Разработка, клинико-лабораторная апробация и аналитическая валидация нового метода определения активности общей и панкреатической альфа-амилазы
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………….. 5
Глава 1 СОВРЕМЕННЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ α-АМИЛАЗЫ В МЕДИЦИНСКОЙ
ПРАКТИКЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) …………………………………………………………… 15
1.1 Общие сведения об α-амилазе …………………………………………………………………. 15
1.1.1 Общая характеристика амилаз……………………………………………………………. 15
1.1.2 α-Амилаза человека и ее изоферменты ………………………………………………. 15
1.1.3 Гены α -амилазы человека………………………………………………………………….. 16
1.1.4 Строение фермента α-амилазы человека…………………………………………….. 17
1.1.5 Биосинтез и физиологическая функция α-амилазы в организме человека
………………………………………………………………………………………………………………….. 19
1.2 Заболевания, сопровождающиеся изменение активности α-амилазы в
биологических жидкостях человека. Диагностическая значимость определения
активности изоферментов α-амилазы ……………………………………………………………. 22
1.2.1 Острый панкреатит (МКБ-10 K85; МКБ-11 DC31)……………………………… 22
1.2.2 Хронический панкреатит …………………………………………………………………… 26
1.2.3 Другие состояния человека, сопровождающихся увеличением уровня α-
амилазы …………………………………………………………………………………………………….. 28
1.3 Методология определения активности α-амилазы в биологических
жидкостях человека ……………………………………………………………………………………… 31
1.3.1 Общий принцип методов определения активности α-амилазы ……………. 31
1.3.2 Субстраты α-амилазы ………………………………………………………………………… 34
1.3.2.1 Субстрат EPS-G7 …………………………………………………………………………….. 38
1.3.2.2 Субстрат CNPG3 ……………………………………………………………………………… 40
1.3.3 Селективное ингибирование изоферментов α-амилазы ………………………. 42
1.3.4 Метрологическая прослеживаемость значения каталитической
активности α-амилазы ……………………………………………………………………………….. 43
1.3.5 Биоматериал для определения активности α-амилазы человека ………….. 45
1.3.6 Основные ограничения и источники ошибок при определении
активностей общей и панкреатической α-амилаз кинетическими методами… 47
1.4 Субстрат GalG2CNP, теоретическое обоснование возможности его
использования применительно к задачам исследования ………………………………… 48
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………………………… 50
2.1 Методы исследования……………………………………………………………………………… 50
2.2 Материалы, используемые в исследовании ……………………………………………… 50
2.3 Методы статистической обработки полученных результатов …………………… 55
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………………………………………. 57
3.1 Разработка и валидация наборов реагентов для определения активностей
общей и панкреатической α-амилаз c субстратом GalG2CNP …………………………. 57
3.1.1 Оптимизация компонентного состава наборов реагентов для определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз………………………………………… 57
3.1.2 Требования к условиям проведения реакции и учету результатов ………. 63
3.1.3 Аналитическая валидация наборов реагентов для определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз с субстратом GalG2CNP…… 68
3.1.4 Оценка влияния потенциально интерферирующих веществ на результаты
определения активностей общей и панкреатической α-амилаз ……………………. 77
3.2 Установление референтных пределов общей и панкреатической α-амилаз
для сыворотки, плазмы крови и мочи человека……………………………………………… 85
3.2.1 Возможность использования плазмы крови наряду с сывороткой крови
человека при применении полученных реагентов ………………………………………. 85
3.2.2 Референтные пределы общей и панкреатической α-амилазы для
сыворотки, плазмы крови и мочи человека…………………………………………………. 88
3.3 Внедрение в практику результатов исследования…………………………………….. 89
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ……………………………………………………………………………………….. 92
ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………………………………… 98
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………………………. 100
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………………………… 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………………………….. 102
Приложение 1 ………………………………………………………………………………………… 117
Приложение 2 ………………………………………………………………………………………… 118
Приложение 3 ………………………………………………………………………………………… 119
Приложение 4 ………………………………………………………………………………………… 120
Приложение 5 ………………………………………………………………………………………… 121
Методы исследования
В экспериментах при определении активности общей α-амилазы и ее
панкреатического изофермента использовали насыщающую концентрацию
субстрата GalG2CNP, то есть скорость реакции была равна максимальной
скорости и не зависела от концентрации субстрата. Анализ проводили с помощью
спектрофотометров, полуавтоматических и автоматических биохимических
анализаторов.
