Оптимизация лабораторной диагностики наследственного сфероцитоза

Материалы и методы исследования
Исследование было выполнено на базе центральной клинико-
диагностической лаборатории федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западный
государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
В исследование были включены 76 пациентов (39 мужчин, 37 женщин)
различных возрастных групп (от 2 лет до 61 года, среднее 25,8 ± 14,5 года,
медиана 25,0), находившихся на обследовании и лечении в СПб ГБУЗ
«Консультативно-диагностический центр для детей», ФГБУ «Российский НИИ
гематологии и трансфузиологии ФМБА России» и ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И.
Мечникова Минздрава России в период с октября 2015 г. по ноябрь 2018 г.
На момент исследования пациенты проживали в г. Санкт-Петербурге,
обследованную группу составили пациенты с подозрением на наличие или с
подтвержденным ранее диагнозом «наследственный сфероцитоз», другого типа
ГА, а также «здоровые» лица (с отсутствием гематологических заболеваний,
которые были определены в I или II группу здоровья).
Из исследования были исключены дети младше 6 месяцев, поскольку в
этот период наличие микросфероцитов считается вариантом нормы [Румянцев
А.Г., 2015].
По результатам проведенного лабораторного обследования пациенты
были разделены на 3 группы: основную, группу сравнения и контрольную.
Основную группу составили 18 пациентов с наследственным
сфероцитозом (по МКБ-10: D58.0: ахолурическая (семейная) желтуха,
врожденная (сфероцитарная) гемолитическая желтуха, синдром Минковского-
Шоффара). Пяти пациентам в связи с тяжелым течением заболевания ранее
была проведена спленэктомия.
Группа сравнения (n=32) – это гетерогенная группа, включающая
пациентов с различными типами несфероцитарных ГА.
Контрольную группу составили 25 человек с отсутствием
гематологических заболеваний.
Характеристика групп пациентов, вошедших в исследование,
представлена в таблице 1.
Таблица 1. Демографическая характеристика групп больных
Основная
Контрольная
группаГруппа сравнения
Демографическийгруппа
(наследственный (гемолитические
показатель(«здоровые»
сфероцитоз,анемии, n=32)
лица, n=25)
n=18)
медиана25,527,020,0
возраст
мин-макс6 – 618 – 562 – 61
мужской91613
пол
женский91612
Всем пациентам однократно были проведены гематологические и
биохимические исследования. Гематологические исследования включали
клинический анализ крови (КАК); расчет интегральных эритроцитарных
параметров (Hb/RDW, MCHC/RDW); микроскопия мазка периферической
крови с описанием морфологии эритроцитов; расчет морфометрических
параметров эритроцитов; биохимические – определение скорости лизиса
эритроцитов с использованием глицеринового теста; тест на связывание
красителя эозин-5-малеимида (ЭМА-тест).
Клинический анализ крови выполняли не позднее 6 часов от момента
забора крови на 3 DIFF гематологическом анализаторе Sysmex KX- 21N
(Sysmex, Япония).
Оценивали концентрацию гемоглобина (Нb, г/л), количество эритроцитов
(RBC, ×1012/л), средний объем эритроцита (MCV, фл), среднее содержание
гемоглобина в отдельном эритроците (MCH, пг), среднюю концентрацию
гемоглобина в эритроците (MCHC, г/л), ширину распределения эритроцитов по
объему (RDW, %), гематокрит (HCT, %). Для оценки результатов использовали
возрастные референтные значения. Также в рамках КАК рассчитывали
интегральные эритроцитарные индексы Hb/RDW и MCHC/RDW, так как по
данным Rocha et.al. (2012) они имеют большую специфичность и
чувствительность для скрининга НС, чем эритроцитарные параметры,
полученные при помощи гематологического анализатора.
Мазки периферической крови фиксировали в течение 2-3 минут в
фиксаторе Май-Грюнвальд, затем красили методом погружения в 10% раствор
красителя Романовского-Гимзы в течение 10 минут.
Расчет морфометрических параметров эритроцитов проводился методом
микроскопии окрашенных мазков периферической крови при помощи АПК
ВидеоТесТ-Морфология. АПК состоит из микроскопа с встроенной системой
ввода изображений, компьютера и соответствующего программного
обеспечения (рисунок 1). Расчет морфометрических параметров производился
по формулам, приведенным в таблице 2.

