Постгеномные технологии персонализированного ведения пациентов с соматотропиномами

В соответствии с поставленными целями и задачами, в первой части нашей работы проведено одноцентровое исследование случай-контроль, во второй части – проспективное неконтролируемое наблюдательное исследование. Набор пациентов проводился на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России (НМИЦ эндокринологии, Москва, РФ), в отделении нейроэндокринологии и остеопатий (зав. отделением – д.м.н. Ж.Е. Белая). Набор здоровых добровольцев проводился из числа сотрудников ФГБУ «НМИЦ эндокринологии».
Критерии соответствия для пациентов с акромегалией
Критерии включения: пациенты обоих полов, в возрасте 18 лет и старше, с активной стадией акромегалии (код МКБ-10 E22.0), подтвержденной характерными клиническими проявлениями, повышением ИФР-1 (согласно возрастному референсному диапазону) и отсутствием подавления секреции СТГ менее 1,0 нг/мл в ходе перорального глюкозотолератного теста (ПГТТ).
Критерии исключения: прием аналогов соматостатина в анамнезе или на момент включения в исследование; лучевая терапия в анамнезе; акромегалия вследствие генетических синдромов, период беременности и лактации, психические заболевания, онкологические заболевания, наличие острых заболеваний и декомпенсации сопутствующих заболеваний на момент включения.
Способ формирования выборки пациентов с акромегалией – сплошной. Период набора: декабрь 2016 – ноябрь 2018 гг.
Критерии соответствия для группы здоровых добровольцев
Критерии включения: субъекты обоих полов, в возрасте 18 лет и старше, отсутствие клинических проявлений эндокринных заболеваний.
Критерии исключения: период беременности и лактации, психические заболевания, онкологические заболевания, наличие острых заболеваний и декомпенсации хронических заболеваний на момент включения.
Способ формирования выборки здоровых добровольцев – случай- контроль.
Критерии оценки исходов
Критерием ремиссии акромегалии в раннем послеоперационном периоде считалось подавление уровня СТГ в ходе ПГТТ менее 1,0 нг/мл (строгий критерий ремиссии – менее 0.4 нг/мл). Критерий долгосрочной послеоперационной ремиссии – нормализация уровня ИФР-1 согласно возраст-специфическому референсному диапазону.
Лабораторные исследования
Забор крови из периферической вены выполнялся утром натощак в промежуток 8:00–10:00. Образцы центрифугировались при температуре 5°С и скорости вращения 3000 оборотов/мин в течение 20 минут (лабораторная центрифуга Eppendorf 5810R с комплектом роторов (А-4-81, Ф-4-81-MTP/Flex, FA-45-30-11 и F-45-48-PCR)). Образцы сыворотки и плазмы немедленно замораживались и хранились при температуре -80°C.
Гормональные исследования проводились в клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» (зав. лабораторией – к.м.н. Л.В. Никанкина). ИФР-1 (возраст-специфические референсные диапазоны: 18-20 лет: 127- 584 нг/мл; 21-25 лет: 116-358 нг/мл; 26-30 лет: 117-329 нг/мл; 31-35 лет: 115-307 нг/мл; 36-40 лет: 109-284 нг/мл; 41-45 лет: 101-267 нг/мл; 46-50 лет: 94-252 нг/мл; 51-55 лет: 87-238 нг/мл; 56-60 лет: 81-225 нг/мл и 61-65 лет: 75-212 нг/мл) и СТГ (референсный диапазон: 0,6-6,9 нг/мл) измеряли иммунохемилюминесцентным методом на аппарате Liaison. Измерение уровня пролактина проводилось иммунохемилюменисцентным методом на автоматизированной системе Vitros 3600 (референсный диапазон: 69-340 мЕд/л).
Инструментальные исследования
Рост измеряли с помощью стадиометра, ИМТ рассчитывался как масса тела (в килограммах), деленная на квадрат роста (метры).
Магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга проводилась в отделении лучевой диагностики ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» (руководитель – д.м.н., проф. А.В. Воронцов) на магнитно-резонансном томографе Magnetom Harmony 1.0Т фирмы Siemens (Германия) с введением гадолиниевого контрастного препарата по показаниям. Объем опухоли (V) был рассчитан способом, предложенным G. Di-Chiro и K.B. Nelson для измерения объема гипофиза: V=0,5xLxWxT, где L- высота аденомы, W-
ширина, T- переднезадний размер (толщина), выраженные в мм [Chiro G. DI. et al., 1962].
