и после связывания.
Полученные относительные значения EC50 позволяют сделать вывод о том, что несшитые полимеры имеют определенное сродство к муцину, которое возрастает на четыре порядка при наличии в составе частиц сульфгидрильных групп. Кроме того, вероятно, на взаимодействие также влияет количество сульфогрупп в полисахариде, которые могут вызывать электростатическое отталкивание от отрицательно заряженных сахаридных доменов муцина, и плотность прививки пИПААм, обеспечивающая наличие сульфгидрильных групп в составе сополимера.
(а)
45 30 15
0 -15 -30
(б)
30 15 0 -15 -30
EC50 » 10-5 М
25oC 0 30oC
33oC -15
(в)
log[муцин], M
-10 -9 -8 -7
EC50 » 10-9 М (г)
Рисунок 12 – Кривые 25oC титрования сополимеров 30oC Геп-г-пИПААм (а), ХС-г- 33oC пИПААм (б), Геп-г- 35oC пИПААм-SS/SH (в), ХС-г-
пИПААм-SS/SH (г) с муцином.
25oC
o 30C
log[муцин], M 35C
-9
3.2.3.3 Исследование взаимодействия привитых сополимеров с дексаметазоном методом ММТ
Методом ММТ изучена способность разработанных сополимеров связывать офтальмологические препараты, а именно, дексаметазон фосфат. Значения EC50, полученные для дексаметазона, связанного с несшитыми графт-сополимерами (Рис. 13 а, б), находились в миллимолярном диапазоне, что свидетельствует о слабом связывании
между ними. Для образцов несшитых сополимеров увеличение температуры до 35 С приводило к более эффективному их взаимодействию с дексаметазоном. В случае со сшитыми Геп-г-пИПААм-SS/SH и ХС-г-пИПААм-SS/SH (Рис. 13 в, г) значения EC50 уменьшались до микромолярных величин, что указывает на большее сродство дексаметазона к данным сополимерам. Вероятно, наблюдаемый эффект обусловлен увеличением гидрофобных взаимодействий сшитых сополимеров с дексаметазоном.
Рисунок 11 – Зависимость
эффекта раствора от его
DFнорм, % DFнорм, %
DFнорм, % DFнорм, %

