Патофизиологические закономерности развития стеатоза печени как основа разработки новых подходов к диагностике и лечению (экспериментально-клиническое исследование)

Экспериментальная часть исследования проводилась на 50 неинбредных половозрелых белых крысах-самцах в возрасте 8–9 месяцев массой тела 400–530 г. Животные содержались в стан- дартных условиях вивария ЦНИЛ ФГБОУ ВО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России в соответствии с Директивой No 63 от 22 сентября 2010 г. Президиума и Парламента Европы «О защите животных, используемых для научных исследований» и приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. No 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», основываясь на принципах гуманного обращения с подопытными животными. Проведение ис- следований одобрено локальным этическим комитетом ПГМУ до начала эксперимента. Схема дизайна экспериментально-кли- нического исследования представлена на рисунке 1.
Рисунок 1 – Дизайн экспериментально-клинического исследования
Были сформированы три группы животных:
Группа 1 – «Контроль» (n = 18) – здоровые, интактные жи- вотные. Для кормления этой группы использовался полноценный

сбалансированный стандартный гранулированный корм, одоб- ренный для лабораторных животных (крыс и мышей) (ООО «Ла- бораторкорм», Россия).
Группа 2 – «Стеатоз» (n = 18). Кормление осуществляли анало- гично животным первой группы с использованием 15%-ного рас- твора фруктозы в качестве питьевой воды (Т.В. Брус, 2018; Е. Roeb et al., 2021; S. Shojaei Zarghani et al., 2016). Учитывая тот факт, что доказана роль фруктозы как фактора риска НАЖБП у лиц без ожи- рения, причем этот фактор риска не зависит от массы тела (D. Kim, 2016; А. Ribeiro, 2019; J.K. DiStefano, 2020; N. Assy, 2008; A. Abid, 2009), экспериментальная модель фруктозоиндуцированного стеа- тоза печени может считаться моделью НАСП-БО.
Группа 3 – «Стеатоз + ДП» (n = 14) – крысы, у которых моде- лировали стеатоз аналогично тому, как это осуществлялось в группе «Стеатоз печени». Одновременно, с первого дня исследования, про- водили ежедневное интрагастральное введение экстракта листьев Джинуры Прокумбенс (производство Via Vitae Estate, Кипр) с по- мощью зонда, из расчета 0,5 г на 1 кг веса животного в день, одно- кратно, на протяжении 30 суток (Z. Hassan et al., 2010).
Ежедневно производились осмотр животных, оценка их пове- дения, состояния шерсти, активности, аппетита; осуществлялось измерение массы тела. В конце эксперимента, на 30-й день, крыс подвергали эфирному наркозу путем их помещения в эксикатор с парами эфира, производили вскрытие и прямой забор крови из пра- вого предсердия для лабораторных исследований. По окончании опыта и вывода животных из эксперимента определяли массу пече- ни и массовый коэффициент (МК), который рассчитывали по фор- муле: МК = масса печени (г)/масса тела (г)·100 %. В связи с боль- шим объемом лабораторных исследований и необходимостью полу- чения достаточного количества крови животных в каждой группе случайным образом делили на две подгруппы. У крыс первой под- группы забирали кровь для биохимических исследований и опреде- ления цитокинов. У крыс второй подгруппы производили забор крови для изучения системы гемостаза. У всех животных забирали печень для морфометрических и гистологических исследований.
Для гистологического исследования забирали центральную часть левой боковой доли печени. Гистологическое исследование

Таблица 1 – Характеристика исследуемых групп
Характеристика
Возраст, лет
min – max, лет Мужчины, абс. (%) Женщины, абс. (%) Индекс массы тела
НАСП-О (n = 52) 43,0 ± 11,1 25–67 17 (33) 35 (67) 37,2 ± 2,6
Вторичный СП (n = 24) 37,6 ± 4,3 25–65 11 (46) 13 (54) 25,5 ± 2,5
Контроль (n = 65) 42,3 ± 7,0 25–52 30 (46) 35 (54) 20,7 ± 1,0
проводили с окраской срезов тканей гематоксилином и эозином, суданом III по Герксгеймеру. Для подтверждения наличия ней- тральных липидов в цитоплазме гепатоцитов и уточнения степе- ни стеатоза в группе «Стеатоз» пять образцов были исследованы с помощью окраски замороженных срезов суданом III, без докра- ски гематоксилином и эозином. При микроскопии оценивали число гепатоцитов с включениями липидов, наличие скоплений клеток воспалительного инфильтрата и баллонной дистрофии, определяли процент гепатоцитов со стеатозом и индекс (степень) стеатоза; наличие признаков воспаления и фиброза (по Kleiner, 2005). Диагноз стеатоза печени верифицировался при наличии в биоптате более 5 % печеночных клеток, содержащих депозиты липидов (M. Carr Rotonya, 2016).