Гистологические и иммуногистохимические исследования
Морфологический анализ образцов ткани выполнен в сотрудничестве с к.м.н. Лапшиной А.М. в отделе фундаментальной патоморфологии ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» (зав. отделением – д.м.н., проф. А. Ю. Абросимов) и включал гистологический и иммуногистохимический (ИГХ) методы исследования. Приготовление гистологических препаратов проводилось по стандартной методике с использованием гистопроцессора (Leica asp200) с проведением дегидратации полученных фрагментов ткани опухоли в абсолютном спирте в течение 12 часов, затем ткань заливалась в парафиновые блоки, после чего из парафиновых блоков производились срезы толщиной не более 5 мкм. Далее срезы депарафинизировали и окрашивали гематоксилином и эозином и проводили иммуногистохимические реакции с антителами к СТГ (разведение 1:400, Dako, поликлональные кроличьи), пролактину (разведение, 1:600, Dako, поликлональные кроличьи), низкомолекулярному цитокератину (разведение 1:100, моноклональные мышиные, клон CAM 5.2 Cell Marque), рецепторам соматостатина 2 подипа (разведение, 1:100, Epitomics, моноклональные кроличьи, клон EP 149), рецепторам соматостатина 5 подипа (разведение, 1:100, abcam, моноклональные кроличьи, клон UMB-5), с демаскирующей обработкой буфером с высоким pH. Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) выполнено с помощью автоматизированного аппарата (иммуностейнер Leica Bond Max) по стандартному протоколу.
В соответствии с морфологической классификацией ВОЗ от 2017 года [Nishioka H. et al., 2018], в исследованных образцах ткани опухоли гипофиза были разделены на плотногранулированные соматотропиномы (ПГС), редкогранулированные соматотропиномы (РГС), маммосоматотропиномы (МС), смешанные сомато- и лактотрофные аденомы (ССЛ). ПГС представлены оксифильными клетками (при окраске гематоксилином и эозином), с интенсивным окрашиванием цитоплазмы большинства опухолевых клеток с антителами к СТГ и САМ 5.2 (при ИГХ), РГС – опухоли гипофиза из оксифильных и хромофобных клеток (при окраске гематоксилином и эозином), с очаговой или слабо выраженной иммуноэкспрессией СТГ цитоплазмы опухолевых клеток и наличием фиброзных телец в более 75% клеток опухоли. МС состоят из одной популяции клеток, способных экспрессировать СТГ и пролактин. ССЛ состоят из двух популяций клеток, каждая из которых имеет позитивное окрашивание на СТГ или пролактин.
Оценка экспрессии рецепторов соматостатина 2 и 5 подтипов проводилась по системе immunoreactive score system (IRS) [Remmele W., Stegner H., 1987].
В качестве контроля для антител СТГ, САМ 5.2 и пролактину использовали ткань трупного аденогипофиза. Для антител к рецепторам соматостатина в качестве контроля использовали образцы ткани нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы.
Генетические исследования
Выделение микроРНК проводилось из 200 мкл плазмы с использованием наборов miRNeasy Serum/Plasma Kit («Qiagen», Германия), согласно инструкции производителя, на автоматической станции QIAcube («Qiagen», Германия). Для предотвращения деградации в выделенную РНК добавляли 1 ед. RiboLock RNase Inhibitor («Thermo Fisher Scientific», США) на 1 мкл раствора нуклеиновых кислот. Концентрацию суммарной РНК в водном растворе оценивали на спектрофотометре NanoVue Plus («GE Healthcare», Великобритания).
Полногеномный анализ экспрессии микроРНК был выполнен на высокопроизводительном секвенаторе NextSeq 500 с помощью TruSeq Small RNA Library Prep Kit («Illumina», США). Биоинформатический анализ полученных данных проводился с помощью программного обеспечения Cutadapt [Martin M., 2011] (удаление адаптеров), Bowtie2 [Langmead B. et al., 2009] (выравнивание прочтений), FastQC (контроль качества), Seqbuster [Pantano L. et al., 2010] (аннотация последовательностей микроРНК, анализ изомеров микроРНК). Итоговый анализ для получения данных по различиям в экспрессии микроРНК проводился при помощи DESeq2 [Love M.I. et al., 2014].
Прочтения для каждого образца из экспериментальной фазы исследования высчитаны согласно присвоенным идентификаторам микроРНК. Для подсчета молекул использовалась кластеризация UMI. Для расчета различий в экспрессии использовались прочтения UMI. Прочтения нормализованы на общее количество прочтений в каждом образце и представлены как количество прочтений на 10000 (нормализованное количество прочтений). Для кластерного анализа использована иерархическая кластеризация с применением метода Евклидова расстояния – включены микроРНК с числом прочтений более 10.