(а)
0 -15 -30 -45 -60 -75 -90
(б)
0 -15 -30 -45 -60 -75 -90 -105 -120
3.3
3.3.1
-30 o
EC50 » 10-6 М -45
-30 35oC EC50 » 10-6 М
-60
Рисунок 13 – Кривые титрования сополимеров Геп-г- пИПААм (а), ХС-г- пИПААм (б), Геп-г- пИПААм-SS/SH (в), ХС-г-пИПААм-SS/SH (г) дексаметазоном.
EC50 » 10-4 М
-5 -4 -3
log[дексаметазон], M
EC50 » 10-4 М
-5 -4 -3
log[дексаметазон], M
35 C
o 25C
30oC
33oC
35oC
25oC
30oC
33oC
35oC
25oC
(в)
0-7 -6 -5 30oC
log[дексаметазон], M
-15 33oC
DFнорм, % DFнорм, %
DFнорм, % DFнорм, %
(г) log[дексаметазон], M 25oC 0o
-7 -6 -5 30C o
Использование разработанных стимул-чувствительных полимеров для создания систем доставки лекарств
pH-чувствительные частицы: инкапсулирование и высвобождение олигонуклеотида Исследование влияния pH на эффективность инкапсулирования модельного
олигонуклеотида показало, что эффективность инкапсулирования зависит от степени
протонирования аминогрупп хитозана. Наиболее эффективное связывание олигонуклеотида наблюдалось при рН менее 6 (Рис. 14 а). Размеры частиц изменялись в зависимости от pH (Рис. 14 б). При pH выше 6.0 происходит депротонирование хитозана, что приводит к снижению поверхностного заряда частиц, их сжатию и агрегации. В кислой среде размер частиц увеличивался за счет повышения положительного заряда аминогрупп с последующим набуханием наночастиц.
Рисунок 14 – Эффективность инкапсулирования олигонуклеотида в частицы хитозан-гепарин при различных pH (а). Гидродинамические размеры и -потенциал полученных частиц с олигонуклеотидом при исследуемых pH (б).
Влияние включения гепарина на высвобождение олигонуклеотида исследовано в средах с различными значениями pH, имитирующими цитозоль, ранние эндосомы или лизосомы (Рис. 15). Наибольшая скорость высвобождения наблюдалась при pH 4.5, что, вероятно, вызвано набуханием частиц. Включение гепарина в состав частиц приводило к ускорению высвобождения, что может быть связано с вытеснением олигонуклеотида конкурентным полианионом.
Рисунок 15 – Кривые высвобождения олигонуклеотида из частиц хитозан- гепарин при различных pH (буферные растворы: MES 4.5, PBS 6.3 и 7.4).
3.3.2 Фоточувствительные наночастицы: инкапсулирование и высвобождение пДНК и миРНК
Фотоиндуцируемое высвобождение нуклеиновых кислот из частиц pLys-Геп-линкер
33 C
исследовано на примере пДНК и Cy3-олиго-dT-dA. Методом гель-электрофореза показано, что пДНК полностью связывается с частицами pLys-Геп, сшитыми ФЧ-линкером, и поэтому теряет свою подвижность в геле (Рис. 16 а, дорожка 4). УФ-облучение приводит к появлению полос пДНК (Рис. 16 а, дорожки 5 и 6). Для частиц, содержащих большее количество линкера, (Рис. 16 а, дорожка 6) наблюдается дополнительное удерживание пДНК в частицах после УФ-обработки, что, вероятно, вызвано неполным разложением линкера или образованием нерегиоспецифических поперечных связей (между амино- и карбоксильными группами pLys и Геп, соответственно), так как количество добавляемых в этом случае активирующих агентов для реакции сшивки линкера с цепями полимера превышает количество, используемое в случае его меньшего содержания.
Высвобождение Cy3-меченого олиго-dT-dA (модели миРНК) изучали с использованием ультрафильтрации коллоидных растворов частиц с последующим измерением флуоресценции фильтрата (Рис. 16 б). Для несшитых ФЧ-линкером частиц полное высвобождение олигонуклеотида достигалось за 8 часов. Сшивка полимеров с ФЧ- линкером привела к значительному замедлению высвобождения олиго-dT-dA: лишь 20% олигонуклеотида высвободилось из частиц через 8 ч. Воздействие УФ-излучения в течение 30 минут инициировало увеличение степени высвобождения до 60% в течение 8 ч. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что предложенный метод конструирования фоточувствительных полиэлектролитных частиц позволяет эффективно контролировать высвобождение различных генетических конструкций.
Рисунок 16 – Исследование фоточувствительного высвобождения (а) пДНК из частиц pLys-пДНК-Геп-линкер, (1) маркер молекулярных масс; (2,3) пДНК; (4) пДНК в сшитых ИПЭК без УФ-обработки; (5) пДНК в сшитых ИПЭК [1:0.5:3:0.8 мол.] после 30 минут УФ-облучения (5 Вт, 365 нм); (6) пДНК в сшитых ИПЭК [1:0.5:3:1.6 мол.] после 30 минут УФ-облучения; (б) Cy3-олиго- dT-dA из частиц pLys-Олиг-Геп- линкер [1:1:3:1.6 мол.]
3.3.3 Термочувствительные частицы: инкапсулирование и высвобождение дексаметазон фосфата
Изучение кинетики высвобождения дексаметазона позволило предположить, что эффективность его связывания влияет на скорость высвобождения. Наблюдается заметное увеличение эффективности инкапсулирования дексаметазона в сшитые частицы по сравнению с несшитыми на основе полученных графт-сополимеров, а именно, 60.3±2.1% для Геп-г-пИПААм, 68.2±1.3% для ХС-г-пИПААм, 71.2±1.7% для Геп-г-пИПААм- SS/SH и 72.4±3.6% для ХС-г-пИПААм-SS/SH. Для несшитых сополимеров, ввиду подвижности цепей пИПААм, наблюдается выраженное влияние температуры на кинетику процесса, а именно, термоиндуцированное замедление высвобождения от 9 ч при 25 С (Рис. 17 а) до 24 ч при 35 С (Рис. 17 б), что объясняется гидрофобными взаимодействиями дексаметазона с цепями пИПААм. В случае сшитых сополимеров скорость высвобождения замедлена до 32 ч уже при 25 С (Рис. 17 а) и меняется незначительно при повышении температуры (Рис. 17 б).