В клинической части исследования общее количество обсле- дованных составило 141 человек. Было сформировано три груп- пы: 1-я группа – 52 пациента с неалкогольным стеатозом печени и ожирением (НАСП-О), 2-я группа – пациенты со вторичным стеатозом печени на фоне гепатита С (вторичный СП), 3-я группа – контрольная (65 практически здоровых лиц). Все обследуемые подписали информированное согласие на участие в исследова- нии. Характеристика групп дана в таблице 1.
Общеклиническое обследование включало сбор анамнеза, жалоб, оценку сопутствующей патологии, наличия профессио- нальной вредности, употребления алкоголя, лекарственных пре- паратов. Стеатоз печени определяли на основании УЗИ с исполь- зованием аппарата – стационарный ультразвуковой сканер Medison CO, LTD, датчики с частотой 5–7,5 МГц, по традицион- ной методике при наличии следующих признаков: диффузная
гиперэхогенность печени, увеличение эхогенности печени по сравнению с почками, дистальное затухание эхосигнала, обедне- ние сосудистого рисунка (В.Т. Ивашкин, 2016). Наличие и сте- пень фиброза печени (ФП) определяли методом ультразвуковой эластографии на аппарате Fibroscan 502 (Echosens, Франция). На- личие в крови РНК вируса гепатита С, уровень вирусной нагруз- ки и генотип выявляли методом полимеразной цепной реакции, серологические маркеры – методом иммуноферментного анализа.
Лабораторное обследование в экспериментальной и клиниче- ской части работы включало в себя: определение биохимических показателей в сыворотке крови, липидного спектра на автоматиче- ском анализаторе Mindray (Китай) с использованием реагентов этой же фирмы (в эксперименте), у пациентов на автоматическом биохи- мическом анализаторе Architect-4000 (США). Концентрацию интер- лейкина 6 (IL-6) определяли методом иммуноферментного анализа на фотометре Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США) с исполь- зованием набора High Sensitive ELISA Kit for Interleukin 6 (IL-6) фирмы Cloud-Clone Corp. (Китай) у животных и набора фирмы ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) у пациентов. Количественное опре- деление функциональной активности фактора Виллебранда (ФВ) и оценку агрегационной активности тромбоцитов в плазме крови про- водили на агрегометре модели 230LA НПФ «БИОЛА» (г. Москва). Определение показателей коагуляционного гемостаза: протромби- нового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), фибриногена и Хагеман-зависимого фибринолиза (ХЗФ) проводилось на оптико- механическом коагулометре «АПГ-4-02» («ЭМКО», Россия, г. Мо- сква) наборами фирмы «Технология-стандарт» (Россия, г. Барнаул).
В клинической части работы пациентам дополнительно опре- деляли метаболические показатели (инсулин, лептин, С-пептид, индекс НОМА-IR); сывороточные концентрации фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) и васкулоэндотелиального фактора роста (ВЭФР) методом иммуноферментного анализа на аппарате Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США) с использованием наборов фирмы ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск); уровень альфа- фетопротеина (АФП) оценивали с помощью набора «AFP» (Siemens, Германия) иммунохемилюминесцентным анализом на
анализаторе Immulit-1000 (Германия). Генетическое исследование с определением однонуклеотидных полиморфизмов генов (ОНП) фактора некроза опухоли альфа TNF-α (G-308A), интерлейкина-6 (IL-6) (G-174С) и васкулоэндотелиального фактора роста VEGFA (G-634C) проводилось у 52 пациентов с НАСП-О и 65 здоровых доноров в г. Перми с использованием аллель-специфической ПЦР «SNP-Скрин» в режиме реального времени. Рассчитывали индексы стеатоза и фиброза: Hepatic steatosis index (HSI) по формуле: HSI = 8 · (АЛТ/АСТ) + ИМТ (+2, если женщина; +2, если диабет) (J.H. Lee et al., 2010), индекс фиброза (ИФ) по формуле: ИФ = = 3,79–0,0056•ТР + 0,0855•ФНО-α-0,0352•альбумин (А.П. Щёкото- ва и соавт., 2016) и индекс APRI (Aspartate-aminotransferase-to- Platelet Ratio Index) по формуле: APRI = (АСТ/ (верхний предел АСТ)) • 100 / тромбоциты (109/л) (С.Т. Wai et al., 2003).