Анализ экспрессии микроРНК производили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени» с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Исследование проведено на оборудовании
StepOnePlus (Applied Biosystems, США) с наборами TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, США) и TaqMan Advanced miRNA (Thermo Fisher Scientific, США), согласно инструкциям производителей. Общий объем ПЦР реакции составлял 20 мкл. Условия амплификации фрагментов ДНК: 95C/20 сек – 1 цикл; 95C/1 сек, 95C/20 сек – 40 циклов. Данные экспрессии нормализованы с использованием геометрической средней референсной микроРНК (cel-miR-39-3p). Для получения значений пороговых циклов (cycle threshold, Ct) использовано программное обеспечение SDS (версия 2.3, Applied Biosystems, США). Значение Ct <35 выбрано в качестве порогового для определения экспрессии микроРНК. Для сравнительной оценки циркулирующих микроРНК использован метод дельта- Ct, выполненный в пакете ddCT версии 1.30.0. Наблюдение Сбор катамнестической информации по включенным пациентам осуществлялся путем телефонных переговоров и личного контакта. Процесс формирования выборки для оценки исходов нейрохирургического лечения представлен на рисунке 1. Рисунок 1. Формирование выборки для послеоперационного наблюдения из валидизационной части исследования экспрессии микроРНК Примечания: ТНАЭ – трансназальная транссфеноидальная аденомэктомия Критерием рецидива являлось превышение верхней границы возраст- специфического диапазона уровня ИФР-1. Отсутствие рецидива оценивалось как ремиссия. Статистический анализ Статистический анализ выполнялся в сотрудничестве с к.м.н. Солодовниковым А.Г. Основные количественные характеристики пациентов представлены в виде среднего (М) или медианы (Ме) и 95% доверительного интервала (95% ДИ) или межквартильного размаха (25–75 процентиль – Q25-Q75) в зависимости от характера распределения и выбранного метода анализа. Соотношения качественных признаков представлены в виде долей (%). Сравнение между количественными параметрами пациентов и группой контроля проводили с использованием непарных двухсторонних t-тестов или критерия Манна-Уитни. Точный критерий Фишера был использован для сравнения двух независимых групп для качественных параметров. Статистически значимым признавался уровень ошибки первого рода менее 5% (p <0,05). Для коррекции проблемы множественных сравнений применялась поправка Бонферрони (кроме сравнений в уровнях экспрессии микроРНК, для которых применялся метод Бенджамини-Хохберга, встроенный в соответствующие вычислительные алгоритмы). После применения поправки значения p в диапазоне между расчитанным и 0,05 интерпретировались как статистическая тенденция. Статистический анализ и графический вывод результатов выполнялись с использованием программного обеспечения R версии 3.4.0 (2017-04-21). Количественные данные, полученные из исходного анализа RT-qPCR, были преобразованы с использованием log2 fold changes (FC) в сравнении с контролем (cel-39), чтобы обеспечить прямое сравнение между группами. Затем значения FC2 сравнивались между каждой парой групп с использованием независимого t-критерия выборки с вычислением нескорректированного p-значения (p) и скорректированного значения p для исключения ложного обнаружения различий при множественных сравнениях с использованием метода Бенджамини-Хохберга [Hirakawa A. et al., 2007; Reiner A. et al., 2003]. Корреляционный анализ проведён с использованием коэффициента ранговой корреляции тау-b Кендалла. Диагностическая ценность микроРНК, различно экспрессирующихся у пациентов с акромегалией и здоровых добровольцев, оценивалась при помощи ROC-анализа. Формирование панели микроРНК для определения больных и здоровых добровольцев выполнена при помощи метода логистической регрессии. В связи с ограниченным размером выборки в исследовании, многофакторный анализ не проводился. Для оценки работоспособности математических моделей применялся ROC-анализ. Отрезные значения Количество пациентов Пол, м(%):ж(%) Возраст, лет ИМТ, кг/м2 ИФР-1, нг/мл СТГ базальный, нг/мл 12 12 4(33,3%):8(67,7%) 4(33,3%):8(67,7%) 31,00 39,00 [24,50;43,25] [28,50;42,00] 26,65 26,76 [25,55;33,38] [21,28;30,67] 599,55 225,95 [537,28;844,83] [172,23;258,53] 11,57 - [3,19;42,75] - 1,000 0,363 0,307 <0,001 - отбирались согласно критерию Юдена, с последующим расчетом чувствительности, специфичности, ПЦПР и ПЦОР и их 95% ДИ по методу Клоппера-Пирсона. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Клиническая характеристика пациентов и здоровых добровольцев, включенных в исследование экспрессии микроРНК методом NGS Для исследования экспрессии микроРНК плазмы методом NGS включено 12 пациентов с акромегалией и 12 здоровых добровольцев. Общая характеристика и биохимические показатели пациентов представлены в Таблице 1. Таблица 1. Основные характеристики и биохимические показатели пациентов и лиц контрольной группы, включенных в анализ экспрессии микроРНК плазмы крови методом NGS Параметры Акромегалия Здоровые добровольцы p* Примечания: Количественные признаки представлены в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q1; Q3]. Качественные признаки представлены в виде долей. Сравнение количественных признаков между группами проведено при помощи критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использован критерий χ2 Пирсона. * Пороговый Р0=0,012 (после применения поправки Бонферрони) Анализ экспрессии микроРНК плазмы у пациентов с акромегалией методом NGS В ходе биоинформатического анализа данных секвенирования получены результаты по экспрессии более 300 микроРНК в плазме крови, из них – 33 с числом прочтений более 10. МикроРНК, по которым были выявлены различия в крови у пациентов с акромегалией по сравнению со здоровыми добровольцами (p <0,05) сведены в Таблице 2. Таблица 2. Изменения в экспрессии микроРНК плазмы крови у пациентов с акромегалией по данным NGS* микроРНК Изменение p p* miR-4446-3p -1,751 0,001 0,373 miR-215-5p -3,041 0,005 0,800 miR-342-5p -1,875 0,014 0,990 Примечания: * - приведены микроРНК со значением нескорректированного значения p <0,05 ** - значение p с поправкой на множественность сравнений методом Бенджамини-Хохберга Валидизация различий в экспрессии микроРНК плазмы на расширенной выборке методом RT-qPCR Для валидизации изменений, полученных в ходе NGS, отобраны пять микроРНК-кандидатов (miR-4446-3p, miR-215-5p, miR-342-5p, miR-210-3p, miR-146a-5p). Две микроРНК выбраны по данным литературы [Fan X., et al., 2015], Dénes J. et al., 2015]. В валидизирующую часть исследования включено 47 пациентов с акромегалией и 28 здоровых добровольцев, в том числе включены по 11 человек из групп акромегалии и здорового контроля из анализа экспрессии методом NGS. Основные характеристики групп представлены в таблице 3. Таблица 3. Основные характеристики и биохимические показатели пациентов и лиц контрольной группы, включенных в анализ экспрессии микроРНК плазмы крови методом RT-qPCR Параметры Акромегалия Здоровые добровольцы p* Количество пациентов Пол, м(%):ж(%) Возраст, лет ИМТ, кг/м2 ИФР-1, нг/мл СТГ базальный, нг/мл 14(29,79%):33 (70,21%) 47,00 [34,00;55,00] 28,30 [25,85;33,85] 689,50 [507,30;881,25] 9,61 [4,79;17,2] 9 (32,14%):19 (67,86%) 42,50 [34,75;56,00] 26,75 [22,71;30,02] 157,25 [107,40;224,02] - - 1,000 0,752 0,042 <0,001 - Примечания: Количественные признаки представлены в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q1; Q3]. Качественные признаки представлены в виде долей. Сравнение количественных признаков между группами проведено при помощи критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использован критерий χ2 Пирсона. * Пороговый Р0=0,012 (после применения поправки Бонферрони) Показатели экспрессии микроРНК плазмы у пациентов с акромегалией в сравнении со здоровым контролем представлены в Таблице 4. Получены статистически значимые различия в экспрессии miR-4446-3p и miR-215-5p. Экспрессия