150
50
HEK 293 HCE NIH 3T3
100
HEK 293 HCE NIH 3T3
00 C (pLys-Геп-линкер), мкг/мл
С (pLys-Геп-линкер), мкг/мл
(а)
Геп-г-пИПААм Геп-г-пИПААм-SH/SS
(б)
100 80 60 40 20
ХС-г-пИПААм ХС-г-пИПААм-SH/SS
80
Геп-г-пИПААм Геп-г-пИПААм-SH/SS
ХС-г-пИПААм ХС-г-пИПААм-SH/SS
Без полимера
00 Время, ч
Время, ч
40 Без полимера 20
Рисунок 17 – Кривые высвобождения дексаметазона фосфата из наногелей на основе Геп- г-пИПААм, Геп-г-пИПААм-SS/SH, ХС-г-пИПААм и ХС-г-пИПААм-SS/SH при 25 С (а) и 35 С (б) в ФБР pH 7.4.
3.3.4 Цитотоксичность частиц
Исследование цитотоксичности частиц проводили с помощью МТТ-теста с
использованием эпителиальных клеток. В случае комплексов с хитозаном добавление гепарина уменьшало цитотоксичность исходного поликатиона. Частицы на основе полилизина не оказывали цитотоксичности за счет присутствия на поверхности биосовместимого гепарина.
50
24 ч
Хитозан
Гепарин
Хит-Геп 1:1 Хит-Геп 2:1
24 ч
0.005%
0.05%
72ч 0.005% 0.05%
72 ч
Рисунок 18 – МТТ-тест: Хит-Геп и исходных полисахаридов (хитозан, гепарин) в концентрациях 0.05 и 0.005 масс. % на первичных кератиноцитах человека через 24 и 72 часа инкубации; pLys-Геп-линкер [1:3:0.8 мол.] через 24 и 72 ч на различных клеточных культурах.
Цитотоксичность графт-сополимеров исследовали на эпителиальных клетках глаза (роговицы и сетчатки) с использованием MTT-теста. Токсичность сополимеров проявлялась лишь при долговременной инкубации и высоких концентрациях.
Токсичность сополимеров in vivo оценивали на глазах крыс по различным показателям, которые говорят о наличии раздражения. В качестве контроля сравнения использовали фосфатно-солевой буферный раствор. Полученные данные демонстрируют, что сополимеры не вызывают острой местной реакции и, соответственно, безопасны для дальнейшего использования в качестве носителей лекарств для лечения офтальмологических патологий.
8
31
125
500
1000
8
31
125
500
1000
1
6
9 12
24 28
0
3
9 12
24 28
Выживаемость, %
Высвобождение 25°C, %
Выживаемость, %
Выживаемость, %
Высвобождение 35°C, %