абв
Рисунок 1. Этапы анализа изображений мазков периферической крови с
использованием АПК «ВидеоТесТ-Морфология». а) загрузка изображения в
программу, выделение эритроцитов, б) распределение эритроцитов на классы в
зависимости от диаметра (микроциты (4,0 – 6,9 мкм), нормоциты (6,9 – 8,0
мкм), макроциты (8,0 – 9,5 мкм), мегалоциты (9,5 – 11,0 мкм)), в) результат.
Таблица 2. Параметры и формулы, используемые для расчета
эритроцитарных параметров аппаратно-программным комплексом.
ПоказательФормулы для Размерность Референтные
расчетазначения
Измеряемые параметры
Средняя площадь эритроцитовS эр.   2 мкм2-
Средний диаметр эритроцитовDэр.  2мкм7,2 – 7,5
Расчетные параметры
Толщина эритроцитовT 
MCV мкм1,7 – 2,3
эр.
S

Индекс сферичностиRсф =
D-3,4  3,9
T

Определение скорости лизиса эритроцитов. Лизис эритроцитов
оценивали с помощью глицеринового теста. Регистрацию скорости разрушения
эритроцитов проводили на автоматическом биохимическом анализаторе
Sapphire-400 (США). Изменение оптической плотности (ОП) регистрировали в
течение 10 минут при 37°С (длина волны 625 нм).
Приготовление реактива: 11 мл (13,81 г) глицерина растворяли в 400 мл
фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с pH=6,85 и доводили объем до 1 л
дистиллированной водой. Реактив хранили при температуре 2 – 8 ˚С.
Ход определения: анализатором автоматически в кювету дозировалось
297 мкл реактива, нагревалось до температуры реакции, затем в ту же кювету
вносилось 3 мкл цельной крови. После перемешивания пробы незамедлительно
начиналась непрерывная регистрация снижения ОП в течение 10 минут.
Результат выражали в виде разницы между начальной и конечной ОП,
умноженной на 1000. Кроме того, скорость лизиса эритроцитов оценивали
визуально по форме графика изменения ОП со временем.
Тест на связывание красителя эозин-5-малеимида (ЭМА-тест) дает
возможность оценить целостность цитоскелета эритроцита путем связывания
флуоресцентного красителя эозин-5-малеимида с белком полосы 3 цитоскелета
эритроцита.
Исследование проводили в 5 этапов: отмывание эритроцитов, инкубация
с красителем эозин-5-малеимидом, отмывка эритроцитов от несвязавшегося
красителя, проявление красителя в ФСБ, измерение средней интенсивности
флюоресценции в процентах (СИФ). Эритроциты отмывали 3 раза в
физиологическом растворе: к 100 мкл цельной крови добавляли 1,5 мл
физиологического раствора, аккуратно перемешивали при помощи
лабораторного встряхивателя «Вортекс персональный V-1» (Biosan, Латвия, РУ
№ ФСЗ 2011/09797) и центрифугировали 5 минут при скорости центрифуги
1500 об/мин, повторяли 3 раза. Далее 10 мкл отмытых эритроцитов
инкубировали с 25 мкл красителя эозин-5-малеимида (флюоресцентный
краситель N-(5-Флуоресценил) малеимид (производство компании «Сигма»,
США) при комнатной температуре в темноте в течение часа. После инкубации
отмывку эритроцитов повторяли 2 раза для удаления несвязавшегося красителя.
После этого полученные эритроциты инкубировали 15 минут при комнатной
температуре в темноте с добавлением 600 мкл ФСБ (pH=7,0). Под воздействием
ФСБ флуоресценция связавшегося с белком эозин-5-малеимида проявляется.
Далее проводили измерение интенсивности флуоресценции с расчетом СИФ на
проточном цитометре FC500 (Beckman Coulter) с использованием программы
CXPanalysis по данным 50000 эритроцитов, гейтированных по параметрам
светорассеяния.
В каждой аналитической серии СИФ пациента с подозрением на наличие
НС сопоставляли с СИФ 3-х пациентов с отсутствием гематологических
заболеваний, при условии, что забор крови всех пациентов производился в один
день, пробы хранились в одинаковых условиях, анализ выполнялся
одномоментно.
В связи с нестабильностью красителя эозин-5-малеимид в разведенном
состоянии и отсутствием контрольных материалов, результат представляли, как
отношение СИФ пациента к сумме СИФ «здоровых» лиц в 1 аналитической
группе, выраженный в процентах.

Статистическую обработку полученных результатов производили с
использованием параметрических и непараметрических методов статистики.