микроРНК не различалась по полу. Таблица 4. Экспрессия микроРНК плазмы крови у пациентов с акромегалией и у лиц из группы здорового контроля, измеренная методом RT- qPCR микроРНК Акромегалия Здоровые добровольцы Log2FC p p* miR-4446-3p 0.471 (0.2876) 1.024 (0.4020) -1,119 <0,001 <0,001 miR-215-5p 0.360 (0.3345) 0.994 (0.6050) -1,465 <0,001 <0,001 miR-146a-5p 1.204 (0.6339) 1.586 (0.8080) -0,397 0,027 0,062 miR-210-3p 1.628 (0.6387) 1.396 (0.4245) 0,221 0,094 0,165 miR-185-5p 1.150 (0.5173) 1.373 (0.8702) -0,255 0,167 0,195 miR-342-5p 1.250 (0.3968) 1.120 (0.3620) 0,158 0,165 0,195 miR-34a-5p 1.287 (0.5310) 1.320 (0.4881) -0,036 0,790 0,790 Примечания: Данные по уровням микроРНК для каждой группы представлены в виде абсолютной экспрессии (2-dCt). Данные по экспрессии представлены в виде средней и стандартного отклонения. Log2FC – бинарные логарифмы значений кратности изменений, рассчитанных как отношения геометрических средних значений 2-dCT. Сравнительный анализ выполнен с использованием критерия Манна-Уитни. * Поправка на множественность сравнений методом Бенджамини-Хохберга. Графическое представление выявленных различий представлено на Рисунке 2. Рисунок 2. Экспрессия семи микроРНК в плазме крови у пациентов с акромегалией (n=47) в сравнении с группой сравнения (n=28), RT-qPCR. Данные по уровням микроРНК для каждой группы представлены в виде абсолютной экспрессии (2-dCt). Данные представлены в виде медианы, стандартного отклонения и 95% доверительного интервала. Сравнительный анализ выполнен с использованием критерия Манна-Уитни. В ходе корреляционного анализ выявлены обратные корреляции между miR-4446-3p и ИФР-1 (τ = -0,34, p <0,001), miR-215-5p и ИФР-1 (τ = -0,30, p <0,001), прямые корреляции между miR-4446-3p и miR-215-5p (τ =0,25, p <0,01), miR-342-5p и miR-34a-5p (τ =0,16, p <0,05). Не выявлено корреляций между микроРНК и СТГ или объемом опухоли. Для оценки диагностической ценности miR-4446-3p и miR-215-5p проведён ROC-анализ, результаты представлены на рисунке 3. Рисунок 3. ROC-анализ miR-4446-3p (А) и miR-215-5p (Б) в качестве диагностических маркеров акромегалии Площадь под кривой для miR-4446-3p и miR-215-5p составила: 0,862 (95% ДИ, 0,722; 0,936, p <0,001) и 0,829 (95% ДИ, 0,698; 0,907, p <0,001), соответственно. Согласно критерию Юдена, выбраны отрезные значения: 0,667 для miR-4446-3p, 0,430 для miR-215-5p. Логистическая регрессионная модель вероятности наличия акромегалии по сочетанию miR-4446-3p и miR-215-5p представлена в таблице 5. Таблица 5. Параметры логистической регрессионной модели для расчета вероятности наличия акромегалии по комбинации miR-4446-3p и miR- 215-5p Исследуемая переменная Коэффициент регрессии β Стандартная ошибка Критерий Вальда χ2 p miR-4446-3p miR-215-5p Константа -4,231 1,083 -3,201 0,926 5,589 1,224 15,268 <0,001 11,950 0,001 20,865 <0,001 Вероятность наличия акромегалии может быть расчитана по формуле: =1 1 + −(5,589−4,231∗ −3,201∗ ) где: p – вероятность 1 исхода (есть акромегалия), A – уровень экспрессии miR-4446-3p, B – уровень экспрессии miR-215-5p. Диагностические возможности панели микроРНК представлены на рисунке 4. Площадь под кривой составила 0,928 (95% ДИ, 0,859; 0,996, p <0,001) Рисунок 4. ROC-анализ для комбинации miR-4446-3p и miR-215-5p в определении пациентов с акромегалией и здоровых добровольцев. Согласно критерию Юдена выбрано отрезное значение 0,542. Отрезная точка 0,542 для панели miR-4446-3p+miR-215-5p соответствует чувствительности 91,5% (95% ДИ, 83,1%; 96,3%) и специфичности 85,7% (95% ДИ, 71,7%; 93,8%). Обобщенные данные по диагностической информативности исследованных микроРНК представлены в таблице 6. Таблица 6. Характеристики диагностической информативности miR- 4446-3p, miR-215-5p и панели miR-4446-3p+miR-215-5p ДЧ (95% ДИ) miR-215-5p 83,0% ДС (95% ДИ) 67,9% ОТ (95% ДИ) 77,3% ПЦПР (95% ДИ) 81,3% ПЦОР (95% ДИ) 70,4% miR-4446-3p 89,4% (76,9%- 96,5%) 82,1% (63,1%- 93,9%) 86,7% (76,8%- 93,4%) 89,4% (79,0%- 