19
150 100 50
150 100 50
24 ч
24 ч ARPE-19 HCE
C (ХС-г-пИПААм), мг/мл 72 ч
C (ХС-г-пИПААм), мг/мл
150 100 50 00
C (Геп-г-пИПААм), мг/мл
72 ч 150
100 50 00
C (Геп-г-пИПААм), мг/мл
8 6 4 2 0
-2
ФСБР pH 7.4
Геп-г-пИПААм ХС-г-пИПААм
1 день
2 день
3 день
4 день
5 день
Рисунок 19 – Выживаемость клеток сетчатки ARPE-19 и роговицы глаза HCE, инкубированных с полимерами Геп-г-пИПААм и ХС-г-пИПААм в течение 24 и 72 часов (слева). Частота моргания крыс после введения глазных капель, содержащих графт- сополимеры или ФБР pH 7.4, с дозированием два раза в день в течение 5 дней (справа).
3.4 Способность частиц переносить и высвобождать нуклеиновые кислоты в клетках Данная часть работы была направлена на исследование возможности применения разработанных полимерных частиц в качестве потенциальных систем доставки лекарственных веществ различной природы: нуклеиновых кислот и гидрофильного ингибитора карбоангидразы, способного снижать внутриглазное давление и
перспективного для лечения глаукомы.
3.5.1 Трансфекция ARPE-19 с использованием pH-чувствительных частиц с нуклеиновыми кислотами
Оценивали целевую способность частиц хитозан-гепарин переносить внутрь клеток и высвобождать генетические конструкции, а именно пДНК, кодирующую зеленый флуоресцентный белок, и миРНК, ингибирующую синтез фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС). На основании сигналов внутриклеточной флуоресценции зеленого белка показано, что клетки трансфицируются в 2-2.5 раза с большей эффективностью полиплексами хитозан-гепарин-pEGFP по сравнению с контрольной трансфекцией с использованием pEGFP без полимеров (Рис. 20 в). Кроме того, полиплексы с гепарином продемонстрировали более высокую эффективность трансфекции по сравнению с полиплексами хитозан-pEGFP, что может быть обусловлено не только ослаблением взаимодействия хитозана с ДНК, но и вытеснением пДНК гепарином в процессе разрушения сборки частиц в цитоплазме при pH 7.4. При этом, увеличение количества гепарина в составе полиплексов приводило к более эффективной трансфекции клеток.
Использование избытка гепарина при мол. соотношении хитозан:гепарин 1:4 приводило к отрицательному заряду поверхности частиц (-22 ± 4 мВ). Однако значительных различий в гидродинамических размерах между полиплексами с разным количеством гепарина не обнаружено (Рис. 20 г). Таким образом, показано, что полиплексы с отрицательным дзета-потенциалом способны связывать пДНК и переносить её в клетки.
Частицы Хит-Геп были применены для доставки миРНК, направленной для подавления выработки мРНК, кодирующей ФРЭС в клетках сетчатки человека. Эффективность РНК-интерференции изучена с применением анализа экспрессии мРНК, кодирующей ФРЭС, методом ПЦР в реальном времени. Показано, что полиплексы хитозан- гепарин с мольным соотношением 1:2 и 1:4 продемонстрировали в 2 раза более сильное ингибирующее действие, чем полиплексы хитозан-гепарин 2:1 (Рис. 20 д). На изображениях флуоресцентной микроскопии клеток ARPE-19, обработанных полиплексами, отчетливо видно эффективное проникновение миРНК. В случае мольных соотношений хитозан:гепарин 1:2 и 1:4 большинство миРНК оказывалась в цитоплазме. При соотношении 2:1 частицы, вероятно, имели больший размер и проявляли склонность к агрегированию, поэтому их проникновение в клетки было затруднено.
Выживаемость, % Выживаемость, %
Выживаемость, % Выживаемость, %
Частота моргания
0.004 0.008
0.004 0.008
0.016 0.031
0.016 0.031
0.063 0.125
0.063 0.125
0.25
0.5
0.25
0.5
0.004 0.008
0.016 0.031
0.004 0.008
0.063 0.125
0.016 0.031
0.25
0.5
0.063 0.125
0.25
0.5
Рисунок 21 – Трансфекция клеток ARPE-19 полиплексами Хит-Геп-pEGFP при мол. соотношении 2:1:0.5 (а) и 1:4:0.5 (б); сигнал нормализованной флуоресценции клеток ARPE-19 после трансфекции полиплексами, в качестве отрицательного контроля использовали клетки, трансфицированные pEGFP без полимерных носителей (принимали за 100% трансфекции) (в); Dh (черные столбцы) и -потенциал (серые столбцы) полиплексов с pEGFP. Состав наночастиц, имеющий наибольшую эффективность трансфекции, отмечен красной рамкой; (д) слева: Относительная экспрессия мРНК ФРЭС после РНК-интерференции с использованием полиплексов хитозан-гепарин с анти-ФРЭС миРНК в клетках ARPE-19 в различных мол. соотношениях (1:1; 2:1; 4:1). В качестве внутреннего стандарта измеряли РНК-интерференцию белка глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы. Справа: изображения флуоресцентной микроскопии клеток ARPE- 19, трансфицированных Хит-Геп-Cy5-миРНК (красный цвет).
3.4.2 Трансфекция фибробластов (3T3) и клеток роговицы (HCE) фоточувствительными частицами с нуклеиновыми кислотами
Фоточувствительные частицы на основе pLys-Геп-линкер апробировали для
доставки миРНК, подавляющей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP), в фибробластах мышей (NIH-3T3), постоянно продуцирующих данный белок. Подавление экспрессии GFP анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (Рис. 21 а). Подавление GFP с использованием сшитых ИПЭК без УФ- облучения было незначительным за счет медленного высвобождения миРНК из сшитых частиц. Однако, подавление GFP существенно увеличивалось после УФ-обработки клеток в течение 30 минут в результате быстрого фотоиндуцируемого внутриклеточного высвобождения миРНК. Морфология клеток не менялась на протяжении всего эксперимента.
Кроме того, способность ИПЭК переносить нуклеиновые кислоты в клетки роговицы человека (HCE) исследовали с применением пДНК, содержащей ген люциферазы светляков (Рис. 21 б). Сшитые ИПЭК не показали способности трансфецировать клетки без УФ-воздействия. В то же время, воздействие УФ светом приводило к появлению люциферазной флуоресценции. Эффективность трансфекции в этом случае составила 27% по сравнению с трансфекцией, опосредованной полиэтиленимином (ПЭИ). Таким образом, для разработанных систем была показана возможность фотоактивации трансфекции пДНК.