Материалы, используемые в исследовании
Образцы сыворотки, гепаринизированной плазмы, ЭДТА-плазмы крови и
мочи человека. Всего для исследования было использовано три группы образцов
биоматериалов человека. Первая группа состояла из 35 и 38 образцов сыворотки
крови, использованных для определения общей и панкреатической α-амилаз в
них,соответственно.Втораягруппасодержаласыворотку крови,
гепаринизированную и ЭДТА-плазму крови, полученные единовременно от
одного человека (всего от 100 человек). Третья – 185 образцов сыворотки крови и
139 проб мочи от условно-здоровых людей.
Все образцы крови были получены от людей старше 18 лет. Отбор
осуществляли натощак при использовании специализированных вакуумных
пробирок. Пробы хранили не более 14 дней при минус 20°С [В.В. Меньшиков. –
М.: Юнимед–пресс, 2003]. Образцы крови с показателем гематокрита, выходящим
за пределы нормальных значений, исключали из исследования. Образцы крови,
взятые у одного человека, исследовались в одной аналитической серии.
Контрольные материалы. В качестве первичного калибратора
использовали сертифицированный референтный материал IRMM/IFCC-456.
Референтный материал был подготовлен для работы согласно инструкции по
применению.
Аттестованные контрольные материалы «Precinorm» и «Precipath» («Roche»,
Германия, РУ № ФСЗ 2010/0752) применяли для контроля хранения реагентов,
сходимости и прецизионности результатов анализа.
Кроме того, были использованы образцы слюнной α-амилазы («Sigma-
Aldrich», США) при определении эффективности ингибирования слюнного
изофермента моноклональными антителами и препарат α-амилазы из
поджелудочной железы быка Bos taurus taurus L. («Вектор-Бест», Россия).
Интерференты. Свободный гемоглобин получали путем лизирования
эритроцитов человека дистиллированной водой [CLSI EP7. – 3d Ed., 2019].
Концентрация гемоглобина в используемом в исследовании лизате составила
119,5 г/л («Вектор-Бест», Россия). В обогащенных пробах концентрацию
гемоглобина измеряли на анализаторе HemoCue Plasma/Low Hb («HemoCue»,
Швеция). Моделирования образцов с различной концентрацией билирубина
использовали его лиофилизированный препарат («Sigma-Aldrich», США).
Концентрацию билирубина определяли колориметрическим методом с 3,5-
дихлорфенилдиазониевой солью («Вектор-Бест», Россия). При создании
различной степени липемии образцов применяли фармакологическую эмульсию
Интралипид, содержащую 20 г/дл триглицеридов (Fresenius Kabi, Германия).
Наборы реагентов для сравнения. Оценку эффективности разработанных
наборов реагентов проводили путем сравнения результатов определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз с результатами, полученными с
помощью диагностических наборов реагентов с субстратом EPS-G7, являющихся
аналогами, зарегистрированными в установленном порядке на территории РФ как
медицинские изделия для диагностики ин витро.
Методы статистической обработки полученных результатов
Полученные в результате исследования данные были подвергнуты
статистической обработке. Накопление, систематизация, корректировка и
визуализация исходной информации и результатов анализа проводилась с
использованием программы Microsoft Office Excel 2007-2010. Статистическая
обработка данных и расчет параметров производили с помощью пакета
прикладных программ Statistica 9.1 (серийный № BX003E612530A91-L).
