Иммуноэндокринные звенья патогенеза психических расстройств при тироидите Хасимото

В клинико-патофизиологическую часть исследования были включены 169 человек (мужчин и женщин в возрасте от 18 до 65 лет), разделенных на 3 группы: 1) AIT+PD – пациенты с АИТ в сочетании с различными ПР (n=33; средний возраст 53,8±15,6 лет); 2) AIT – пациенты с АИТ без ПР (n=103; средний возраст 46,7±13,3 лет); 3) HC – группа контроля, соматически здоровые лица без ПР (n=33; средний возраст 41,9±12,9 лет). Перед проведением исследований было получено информированное согласие всех участников. Исследование одобрено этическим комитетом СПбГУ (протоколы No 76 от 30.06.2017, No 84 от 20.06.2018 и No 10/19 от 17.10.2019). Набор пациентов в группу AIT+PD осуществлялся на клинической базе СПбГУ в СПбГБУЗ “Больница им. П.П. Кащенко” в рамках соглашения о научном сотрудничестве, на основании психиатрического диагноза, верифицированного врачом-психиатром, и наличия АИТ, подтвержденного по критериям Японской тироидологической ассоциации (JTA) [Akamizu, and Amino, 2017]. Отбор в остальные группы осуществлялся на амбулаторном приеме в клинике «Волховмед».
Ультразвуковое исследование ЩЖ. Оценивалась ультразвуковая картина ЩЖ- объем, эхогенность, наличие образований (кист, узлов), объем образований (при наличии), контур ЩЖ, капсула ЩЖ, размер шейных лимфатических узлов (Таблица 1) [Akamizu, and Amino, 2017].
Таблица 2. Сравнительный анализ объема ЩЖ у пациентов в исследуемых группах
Параметр Объем ЩЖ, см3
Объем ЩЖ, Т-баллы (log odd)
Исследуемые группы пациентов
Варианты сравнения групп HC – AIT
HC – AIT+PD. AIT – AIT+PD. HC – AIT
HC – AIT+PD. AIT – AIT+PD.
р
0.013 <0.001 0.004 0.003 <0.001 0.003 AIT+PD 15 (11.2;18) 4.08(3.91;4.2) AIT 11(8.35; 14.8) 3.90(3.71;4.09) HC 8.5 (7.8; 11) 3.74 (3.69;3.85) Анамнез и физикальное обследование. При сборе анамнеза и физикальном обследовании оценивалось наличие различных симптомов ПР, а ввиду закономерного сочетания АИТ и гипопаратироза - также симптомов гипокальциемии (положительный симптом Хвостека, снижение коленных рефлексов, жалобы на периферические судороги). Проверялось наличие симптомов гипотироза (в частности сухости локтей, ломкости ногтей, выпадения волос, положительного симптома Строева — прикусывания языка и щек в отсутствие ортодонтических причин для этого) [Строев и соавт., 2017]. В исследование намеренно не включались лица с глубоким гипотирозом, группы AIT и AIT+PD состояли только из пациентов с АИТ в состоянии эутироза, либо легкого субклинического гипотироза. Результаты клинико-анамнестического обследования отражены в таблице 2. Таблица 2. Клиническая характеристика пациентов в группах AIT+PD и AIT Симптом Наличие симптомов в группе AIT+PD n(%) Наличие симптомов в группе AIT n(%) p Симптомы нарушения психики Попытки суицида Дефицит внимания Аутизация Бред Депрессия Генерализованная тревога Галлюцинации Раздражительность Обсессивно-компульсивное расстройство(ОКР) Панические атаки Фобии Расстройства сна Симптом Хвостека Сухость локтей Снижение коленных рефлексов Ломкость ногтей/ выпадение волос Периферические судороги Положительный симптом Строева 7 (21,2%) 26 (78,8%) 9 (27,3%) 26 (78,8%) 3 (9,1%) 29 (87,9%) 23 (69,7%) 11 (33,3%) 7 (21,2%) 16 (48,5%) 15 (45,5%) 28 (84,8%) 6 (18,2%) 15 (45,5%) 14 (42,4%) 11 (33,3%) 15 (45,5%) 9 (27,3%) − − − − − 1 (1%) − − − 49 (47,6%) 48 (46,6%) 36 (35%) 59 (57,3%) 54 (52,4%) 46 (44,7%) 45 (43,7%) 42 (40,8%) p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p = 0,002 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 Симптомы гипотироза Иммуноферментный анализ концентраций антител и гормонов. Лабораторные исследования концентраций аутоантител и гормонов в сыворотке периферической венозной крови проводились на планшетном спектрофотометре BioMark xMark (Bio-Rad, USA). Количественную оценку сывороточных концентраций АТ к тиропероксидазе (ТПО), АТ к тироглобулину (ТГ), уровней тироидных гормонов- свободного трийодтиронина (FT3) и свободного тироксина (FT4), тиротропного гормона (ТТГ), пролактина (ПРЛ) проводили с использованием коммерческих наборов реагентов компании ООО “Хема-Медика” (Россия), аутоантител к рецептору ТТГ - с использованием наборов реагентов компании EUROIMMUN (Германия), исследование аутоантител к альфа-енолазе- с использованием наборов реагентов компании Cusabio Biotech Co., Ltd (КНР). Каждое исследование проводилось согласно инструкции производителя соответствующего коммерческого набора. Определение спектра анти-нейрональных антител методом непрямой иммунофлуоресценции Лабораторные исследования анти-нейрональных аутоантител в сыворотке периферической венозной крови проводились с использованием набора Autoimmune Encephalitis Mosaic 1 (Euroimmune, Germany). Методика предназначена для выявления аутоантител против нейрональных антигенов ( глутаматный рецептор типа N- метил-D-аспартата (NMDA), контактин-ассоциированный белок-2 (CNTNAP2), рецептор α- амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты 1 и 2 (AMPAR), богатый лейцином глиома-инактивированный белок 1 (LGI1), рецептор гамма-амино-масляной кислоты типа В (GABABR)) методом непрямой иммунофлуоресценции на микроскопе Leica DM4000 (Leica Microsystems, Germany). Иммунофлюоресцентный анализ концентраций цитокинов Измерение концентраций цитокинов в сыворотке периферической венозной крови проводилось с помощью мультипараметрического флуоресцентного анализа на приборе Luminex, модель MagPix (Luminex Inc., USA), с использование набора Human Th17 Magnetic Bead Panel (Merck, Германия) Иммунофенотипирование основных субпопуляций «поляризованных» Т-хелперов периферической крови. 