21
Рисунок 21 – РНК интерференция анти-GFP миРНК, доставленной с помощью ФЧ-частиц ([Lys – NH3+]:[миРНК – PO4-]:[Геп – SO3-]:[линкер] = 1:1:4:0.8) в клетки NIH-3T3. Изображения флуоресцентной микроскопии клеток NIH-3T3, продуцирующих GFP, после трансфекции анти-GFP миРНК в комплексе с ИПЭК: (1) интактные клетки; (2) клетки, инкубированные со сшитыми анти-GFP-миРНК/ИПЭК; (3) клетки, инкубированные со сшитыми анти-GFP- миРНК/ИПЭК и подвергнутые УФ-облучению (5 Вт, 365 нм) в течение 30 минут; (4) клетки,
инкубированные с полиплексом анти-GFP-миРНК/ПЭИ. (б) Трансфекция клеток роговицы +−−
(HCE) ИПЭК pLys-Геп-линкер с пДНК ([Lys–NH3 ]:[пДНК–PO4 ]:[Геп–SO3 ]:[линкер] = 1:0.5:4:0.8).
3.4.3 Фармакодинамический эффект снижения внутриглазного давления при использовании термочувствительных частиц с инкапсулированным ингибитором карбоангидразы
Гидрофильный ингибитор карбоангидразы, и полимерные частицы, содержащие ингибитор, на основе сшитых/несшитых привитых сополимеров были протестированы на кроликах с нормальным внутриглазным давлением с точки зрения способности его снижения. Ингибитор карбоангидразы продемонстрировал явный эффект снижения внутриглазного давления (Рис. 22). Несшитые полимерные частицы с инкапсулированным ингибитором карбоангидразы обладали аналогичным эффектом, тогда как сшитые частицы оказали заметное пролонгированное, более 8 часов, снижение давления, что обусловлено удерживанием ингибитора на роговице за счет мукоадгезивных свойств носителей.
12
10 ФБР pH 7.4
66
012345678
время, ч
012345678
время, ч
Геп-г-пИПААм
10
Геп-г-пИПААм-SH/SS ХС-г-пИПААм-SH/SS
ФБР pH 7.4
ИКА
ДРЗ
ХС-г-пИПААм ИКА
ДРЗ
Рисунок 22 – Изменения внутриглазного давления после введения глазных капель с растворами Геп-г-пИПААм и ХС-г-пИПААм (слева), Геп-г-пИПААм-SH/SS и ХС-г-пИПААм- SH/SS (справа), содержащими ИКА относительно контроля ФБР pH 7.4, коммерческого препарата дорзоламида и свободного ИКА.
Таким образом, на данном этапе работы была изучена способность разработанных полимерных носителей сохранять активность биологически активного вещества и способствовать эффективности его действия с целью улучшения качества терапии офтальмологических заболеваний.
ВГД, мм рт. ст.
ВГД, мм рт. ст.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны способы синтеза гибридных термочувствительных графт- сополимеров природных полисахаридов (гепарина и хондроитин сульфата) с привитыми цепями поли(N-изопропилакриламида) с использованием метода контролируемой радикальной полимеризации по механизму присоединения-фрагментации, а также получения на их основе частиц, обладающих комплексом свойств (контролируемый размер, связывание биологически активных веществ, стимул-чувствительное высвобождение лекарств, стабильность в физиологических средах, отсутствие цитотоксичности, мукоадгезивные свойства), необходимых для их использования в качестве систем доставки лекарств различной природы.
2. Разработан метод синтеза фоточувствительного линкера, содержащего в химической структуре функциональные группы для эффективного включения в частицы различной природы и пригодного для создания систем фотоиндуцируемой доставки лекарств.
3. Впервые получены узкодисперсные образцы частиц различной структуры на основе поликатионов хитозана и поли(L-лизина) с включенным конкурентным полианионом гепарином для эффективной pH- и фотоиндуцируемой доставки генетических конструкций. 4. Показано, что использование конкурентного сильного полианиона гепарина в pH- и фоточувствительных частицах значительно повышает эффективность внутриклеточного высвобождения генетических конструкций, увеличивает стабильность частиц в физиологических средах и понижает их цитотоксичность.
5. На основании исследования цитотоксичности полимерных частиц и изучения биологической активности полученных систем с инкапсулированным лекарственным веществом в клеточных экспериментах и на глазах животных, показана принципиальная возможность применения разработанных полимерных наночастиц в качестве систем доставки лекарственных веществ различной природы.