Полученные данные, исходя из задач исследования, объединялись в
вариационные ряды, для которых проводился расчет одного или нескольких
параметров, таких как среднее арифметическое значение, коэффициент вариации,
среднеквадратичное отклонение, относительная разность средних. Для некоторых
вариационных рядов был проведен регрессионный анализ и вычислены
параметры уравнения линейной регрессии вида y = ax + b. После проверки на
нормальность критерием Колмогорова-Смирнова, данные при оценке
использования различных образцов плазмы наряду с сывороткой крови были
приведеныкнормальномураспределениюпутемлогарифмической
трансформации.
Результаты исследования и их обсуждение
Оптимизация компонентного состава наборов реагентов для
определения активностей общей и панкреатической α-амилаз
В настоящей работе стояла задача разработать метод с субстратом
GalG2CNP для определения активностей общей и панкреатической α-амилаз для
использования в лабораторной диагностике. Очевидно, что для разработки метода
на основе субстрата GalG2CNP необходимо создать реагенты, которые можно
внедрить в производство, что в первую очередь предполагает необходимость их
стабилизации. Более того, эти реагенты должны быть пригодны для работы с
оборудованием, применяемым для биохимических исследований в условиях
клинико-диагностических лабораторий.
Решение этой задачи заключалось в поиске состава и количества
компонентов в реагентах. Для этого использовали метод последовательных
приближений, общий принцип которого сводится к доказательству
существования решения и нахождения его приближения. На первом шаге в
качестве нулевого приближения был взят биреагентный вариант методики. При
этом в первом реагенте содержался буферный раствор, обеспечивающий pH,
необходимый для взаимодействия фермента с субстратом и его гидролиза, а во
втором реагенте – субстрат. Помимо этого, в состав реагентов были включены
компоненты, поддерживающие конформационно правильное состояние фермента
в ходе реакции (ионы Cl и Ca2+). Кроме того, такой короткий субстрат как
GalG2CNP требует присутствия в реакционной среде роданида калия,
позволяющего увеличить скорость гидролиза за счет аллостерической
перестройки α-амилазы, которая селективно атакует связь между агликоном и
первой молекулой глюкозы, сводя к минимуму гидролиз по другим гликозидным
связям, что приводит к уменьшению константы Михаэлиса (КM). Для каждого
компонента проводилась процедура варьирования концентрации для нахождения
рабочего диапазона и проверки выполнения установленных требований к
аналитическим характеристикам получаемой системы.
Далее для упрощения процедуры была проведена оптимизация реагентной
системы, сводившаяся к объединению двух реагентов в один. Однако, это
оказалось возможным только для реагентов для определения активности общей α-
амилазы и неприемлемым для ее панкреатического изофермента по причине
объективной необходимости на первоначальном этапе ингибировать активность
слюнного изофермента посредством моноклональных антител, что возможно
осуществить только в отдельной стадии. В состав набора для определения
активности общей α-амилазы входит один реагент, который представляет собой
буферный раствор, содержащий субстрат GalG2CNP. В состав набора реагентов
для определения активности панкреатической α-амилазы входят два реагента:
реагент 1 содержит антитела, ингибирующие активность слюнного изофермента,
реагент 2 – субстрат. Реагенты не требуют дополнительной подготовки и готовы к
использованию.
Таким образом, был подобран основной компонентный состав. Для
обеспечения стабильности реагентов в их состав были дополнительно введены
Triton X100, ЭДТА, БСА, ацетат кальция и азид натрия, что обеспечило их
хранение при температуре 2-8°С в защищенном от света месте в течении 5 лет без
существенного влияние на их оптическую плотность (p≤0,05) (рисунок 1).
Хранение сверх этого срока не было предпринято, так как представляется
нецелесообразным для производства и практического применения [К.А.
Черемисина, пат. РФ № 2417374, 2011; К.А. Черемисина, пат. РФ № 2417373,
2011].
Рисунок 1 – Изменение оптической плотности реагентов при хранении при
температуре 2–8°С (λ 405 нм)
Примечание: О – реагент для определения активности общей α-амилазы; П
– реагент 1 набора реагентов для определения активности панкреатической α-
амилазы; арабскими цифрами указан порядковый номер опытной серии реагента.