94,9%) 82,1% (66,4%- 91,5%) (69,2%- (47,7%- (66,2%- (71,4%- (54,6%- 92,4%) 84,1%) 86,2%) 88,3%) 82,4%) ДЧ – диагностическая чувствительность, ДС – диагностическая специфичность, ОТ – общая точность, ПЦПР – прогностическая ценность положительного результата, ПЦОР – прогностическая ценность отрицательного результата Гистологические и иммуногистохимические характеристики соматотропином miR-4446-3p +miR-215- 5p 91,5% (79,6%- 97,6%) 85,7% (67,3%- 96,0%) 89,3% (80,1%- 95,3%) 91,5% (81,2%- 96,4%) 85,7% (69,9%- 93,9%) Из 47 пациентов, включенных в валидизационную часть исследования, 44 проведена транссфеноидальная аденомэктомия. Послеоперационные образцы ткани двух пациентов не были включены в связи с недостаточным количеством материала. Морфологическое распределение представлено следующим образом: 30 ПГС (71,4%), 10 РГС (23,8%), 1 МС (2,4%), 1 ССЛ (2,4%). Для всех исследованных аденом индекс иммунореактивности SSTR2 составил 6,0 баллов [4,0; 9,0], SSTR5 – 5,5 баллов [2,0; 6,0]. По сравнению с РГС, в образцах ПГС отмечалась более высокая экспрессия SSTR2 (p=0,002), а также более высокое значение SSTR2/SSTR5 (p <0,001) В ходе корреляционного анализа выявлена прямая корреляция между базальным СТГ до операции и объемом опухоли (τ = 0,24, p <0,05) и обратная корреляция между соотношением SSTR2/SSTR5 и объемом опухоли (τ = -0,28, p <0,05). Наблюдение включенных пациентов Исходные клинические характеристики и результаты нейрохирургического лечения в раннем послеоперационном периоде Из 47 включенных пациентов двое отказались от оперативного вмешательства в пользу медикаментозного лечения аналогами соматостатина пролонгированного действия, один пациент скончался вследствие остановки сердца. Пяти пациентам ранее проводилась ТНАЭ, восемь пациентов на момент включения в исследование получали агонисты дофамина. Таким образом, оценка результатов хирургического лечения проводилась на выборке из 44 пациентов. Исходные характеристики пациентов и результаты хирургического лечения представлены в таблице 7. Таблица 7. Характеристики пациентов с акромегалией до операции и результаты нейрохирургического лечения Параметры Значения Количество пациентов 44 Параметры Значения 14 (32,8%): 30 (68,2%) 47,00 [34,00; 55,00] 28,25 [25,72; 34,50] 744,75 [548,83; 889,85] 9,50 [4,94; 17,07] 832 [419,25; 2532,38] 35, 79,5% Пол, м(%):ж(%) Возраст, лет ИМТ, кг/м2 ИФР-1, нг/мл СТГ базальный, нг/мл Объем опухоли (МРТ), мм3 Ремиссия после хирургического лечения (n, %) Размер аденомы (n, %): Микроаденома Макроаденома 8, 18,2% 36, 81,8% Частота ремиссии в зависимости от размера аденомы (n, %): Микроаденома Макроаденома 7, 87,5% 28, 77,7% Частота развития осложнений после нейрохирургического лечения (n, %): Гипопитуитаризм Несахарный диабет 5, 11,4% 4, 9,1% Примечания: Количественные признаки представлены в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q1; Q3]. Качественные признаки представлены в виде долей. При сравнении пациентов, достигших краткосрочной ремиссии, с пациентами с сохраняющейся активностью заболевания, выявлены статистически значимые различия уровней базального СТГ (Таблица 8). Статистически значимых различий в уровнях исследованных микроРНК не выявлено. Таблица 8. Сравнительная характеристика пациентов в зависимости от достижения краткосрочной ремиссии акромегалии после нейрохирургического лечения Параметр Возраст, годы Пол, м(%):ж(%) ИФР-1, нг/мл Базальный СТГ до операции, нг/мл Макроаденома(%) Ремиссия (n=35) 45 [33; 55] 10(28,6%):25(71,4%) 737,60 [532,10; 876,20] 8,90 [3,74; 15,20] 28(80%) Нет ремиссии (n=9) 47 [29; 53] 4(44,4%):5(55,6%) 935,60 [649,60; 1186,00] 36,40 [9,61; 63,30] 8(89%) p* 0,328 0,434 0,047 0,001 1,000 Объем опухоли ПГС(%):РГС(%) SSTR2, IRS SSTR5, IRS SSTR2/SSTR5 858,00[405,00;1552,80] 23(74,2%):8(25,8%) 6,0 [4,0; 9,0] 6,0 [2,0; 6,0] 1,3 [0,7; 3,0] 1638,00[360,00;3450,00] 7(77,8%):2(22,2%) 6,0 [2,0; 12,0] 6,0 [2,0; 6,0] 1,0 [0,5; 3,0] 0,156 1,000 0,469 0,904 0,987 