Системы контролируемой доставки биологически активных веществ (БАВ) на
основе биосовместимых и биодеградируемых полимеров представляют собой
перспективные инструменты повышения биодоступности терапевтических агентов
за счет улучшения их проникновения через биологические барьеры, защиты от
воздействия вне- и внутриклеточных ферментов, адресного транспорта к
конкретным органам путем заданного конструирования носителя [1]. Стимул-
индуцируемое высвобождение функциональных соединений из полимерных
носителей (наночастиц различной природы и дизайна) является быстро
развивающейся универсальной концепцией, которая, как ожидается, станет одним
из ключевых подходов к будущей лекарственной терапии [2–4]. В области генной
терапии известно, что прямое применение генетических конструкций часто связано
с высокой токсичностью, отсутствием селективности и низкой биодоступностью [5,
6]. В терапии офтальмологических заболеваний при местном введении
низкомолекулярных лекарств в виде глазных капель также наблюдается крайне
низкая биодоступность препаратов ввиду их быстрого вымывания слезной
жидкостью с поверхности роговицы [7, 8].
Разработка биосовместимых и биодеградируемых стимул-чувствительных
носителей для доставки БАВ различной природы позволяет преодолеть имеющиеся
недостатки. Инкапсулирование внутрь наноконтейнеров или связывание с
полимерными носителями защищает БАВ от действия ферментов, а также позволяет
доставлять их в нужные ткани с возможностью регулируемого под действием
внешних факторов высвобождения. Таким образом, применение стимул-
чувствительных полимерных носителей для доставки лекарств значительно
повышает эффективность терапии за счет увеличения их доступности, контроля
скорости высвобождения и снижения токсичности для организма. По упомянутым
причинам использование инкапсулированных форм БАВ имеет высокий потенциал
в лечении различных заболеваний.
Применение природных полисахаридов в качестве компонентов систем
стимул-чувствительной доставки лекарств представляет особый интерес ввиду их
природных свойств, биосовместимости и способности к биодеградации, а также
варьируемой структуры и физико-химических свойств, химической
функциональности и низкой стоимости производства [9, 10]. Выбор природы и
структуры полисахаридной части позволяет управлять физико-химическими и
биологическими свойствами формируемых частиц, такими как размер, морфология,
чувствительность к изменениям среды, стабильность, способность инкапсулировать
вещества различной природы, наличие реакционноспособных групп для
модификации и функционализации поверхности и т.д. [11–13].
Среди имеющихся разнообразных систем доставки на основе природных
полисахаридов наиболее перспективными являются модифицированные
полисахариды, способные эффективно инкапсулировать лекарства различной
природы и имеющие высокую чувствительность к изменениям внешней среды для
того, чтобы обеспечить регулируемую скорость высвобождения препаратов в
физиологических условиях [13–15]. Применение полисахаридов в качестве
макромолекулярной основы обеспечивает возможность создания направленных
систем доставки лекарств за счет специфического связывания полисахаридов с
рецепторами на поверхности клеток [16]. Использование определенным образом
разработанной комбинации синтетических и природных полимеров (катионных и
анионных полисахаридов) позволяет достигать необходимых физико-химических и
биологических свойств, таких как высокая эффективность инкапсулирования
лекарств, малые размеры носителей, высокая стабильность и регулируемая скорость
высвобождения препаратов. Выбор компонентов полимерной матрицы,
обеспечивающих ее стимул-чувствительное поведение, позволит контролировать
скорость высвобождения инкапсулируемых агентов. Химическое или физическое
сшивание макромолекул матрицы будет способствовать получению носителей,
обладающих различной ответной реакцией на определенные внешние стимулы и,
таким образом, способных к влиянию на скорость диффузии лекарственных
молекул. Гидрофильность полисахаридов и наличие функциональных групп
представляет возможность инкапсулировать в полисахаридные носители
лекарственные соединения за счет физических и химических взаимодействий, а
также способствует их более эффективной биоадгезии и клеточному
проникновению.
Принимая во внимание высокий потенциал стимул-чувствительных
биосовместимых и биодеградируемых полимерных частиц, основным компонентом
которых являются природные полисахариды, для применения в качестве систем
контролируемой доставки лекарств, разработка стимул-чувствительных
полимерных наносистем различной архитектуры, исследование влияния
химического строения и молекулярно-массовых характеристик на размер
формирующихся частиц, их стабильность к агрегации, способность связывать и
высвобождать биологически активные молекулы под действием внешних факторов,
таких как изменение температуры, pH и светового излучения определенной длины
волны, а также способность эффективно доставлять переносимые молекулы в клетки
и ткани является актуальной проблемой, решение которой позволит приблизиться
к получению новых лекарственных форм для лечения широкого спектра
заболеваний, в том числе, офтальмологических.
Цель настоящей работы – разработка биосовместимых гибридных
полимерных носителей на основе природных полисахаридов, способных
реагировать на воздействие специфического стимула, повышая биодоступность и
эффективность действия офтальмологических препаратов.
Достижение поставленной цели включало в себя решение следующих задач:
• Синтез новых термочувствительных привитых сополимеров гепарина и
хондроитин сульфата (основная цепь) с поли(N-изопропилакриламидом)
(боковые цепи), а также разработка методов получения наноразмерных частиц на
их основе, обладающих различной подвижностью цепей и содержащих в своей
структуре ряд реакционно-способных групп для доставки малых молекул;
• Синтез фоточувствительного линкера на основе 4-бромметил-3-нитробензойной
кислоты, изучение особенностей его фотодеструкции;
• Разработка и оптимизация состава pH- и фоточувствительных частиц на основе
интерполиэлектролитного комплекса хитозан-гепарин, а также комплекса
поли(L-лизин)-гепарин, модифицированного фоточувствительным линкером, с
целью получения узкодисперсных по размеру частиц с необходимым набором
характеристик и свойств (контролируемый размер, способность связывать
биологически активные вещества, стабильность в физиологических средах,
отсутствие цитотоксичности) для доставки нуклеиновых кислот;
• Изучение особенностей инкапсулирования веществ различной природы и
исследование профилей их высвобождения из полимерных частиц;
• Изучение биодеградации, цитотоксичности, внутриклеточного проникновения и