Требования к условиям проведения реакции и учету результатов
Для работы с полученными наборами реагентов необходимо было
установить требования к условиям проведения реакции и учету результатов. В
первую очередь было установлено, что при длине волны 405 нм (максимум для 2-
хлор-4-нитрофенол (CNP)) в полученных системах реагентов отсутствует
интерференция других веществ. При этом в качестве референтной длины волны
для устранения цветности и другой возможной интерференции образца можно
использовать длину волны из диапазона 500-800 нм, где отсутствует
светопоглощение как продуктом реакции, так и компонентами, входящими в
состав реагентов.
Далее был рассчитан теоретический фактор для возможности перевода
скорости накопления продукта реакции CNP в условные международные единицы
активности ферментов по отношению к объему Ед/л. Для этого был использован
сертифицированный референтный материал α-амилазы IRMM/IFCC-456. По
результатам нескольких серий измерений и статистического анализа данных было
установлено, что теоретический фактор для расчета активности общей α-амилазы
в Ед/л равен 3200, для панкреатической – 2900.
Вследствие того, что разрабатываемые наборы реагентов имели
предполагаемое применение для диагностики ин витро, немаловажно было
провести адаптацию к биохимическим анализаторам, применяемым в клинико-
диагностических лабораториях. Поэтому схема и условия проведения реакция
подбирались в соответствии с данным требованием. В связи с этим для
полученного реагента для определения активности общей α-амилазы была
установлена следующая процедура анализа. Реакция проводится при температуре
реакции 37°С. 1 мл реагента смешать с 0,025 мл анализируемого образца,
перемешать и через 1 минуту начать считывание оптической плотности.
Количество считываний должно быть не менее четырех. После чего, рассчитать
среднее арифметическое значение изменения оптической плотности за минуту
(∆Е/мин).
Процедура проведения реакции при использовании набора реагентов для
определения активности панкреатического изофермента α-амилазы отличается
наличием дополнительной стадии, так как в состав набора входят два реагента: к
0,8 мл реагента 1 добавить 0,02 мл анализируемого образца, перемешать,
выдержать 5 мин при температуре 37°С, после чего добавить 0,2 мл реагента 2,
перемешать и далее – аналогично как при определении активности общей α-
амилазы.
Активность α-амилазы и ее панкреатического изофермента численно равна
скорости катализируемой ей реакции гидролиза субстрата на линейном участке
кинетической кривой при насыщающей концентрации этого субстрата. Скорость
катализируемой ферментом реакции, а значит активность фермента, согласно
уравнению Михаэлиса-Ментен, можно определить по скорости накопления
продукта реакции CNP (рисунок 2).
Рисунок 2 – Кинетическая кривая накопления продукта реакции (CNP) при
определении активности общей α-амилазы
Таким образом, скорость реакции (ΔЕ/мин) на линейном участке
кинетической кривой считается прямо пропорциональной активности фермента.
Расчет активности α-амилазы (А) в анализируемом образце осуществляется по
калибратору или рассчитывается по теоретическому фактору расчета: А =
F·∆Е/мин, где F = 3200 (λ 405 нм).
Аналитическая валидация наборов реагентов для определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз с субстратом GalG2CNP
Валидация методики представляла собой экспериментальное доказательство
того, что она применима в клинико-лабораторной практике. Для этого
проводилась оценка методики по характеристикам, выбираемым с учетом
типовых рекомендаций (например, ГОСТов, законодательных актов и других
регламентирующих документов). Были определены основные аналитические
характеристики разработанных наборов реагентов: линейность, предел
количественного обнаружения, специфичность, правильность, прецизионность и
устойчивость.