Результаты исследования обработаны с использованием пакета прикладных электронных таблиц (ППЭТ) Stat2015, MedCalc® 15.8 Portable (© MedCalc Software, 1993-2014), авторского (© В.С. Ше- лудько, 2001–2016), анализа табличного процессора Excel® 2016 MSO (© Microsoft, 2016) (В.С. Шелудько и соавт., 2019) и пред- ставлены при нормальном распределении признака в виде сред- ней арифметической (М) и σ – среднего квадратического откло- нения (σ) – (М ± σ), при асимметричном распределении признака – медианы (Ме) и межквартильного размаха (Q1–Q3). Статистиче- ские различия между группами оценивали по t-критерию Стью- дента при нормальном распределении и U-критерию Манна- Уитни для независимых выборок. Коэффициенты корреляции вычисляли ранговым методом по Спирмену. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05. Определение зависимо- сти между качественными признаками проводилось на основе таблиц сопряжённости по критерию Хи-квадрат. Зависимость считалась статистически достоверной при р < 0,05. Для оценки корреляции между количественным и качественным признаками количественные признаки преобразовывались в качественные. При наличии достоверной выраженной зависимости признаков строилось уравнение множественной регрессии. Для расчета по- роговых значений и диагностической эффективности показате- лей, имеющих предикторную ценность, проводился ROC-анализ и расчет отношения шансов (QR). Рисунок 2 – Изменения в ткани печени группы «Стеатоз», гистологические срезы (увеличение ×400, окраска г/э) Рисунок 3 – Изменения в ткани печени группы «Стеатоз+ДП», гистологические срезы (увеличение ×400, окраска г/э) Результаты исследования и их обсуждение Экспериментальная часть. Результаты гистологического ис- следования показали, что у животных в группе «Стеатоз» при окра- ске гематоксилином и эозином (г/э) определяются гепатоциты с признаками мелкокапельной и крупнокапельной жировой дистро- фии в виде обильного накопления оптически пустых вакуолей раз- личного размера в цитоплазме клеток, набухание цитоплазмы, экс- центричное расположение ядер клеток. Указанные изменения более выражены в гепатоцитах на периферии печеночных долек, менее выражены в центролобулярной зоне долек (50–80 %, степень стеато- за – II–III) (рисунок 2). Описанная структурная реорганизация пече- ни подтверждает развитие стеатоза у животных и адекватность ис- пользованного способа моделирования данного заболевания. В пе- ченочной ткани лабораторных животных группы «Стеатоз+ДП» также обнаруживаются гепатоциты с признаками мелкокапельной и очаговой крупнокапельной жировой дистрофии в виде накопления оптически пустых вакуолей в цитоплазме клеток, распространенной преимущественно на периферии печеночных долек. Однако доля таких гепатоцитов с признаками стеатоза существенно меньше – 20–40 %, степень стеатоза – I–II (рисунок 3). В печеночной ткани обеих групп животных воспалительно- клеточной инфильтрации в портальных трактах и в толще печеноч- ных долек не выявлялось, фиброз (очаговый портальный и мосто- видный) не прослеживался, признаки белковой дистрофии (по типу гидропической и гиалиново-капельной) в гепатоцитах отсутствовали. Для подтверждения наличия нейтральных липидов в цито- плазме гепатоцитов и уточнения степени стеатоза в группе «Стеа- тоз» пять образцов были также исследованы с помощью окраски замороженных срезов суданом III, без докраски гематоксилином и эозином (рисунок 4). При этом в цитоплазме гепатоцитов были обнаружены округлые вакуоли различных размеров оранжевато- желтого цвета, соответствующие нейтральным липидам (до 50–80 % объема паренхимы органа, степень стеатоза – II–III). В контроль- ных образцах определялись гепатоциты с эухромными центрально расположенными ядрами и эозинофильной цитоплазмой. В еди- ничных гепатоцитах (менее 5 %) выявлялись интрацитоплазмати- ческие оптически пустые вакуоли, более соответствующие ней- тральным липидам (степень стеатоза – 0) (рисунок 5). Рисунок 4 – Изменения в ткани печени группы «Стеатоз», гистологические срезы (увеличение ×400, окраска суданом III) Рисунок 5 – Ткань печени животных контрольной группы, гистологические срезы (увеличение ×400, окраска Данные статистического анализа при сравнении количества гепатоцитов при стеатозе у экспериментальных животных отра- жены в таблице 2. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение жи- вотным экстракта листьев Джинуры Покумбенс при моделировании жирового гепатоза замедляет формирование характерных для этого заболевания морфологических изменений в ткани печени. гематоксилином и эозином) При сравнении массы тела до начала эксперимента и по его окончании в каждой группе животных достоверных различий не Группа Контроль Стеатоз Стеатоз+ДП Доля гепатоцитов с стеатозом, % 3,5 ± 0,31,2 63,3 ± 6,51,3 31,4 ± 7,42,3 обнаружено, что подтверждает форму НАСП-БО в нашей экспе- риментальной модели. 3,75 (3,38–3,99) и 3,5 (3,3–3,6), соответственно) (р = 0,009). У животных, получавших ДП, этот показатель был ниже, чем в группе «Стеатоз», и практически не отличался от та- кового в группе контроля – 3,5 (3,4–3,9) %. Таблица 2 – Количество гепатоцитов при стеатозе у эксперимен- тальных животных (%) Однако массовый коэффициент печени был достоверно выше в группе «Стеатоз» по сравнению с груп- пой контроля – Примечание: р – значимость различий; 1 – различия статистически значимы в группах «Контроль» и «Стеатоз»; 2 – различия статистически значимы в группах «Контроль» и «Стеатоз+ДП»; 3 – различия статисти- чески значимы в группах «Стеатоз» и «Стеатоз+ДП». По данным лабораторного исследования биохимические пока- затели (трансаминазы, маркеры холестаза, общий белок, альбумин и глюкоза) в группе животных «Стеатоз» не имели значимых разли- чий от группы «Контроль». При сравнительном анализе показателей липидограммы обнаружено, что при формировании стеатоза печени у животных второй группы развивается дислипидемия, проявляю- щаяся статистически значимо более выраженными триглицериде- мией (р1–2 = 0,012), ЛПОНП-емией (р1–2 = 0,008) и статистически значимым снижением концентрации ЛПВП (р1–2 = 0,001). Курсовое введение экстракта ДП не оказало существенного влияния на мета- болизм липидов. Можно отметить лишь тенденцию к снижению содержания триглицеридов и ЛПОНП в плазме крови животных, получавших ДП, по сравнению с группой «Стеатоз» (р2–3 = 0,064 и р2–3 = 0,057 соответственно) (таблица 3). При проведении сравнительного анализа содержания IL-6 в сыворотке крови животных разных групп установлено, что при моделировании стеатоза печени концентрация этого цитокина статистически значимо увеличивается по сравнению с контроль- ными данными (р = 0,006), однако уровень этого цитокина ока- зался ниже уровня чувствительности, указанного в наборе. При этом введение ДП не оказало влияния на содержание IL-6. Таблица 3 – Биохимические показатели крови животных в исследуемых группах, Me (Q1–Q3) Показатель Группа 1 (К), Группа 2 (С), Группа 3, р n = 9 n = 9 n = 7 (С+ДП) Общий холесте- рин (ммоль/л) 2,0 (1,6–2,1) 1,63 (1,42–2,08) 1,4 (1,0–1,7) р1–2 = 0,185 р1–3 = 0,004 р2–3 = 0,185 Триглицериды (ммоль/л) 1,5 (1,2–2,3) 3,20 (1,86–5,00) 1,9 (0,7–2,6) р1–2 = 0,012 р1–3 = 0,711 р2–3 = 0,064 ЛПНП (ммоль/л) 0,6 (0,5–0,8) 0,59 (0,51–0,66) 0,5 (0,4–0,7) р1–2 = 0,270 р1–3 = 0,064 р2–3 = 0,290 ЛПВП (ммоль/л) 1,0 (1,0–1,2) 0,75 (0,66–0,91) 0,7 (0,4–1,0) р1–2 = 0,001 р1–3 = 0,002 р2–3 = 0,672 ЛПОНП (ммоль/л) 0,7 (0,6–1,0) 1,45 (0,84–2,27) 0,9 (0,3–1,2) р1–2 = 0,008 р1–3 = 0,459 р2–3 = 0,057 Примечание: р – значимость различий; здесь и в таблице 4 К – кон- трольная группа; С – группа «Стеатоз», С+ДП – группа «Стеатоз+Д», циф- ры 1–3 соответствуют порядковому номеру группы. При оценке результатов исследований системы гемостаза у животных группы «Стеатоз» обнаружено статистически значимое изменение показателей, отражающих активность плазменного звена по внешнему механизму свертывания, по сравнению с контрольны- ми данными: удлинение ПВ (р1–2 = 0,034), свидетельствующее о снижении активности внешнего механизма свертывания крови, а именно активности факторов протромбинового комплекса (факто- ров II, VII, X, V), синтезирующихся в печени (таблица 4). В группе животных, принимавших экстракт листьев ДП, на- блюдаются аналогичные изменения, при этом статистически зна- чимых различий ПВ у животных 2-й и 3-й групп не обнаружено. Применение экстракта ДП вызвало положительную динамику теста АЧТВ: cтатистически значимое уменьшение АЧТВ по сравнению с группой «Стеатоз» (р2–3 = 0,0001), наряду с отсутст- вием достоверных