200 мкл цельной периферической крови окрашивали на поверхностные антигены при помощи следующей панели моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами: anti-CD183 Alexa Fluor 488 (CXCR3, BioLegend, Inc., USA), anti-CD25 PE (Beckman Coulter, USA), anti-CD185 PE/DazzleTM 594 (CXCR5, BioLegend, Inc., USA), anti-CD194 PerCP/Cy5.5 (CCR4, BioLegend, Inc., USA), anti-CD196 PE/Cy7 (CCR6, BioLegend, Inc., USA), anti-CD4 APC (BioLegend, Inc., USA), anti-CD8 APC- AF700 (BioLegend, Inc., USA), anti-CD3 APC/Cy7 (BioLegend, Inc., USA), anti-CD197 Brilliant Violet 421 (CCR7, BioLegend, Inc., USA) и anti-CD45RA Brilliant Violet 510 (BioLegend, Inc., USA). После инкубации с антителами при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут проводился лизис эритроцитов c последующей отмывкой по общепринятой методике [Хайдуков et al., 2014]. Анализ образцов проводился при помощи проточного цитофлуориметра Navios (Beckman Coulter, Inc., USA), оснащенного тремя лазерам с длинами волн излучения 405, 488 and 638 нм. В каждом образце анализировалось не менее 40000 CD3+CD4+ T-хелперов. Полученные данные анализировались при помощи программного обеспечения Kaluza software (Beckman Coulter, Inc., USA). Статистический анализ полученных данных. Для описания категориальных переменных использовались абсолютные значения и доли от целого – n (%). Непрерывные, дискретные и ранговые переменные описывались медианой и квартилями (Md [q1; q3]) [Ramakrishna, 2017]. Дополнительно непрерывные и дискретные переменные описывались средним и стандартным отклонением (M (σ)) [Ramakrishna, 2017]. Величины, имеющие половозрастную норму, подвергались стандартизации в соответствии с данными нормативных показателей [Dinov, 2018]. Результат стандартизации умножался на 10 с последующим добавлением 50 для получения Т-баллов [Lenhard, and Lenhard, 2013]. Для снижения влияния очень больших значений вычислялся десятичный логарифм от количественных характеристик [Shahbaba, 2012]. Межгрупповой анализ выполнялся при помощи критерия Манна—Уитни (U-статистика) в случае 2-х групп или при помощи критерия Краскела—Уоллиса (χ2(степень свободы)) в случае сравнения трёх групп. Критерий Спирмена (r-статистика) использовался для выполнения корреляционного анализа между количественными, счётными и порядковыми характеристиками [Ramakrishna, 2017]. Для оценки ассоциации категориальных переменных с количественными использовалась логистическая модель с упорядоченным выбором, где мерой связи выступал коэффициент модели (логарифм отношения шансов - log(odds)) [Buri et al., 2020]. Коррекция на множественное тестирование гипотез осуществлялось поправкой Беньямини—Хохберга [Benjamini, and Hochberg, 1995]. Результаты признавались статистически значимыми при вероятности ошибки первого рода (p) менее 0,05 [Shahbaba, 2012]. Расчёты выполнены на языке программирования R v 4.1.0. Экспериментальное исследование. Из сывороток пациентов с АИТ в коморбидности с шизофренией и пациентов с АИТ и депрессией (с концентрациями АТ к ТПО выше 100 МЕ/мл), выделяли поликлональные IgG методом аффинной хроматографии на колонках с белком G [Sviatenko et al., 2014]. Ввиду многократно большей подверженности женщин, по сравнению с мужчинами, развитию аутоиммунных реакций [Zandman-Goddard et al., 2007; Lee, and Chiang, 2012; Quintero et al., 2012], при экспериментальном моделировании ЭХ на мышах использованы самки. Пассивная иммунизация IgG проводилась на самках линии Balb/с возраста 8-10 недель, массой тела 20 г, полученных из НПП «Питомник лабораторных животных» ФГБУН ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино, Россия), которые относились к свободным от специфических патогенов (SPF - Specific Pathogen Free) животным и содержались в стандартных условиях в беспатогенной зоне при +23±1°С и 12- часовом синхронизированном световом цикле (7-00 – 19-00), на диете из специального корма DeltaFix (Новосибирск, Россия) со свободным доступом к пище и воде в индивидуальных клетках вивария СПбГУ, соответствующего требованиям «Стандарта надлежащей лабораторной практики» (GLP). В эксперимент было вовлечено 4 группы животных: 1-я группа PBS – с введением натрий-фосфатного буфера (n=15); 2-я группа Com - с введением раствора коммерческих поликлональных человеческих IgG здоровых доноров (Jackson, ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, США) (n=15); 3-я группа Depr- с введением раствора IgG пациентов c АИТ и депрессией (n=15); 4 группа Schiz- с введением раствора IgG пациентов c АИТ и шизофренией (n=15). Каждое животное в группах 2-4 получило одинаковую дозу IgG по белку (16 мкг на мышь, весом 20 г), вводимый объем раствора во всех случаях составлял 2 мкл. Исследования поведения проводились на самках без регистрации эстрального цикла, по данным ряда работ, вариабельность параметров поведения для самок не превышает вариабельность для самцов, даже в случаях отсутствия контроля фаз эстрального цикла [Prendergast et al., 2014; Becker et al., 2016]. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами исследований на животных, действующими в Евросоюзе (86/609/EEC). Протокол эксперимента одобрен биоэтическим комитетом СПбГУ (протокол N 131-03-3, от 25 марта 2019 г.). Интрацеребровентрикулярная инъекция экспериментальных растворов проводилась с использованием стереотаксической установки (RWD Life Science-68018, USA), все этапы операции проводились под непрерывной подачей изофлюрана (VetEquip-V-1, USA), координаты краниотомии и области введения растворов: ML -1; AP -0,4; DV -2,2 [Mouse Brain Atlas]. Восстановительный период после операции длился 48 часов, после чего была проведена батарея тестов: тест открытого поля [Prut, and Belzung, 2003] , тест с крестообразным приподнятым лабиринтом [Walf, and Frye, 2007], тест социального взаимодействия [Kaidanovich-Beilin et al., 2011], тест открытого поля с новым предметом [Denninger et al., 2018], тест по Порсольту (ранний на 4-й и отсроченный на 15-й день после операции [Bogdanova et al., 2013], ввиду того, что не только непосредственное краткосрочное действие IgG на антигены-мишени, но и спровоцированное IgG кумулятивно длящееся воспаление - могли влиять на церебральные функции)[Чурилов, and Васильев, 2014]. Для оценки параметров поведения использовалась система видеотрекинга Ethovision XТ (Noldus, Netherlands). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Результаты анализа эндокринных параметров при ПР, сопряженных с АИТ Известно, что исходом нелеченого АИТ служит гипотироз. Описано «микседематозное безумие» как форма психоза, связанного с гипотирозом [Asher, 1949]. Но ПР при АИТ, в том числе и симптомокомплекс ЭХ, наблюдаются и на фоне субклинического гипотироза, эутироза, а также гипертироза, следовательно, их патогенез имеет не только гормональную, но, вероятно, и иммунную составляющую [Zvonarev et al., 2020]. Как отмечалось выше, привлеченные к исследованию пациенты с АИТ находились в эутирозе или легком гипотирозе. При этом, у пациентов группы AIT+PD уровень FT4 был достоверно ниже, чем у пациентов из группы AIT, хотя сывороточные концентрации данного гормона пациентов всех групп были в пределах референсных значений нормы (Рисунок 1, Б). Уровень свободного FT3 достоверно не отличался в исследуемых группах (Рисунок 1, А), как и уровень ТТГ (Рисунок 1, В). Существует общий стимулятор продукции пролактина и ТТГ — тиролиберин [Fröhlich, and Wahl, 2019]. Известно также, что ПРЛ как системный, ауто- и паракринный иммуностимулятор способствует развитию аутоиммунитета, а при гиперпролактинемии (ГПРЛ)— и аутоиммунной патологии [Borba et al., 2019]. Поэтому ГПРЛ может выступать как иммунопатогенный фактор, способствующий возникновению и прогрессированию АИТ по механизму прочного круга, по мере тиролибериновой компенсации гипотироза [Строев et al., 2017]. Известны и, собственно, гиперпролактинемические поведенческие нарушения [Petrikis et al., 2016]. Патогенетически важно в этой связи, что у пациентов с АИТ и ПР сывороточный уровень ПРЛ был статистически значимо выше, чем у пациентов других групп, и превышал референсные значения нормы (Рисунок 1, Г). Многие нейролептики, применяемые в терапии психозов, обладают дофаминолитическим пролактогенным действием. В связи с этим, пациенты, получающие антипсихотическую фармакотерапию из группы AIT+PD были дополнительно подразделены на 3 подгруппы, в зависимости от ожидаемого риска провокации ГПРЛ, как побочного эффекта принимаемых ими антипсихотиков (отсутствие риска, низкий риск, высокий риск) [Vilar et al., 2014]. Оказалось, что в группах, принимавших препараты с ожидаемо минимальным риском ГПРЛ и с самым высоким её ожидаемым риском, повышенный уровень ПРЛ выявлялся лишь в 25% наблюдений в каждой из групп, а в группе, принимающей препарат с ожидаемо низким риском ятрогенной ГПРЛ, она определялась уже у 80%. Это позволяет предположить, что существует нелекарственная причина ГПРЛ у пациентов с АИТ и шизофреноподобным психозом. Была выявлена обратная достоверная статистически значимая корреляция (r=-0.51, р=0.037) между уровнем ПРЛ и приписываемым различным антипсихотикам ожидаемым риском ятрогенной ГПРЛ, что опять-таки указывает на независимый от лекарственного лечения фактор, вызывающий ГПРЛ в подобных коморбидных случаях. Эти данные позволяют предполагать, что лечение пациентов с АИТ и ПР не должно быть идентичным другим формам шизофреноподобных психозов. Рисунок 1. Анализ уровней различных гормонов у пациентов исследуемых групп. Гистограмма А – абсолютное содержание свободного трийодтиронина абсолютное содержание свободного тироксина абсолютное содержание тиротропного гормона (log.FT3) Гистограмма Б Гистограмма В Гистограмма Здесь и далее: темно-серым цветом – группа AIT+PD (n=33); серым цветом – группа AIT (n=103), белым цветом – группа контроля (n=33). Результаты предварительно стандартизированы представлены в виде логарифмированных Т-баллов, а также минимального и максимального значения. Достоверность различий указана согласно U-критерию Манна- Уитни. Бледно-серым цветом на гистограммах обозначена стандартизированная зона нормы. Результаты анализа различных аутоиммунных параметров при ПР, сопряженных с АИТ Известно, что в клинической патофизиологии АИТ определенная маркерная роль придается АТ к ЩЖ, хотя их уровень и спектр не всегда коррелируют с тяжестью гипотироза [Ragusa et al., 2019]. Мы исследовали титр AT к ТГ, которые, по некоторым данным, могут Г – – – (log.FT4) (log.TSH) абсолютное содержание пролактина (log.Prolactin) участвовать в патогенезе ЭХ, так как этот антиген экспрессирован в ЦНС [Laurent et al., 2016]. Концентрация АТ к ТГ была достоверно выше у пациентов с АИТ и ПР, по сравнению с пациентами из других групп, а также выходила за пределы нормы (Рисунок 2, А). Другой вид антитироидных АТ - АТ к ТПО, участие которых в патогенезе ЭХ также постулируется многими авторами, ввиду церебральной экспрессии этого аутоантигена [Montagna et al., 2016]. Уровень АТ к ТПО превышал значения нормы в обеих группах пациентов с АИТ, а у пациентов с АИТ и ПР был статистически значимо выше, чем в других группах (Рисунок 2, Б).