Примечания: Количественные признаки представлены в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q1; Q3]. Качественные признаки представлены в виде долей. Сравнение количественных признаков между группами проведено при помощи критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использован критерий χ2 Пирсона. * Пороговый Р0=0,005 (после применения поправки Бонферрони) С целью определения прогностической ценности базального СТГ до операции проведен ROC-анализ (Рисунок 5). Рисунок 5. ROC-анализ базального СТГ до операции в качестве предиктора ремиссии акромегалии в раннем послеоперационном периоде Согласно критерию Юдена, выбрано отрезное значение дооперативного уровня СТГ 27,75 нг/мл. Диагностические возможности теста представлены в таблице 9. ПЦПР полученной модели неудовлетворительная, так как нижняя граница ДИ пересекает 50%. Однако, ПЦОР является высокой (91%, 95% ДИ: 81%-96%), что позволяет рекомендовать модель только для прогнозирования ремиссии, то есть исключения отсутствия ремиссии с вероятностью от 81% до 96%, что особенно важно при диагностическом скрининге. ДЧ ДС (95% ДИ) (95% ДИ) ОТ ПЦПР ПЦОР (95% ДИ) (95% ДИ) (95% ДИ) Таблица 9. Характеристики прогностической информативности базального СТГ перед операцией в определении ранней послеоперационной ремиссии акромегалии Базальный СТГ до операции 66,7% (29,9%- 92,5%) 91,4% (76,9%- 98,2%) 86,4% (72,7%- 94,8%) 66,7% (38,2%- 86,6%) 91,4% (80,8%- 96,4%) Примечания: ДЧ – диагностическая чувствительность, ДС – диагностическая специфичность, ОТ – общая точность, ПЦПР – прогностическая ценность положительного результата, ПЦОР – прогностическая ценность отрицательного результата Отдаленные результаты нейрохирургического лечения Результаты хирургического лечения и наблюдения представлены на рисунке 6. Рисунок 6. Результаты хирургического лечения и наблюдения Медиана периода наблюдения составила 19 месяцев [12,50;29,00]. При динамическом обследовании у 27 пациентов подтверждена ремиссия заболевания, у двоих выявлен рецидив акромегалии, четверо пациентов были потеряны для наблюдения (Таблица 10). Таблица 10. Оценка отдаленных исходов нейрохирургического лечения пациентов с акромегалией. Параметры Значения Период наблюдения, месяцы 19,00 [12,50; 29,00] (мин. 6; макс. 47) Отдаленный нейрохирургического лечения (n, %): Ремиссия Нет ремиссии* Рецидив Потеряны для наблюдения исход 27, 61,4% 9, 20,5% 2, 4,5% 6, 13,6% Примечания: Количественные признаки представлены в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q1; Q3]. Качественные признаки представлены в виде долей. Для периода наблюдения в круглых скобках приведены минимальные и максимальные значения. * Включено два пациента с дискордантностью лабораторных результатов Таким образом, из 44 прооперированных пациентов, ТНАЭ позволила достичь долгосрочной ремиссии в 27 случаях (61.4%). Сравнительная характеристика пациентов представлена в Таблице 11. Пограничное значение p получено для уровня базального СТГ до операции (p=0,006), также выявлена тенденция к различиям в дооперационных уровнях ИФР-1 (p=0,030). Таблица 11. Сравнительная характеристика пациентов в зависимости от достижения долгосрочной ремиссии акромегалии Параметр Долгосрочная Нет ремиссии p** ремиссия (n=27) (n=11)* Возраст, годы Пол, м(%):ж(%) ИФР-1 операции, нг/мл СТГ до операции, нг/мл Макроаденома(%): Микроаденома(%) Объем опухоли ПГС(%):РГС(%) SSTR2, IRS 45,0 [33,0; 55,0] 47,0 [29,0; 53,0] 7(25,9%):20(74,1%) 5(45,5%):5(54,5%) 674,80 [482,5; 771,0 [649,6; 992,0] 876,2] 8,9 [3,76; 11,9] 28,0 [6,75; 47,2] 22(77,7%):6(22,3%) 9(81,8%):2(18,2%) 858,0 [405,0; 1552,8 [360,0; 3213,0] 1260,0] 17(68,0%):8(32,0%) 8(80,0%):2(20,0%) 6,0 [4,0; 12,0] 6,0 [4,0; 8,0] 0,874 0,235 0,030 0,006 1,000 0,339 0,686 0,565 до SSTR5, IRS 5,0 [2,0; 6,0] SSTR2/SSTR5 1,5 [0,67; 3,0] 6,0 [2,0; 6,0] 0,588 1,0 [0,67; 3,0] 0,637 Примечания: Количественные признаки представлены в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q1; Q3]. Качественные