различий с контролем (р1–3 = 0,072), на наш взгляд, можно расценивать как положительное влияние ДП на функциональную активность гепатоцитов. Статистически значи- мых различий показателей первичного звена гемостаза у живот- ных разных групп не обнаружено. Корреляционный анализ лабо- раторных параметров в группе животных «Стеатоз» показал зна- чимые взаимосвязи функциональных печеночных тестов с метаболическими показателями, корреляции параметров гемоста- за с маркерами цитолиза, холестаза и липидного обмена. Таблица 4 – Показатели системы гемостаза у животных, Me (Q1–Q3) Показатель Группа 1 (К) Группа 2 (С) Группа 3 р n = 9 n = 9 n = 7 (С+ДП) АЧТВ, с 35,3 (32,4–37,1) 38,30 (37,92–39,50) 33,2 (31,3–33,9) р1–2 = 0,181 р1–3 = 0,072 р2–3 = 0,0001 ПВ, с 19,8 (19,1–20,4) 20,90 (20,20–22,10) 21,9 (21,7–22,9) р1–2 = 0,034 р1–3 = 0,001 р2–3 = 0,239 ТВ, с 72,8 (67,9–80,1) 76,10 (67,90–83,12) 70,2 (67,1–71,5) р1–2 = 0,364 р1–3 = 0,077 р2–3 = 0,100 Примечание: р – значимость различий. Таким образом, на модели фруктозоиндуцированного стеатоза, являющегося эквивалентом формы НАСП-БО, установлено, что ве- дущими звеньями патогенеза неалкогольного жирового гепатоза являются: нарушение липидного обмена и печеночная коагулопа- тия. Морфологические изменения печеночной ткани проявляются жировой дистрофией и гепатомегалией. Курсовое внутрижелудоч- ное введение экстракта листьев ДП экспериментальным животным с стеатозом оказывает гепатопротекторный эффект, препятствуя фор- мированию гепатомегалии и характерных для стеатоза морфологи- ческих изменений в ткани печени, что позволило уточнить особен- ности патогенеза фруктозоиндуцированного стеатоза печени (НАСП-БО) и обосновать в эксперименте саногенетический гепато- протекторный эффект ДП (рисунок 6). Рисунок 6 – Особенности патогенеза НАСП-БО по результатам экспериментального исследования и точки приложения ДП (Х) Исследование пациентов с неалкогольным стеатозом пе- чени на фоне ожирения и вторичным стеатозом с вирусным поражением печени. Картина клинической симптоматики в обе- их группах была схожа. Жалобы предъявляли от 10 до 30 % па- циентов. Стоит отметить, что астенический и болевой синдромы чаще регистрировались у пациентов с вторичным СП. Гепатоме- галия наблюдалась у 20 % лиц в группе с НАСП-0 и больных с вирус-ассоциированным стеатозом. По данным инструменталь- ных методов у пациентов обеих групп имелись признаки стеатоза печени, у лиц с вторичным СП регистрировался фиброз 1–2-й ста- дии. Гипертоническая болезнь отмечалась у 56 % больных НАСП- О, сахарный диабет 2-го типа – у 19 %. Ожирение I степени имели 42 % пациентов с НАСП, II степени – 35 %, III степени – 23 %. Распределение по генотипам вируса в группе с вторичным СП было следующим: 12 лиц (50 %) с генотипом НСV-3, 8 (33 %) имели генотип НСV-1 и 4 (16 %) – НСV-2. Биохимические маркеры цитолиза и холестаза у пациентов обеих групп находились в пределах референсных значений набо- ров. У всех лиц с НАСП-О имелись признаки ожирения разной степени, ИМТ равнялся в среднем 37,2 ± 2,6 (р = 0,001). В группе с вторичным стеатозом на фоне вирусного поражения печени ИМТ в среднем был 25,5 ± 2,5, что тоже превышало данные кон- троля (р = 0,002). Но стоит отметить, что в этой группе большая часть пациентов (85 %) имели показатели ИМТ до 24,9 кг/м2, что по ВОЗ соответствует нормальной массе тела. У 15 % были по- вышены значения ИМТ в диапазоне от 24,9 до 29,0 кг/м2. Липидный спектр у пациентов обеих исследуемых групп достоверно отличался от контрольных данных, регистрировались: гипертриглицеридемия, снижение ЛПВП, повышение ЛПОНП. Более выраженная дислипидемия наблюдалась у лиц с НАСП-О в сочетании с гиперинсулинемией, повышением индекса НОМА- IR, уровня лептина и С-пептида (таблица 5). Таблица 5 – Метаболические показатели в исследуемых группах, Me (Q1–Q3) Показатель Глюкоза, ммоль/л ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л ЛПВП, ммоль/л ЛПНП, ммоль/л ЛПОНП, ммоль/л ИА Инсулин, мкМЕ/мл НОМА-IR С-пептид, нг/мл Лептин, нг/мл Контроль (n = 20) 4,7 (4,4–5,1) 4,4 (3,4–5,0) 0,9 (0,8–1,3) 1,6 (1,5–1,8) 2,8 (2,3–3,2) 0,4 (0,3–0,6) 1,8 (1,5–1,9) 7,7 (6,2–7,8) 1,6 (1,5–1,7) 1,1 (0,8–1,9) 1,8 (1,2–2,8) НАСП-О (n = 52) 5,0 (4,6–6,0) 5,4 (4,7–6,0)1,3 1,4 (0,8–2,0)1,3 