Исследовался и уровень АТ к рецептору ТТГ (поскольку распространены смешанные формы АИТ и базедовой болезни - «хаситоксикоз», а также ввиду экспрессии рецептора ТТГ в ЦНС, однако он достоверно не отличался в исследуемых группах (Рисунок 2, В). Еще одним возможным патогенетическим механизмом ЭХ служит действие анти-альфа- енолазных АТ, поскольку данный антиген и его гомологи экспрессированы в ЦНС и нейроэндокриноцитах, присутствуют в характерных для АИТ клетках Асканази-Хюртле, а также ввиду нередкого обнаружения таких АТ при ЭХ, в частности — в японских когортах больных [Fujii et al., 2005; Yoneda et al., 2007]. По данным наших исследований у пациентов с АИТ и ПР, уровень данных АТ был статистически значимо выше, чем у пациентов других групп (Рисунок 2, Г). Рисунок 2. Анализ титров различных АТ у пациентов исследуемых групп. Гистограмма А – сравнительный анализ титра АТ к тироглобулину (log.anti-TG Abs) Гистограмма Б – сравнительный анализ титра антител к тиропероксидазе (log.anti-TPO Abs) Гистограмма В – сравнительный анализ титра антител к рецептору ТТГ (log.anti-TSHR Abs) Гистограмма Г – сравнительный анализ титра антител к альфа-1-енолазе (log.anti-ENO1 Abs) Аутоиммунные заболевания ЩЖ характеризуются полиспецифическим патологическим аутоиммунным ответом, вовлекающим множество тироидных и экстратироидных антигенов. С целью широкой характеристики спектра и напряженности аутоиммунитета при ЭХ нами проведен анализ сывороток на наличие различных антинейрональных АТ. Известны случаи коморбидности лимбических энцефалитов и АИТ, а именно аутоиммунного анти-NMDA-рецепторного энцефалита, вызванного реакцией АТ к NR1 и NR2-субъединицам глутаматного NMDA-рецептора [Jung et al., 2016] и анти-GABA-B рецепторного энцефалита [Gu et al., 2019]. 28 пациентов из группы AIT+PD были обследованы на наличие анти-нейрональных АТ, в результате чего у одной пациентки с диагностированной шизофренией выявлены АТ к глутаматному рецептору тип NMDA (Рисунок 3, А), а у другой пациентки с диагнозом биполярное аффективное расстройство- АТ к GABA-B рецептору (Рисунок 3, Б). В данных случаях можно предположить, что ПР этих пациенток имели аутоиммунную природу и могли быть результатом аутоиммунных энцефалитов. Рисунок 3. Результаты детекции анти-нейрональных АТ методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием в качестве субстрата эмбринональных почечных клеток человека, трансфицированных нейрональными рецепторами (набор Autoimmune Encephalitis Mosaic 1, EUROIMMUN, Германия). Разведение сыворотки 1:10. Положительный результат определяется цитоплазматическим окрашиванием (указаны стрелками), увеличение х 40, длина волны- 480 nm, сила свечения -510 nm. Фото А- детекция АТ против глутаматных рецепторов типа NMDA Фото Б- детекция АТ против рецепторов гамма-амино-масляной кислоты типа В (GABAB) Патогенетическая роль иммуноэндокринных нарушений у пациентов с АИТ и психическими расстройствами Для оценки патогенетической роли обнаруженных изменений в развитии ЭХ, оценивались взаимосвязи между концентрациями гормонов, антител, цитокинов и другими клиническими параметрами у пациентов различных групп. Так в группе AIT+PD были выявлены достоверные прямые корреляции между концентрациями ТТГ и АТ к ТГ (что объясняется, вероятно, более напряженными условиями компенсации гипотироза при более выраженном АИТ), а также между концентрациями FT3 и таких цитокинов как IL-1b и IL- 15 (Рисунок 4, А). Последнее мы связываем со способностью этих и других цитокинов действовать на гипоталамо-гипофизарную регуляцию эндокринных функций через вагальные афференты, располагающие их рецепторами [Корнева, 2020]. Это вполне увязывается с исключительной ролью FT3 в ЦНС: он располагает рецепторами на микроглиальных клетках и контролирует процессы их нейровоспалительной активации и фагоцитарное поведение [Mori et al., 2015]. У пациентов из группы AIT были установлены достоверные прямые взаимосвязи между уровнем ПРЛ и АТ к альфа-1-енолазе, что, видимо, объясняется ролью ПРЛ как адъюванта в отношении аутоиммунитета [Borba et al., 2019], а также между концентрациями FT4 и фактора некроза опухоли альфа (TNFα). Последнее подтверждает ранее полученные для AIT данные [Cheng et al., 2020]. Обратные взаимосвязи выявлены между уровнем FT3 и содержанием АТ против альфа-1-енолазы и против ТГ (Рисунок 4, Б). Это, вероятно, объясняется апоптогенной ролью гормонов ЩЖ в отношении лимфоидных клонов и способностью первых подавлять аутоиммунитет не только к ЩЖ, но и экстратироидным мишеням [Mihara et al. 1999]. Также были установлены статистически значимые корреляции между уровнями гормонов и различными клиническими симптомами (симптомами ПР и гипотироза) в группе AIT+PD (Рисунок 4, В) и в группе AIT (Рисунок 4, Г). Эти данные расцениваются нами как косвенное подтверждение постулированного «токсической» теорией участия дисгормональных сдвигов при компенсации гипотироза в патогенезе ЭХ. Рисунок 4. Результаты корреляционного анализа между уровнями гормонов и различными клиническими показателями в исследуемых группах Гистограмма А и Б – результаты корреляционного анализа между уровнями гормонов и другими иммуно-эндокринными показателями в группах AIT+PD и AIT, соответственно. Гистограмма В и Г – результаты корреляционного анализа между уровнями гормонов и некоторыми симптомами ПР и гипотироза в группах AIT+PD и AIT, соответственно. Здесь и далее на корреляционных гистограммах количественных показателей приведены результаты корреляционного анализа по Спирмену (р<0,05); на корреляционных гистограммах количественных и качественных показателей приведены результаты анализа с использованием модели логистической регрессии (р<0,05) Рисунок 5. Результаты корреляционного анализа между титрами различных антител и клиническими параметрами в группе AIT+PD Гистограмма А результаты корреляционного анализа между титром АТ к ТГ и IL-15 Гистограмма Б – результаты корреляционного анализа между титром АТ к альфа-1 