При исследовании образцов крови доноров разрабатываемым методом и
методом сравнения был найден рабочий диапазон активности ферментов,
который составил для общей α-амилазы от 32 до 1322 Ед/л, для панкреатической
– от 19 до 1392 Ед/л (рисунок 3). Причем уравнения линейной регрессии
(y = ax + b) приняли вид y = 0,94x для общей α-амилазы и y = 0,9x для
панкреатической α-амилазы поскольку отличие коэффициента регрессии b от 0
оказалось статистически незначимо при использовании для оценки критерия
Стьюдента (α = 0,01) (таблица 1). Уточнение пределов данного диапазона было
проведено при использовании препарата панкреатической α-амилазы, и позволило
показать, что рабочий диапазон является линейным и имеет следующие пределы:
верхний предел определения активности общей α-амилазы составил 1419 Ед/л,
для панкреатической α-амилазы – 1390 Ед/л. Для установления наименьшей
определяемой активности фермента в образце количество α-амилазы быка в пробе
уменьшали до тех пор, пока значение коэффициента вариации повторных
измерений в одной аналитической серии не превысило 5%. Наименьшая
активность фермента в образце, которая может быть количественно оценена с
требуемой сходимостью, составила 5 Ед/л и 4 Ед/л, соответственно. Таким
образом, рабочий диапазон для определения активности общей α-амилазы для
реагентов с GalG2CNP составил от 5 до 1419 Е/л, для панкреатической α-амилазы
– от 4 до 1390 Е/л.
Специфичность определения активности панкреатического изофермента α-
амилазы была доказана при использовании препаратов слюнного изофермента. В
данных образцах были определены общая активность α-амилазы, остаточная
активность слюнного изофермента, измеренная реагентами для определения
панкреатической α-амилазы, рассчитано их отношение (%). В результате было
показано, что эффективность ингибирования слюнного изофермента α-амилазы
антителами к нему при определении панкреатического изофермента составляет
более 97% (таблица 2).
Таблица 1 – Регрессионный анализ
α-
SDSD
ами-СубстратabrnYX
GalG2CNPEPS-G7
лаза
GalG2CNP (y);
О0,94 1 0,998 35 192,3305,21203,4 324,45
EPS-G7 (x)
GalG2CNP (y);
П0,90 -4 0,998 38 248,0338,61278,5 373,37
EPS-G7 (x)
Примечание: a, b – параметры линейной регрессии y = ax+b; r –
коэффициент корреляции; n – количество пар исходных данных; SD –
среднеквадратичные отклонения относительно средних для выборок (Ед/л); Y , X –
средние арифметические значения активностей для выборок (Ед/л); О – общая α-
амилаза; П – панкреатическая α-амилаза.
Рисунок 3 – Результаты определения активностей общей (О) и
панкреатической (П) α-амилаз в образцах из поджелудочной железы быка,
полученные с помощью наборов реагентов с субстратом GalG2CNP и с
субстратом EPS-G7.
Таблица 2 – Доля остаточной активности слюнной α-амилазы (С, %) при ее
ингибировании антителами, входящими в состав реагентов с субстратами
GalG2CNP и EPS-G7, от общей активности α-амилазы
№ образца слюннойGalG2CNPEPS-G7
α-амилазыО, Е/л П, Е/л С, % О, Е/л П, Е/л С, %
14512,26046,67
231872,2419122,86
3683152,2850222,6
4879212,41166302,6
51234292,35 1604402,5
Примечания: О – общая, П – панкреатическая, СЛ – слюнная α-амилаза.
Аналитическая вариация результатов была оценена как для одной серии
измерений (20 параллельных измерений в одной аналитической серии), так и для
среднесрочного периода времени (по одному измерению раз в день в течение
30 дней). Внутрисерийный коэффициент вариации для GalG2CNP не превышал
1,4%, среднесрочный – 3,5% (таблица 3).
Правильность определения – отклонение среднего результата определений
от значения, принимаемого за истинное, была проверена при использовании двух
контрольных материалов, с известным диапазоном активностей общей и
панкреатической α-амилаз. Было показано, что значения активности
изоферментов укладываются в аттестованный диапазон контрольных материалов
(таблица 3).