Методы описательной статистики включали в себя оценку среднего
арифметического (M), стандартного отклонения (SD), медианы (Me), нижний
(25) и верхний (75) квартили. Для оценки нормальности распределения
применяли критерий Колмогорова-Смирнова (d). Для оценки межгрупповых
различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение,
применяли t-критерий Стьюдента, ранговый U-критерий Манна – Уитни.
Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы
принимали равным 0,05.
Диагностическую ценность исследуемых маркеров оценивали с помощью
построения характеристической кривой (ROC-кривая, Receiver Operating
Characteristic, ROC-curve), которая показывает отношение доли истинно
положительных результатов (чувствительность) к доле истинно отрицательных
случаев (специфичность). Точки наиболее оптимального расположения
пересечения на ROC-кривой положительных и отрицательных примеров
определяются как пороговые значения, или Сut-off. Для получения численного
значения клинической значимости теста, а также для сравнения двух тестов,
использовали показатель AUC (Area Under Curve), или значение площади под
характеристической ROC-кривой. Этот показатель оценивали по общепринятой
экспертной шкале, при которой интервал AUC 0,9 – 1,0 характеризует качество
модели как «отлично», 0,8 – 0,9 – как «очень хорошо», 0,7 – 0,8 – «хорошо», 0,6
– 0,7 «удовлетворительно» и 0,5 – 0,6 «неудовлетворительно». Статистическую
обработку материала выполняли с использованием программ прикладного
статистического анализа (Statistica for Windows, v. 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты исследования клинического анализа крови с расчетом
основных и интегральных эритроцитарных параметров
Использование гематологических анализаторов, основанных на принципе
Култера, обеспечивает расчет основных эритроцитарных параметров и
интегральных эритроцитарных индексов.
Результаты исследования основных эритроцитарных параметров в
группах представлены в таблице 3.

Таблица 3. Основные эритроцитарные параметры в группах. Приведены
медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили
ПоказательГруппы

НС (наследственныйГА (гемолитические«Здоровые»
сфероцитоз)анемии)лица
RBC, ×1012/л4,4(3,6; 5,1)4,6 (3,1; 5,1)4,6(4,3;4,7)
Hb, г/л133 (115; 149)**121,5(110;136,5)***137 (127;145)
MCV, фл83,3 (80,1; 87,7)79,7(71,2;88,7)83(82; 85,6)
MCH, пг30,7(29,40; 32,40)28,9(24,8;32,2)30(29,4; 31)
MCHC, г/л366,5(356; 373)**350,5(336,5; 363,5)364 (353; 367)
RDW, %16(14; 19,2)*15,2(13,8; 17,4)***13,3(13; 13,7)
Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни
*достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами НС и ГА ***достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» Данные, полученные с помощью гематологического анализатора Sysmex KX-21N, не выявили достоверных различий по большинству из приведенных в таблице параметров между группами пациентов, за исключением RDW, свидетельствующим о наличии анизоцитиоза. Далее нами изучались интегральные эритроцитарные индексы Hb/RDW и MCHC/RDW в группах (таблица 4). Также были проанализированы аналитические характеристики основных эритроцитарных параметров (рисунок 2а) и интегральных эритроцитарных индексов (рисунок 2б) с использованием ROC-анализа. Оценивали чувствительность и специфичность тестов (таблица 5). Значение AUC (площади под кривой) у эритроцитарных параметров, полученных с помощью гематологического анализатора, находилось в диапазоне 0,31 – 0,51, что позволило охарактеризовать качество тестов как «неудовлетворительно». Значение AUC (площади под кривой) у расчетных эритроцитарных индексов составило 0,808 для Hb/RDW и 0,800 для MCHC/RDW. Значение AUC позволило оценить клиническую значимость тестов: для индекса Hb/RDW как «хорошо» и для MCHC/RDW - «удовлетворительно». Чувствительность исследуемых расчетных эритроцитарных параметров составила 83,3% для Hb/RDW и 88,8% для MCHC/RDW, специфичность – 65,2% для Hb/RDW и 52,17% для MCHC/RDW. Таблица 4. Результаты анализа интегральных эритроцитарных параметров в группах. Приведены медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили ПоказательГруппы НСГА (гемолитические «Здоровые» (наследственныйанемии)лица сфероцитоз) Hb/MCHC0,37 (0,32;0,41)0,36 (0,31;0,39)0,38 (0,36;0,40) Hb/RDW7,84 (7,07;9,66)*8,02 (6,09; 9,75)**10,33 (9,38;10,89) MCHC/RDW22,55 (18,43;26,36)*22,9026,89 (19,56;25,09)**(25,75;27,95) Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» аб