енолазе и IL-1b Гистограмма В – результаты корреляционного анализа между титрами АТ и симптомами ПР В группе AIT были выявлены статистически значимые корреляции между концентрациями различных АТ и другими лабораторными параметрами (Рисунок 6, А-Д). Kонкордантность изменений уровня различных АТ при АИТ находится в русле представлений об этом заболевании как о полиспецифической мультиантигенной аутоиммунопатии [Ragusa et al., 2019]. Ранее было показано, что, хотя при АИТ уровни IL17A, как и IL12 выше, нежели в норме [Altay et al., 2016], уровень АТ-ТРО коррелирует при АИТ скорее не с Th17, а с Th1-зависимыми цитокинами [Karanikas et al., 2005], что не противоречит нашим данным. Рисунок 6. Результаты корреляционного анализа между титрами различных АТ и другими лабораторными параметрами в группе AIT Гистограмма А – результаты корреляционного анализа между титром АТ к ТПО и IL-12P70 Гистограмма Б – результаты корреляционного анализа между титром АТ к ТПО и IL-17А Гистограмма В – между титром АТ к ТПО и титром АТ к ТГ Гистограмма Г – результаты корреляционного анализа между титром АТ к ТГ и титром АТ к альфа-1-енолазе Гистограмма Д –результаты корреляционного анализа между титром АТ к альфа-1-енолазе и титром АТ к рецептору ТТГ Результаты анализа субпопуляционного состава Т-лимфоцитов Субпопуляционный состав Т-хелперов периферической крови. На основании экспрессии CD3, а также коэкспрессии CD4 или CD8, были выявлены популяции Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, соответственно. В ходе дальнейших исследований был проведен детальный анализ субпопуляционного состава Т- хелперов (Th) периферической крови. Относительное содержание CD3+CD4+ лимфоцитов в рамках общего пула CD3+ Т-клеток достоверно не различалось между сравниваемыми группами и составляло в группе контроля (НС) 61.01% (55.59; 66.95), в группе психически здоровых пациентов с АИТ (AIT) 63.88% (57.84; 70.09) и 65.01% (58.20; 68.77) у пациентов с АИТ и ПР (AIT+PD). На первом этапа была проведена оценка коэкспрессии двух поверхностных антигенов CD45RA и CD62L, репертуар которых изменяется по мере созревания Th и приобретения ими эффекторных функций. Использование данных маркеров позволяет выявить субпопуляции «наивных» Th («naïve», CD45RA+CD62L+), а также оценить уровень зрелых или «поляризованных» субпопуляций Th – клеток центральной памяти, патрулирующих периферические лимфоидные органы, и эффекторной памяти, способные покидать кровоток и мигрировать в очаги воспаления, где они проявляют свои эффекторные свойства, связанные, в первую очередь, с продукцией эффекторных цитокинов [Кудрявцев, 2014]. Это клетки с фенотипами CD45RA–CD62L+ (СМ) и CD45RA–CD62L– (ЕМ), соответственно, а также терминально-дифференцированные CD45RA-позитивные эффекторные клетки (TEMRA, CD45RA+CD62L–). Доли данных популяций Т-лимфоцитов в исследуемых группах статистически значимо не отличались (Рисунок 7). Рисунок 7. Относительное содержание основных субпопуляций Т-хелперов, находящихся на различных стадиях дифференцировки, в периферической крови пациентов. Гистограмма А – содержание «наивных» Th (Naïve); гистограмма Б – содержание Th центральной памяти (СМ); гистограмма В – содержание Th эффекторной памяти (ЕМ); гистограмма Г – содержание «терминально-дифференцированных» CD45RA-позитивных эффекторных Th. Результаты представлены в виде % клеток от общего пула CD3+CD4+ лимфоцитов. Здесь и далее: темно- серым цветом – группа AIT+PD (n=14); серым цветом – группа AIT (n=46), белым цветом – группа контроля (n=20). Результаты представлены в виде медианы, интерквантильного размаха (Med (Q25; Q75), а также минимального и максимального значения. Достоверность различий указана согласно U-критерию Манна-Уитни. Затем была проведена оценка особенностей экспрессии хемокиновых рецепторов CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5 Th клетками пациентов различных групп. Были выявлены четыре основные субпопуляции «поляризованных» Т-хелперов периферической крови: Th1 (фенотип CXCR5-CXCR3+CCR6-CCR4-), Th2 (фенотип CXCR5-CXCR3–CCR6-CCR4+), общий пул Th17 с фенотипом CXCR5-CCR6+, а также общий пул фолликулярных Т- хелперов (Tfh), несущих на своей поверхности CXCR5. Результаты приведены на рисунке 8. При анализе общей субпопуляции Тfh, выявлена статистически значимая разница между группами AIT+PD и группой AIT (Рисунок 8, Г). При этом уровень IL-21, экспрессируемого именно Т-фолликулярными хелперами, тоже статистически значимо отличался в обеих группах с АИТ по сравнению с группой контроля (Таблица 2). Один из мощнейших стимуляторов аутоиммунитета и антителообразования, ключевой цитокин Th17-зависимых реакций - IL-21, по литературным данным, участвует, в частности, и в иммунопатогенезе шизофрении [Long et al., 2019], поэтому мы расцениваем полученные данные как патогенетически значимые для лиц с АИТ и ПР. Выявлена статистически значимая обратная корреляция между долей общих CM Tfh и концентрацией FT4 в группе AIT+PD (Рисунок 8, Е), и объемом ЩЖ в группе AIT (Рисунок 8, Ж). Вероятно, у пациентов с AIT+PD фоллликулярные Т-хелперы играют важную роль в подавлении функции ЩЖ, на что указывает повышенный уровень CMTfh у данных пациентов, характер взаимосвязи с FT4 а также высокий уровень IL-21 (их главного эффекторного цитокина). Таблица 2. Анализ уровней различных цитокинов в исследуемых группах. Цитокин Группа НС Med [Q25; Q75] Группа AIT Med [Q25;Q75] Группа AIT+PD Med [Q25; Q75] Варианты сравнения групп Статис- тическая значи- мость (р) CCL20 IL-13 IL-15 IL-21 IL-5 7.36 [4.25; 12.76] 0.61 [0.0; 2.07] 50.84 [32.87;70.6] 0.0 [0.0; 0.5] 0.0 [0.0; 0.03] 15.12 [10.06; 25.20] 50.84 [17.15; 91.30] 0.56 [0.00; 3.98] 8.30 [0.0; 