Таблица 3 – Статистические характеристики результатов определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз реагентами GalG2CNP и EPS-G7 в
контрольных материалах
Контрольный материал 1Контрольный материал 2
Статистические
аттестованный диапазонаттестованный диапазон
параметры
ОПОП
(62,4-90,0) Е/л(30,0-43,2) Е/л(157-223) Е/л(82-118) Е/л
EPSGalG2EPSGalG2EPS-GalG2EPS-GalG2
-G7CNP-G7CNPG7CNPG7CNP
одна серия измерений, n=20
M,
77,5 76,1/80,9* 36,5 36,0/39,9* 190,0 188,2/200,2* 100,0 99,9/110,9*
Е/л
SD,
1,1 0,69/0,73* 0,5 0,51/0,57* 3,42,04/2,17*1,11,23/1,36*
Е/л
CV,
1,40,91,41,41,81,11,11,2
%
одно измерение один раз в день в течении месяца, n=30
M,
76,8 76,6/81,5* 36,9 36,7/40,8* 191,4 188,4/200,4* 100,1 100,2/111,4*
Е/л
SD,
1,3 1,54/1,64* 1,3 1,29/1,43* 5,53,24/3,45*1,91,94/2,16*
Е/л
CV,
1,72,03,43,52,91,71,91,9
%
Примечания: M – среднее арифметическое значение результатов измерений
активности для заданного образца, Ед/л; SD – среднеквадратичное отклонение от
среднего значения, Ед/л; CV – коэффициент вариации, %; n – количество
измерений; О – общая, П – панкреатическая α-амилаза.
* Полученное значение активности при измерении/пересчитанное значение
активности из GalG2CNP в EPS-G7 по установленной в работе зависимости.
Таким образом, сравнение двух реагентов (GalG2CNP и EPS-G7) для
определения изоферментов α-амилазы показало высокую степень согласия между
ними. Вместе с тем, использованный в работе калибратор аттестован методом с
субстратом с EPS-G7, и, несмотря на то, что значение активности α-амилазы для
негопрослеженодосертифицированногореферентногоматериала,
рекомендованного Международным бюро мер и весов (Bureau International des
Poids et Mesures, BIPM), и что нами установлена высокая положительная
корреляция при анализе сывороток крови человека, регрессионный анализ
показал, что результаты, полученные с помощью метода GalG2CNP ниже таковых,
определенных методом EPS-G7. Известно, что скорость ферментативной реакции,
а значит активность фермента, зависит от природы субстрата. Поэтому
необходимо учитывать тот факт, что получаемые в образцах значения активности
α-амилазы будут различаться. В связи с этим необходимо применять для расчетов
фактор для реагентов с GalG2CNP, что в медицинской лабораторной практике
представляется не всегда возможным, либо использовать калибратор, значение
активности α-амилазы в котором аттестовано методом с субстратом GalG2CNP.
При этом, если значение в калибраторе будет прослежено до референтного
материала более высокого уровня, то это позволит гармонизировать результаты,
получаемые в различных лабораториях реагентами с разными субстратами.
Согласно критериям точности, предъявляемым в РФ к анализу ферментов в
биологическихжидкостях[ГОСТР53022.2–2008,
https://docs.cntd.ru/document/1200072564], разработанный нами метод и наборы
реагентов на его основе для определения активности общей α-амилазы и ее
панкреатического изофермента соответствуют национальным стандартам. Таким
образом, кинетический колориметрический метод с использованием в качестве
субстрата GalG2CNP может быть рекомендован для использования в клинико-
диагностических лабораториях [К.А. Черемисина, и др., 2021].
Оценка влияния потенциально интерферирующих веществ на
результаты определения активностей общей и панкреатической α-амилаз
Далее было проведено испытание устойчивости методик для высоких
концентраций в образцах крови человека гемоглобина, билирубина и
триглицеридов, которые часто становятся причиной ошибки преаналитического
этапа лабораторных исследований. Для создания ряда образцов с разной
концентрацией интерферента пробы нескольких пациентов разделялась на равные
части, в каждую из которых добавляли один из интерферентов: гемоглобин,
билирубин, жировую эмульсию (триглицериды) до заданных концентрации в
диапазоне 0-10 г/л, 0-770 мкмоль/л, 0-1500 мг/дл, соответственно. Далее
проводили определение активности ферментов в каждом образце; полученные
значения сравнивали со значением в контрольной пробе. На основании анализа
данных были выявлены пороговые значения концентраций гемоглобина,
билирубина и триглицеридов, при которых относительная погрешность
определения активности, т.е. разность между значениями активности в
контрольной пробе и опытной пробе, не превышала 10% для каждого из
пациентов.