биологической активности полученных лекарственных наноформул;
• Оценка возможности применения полученных наносистем в качестве систем
доставки лекарственных веществ in vivo.
Методы исследования:
• Для синтеза и модификации полимеров использовались методы контролируемой
радикальной полимеризации с обратимой передачей цепи по механизму
присоединения-фрагментации (RAFT), полимеризации с раскрытием цикла
(ROP) N-карбоксиангидридов α-аминокислот, широкого ряда
полимераналогичных превращений;
• Для определения структуры, состава и молекулярно-массовых характеристик
синтезированных полимеров применялись методы ЯМР-спектроскопии, гель-
проникающей хроматографии (ГПХ), статического рассеяния света (СРС),
спектрофотометрии (анализ продуктов биодеградации полимеров);
• Для определения физико-химических характеристик полученных полимерных
частиц и изучения их чувствительности к различным стимулам использовались
методы динамического рассеяния света (ДРС), турбидиметрии, анализа
траекторий наночастиц, просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ),
изотермической титрационой калориметрии, микромасштабного термофореза;
• Определение количеств инкапсулированных веществ проводили методами
спектрофотометрии в УФ- и видимой области, гель-электрофореза в слое
агарозы;
• Для определения безопасности и специфической биологической активности
исследуемых материалов использовались методы анализа цитотоксичности
частиц, флуоресцентная микроскопия, проточная цитометрия. Увеличение
концентраций РНК, выделенной в экспериментах по РНК-интерференции,
проводилось с помощью полимеразной цепной реакции. Тестирование
полимеров на глазах животных проводилось с использованием метода измерения
внутриглазного давления.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые:
• разработан метод синтеза графт-сополимеров на основе гепарина и хондроитин
сульфата с привитыми цепями пИПААм с различной плотностью прививки и
длиной боковых цепей;
• получены и систематизированы научные представления о влиянии включения
конкурентного анионного низкомолекулярного полисахарида (гепарина) на
инкапсулирование и высвобождение генетических конструкций из полиплексов
на основе хитозана и поли(L-лизина) на примере модельного олигонуклеотида,
миРНК и пДНК;
• предложен метод синтеза фоточувствительного линкера на основе 4-бромметил-
3-нитробензойной кислоты с целью его применения в качестве компонента
фоточувствительной системы доставки лекарств;
• изучено влияние сшивки сополимеров гепарин-графт-пИПААм и хондроитин
сульфат-графт-пИПААм дисульфидными связями на эффективность
инкапсулирования и специфичность взаимодействия с модельным
офтальмологическим препаратом дексаметазоном фосфатом;
• применен метод микрокапиллярного термофореза для изучения мукоадгезивных
свойств сополимеров в растворе.
Практическая значимость работы:
• Синтезированные термочувствительные графт-сополимеры полисахаридов и
частицы на их основе перспективны для местного применения (в виде глазных
капель) в терапии офтальмологических заболеваний за счет мукоадгезивных
свойств и способности удерживать лекарства (кортикостероиды, ингибиторы
карбоангидразы) на слизистых оболочках;
• Разработанные pH-чувствительные полиэлектролитные системы на основе
хитозан-гепарина в комплексе с нуклеиновыми кислотами способны проникать в
клетки и эффективно высвобождать генетический материал под воздействием
внутриклеточного изменения pH, сохраняя биологическую активность
полинуклеотидов. Такие системы могут быть использованы в ex vivo генной
терапии различных клеток;
• Полученные фоточувствительные полиэлектролитные системы на основе
поли(L-лизина) и гепарина, сшитых фоточувствительным линкером способны
эффективно переносить генетический материал в клетки под воздействием УФ-
излучения, что может быть применено в генной терапии клеток сетчатки при
интравитреальном введении частиц. Такие системы могут включать различные
линкерные молекулы, в том числе чувствительные к свету в ИК-области для
лечения заболеваний глаз.
Обоснованность и достоверность результатов и выводов настоящей работы
обеспечивается использованием современных методов синтеза и анализа полимеров
и частиц на их основе, подтверждается хорошей воспроизводимостью полученных
результатов, их согласованностью при использовании независимых методов
исследования и соответствием полученных результатов имеющимся литературным
данным.
Положения, выносимые на защиту:
• Использование анионных гликозаминогликанов (гепарина и хондроитин
сульфата) позволяет наиболее эффективно провести реакции их
предполимеризационной модификации и последующей контролируемой
радикальной сополимеризации с обратимой передачей цепи по механизму
присоединения-фрагментации (RAFT) N-изопропилакриламида с получением
высокой степени прививки и различной длиной цепей пИПААм, что позволило
получить узкодисперсные графт-сополимеры различного состава;
• Частичная ковалентная сшивка цепей пИПААм дисульфидными связями в
составе частиц на основе графт-сополимеров гепарина и хондроитин сульфата с
привитыми пИПААм позволяет получить более высокую эффективность
инкапсулирования низкомолекулярных лекарств, а также улучшить
мукоадгезивные свойства сшитых частиц по сравнению с исходными графт-
сополимерами;
• Включение конкурентного полианиона гепарина в состав полиплексов на основе
хитозана и поли(L-лизина) с олиго- и полинуклеотидами позволяет снизить
цитотоксичность полимерных частиц, значительно увеличить эффективность
внутриклеточной доставки генетических конструкций и обеспечить их быстрое
внутриклеточное высвобождение;
• Использование стимул-чувствительных молекул (пИПААм,
фоточувствительного линкера на основе 4-бромметил-3-нитробензойной
кислоты, pH-чувствительного хитозана) в качестве компонентов систем
контролируемой доставки лекарств позволяет регулировать скорость
высвобождения инкапсулируемых лекарств;
• Перспективность применения полученных полимерных частиц на основе
природных полисахаридов в качестве стимул-чувствительных систем доставки
лекарств различной природы определяется отсутствием цитотоксичности,
высокими степенями загрузки инкапсулируемых веществ, способностью быстро
и контролируемо высвобождать молекулы под действием внешнего стимула,
способностью проникать в клетки или удерживаться на слизистых оболочках
глаза.
Апробация результатов. Основные результаты диссертационной работы
докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях и
симпозиумах: Международная научная конференция студентов, аспирантов и
молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2018, 2019), 14th, 15th International Saint-
Petersburg Conference of Young Scientists «Мodern рrоblеms of polymer science»