1,3 (1,1–1,6)1 3,3 (2,8–3,8)1,3 0,9 (0,7–1,0)1,3 2,9 (2,5–3,4)1,3 13,3 (9,3–18)1,3 3,1 (2,4–4,3)1,3 2,8 (2,0–3,6)1 8,8 (6,3–14,1)1,3 Вторичный СП (n = 24) 4,8 (4,1–5,4) 4,6 (4,3–5,4) 1,2 (1,0–1,6)2 1,3 (1,1–1,6)2 2,8 (2,4–3,1) 0,6 (0,5–0,7)2 2,6 (2,1–3,6)2 6,3 (5,1–8,4) 1,93 (1,2–3)2 3,1 (2,3–4,3)2 2,8 (1,5–6,1)1 Примечание: р – значимость различий; 1 – различия статистически значимы в группах контроль и НАСП-О; 2 – различия статистически зна- чимы в группах контрольной и вторичного СП; 3 – различия статистиче- ски значимы в группах НАСП-О и вторичного СП. Индекс HSI у практически здоровых лиц был менее 30, что исключает стеатоз. В группах с НАСП-О и вторичным СП значе- ния данного показателя превышали 30, что подтверждает наличие стеатоза в обеих группах больных. При этом показатели индекса HSI у пациентов с НАСП-О были выше значений группы с вто- ричным СП, что свидетельствует о более выраженном жировом поражении печени. Таким образом, расчетный индекс HSI пока- Таблица 6 – Показатели гемостаза в исследуемых группах, Me (Q1–Q3) Показатель Агрегация с коллагеном, % Агрегация с ристоцетином, % Агрегация с АДФ, % ФВ, % АЧТВ, с ТВ, с Контроль (n = 20) 64,0 (58,8–69,3) 69,2 (60,8–75,3) 59,4 (47,3–64,0) 78,1 (55,4–83,8) 28,0 (28,0–29,0) 12,0 (12,0–12,8) НАСП-О (n = 52) 43,5 (23,5–54,0)1 74,5 (64,3–81,0)1 51,0 (37,8–60,8)1 94,0 (75,8–105,8)1 30,6 (29,7–31,3)1 27,0 (26,3–27,8)1,3 Вторичный СП (n = 24) 42,0 (30,0–62,0)1 92,1(69,5–96,7)2,3 42,0 (36,0–54,0)2. 93,5(72,1–103,5)2 32,6 (30,6–36,0)2 19,0 (17,8–19,9)2 зывает наличие СП в обеих исследуемых группах пациентов, бо- лее выраженный у пациентов с НАСП на фоне ожирения. Индекс фиброза в группе контроля варьировался в интервале от 0 до 0,5, что исключает ФП. Значения ИФ у 67 % пациентов с НАСП-О были менее 0,5, что свидетельствует об отсутствии при- знаков ФП. При этом у 23 % обследованных этой группы ИФ был более 0,5 (от 0,56 до 1,2), что соответствовало начальной стадии фиброза. У всех пациентов с вторичным СП данный индекс пре- вышал 0,5 (от 0,6 до 1,5) и соответствовал умеренной стадии фиброза. У обследуемых всех групп расчетный индекс APRI был менее 0,5, что исключает значимый фиброз и цирроз печени. Примечание: р – значимость различий; 1 – различия статистически значимы в группах контроль и НАСП-О; 2 – различия статистически значимы в группах контрольной и вторичного СП; 3 – различия стати- стически значимы в группах НАСП-О и вторичного СП. Количество тромбоцитов в обеих группах значимо не отлича- лось от контрольных данных. У пациентов с НАСП-О и вирус- ассоциированным СП наблюдалось снижение агрегации с коллаге- ном (р = 0,002 и р = 0,04 соответственно) и с АДФ (р = 0,02 и р = 0,03 соответственно). При этом агрегация тромбоцитов с ристоцетином и функциональная активность ФВ, напротив, при НАСП-О (р = 0,001 и р = 0,01) и вторичном стеатозе (р = 0,001 и р = 0,001) была выше, чем в контрольной группе. При анализе показателей коагуляцион- ного гемостаза в обеих группах со стеатозом наблюдалось неболь- шое удлинение АЧТВ в сравнении с контрольными данными (р = 0,003 Показатель ФНО-α, пг/мл ИЛ-6, пг/мл ВЭФР, пг/мл Контроль (n = 20) 0,0 (0,0–0,0) 0,0 (0,0–0,0) 86,7 (10,7–175,1) НАСП-О (n = 52) 1,1 (0,0–2,1)1 1,0 (0,0–2,2)1 184,6 (94,8–291,7)1 Вторичный СП (n = 24) 2,1 (0,9–3,1)2,3 2,2 (0,4–7,8)2.,3 365(232,8–617,3)2.,3 и р = 0,002), но при этом не выходило за рамки референсных значе- ний набора (24–38 с). При этом показатель ТВ был значимо удлинен у пациентов с НАСП-О и вторичным стеатозом в сравнении с прак- тически здоровыми лицами (р = 0,001 и р = 0,001 соответственно), что может свидетельствовать о нарушении синтетической функции печени (таблица 6). По результатам иммуноферментного исследования у паци- ентов обеих групп было зарегистрировано повышение сыворо- точных концентраций провоспалительных цитокинов и ВЭФР, более значимое у лиц с вторичным стеатозом (таблица 7). Таблица 7 – Концентрации цитокинов в исследуемых группах, Me (Q1–Q3) Примечание: р – значимость различий; 1 – различия статистически значимы в группах контроль и НАСП-О; 2 – различия статистически значимы в группах контрольной и вторичного СП; 3 – различия стати- стически значимы в группах НАСП-О и вторичного СП. Корреляционный анализ в