18.77] 1.24 [0.01; 4.15] 26.04 [13.0; 52.75] 102.9 [51.78;172.6] 1.45 [0.15; 3.08] 7.43 [0.0; 13.59] 1.06 [0.05; 2.39] HC - AIT HC - AIT+PD AIT - AIT+ PD HC - AIT HC - AIT+ PD AIT - AIT+ PD HC - AIT HC - AIT+ PD AIT - AIT+ PD HC - AIT HC - AIT+ PD AIT - AIT+ PD HC - AIT HC - AIT+ PD AIT - AIT+ PD p = 0.006* p <.001* p = 0.013* p < 0.001* p < 0.001* p = 0.038* p < 0.001* p < 0.001* p = 0.289 p < 0.001* p < 0.001* p = 0.527 p < 0.001* p < 0.001* p = 0.729 Рисунок 8. Изменения в субпопуляционном составе «поляризованных» Th периферической пациентов исследуемых групп. Гистограмма А – относительное содержание Th1; гистограмма Б – Th2; гистограмма В – Th17 ; гистограмма Г – фолликулярных Т-хелперов (Tfh) Результаты приведены в виде процента от общего пула СМ Th с фенотипом CD3+CD4+CD45RA–CD62L+. Гистограмма Д – взаимосвязь между содержанием Tfh клеток и уровнем свободного тироксина FT4; гистограмма Е – взаимосвязь между содержанием Tfh клеток и объемом щитовидной железы. Для анализа субпопуляционного состава Tfh был использован подход, основанный на оценке наличия или отсутствии на поверхности клетки хемокиновых рецепторов CXCR3 и CCR6 [Morita et al., 2011]. Благодаря этому весь компартмент циркулирующих Tfh человека был разделен на четыре популяции: CXCR3+CCR6− Tfh1, CXCR3−CCR6− Tfh2, CXCR3−CCR6+ Tfh17 и CXCR3+CCR6+ DP Tfh. Результаты приведены на рисунке 9. Доля субпопуляции Tfh2 была статистически значимо ниже в группе AIT+PD, по сравнению с остальными группами, тогда как группа AIT статистически значимо не отличалась от группы контроля (Рисунок 9, Б). Содержание DP Tfh было достоверно выше в группе AIT+PD по сравнению с остальными группами, тогда как группа AIT значимо не отличалась от контроля (Рисунок 9, Г). В то же время, концентрация IL-13 в группах AIT+PD и AIT достоверно превосходила значения, полученные для контрольной группы (Таблица 2). Более того, в сыворотке крови обследованных пациентов с AIT+PD и AIT и концентрация IL-5 была достоверно выше контрольных значений (Таблица 2). Оба эти цитокина принадлежат к Th2- зависимым и их продукция тесно связана, чем и объясняется, вероятно, конкордантность их изменений при АИТ. Прирост их продукции при АИТ регистрировался и другими авторами [Zivancevic-Simonovic et al., 2015]. IL-13 ассоциирован с развитием болезни Грейвса-фон Базедова, он экспрессируется не только в лимфоцитах, но и в тироцитах, а его продукция зависит от ТТГ и его рецептора [Bednarczuk et al., 2003; Ajjan et al., 1997]. При анализе взаимосвязей между содержанием отдельных субпопуляций Tfh и различными иммуноэндокринными параметрами в группе AIT+PD были обнаружены статистически значимые корреляции между уровнем АТ к ТГ и Tfh17, а также этими АТ и Tfh1 (Рисунок 9, Д). У пациентов с AIT уровни Tfh2 и DP Tfh статистически значимо коррелировали с концентрациями гормонов ЩЖ, хотя эти корреляции были разнонаправленными (Рисунок 9, Е). Вероятно гормоны ЩЖ способствуют разнонаправленной дифференцировке Tfh. Характерно, что ранее Zhao et al. (2018) также нашли при АИТ положительную корреляцию содержания в крови Tfh17 — с концентрациями как АТ к ТГ, так и АТ к ТПО [Zhao et al., 2018]. Таким образом, у пациентов с АИТ в коморбидности с ПР наблюдается диcбаланс субпопуляционного состава Т-фолликулярных хелперов, а именно снижение субпопуляции Tfh2, которые, вероятно, мигрируют в лимфоузлы и ЩЖ, приобретающую при АИТ выраженную лимфоидную инфильтрацию и даже лимфоидные фолликулы [Строев и соавт., 2017], где эти лимфоциты, видимо, и экспрессируют IL-5 и IL-13 , о чем свидетельствуют повышенные уровни обоих этих цитокинов . Рисунок 9. Изменения в субпопуляционном составе фолликулярных Th (Tfh) периферической крови пациентов различных групп. Гистограмма А – относительное содержание Tfh1; гистограмма Б – Tfh2; гистограмма С – Tfh17; гистограмма Г – DP Tfh. Результаты приведены в виде процента от общего пула фолликулярных Т-хелперов центральной памяти с фенотипом CD3+CD4+CD45RA–CD62L+CXCR5+ Гистограмма Д и Е – результаты корреляционного анализа между относительным содержанием различных субпопуляций Tfh и некоторыми иммуноэндокринными параметрами в группах AIT+PD и AIT, соответственно. В дальнейшем была проведена оценка уровней экспрессии ключевых хемокиновых рецепторов – CCR4, CCR6 и CXCR3 – на поверхности общего пула фолликулярных Т- хелперов центральной памяти (Рисунок 10). Содержание CCR4-позитивных клеток статистически значимо отличались в группе AIT+PD от группы AIT, и в группе AIT от контрольной группы (Рисунок 10, А), а содержание CXCR3+ клеток статистически значимо отличалась в группе AIT+PD от всех остальных групп (Рисунок 10, В). Также были установлены статистически значимые корреляции между разичными иммуноэндокринными параметрами и Tfh в группе AIT+PD (Рисунок 10, Г) и в группе AIT (Рисунок 10, Д). У пациентов с AIT+PD на поверхности Tfh повышены уровни экспрессии CXCR3, уровень которого связан с концентрацией АТ к ТГ, и CCR4, который связан с объемом ЩЖ, вероятно, наличие этих маркеров миграции в воспаленную ткань на поверхности клеток может быть связано с их способностью инфильтрировать ткань ЩЖ, что подтверждается увеличением объема ЩЖ у пациентов из группы AIT+PD. Рисунок 10. Относительное содержание фолликулярных Т-хелперов центральной памяти в зависимости от уровней экспрессии ключевых хемокиновых рецепторов Гистограмма А — относительное содержание CCR4+ клеток Гистограмма Б — относительное содержание CCR6+ клеток Гистограмма В — относительное содержание CXCR3+ клеток Гистограммы Г и Д — результаты корреляционного анализа между относительным содержанием CCR4+, CCR6+ и CXCR3+ Tfh и некоторыми иммуноэндокринными параметрами