Рисунок 2. ROC-кривая для основных (а) и расчетных (б) эритроцитарных параметров. Таблица 5. Пороговые значения, чувствительность и специфичность расчетных эритроцитарных индексов, полученные в ходе исследования ПороговоеЧувствительностьСпецифичность значение MCHC/RDW≤ 24,388,8%52,17% Hb/RDW≤ 8,783,3%65,2% По данным литературы, параметры Hb/RDW, MCHC/RDW могут использоваться для выявления пациентов с НС при выполнении КАК. В нашем исследовании при сравнении основных и расчетных эритроцитарных параметров в основной группе (НС, n=18) и группе сравнения (ГА, n=32) ни один из параметров не оказался эффективным для скрининга НС. Это указывает на то, что описанные изменения связаны с изменением показателей Hb и RDW в КАК и могут быть при любом из типов ГА. Таким образом, использование данных, полученных при помощи гематологического анализатора и расчетных параметров Hb/RDW и MCHC/RDW дает возможность только предположить у пациента наличие одного из типов ГА, но не указывает на наличие именно НС. Морфометрические параметры эритроцитов. Анализ мазка крови с применением аппаратно-программного комплекса (АПК) позволяет с большей степенью установить различия в форме эритроцитов в количественной форме, что позволяет уточнить характер анемии (таблица 6). Как следует из представленных данных, анализ морфометрических параметров позволяет выявить достоверные различия в группах по всем изученнымпараметрам.Срединих наиболеезначимымидля дифференциальной диагностики микросфероцитарной анемии являются: толщина эритроцитов (Тэр), индекс сферичности эритроцитов (Rэр) и средний диаметр эритроцитов (Dэр) (таблица 7). Как видно из приведенных данных специфичность и чувствительность морфометрических параметров эритроцитов составили 100%. Это свидетельствует о том, что предложенный метод подходит для дифференцировки микросфероцитов от нормоцитов. Описанная методика не дает возможности автоматического описания изменения формы эритроцитов (пойкилоцитоза эритроцитов). Полученные нами результаты указывают на то, что измерение объема эритроцитов с помощью автоматизированного гематологического анализатора не должно и не может заменить собой полностью исследования их диаметра и толщины. Если исходить из фактов, свидетельствующих о том, что развитие анемии чаще всего сопровождается изменением формы эритроцитов – диаметра, толщины и объема, то следует признать целесообразным изучение всех трех показателей [Зенина М.Н., 2015]. Таким образом, использование в лабораториях систем анализа изображения позволяет при микроскопическом анализе выявлять параметры эритроцитов, необходимые для дифференциальной диагностики анемий. Таблица 6. Значения эритроцитарных показателей, полученных с помощью аппаратно-программного комплекса. Приведены среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD) Исследуемые параметрыНС«Здоровые» Значения (наследственлицар -ный сфероцитоз) Толщина эритроцитов микроцитов2,9±0,22,3±0,20,001 (Tмэр), мкм Толщина эритроцитов (Тэр)2,6 ± 0,32,1± 0,20,005 Индекс сферичности эритроцитов2,2± 0,22,8± 0,20,003 микроцитов (Rмэр) Индекс сферичности эритроцитов2,3 ± 0,13,7±0,30,005 (Rэр) Средний диаметр эритроцитов (Dэр)6,6 ± 0,27,5±0,20,005 Содержание микроцитов (% микр)68,7 ± 16,912,6± 6,7<0,001 Содержание нормоцитов (% норм)30,4 ± 16,572,9± 7,3<0,001 Содержание макроцитов (% макр)1,9± 1,214,5± 11,8<0,001 Таблица 7. Пороговые значения, чувствительность и специфичность морфометрических эритроцитарных параметров. ИндексыПороговое Чувствительность Специфичность значение Толщинаэритроцитов≥ 2,1100%100% (Тэр) Индекс сферичности (Rэр)≤ 2,3100%100% Диаметр эритроцитов (Dэр)≤ 6,2100%100% Изучение скорости лизиса эритроцитов с использованием глицеринового теста. Результаты глицеринового теста на определение скорости лизиса эритроцитов c кровью сразу после взятия в группах приведены в таблице 8. Чувствительность и специфичность теста составили 77% и 96% соответственно (рисунок 3). Таблица 8. Разность начальной и конечной ОП при проведении глицеринового теста c кровью сразу после взятия в группах. Приведены медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили ПоказательГруппы НС (наследственныйГА (гемолитические«здоровые» сфероцитоз)анемии)лица ГТ-0 (у.е.)949,5 (894,0; 1256,0)*952,5 (888,0;987,0)**573,0 (517,0;732,0) Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» Пороговое значение≥864 у.