признаки представлены в виде долей. Сравнение количественных признаков между группами проведено при помощи критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использован критерий χ2 Пирсона. * В расчет включено два пациента с рецидивом заболевания и два пациента с дискордантными лабораторными результатами ** Пороговый Р0=0,005 (после применения поправки Бонферрони) Для определения прогностической ценности СТГ до операции в определении долгосрочной ремиссии акромегалии был проведен ROC-анализ (Рисунок 7). Рисунок 7. ROC-анализ базального СТГ до операции в качестве потенциального предиктора долгосрочной ремиссии акромегалии Согласно критерию Юдена, оптимальное отрезное значение составило 15,55 нг/мл. Характеристики информативности представлены в таблице 12. Как и в случае модели для определения краткосрочной ремиссии, ПЦПР данной модели неудовлетворительная, так как нижняя граница ДИ пересекает 50%. При этом, ПЦОР является высокой (88%, 95% ДИ: 75%-95%), что также позволяет рассматривать модель только для прогнозирования ремиссии, то есть исключения отсутствия ремиссии с вероятностью от 75% до 95%. Таблица 12. Характеристики информативности базального СТГ перед операцией в определении долгосрочной ремиссии акромегалии ДЧ ДС (95% ДИ) (95% ДИ) ОТ ПЦПР ПЦОР (95% ДИ) (95% ДИ) (95% ДИ) Примечания: ДЧ – диагностическая чувствительность, ДС – диагностическая специфичность, ОТ – общая точность, ПЦПР – прогностическая ценность положительного результата, ПЦОР – прогностическая ценность отрицательного результата ВЫВОДЫ 1. При анализе циркулирующих микроРНК методом высокопроизводительного секвенирования отличительной особенностью пациентов с акромегалией по сравнению с здоровым контролем является тенденция к снижению уровней miR-4446-3p, miR-215-5p и miR-342-5p в образцах плазмы крови. 2.Снижение уровней miR-4446-3p и miR-215-5p плазмы валидизированы методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на расширенной выборке. Панель из данных микроРНК позволяют выделить пациентов с акромегалией по сравнению со здоровыми добровольцами с чувствительностью 91,5% (95%ДИ: 83,1%-96,3%), специфичностью 85,7% (95%ДИ 71,7%-93,8%) и общей точностью 89.3% (95%ДИ: 80,1%-95,3%), что определяет возможность дальнейшего использования этих микроРНК как диагностических биомаркеров акромегалии 3. Уровни miR-4446-3p и miR-215-5p плазмы коррелируют с уровнем ИФР-1, что может свидетельствовать о связи данных микроРНК с биохимической активностью акромегалии 4. Корреляций между уровнями miR-4446-3p и miR-215-5p с гистологическими и иммуногистохимическими характеристиками соматотропином не выявлено. Также не обнаружено различий по уровням miR-4446-3p и miR-215-5p у пациентов с различными морфологическими вариантами соматотропином 5. Нейрохирургическое лечение на базе ФГБУ НМИЦ эндокринологии МЗ РФ в качестве первого метода лечения эффективно для достижения ремиссии акромегалии в 79,5% случаев при анализе сразу после нейрохирургического вмешательства с сохранением ремиссии в 61,4% наблюдений в ходе долгосрочного наблюдения (медиана периода наблюдения 19,00 месяцев [Q1;Q3: 12,50; 29,00]). Базальный СТГ является потенциальным предиктором ремиссии акромегалии. Базальный СТГ до операции 70,0% (34,8%- 93,3%) 85,7% (67,3%- 96,0%) 81,6% (65,7%- 92,3%) 63,6% (39,3%- 82,5%) 88,9% (75,4%- 95,4%) ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Трансназальная транссфеноидальная аденомэктомия в высокоспециализированном учреждении рекомендуется в качестве эффективного метода достижения ремиссии у пациентов с акромегалией 2. Уровень базального СТГ до операции с отрезной точкой 15.55 нг/мл может служить прогностическим маркером долгосрочной ремиссии после нейрохирургического вмешательства с общей точностью 81,6% (95% ДИ, 65,7%-92,3%) 3. MiR-4446-3p и miR-215-5p плазмы могут использоваться в разработке панелей в качестве потенциальных диагностических биомаркеров при акромегалии