в группах AIT+PD и AIT, соответственно. В группе AIT между субпопуляциями Tfh и различными симптомами, статистически значимых корреляций обнаружено не было (результаты не приведены). Тогда как в группе AIT+PD были выявлены статистически значимые корреляции между различными симптомами ПР и субпопуляциями Tfh (Рисунок 11, А). Стоит отметить, что доли DP Tfh и Tfh2 разнонаправленно коррелировали с паническими атаками и раздражительностью (Рисунок 11, А). Статистически значимые корреляции были установлены и между субпопуляциями Tfh и различными симптомами гипотироза (Рисунок 11, Б). Исходя из вышесказанного, отметим, что противоположные изменения в уровнях DPTfh и Tfh2, а также разнонаправленность их взаимосвязей с одними теми же клиническими параметрами (панические атаки и раздражительность) у пациентов с AIT+PD могут указывать на антагонистические отношения между этими субпопуляциями в иммунопатогенезе заболевания. Рисунок 11. Результаты корреляционного анализа между относительным содержанием различных субпопуляций Tfh пациентов с AIT+PD и некоторыми симптомами ПР и гипотироза (гистограммы А и Б, соответственно). Субпопуляционный состав Th17 у пациентов исследованных групп Накоплены обширные данные о существенной роли Th17 и их цитокинов при аутоиммунопатиях ЩЖ [Luty et al., 2019]. В связи с этим, мы изучили субпопуляционный состав Th17 у вовлеченных в исследование лиц. Было показано отсутствие достоверных различий между группами по относительному содержанию CXCR5-CCR6+ Th17 среди клеток центральной памяти, патрулирующих лимфоидную ткань, и клеток эффекторной памяти, способных покидать кровоток и мигрировать в очаги воспаления (Рисунок 8, В). Далее в рамках общего пула CCR6+ Th17 были выделены четыре основные субпопуляции Th17, которые различались как по паттернам экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR3 и CCR4, так и по спектру функциональных активностей [Paulissen et al., 2015; Wacleche et al., 2016]. В настоящее время выделяют «классические» Th17 с фенотипом CCR4+CXCR3–, CCR4+CXCR3+ Th17 обозначаемые как «дважды-позитивные» или DP Th17, затем «не классические» CCR4–CXCR3+ или Th17.1 и, наконец, «дважды-негативные» CCR4– CXCR3– или DN Th17 лимфоциты. Было показано (Рисунок 12, В), что доля DP Th17 в рамках общего пула CD45RA–CD62L+CCR6+ Th в группе AIT+PD была статистически значимо выше, чем в группе AIT. Сходные результаты были получены при анализе общего пула ЕМ Th17, причем доля DP Th17 в группе AIT+PD была достоверно выше чем в любой другой группе (Рисунок 12, Ж). Более того, процентное содержание Th17.1 у AIT+PD было статистически значимо ниже, чем в группе AIT (Рисунок 12, З). Далее был проведен анализ ключевых регуляторных и эффекторных цитокинов Th17 в сыворотке крови пациентов различных групп. Было показано, что уровень хемокина CCL20, отвечающего за регуляцию направленной миграции клеток, включая антиген- специфические Th17, в очаги воспаления, способствуя амплификации ответа [Mellado et al., 2015], статистически значимо отличался во всех группах – самый высокий уровень данного цитокина был в группе AIT+PD, самый низкий в контрольной группе здоровых лиц (Таблица 2). Это, очевидно, должно истолковываться с учетом установленной важной роли данного макрофагального цитокина в эмиграции Т-лимфоцитов в ЦНС [Arima et al., 2012]. В настоящее время известна роль этого цитокина в компенсаторном рекрутировании к месту иммунопатологического процесса Т-регуляторов и показано, что при шизофрении астроциты мозга характеризуются пониженной способностью экспрессировать этот хемокин, что интерпретируется как фактор, способствующий иммунологическим механизмам патогенеза данного психоза [Akkouh et al., 2020]. Рисунок 12. Субпопуляционный состав Th17 центральной и эффекторной памяти. Гистограммы А–Г и Д–З – относительное содержание «классических» Th17, «дважды-негативных» DN Th17, «дважды-позитивных» DP Th17 и «не классических» или Th17.1 в рамках общего пула СМ и ЕМ Th17, соответственно. Мы выявили статистически значимые корреляции между содержанием субпопуляций Th-17 и различными иммуноэндокринными параметрами в группе AIT+PD (Рисунок 13, А) и группе AIT (Рисунок 13, Б). У пациентов из группы AIT+PD достоверные корреляционные взаимосвязи также были выявлены между субпопуляциями Th17 и симптомами ПР (Рисунок 13). Рисунок 13. Взаимосвязь между уровнем различных субпопуляций Th17 и иммуноэндокринными параметрами и симптомами ПР. Гистограмма А и Б — результаты корреляционного анализа субпопуляций Th17 и иммуноэндокринных параметров в группах AIT+PD и AIT соответственно Гистограмма В — результаты корреляционного анализа субпопуляций Th17 и различных симптомов ПР Таким образом, у пациентов с АИТ и психическими расстройствами выражены особенности, способствующие миграции в периферические ткани DPTh17 в рамках клеток центральной и эффекторной памяти , в периферической крови также повышен уровень CCL20, отвечающего за миграцию клеток, в том числе — защитных Treg, в ЦНС и другие органы при воспалении, что указывает на хроническую активацию Th17 и их важную роль в патогенезе АИТ в комбинации с ПР. Результаты экспериментального моделирования ЭХ пассивной иммунизацией Была предпринята попытка моделирования ЭХ пассивной иммунизацией мышей линии BAlb/c интрацеребровентрикулярным стереотаксическим введением пула Ig G, выделенных от пациентов с АИТ и шизофренией, либо АИТ и депрессией. Этим животным, а также контрольной группе мышей, получавших равную дозу IgG здоровых доноров, были проведена вышеуказанная батарея тестов для выявления нарушений поведения. Однако, достоверные различия между исследуемыми группами животных при поведенческих тестах