е. Чувствительность77,78% Специфичность96,00% Рисунок 3. ROC-кривая глицеринового теста, проводимого на крови сразу после взятия для выявления пациентов с НС. Глицериновый тест, проводимый с кровью сразу после взятия, не обладает достаточной чувствительностью для надежной диагностики НС. В связи с этим, тест повторили после 24 часовой инкубации при комнатной температуре. Полученные результаты приведены в таблице 9 и на рисунке 4. Чувствительность и специфичность теста составили 94% и 98,7% соответственно. Пороговое значение составило ≥ 968 у.е. Как видно из представленных данных инкубирование крови 24 часа при комнатной температуре позволило увеличить диагностическую значимость теста. Таблица 9. Разность начальной и конечной ОП при проведении глицеринового теста c инкубированной кровью в группах. Приведены медиана (Ме), нижний (25) и верхний (75) квартили ПоказательГруппы НС (наследственныйГА (гемолитические«здоровые» сфероцитоз)анемии)лица ГТ_инк1843 (1094;1957) */**/***965 (901;1000)586 (530;745) Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами НС и ГА ***достоверные различия (р<0,05) между группами ГА и «здоровые» Пороговое значение≥968 Чувствительность94,44 Специфичность98,7 Рисунок 4. ROC-кривая для глицеринового теста, проводимого с инкубированной кровью для основной группы (НС). Помимо количественной оценки скорости лизиса эритроцитов (в у.е.), возможна визуальная оценка графиков кинетики лизиса эритроцитов. Это позволяет оценить скорость лизиса при пограничных значениях ГТ, а также это важно для контроля протекающей в кювете реакции, поскольку такой график отображает изменение ОП в любую секунду теста. Примеры графиков, полученных с автоматического биохимического анализатора Sapphire-400 представлены на рисунках 5 А, Б, В. Изучение кинетики гемолиза эритроцитов у пациентов основной группы (НС) отчетливо показало наличие двух фаз: в начальный период, который у всех пациентов составлял от 50 до 100 с, снижение оптической плотности происходило быстрее, чем во второй. Лизис эритроцитов при выполнении глицеринового теста протекает быстрее у пациентов с НС по сравнению с иными видами ГА или здоровыми лицами. Данный феномен может быть обусловлен нестойкостью мембраны микросфероцитов, которые составляют значительную долю клеток эритроидного ростка в периферической крови больных НС. абв Рисунок 5. Графическое представление скорости лизиса эритроцитов у пациентов: А - основной группы (НС), Б – группы сравнения (ГА), В – контрольной группы («здоровые» лица) Следовательно, проведение глицеринового теста на определение скорости лизиса эритроцитов может использоваться для подтверждения наличия у пациента микросфероцитарной анемии. Тест на связывание красителя эозин – 5 – малеимида. Полученные значения СИФ (%) с использованием метода проточной цитометрии и красителя эозин-5-малеимида образцов крови пациентов всех групп и «здоровых лиц» представлены в таблице 10. Таблица 10. Средняя интенсивность флюоресценции для пациентов основной (НС), группы сравнения (ГА) и контрольной группы («здоровые» лица). параметрНСГА«здоровые» (наследственный(гемолитическиелица сфероцитоз)анемии) */** СИФ, %799697 Непараметрический ранговый U-критерий Манна Уитни *достоверные различия (р<0,05) между группами НС и «здоровые» **достоверные различия (р<0,05) между группами НС и ГА Чувствительность и специфичность теста составили 94,44% и 100% соответственно, что соответствует литературным данным [Stoya B., 2006] (рисунок 6). Пороговое значение≤ 86% Чувствительность94,44% Специфичность100,00% Рисунок 6. ROC-кривая для показателя СИФ. Полученные данные легли в основу лабораторного алгоритма диагностики наследственного сфероцитоза, который предполагает 3 этапа (рисунок 7). 1 этап: скрининг 2 этап: подтверждение наличия микросфероци тов 3 этап: подтверждение наследственного сфероцитоза Рисунок 7. Алгоритм лабораторной диагностики наследственного сфероцитоза. Первый этап - это клинический анализ крови, в результате которого на основании двух расчетных индексов (Hb/RDW и/или MCHC/RDW) при первичном обследовании групп клинически бессимптомных лиц можно выделить группу пациентов с высокой вероятностью наличия наследственного сфероцитоза. На втором этапе у пациентов с подозрением на НС проводится морфометрия эритроцитов в окрашенных мазках периферической крови с использованием АПК и/или определение скорости лизиса эритроцитов с инкубированной кровью в глицериновом тесте для подтверждения наличия сфероцитов. Третий