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?

Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

Читать

Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее

Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее

Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее

Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

Хочешь уникальную работу?

Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

Специализируюсь на правовых дипломных работах, магистерских и кандидатских диссертациях

#Кандидатские #Магистерские

495 Выполненных работ

Практический стаж работы в финансово - банковской сфере составил более 30 лет. За последние 13 лет, мной написано 7 диссертаций и более 450 дипломных работ и научных с... Читать все

Практический стаж работы в финансово - банковской сфере составил более 30 лет. За последние 13 лет, мной написано 7 диссертаций и более 450 дипломных работ и научных статей в области экономики.

#Кандидатские #Магистерские

56 Выполненных работ

Большой опыт работы. Кандидаты химических, биологических, технических, экономических, юридических, философских наук. Участие в НИОКР, Только актуальная литература (пос... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

551 Выполненная работа

Здравствуйте) Имею сертификат специалиста (врач-лечебник). На данный момент являюсь ординатором(терапия, кардио), одновременно работаю диагностом. Занимаюсь диссертац... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

13 Выполненных работ

Серьезно отношусь к тренировке собственного интеллекта, поэтому постоянно учусь сама и с удовольствием пишу для других. За 15 лет работы выполнила более 600 дипломов и... Читать все

Серьезно отношусь к тренировке собственного интеллекта, поэтому постоянно учусь сама и с удовольствием пишу для других. За 15 лет работы выполнила более 600 дипломов и диссертаций, Есть любимые темы - они дешевле обойдутся, ибо в радость)

#Кандидатские #Магистерские

76 Выполненных работ

Закончила ГУУ с отличием "Бухгалтерский учет, анализ и аудит". Выполнить разные работы: от рефератов до диссертаций. Также пишу доклады, делаю презентации, повышаю уни... Читать все

Закончила ГУУ с отличием "Бухгалтерский учет, анализ и аудит". Выполнить разные работы: от рефератов до диссертаций. Также пишу доклады, делаю презентации, повышаю уникальности с нуля. Все работы оформляю в соответствии с ГОСТ.

#Кандидатские #Магистерские

0 Выполненных работ

Помогаю с выполнением курсовых проектов и контрольных работ по электроснабжению, электроосвещению, электрическим машинам, электротехнике. Занимался наукой, писал стать... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

19 Выполненных работ

Мой опыт в написании работ - 9 лет. Я специализируюсь на написании курсовых работ, ВКР и магистерских диссертаций, также пишу научные статьи, провожу исследования и со... Читать все

Мой опыт в написании работ - 9 лет. Я специализируюсь на написании курсовых работ, ВКР и магистерских диссертаций, также пишу научные статьи, провожу исследования и создаю красивые презентации. Сопровождаю работы до сдачи, на связи 24/7 ?

#Кандидатские #Магистерские

359 Выполненных работ