были выявлены только при проведении теста с крестообразным приподнятым лабиринтом, направленного на выявление тревожности у животных. Животные, получавшие IgG oт пациентов с АИТ и депрессией, были статистически значимо менее активны, в отношении развития поведения риска, чем животные, получавшие донорские IgG здоровых лиц, и чем животные, получавшие растворы IgG от пациентов с АИТ и шизофренией, что можно интерпретировать как повышенную тревожность у группы мышей, получавших IgG oт пациентов с АИТ и депрессией, в сравнении остальными [Walf, and Frye, 2007]. Однако, животные, получавшие IgG пациентов с АИТ и шизофренией, по параметрам поведения в этом тесте достоверно не отличались от групп контроля (Рисунок 14, Б). Остальные поведенческие тесты достоверных различий в исследуемых группах животных не выявили. Таким образом, первая в мировой практике экспериментальная модель ЭХ позволила частично воспроизвести картину свойственных этому симптомокомплексу поведенческих аномалий. Рисунок 14. Сравнительный анализ результатов теста с крестообразным приподнятым лабиринтом у лабораторных мышей из исследуемых групп. Гистограмма А – результаты сравнительного анализа времени, проведенного в открытых рукавах лабиринта Гистограмма Б – результаты сравнительного анализа количеств проявленного поведения риска Белым цветом- группа мышей с инъекцией натрий-фосфатного буфера (PBS); темно-серым цветом- группа мышей с инъекцией поликлональных IgG здоровых доноров (Com); серым цветом- группа мышей с инъекцией IgG пациентов АИТ и депрессией (Depr); светло-серым цветом- группа мышей с инъекцией IgG пациентов АИТ и шизофренией (Schiz) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Представленная диссертационная работа является первым комплексным исследованием по изучению иммунопатологических аспектов в патогенезе развития психических нарушений, ассоциированных с АИТ Хасимото. Был проведен комплексный анализ аутоантител (как тироидных, так и экстратироидных), гормонов, цитокинов, Т-лимфоцитов у пациентов с АИТ и пациентов с АИТ и психическими нарушениями, а также анализ их взаимодействия друг с другом, и влияния на формирование клинических признаков нарушений психики при тироидите Хасимото. Было показано, что патогенетическая роль при Энцефалопатии Хасимото принадлежит не только АТ к ТПО, но также и другим экстратироидным антителам. Были выявлены особенности субпопуляционного состава Т- лимфоцитов у пациентов с АИТ и ПР. Субпопуляция CMTfh у пациентов с АИТ и ПР была достоверно выше, и достоверно связана с уровнем свободного тироксина, что свидетельствует о существенной патогенетической роли этих клеток. Дисбаланс субпопуляционного состава Т-фолликулярных хелперов, а также их разнонаправленные корреляции с одними и теми же клиническими параметрами указывает на возможные антагонистические отношения субпопуляций Tfh2 и DPTfh в патогенезе ПР, ассоциированных с АИТ. Обнаружено, что гиперпролактинемия у пациентов с АИТ и психическими нарушениями, принимающих антипсихотическую терапию не связана в полной мере с пролактогенным эффектом препаратов. Впервые получена экспериментальная модель части поведенческих нарушений ЭХ пассивной интрацеребровентрикулярной иммунизацией мышей IgG пациентов с АИТ и ПР. ВЫВОДЫ 1. Часть проявлений ЭХ, но не вся ее картина, зависят от АТ к ТПО. Патогенетическую роль при ЭХ играют также АТ к альфа-енолазе, тироглобулину, а в отдельных случаях — АТ минорных антинейрональных специфичностей. 2. У пациентов с АИТ и коморбидными ПР Тfh играют существенную патогенетическую роль, на что указывает повышенный уровень CMTfh у данных пациентов, характер их взаимосвязи с FT4, а также высокий уровень IL-21, как их главного эффекторного цитокина. 3. У пациентов с АИТ и ПР наблюдается дисбаланс субпопуляционного состава Тfh, коррелирующий с проявлениями заболевания и, предположительно патогенетически значимый. При этом на поверхности Tfh повышены уровни экспрессии CXCR3, что коррелирует с признаками поражения ЩЖ и является патогенетически значимым для контроля процессов миграции лимфоцитов в ЦНС и ЩЖ. 4. ГПРЛ при АИТ, коморбидным с психическими нарушениями на фоне эутироза и легкого гипотироза служит патогенетическим фактором усиления аутоиммунитета и коррелирует с некоторыми психопатологическими симптомами заболевания, будучи, по крайней мере, частично не связанной с ятрогенными воздействиями. 5. Цитокиновый спектр у пациентов с АИТ, ассоциированным с ПР, характеризуется рядом особенностей, имеющих патогенетическое значение для проявлений ЭХ, так как коррелирует с особенностями субпопуляционного состава Tfh (увеличение общей субпопуляции Тfh, снижение субпопуляции Tfh2) и с рядом проявлений заболевания. 6. Пассивная интрацеребровентрикулярная иммунизация мышей IgG пациентов с АИТ и ПР позволяет частично воспроизвести поведенческие аномалии, характерные для ЭХ, в экспериментальной модели. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для пациентов с ПР и коморбидным АИТ, нуждающихся в антипсихотической терапии, следует подбирать препараты с наименее выраженным пролактогенным эффектом, поскольку у таких пациентов есть особенности метаболизма ПРЛ в силу наличия АИТ. 2. Пациентов с ПР и коморбидными аутоиммунными заболеваниями стоит тщательнее обследовать на наличие анти-нейрональных антител, для исключения аутоиммунного генеза нарушений психики и верификации наличия аутоиммунных энцефалитов. 3. Полученная экспериментальная модель может быть использована и модифицирована для дальнейшего изучения патогенеза ЭХ. Стоит рассматривать также экспериментальные модели с хроническим введением IgG пациентов с АИТ и ПР с последующей оценкой поведенческих тестов.