группе с НАСП-О показал значимые взаимосвязи биохимических параметров с метаболическими показа- телями и расчетными индексами HSI, ИФ и APRI, корреляции пока- зателей гемостаза с маркерами цитолиза, ЭД, холестаза и липидного обмена. В группе с вирус-ассоциированным стеатозом биохимиче- ские маркеры коррелировали с концентрацией цитокинов и индек- сами стеатоза и фиброза, а параметры гемостаза с биохимическими тестами, метаболическими маркерами, цитокинами и ВЭФР. Анализ результатов исследования, полученных в экспери- ментальной и клинической части при стеатозе печени разного генеза, выявил сходные изменения липидного спектра и биомет- рических характеристик печени (таблица 8). В рамках данного исследования методом множественной регрессии была разработана математическая модель диагностики стеатоза печени, формула для расчета которого выглядит сле- Показатель Биометрия печени НАСП-О Гепатомегалия у 20 % Вторичный Гепатомегалия у 20 % дующим образом (Решение о выдаче патента от 05.08.2021 г. по заявке No 2021106422/14(013887)): ИС = –1,2390 + 0,0575·ИМТ + 0,0064·ГГТП + + 0,0006·ВЭФР + 0,0001·IL6. Таблица 8 – Сравнительная оценка результатов экспериментального и клинического исследования Экспериментальная модель НАСП-БО Фруктозоинду- цированный Гепатомегалия Клинические модели СП Маркеры цитолиза и холестаза Норма Норма Норма Липидный спектр и метабо- лические параметры ТГ↑↑ ЛПВП↓ ЛПОНП↑ ХС↑, ТГ↑↑, ЛПНП↑, ЛПОНП↑↑, ИА↑↑; ЛПВП↓ инсулин↑↑, НОМА-IR↑, лептин↑↑ С-пептид↑ ТГ↑, ЛПОНП↑, ИА↑; ЛПВП↓, НОМА-IR↑, лептин↑ С-пептид↑ Цитокины Норма IL-6 ↑ ФНО-α ↑ IL-6 ↑↑ ФНО-α ↑↑ Маркеры повреждения эндотелия Норма ВЭФР↑ ФВ↑ ВЭФР↑↑ ФВ↑ Параметры гемостаза Удлинение ПВ Нарушение агрегации тромбоцитов удлинение ТВ Нарушение агре- гации тромбоци- тов удлинение ТВ При значении индекса стеатоза (ИС), равном 0,5 и более, ди- агностируют наличие НАСП, при ИС менее 0,5 – отсутствие НАСП. Диагностическая чувствительность данной математиче- ской модели составила 95,2 %, специфичность – 97,0 %. Для каж- дого параметра модели оценивали предсказательную ценность по шкале значений площади под ROC-кривой (AUC) (рисунок 7). Также были рассчитаны пороговые значения для каждого показа- теля модели, которые составили: ИМТ более 24,2, ГГТП более 18 Ед/л, ВЭФР более 138 пг/мл и IL-6 более 0 пг/мл. Рисунок 7 – ROC-кривая для показателей индекса стеатоза Валидация математической модели расчета ИС была прове- дена на новой группе пациентов с НАСП в количестве 20 человек (10 мужчин и 10 женщин), средний возраст 44,7 ± 9,6 г., из кото- рых 45 % имели форму НАСП-О, а 55 % – нормальный и повы- шенный ИМТ (форма НАСП-БО). У 19 пациентов (95 %) данной группы значения ИС были более 0,5 (в диапазоне от 0,5 до 1,5), что свидетельствует о наличии стеатоза печени по критериям мо- дели. Диагностическая чувствительность модели на новой группе больных составила 95 %, что доказывает высокую эффективность предложенного метода диагностики стеатоза печени и возмож- ность его использования как у лиц с ожирением, так с нормаль- ной и повышенной массой тела. При исследовании особенностей ОНП гена TNF-α в позиции rs1800629 генотип АА гена TNF-α в регионе -308G/A значимо чаще регистрировался у пациентов с НАСП-О, чем в популяции здоровых (7,69 и 0 % соответственно; χ2 = 6,05; р = 0,04; ОR = 1,76) (рисунок 8). При оценке ОНП гена VEGFA (G-634C) в позиции rs2010963 нами было установлено, что генотип GС преобладал у здоровых в 35,38 % (χ2 = 7,71; р = 0,04). Однако вариант СС значимо чаще встречался у пациентов с НАСП-О – в 28,85 % случаев (ОR = 3,36), а у здоровых обнаруживался лишь в 10,77 % (χ2 = 6,18; р = 0,02). Аллель С гена VEGFA в регионе -634G/C у пациентов с НАСП-О регистрировалась в 54,81 %, что было значимо выше, чем в контрольной группы (χ2 = 6,83; р = 0,01; ОR = 2,00) (рисунок 9). Таким образом, генетическими факторами риска развития НАСП у пациентов с ожирением в Пермском крае следует счи- 26 тать носительство АА-вариантов гена TNF-α (G308A) и СС- варианта гена VEGFA (G634С). По полиморфизму гена IL-6 в ре- гионе -174G/С (rs1800795) значимых различий не было выявлено. Рисунок 8 – Аллельные вариации гена TNF-α (G-308A) у доноров и пациентов с НАСП Рисунок 9 – Аллельные вариации гена VEGFA (G-634C) у доноров и