этап – это подтверждение наследственного характера заболевания (сфероцитоза) по оценке мембраны эритроцитов с помощью теста на связывание красителя эозин-5-малеимида. Предложенная схема позволит выявить латентные формы НС и провести дифференциальный диагноз гемолитических анемий, протекающих с появлением микросфероцитов в крови. По нашему мнению, предложенный лабораторный алгоритм выявления пациентов с НС может использоваться для выявления пациентов с НС при проведении клинического анализа крови в централизованных клинико- диагностических лабораториях (ЦКДЛ). Он не требует дополнительных финансовых вложений, поскольку эритроцитарные индексы MCHC/RDW и Hb/RDW рассчитываются с использованием эритроцитарных параметров, полученных с помощью гематологического анализатора. При этом алгоритм позволит провести как скрининг наиболее распространенного типа гемолитической анемии, так и подтверждение диагноза наследственного сфероцитоза при наличии проточного цитометра при помощи теста на связывание красителя эозин-5-малеимида. Внедрение предложенных интегральных эритроцитарных индексов в ЛИС и данного алгоритма в лабораторную практику медицинских организаций позволит проводить направленный поиск пациентов с НС и обеспечить создание реестра таких пациентов. Ранняя диагностика НС позволит снизить риск ошибок при дифференциальной диагностике различных видов гемолитических анемий и необоснованную лекарственную терапию. Кроме того, своевременная постановка диагноза НС освободит пациента и медицинскую организацию от ненужных дополнительных обследований. Таким образом, разработанный лабораторный алгоритм диагностики позволит у пациентов с высокой вероятностью НС провести дифференциальную диагностику с другими видами гемолитических анемий и установить наличие наследственного сфероцитоза, своевременно назначить соответствующую терапию, тем самым решить важную социально-значимую задачу по улучшению качества медицинской помощи данной категории пациентов. ВЫВОДЫ 1.Данные клинического анализа крови, в результате которого на основании эритроцитарных и двух расчетных индексов (MCHC/RDW и Hb/RDW), а также наличия микросфероцитов в окрашенных мазках крови можно выделить группу пациентов, требующих дальнейшего проведения дифференциального диагноза. 2.Использование в клинико-диагностических лабораториях систем анализа изображения позволяет при микроскопическом анализе выявлять параметры эритроцитов, необходимые для дифференциальной диагностики анемий. 3.Проведение глицеринового теста для определения скорости лизиса эритроцитов с использованием инкубированной крови может использоваться для подтверждения наличия у пациента микросфероцитарной анемии. 4.Высокотехнологичный метод проточной цитометрии позволяет выявлять сохранность структуры цитоскелета эритроцитов в 100% случаев наследственного сфероцитоза. 5.Разработанный лабораторный алгоритм диагностики у пациентов с высокой вероятностью наследственного сфероцитоза позволяет провести дифференциальную диагностику с другими видами гемолитических анемий и установить наличие наследственного сфероцитоза. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для врачей клинической лабораторной диагностики, гематологов, педиатров, терапевтов: 1.Одновременно с оценкой эритроцитарных параметров, полученных при помощи гематологического анализатора, рекомендуется рассчитывать интегральные эритроцитарные индексы Hb/RDW, MCHC/RDW (с использованием значения Hb в г/л). 2.Пациентам с микросфероцитарной анемией следует оценивать морфометрические показатели эритроцитов и скорость лизиса эритроцитов. 3.Если у пациента выявлена высокая скорость лизиса эритроцитов, то следует проводить исследование связывания красителя эозин – 5 – малеимида. 4.Диагноз НС подтверждается тестом на связывание эозин – 5 - малеимида. 5.Для целенаправленного автоматического поиска пациентов с высокой вероятностью наследственного сфероцитоза рекомендуется внедрение интегральных эритроцитарных индексов в лабораторные информационные системы (ЛИС). ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Разработанные методические подходы позволяют осуществлять изучение особенностей выявления других вариантов ГА, а также разработку лабораторных подходов для подтверждения диагноза НС. В качестве перспектив разработки темы можно рассматривать внедрение предложенного алгоритма, как возможность выявления пациентов с НС на базе клинико- диагностических лабораторий.