пациентов с НАСП При оценке зависимости по таблице сопряженности в группе с НАСП-О была выявлена взаимосвязь полиморфизма региона -308G/A гена TNF-α с активацией выработки цитокинов ФНО-α и IL-6 (Ki = 0,558; р = 0,043 и Ki = 0,597; р = 0,042 соответственно), а также ассоциация полиморфизма региона -634G/C гена VEGFA с продукцией ФВ (Ki = 0,642; р = 0,045), что может приводить к прогрессированию иммуновоспалительного синдрома и дис- функции эндотелия в группе носителей. Оценка индивидуального генетического профиля здоровых лиц и пациентов с НАСП-О проводилась с использованием балльной шкалы со следующими значениями: 0 – по трем полиморфизмам пациент гомозиготен по протективным аллелям; 1 – гетерозиготен по одному из двух ге- нов; 2 – гетерозиготен по двум генам; 3 – обследуемый имеет обе аллели риска по одному гену, гомозиготен по протективным алле- лям по другому гену; 4 – по одному гену у обследуемого имеются обе аллели риска, по другому гену обследуемый гетерозиготен; 5 – обследуемый по обоим генам гомозиготен по аллелям риска TNF-α (АА) / VEGFA (СС). По предложенной шкале при наличии у здоровых доноров 0–1 балла риск развития НАСП оценивается как низкий, 2–3 балла – умеренный, 4–5 баллов – высокий. При выявле- нии у пациентов с ожирением 0–1 балла, риск прогрессирования НАСП оценивается как низкий, 2–3 балла – умеренный, 4–5 баллов – высокий. В группе здоровых более половины (51 %) имели низкий риск развития НАСП (0–1 балл по шкале), 38 % – умеренный (2–3 балла), 11 % – высокий (4 балла) (таблица 9). Таблица 9 – Генетический профиль здоровых и пациентов с НАСП-О Группа В группе пациентов 25 % имели низкий риск прогрессирова- ния НАСП (0–1 балл), почти половина больных (44 %) – умерен- ный (2–3 балла), а треть обследуемых (31 %) – высокий риск (4–5 баллов) по шкале. ВЫВОДЫ 1. Фруктозоиндуцированная модель стеатоза адекватно от- ражает механизмы развития НАЖБП и открывает дополнитель- ные возможности для дальнейшего изучения патогенеза и разра- ботки методов патогенетической терапии этого заболевания. 2. При НАСП-О и у пациентов с вторичным вирус-ассоци- ированным стеатозом печени общность патофизиологических механизмов заключается в активации провоспалительных цито- кинов, повреждении эндотелия, изменениях в системе гемостаза, более выраженных при вторичном стеатозе на фоне вирусного поражения печени. Метаболические изменения и дислипидемия более значимы при стеатозе у лиц с ожирением. 3. Надежным и удобным критерием диагностики НАСП яв- ляется применение формулы расчета ИС с использованием пара- метров: ИМТ, ГГТП, ВЭФР и IL-6. 4. Носительство генотипов АА гена TNF-α в регионе -308G/A и СС гена VEGFA в регионе -634G/C является фактором риска развития НАСП-О. 5. На эксперимантальной модели фруктозоиндуцированного стеатоза печени доказан гепатопротективный эффект экстракта Баллы 012345 Доноры,% 9 42 35 3 11 – НАСП-О,% 2 23 40 4 29 2 листьев Джинуры Прокумбенс, который проявляется в замедле- нии процесса формирования характерных для стеатоза морфоло- гических и биометрических изменений печени. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Исследование полиморфизма генов TNF-α (G-308A) и VEGFA (G-634C) следует использовать в качестве оценки риска развития НАСП-О у жителей Пермского края. Предикторами раз- вития СП следует считать носительство АА-варианта гена TNF-α (G308A) и СС-варианта гена VEGFA (G634С). 2. Анализ индивидуального генетического профиля с ис- пользованием генетических маркеров TNF-α в регионе -308G/A и VEGFA в регионе -634G/C позволяет провести раннюю неинва- зивную диагностику риска развития НАСП у здоровых и опреде- лить риск возможного прогрессирования данного заболевания у пациентов с ним: при выявлении 0–1 балла риск оценивается как низкий, 2–3 балла – умеренный и 4–5 баллов – высокий. 3. Для диагностики НАСП оптимально использовать расчет ИМТ, определение в сыворотке крови уровня ГГТП, концентра- ции ВЭФР и IL-6, и рассчитывать ИС с чувствительностью 95,2 % и специфичностью 97,0 %. При ИС, равном 0,5 и более, диагности- руют наличие НАСП, при ИС менее 0,5 – отсутствие. 4. Экстракт листьев Джинуры Прокумбенс рекомендуется для дальнейшего углубленного доклинического исследования в качестве растительного гепатопротектора при НАСП.