Найдены предельные концентрации гемоглобина, билирубина и
триглицеридов, ниже которых отсутствует влияние на результаты определения
активности общей, панкреатической α-амилаз методом с субстратом GalG2CNP,
которые составляют 5,0 г/л, 770,0 мкмоль/л и 1500,0 мг/дл, соответственно.
Столь высокие пороговые значения дают возможность проводить анализ
этих ферментов для пациентов с различной патологией, что имеет существенное
практическую значимость. Например, пробы крови со значением липемического
индекса 1500 мг/дл имеют высокую мутность. Тем не менее, при такой
значительной степени липемии уровень общей и панкреатической α-амилазы
может быть установлен методом с GalG2CNP, что важно для пациентов с
сахарным диабетом, хронической болезнью почек, панкреатитами различной
этиологии и других заболеваниях. Следует отметить, что билирубин в высокой
концентрации нередко становится источником спектральной интерференции из-за
свойства поглощать свет в широком диапазоне длин волн: от 340 нм до 500 нм,
однако, полученные данные указывают на отсутствие влияния билирубина в
концентрации до 770 мкмоль/л на результаты определение активности
исследуемых ферментов, что свидетельствует о высокой устойчивости
аналитической системы разработанного нами метода к билирубину. Кроме того,
согласно литературным данным, для метода с субстратом EPS-G7, определение
активности α-амилазы затруднено в гемолизированных пробах крови и образцах
мочи, содержащих кровь. На практике, использование метода с субстратом
GalG2CNP позволяет не отбраковывать гемолизированные образцы сыворотки
крови.
Возможность использования плазмы крови наряду с сывороткой крови
человека при применении полученных реагентов
В лабораторной медицине для оценки основных параметров метаболизма
человека в качестве материала для анализа используют сыворотку или плазму
крови. На сегодняшний день сыворотка является универсальным и самым
распространенным типом образца для биохимических исследований. Между тем,
в медицинских лабораториях все чаще стали использовать плазму крови, чему в
значительной мере поспособствовало развитие медицинской техники и возросшая
потребность лабораторий в оптимизации своей работы. Несмотря на ряд
преимуществ плазмы, например, сокращение времени между взятием образца
крови у пациента и его анализом, антикоагулянты могут оказывать негативное
влияние на результат определения аналитов, в том числе активности ферментов,
что может привести даже к ошибочному диагнозу [М. Ferdinando, 2008; S. Barelli,
et al., 2007].
Нами было проведено сравнение активностей общей α-амилазы и
панкреатической α-амилазы в гепаринизированной, ЭДТА-плазме с активностью
в сыворотке крови человека при использовании разработанных наборов
реагентов. Согласно полученным данным, тип образца не влиял на активность
общей α-амилазы и ее панкреатического изофермента (таблицы 4 и 5).
Различия средних значений для сыворотки и обеих плазм были
статистически незначимы; показана высокая корреляция между результатами в
парах сыворотка-плазма и плазма-плазма: коэффициент корреляции для этих пар
образцов составил 1,0. Между тем, в литературе содержаться сведения о том, что
соли ЭДТА занижают активность фермента, и в качестве антикоагулянта при
анализе активности α-амилазы предпочтительно использовать гепарин [В.В.
Меньшиков. – М.: Юнимед–пресс, 2003; G. Lima–Oliveira, et al., 2014; D.F.
Davidson, 2002]. Большинство наборов реагентов для определения активности как
общей, так и панкреатической α-амилазы основаны на методе с использованием в
качестве субстрата EPS-G7. Именно для EPS-G7 показано выраженное влияние
ЭДТА на результат исследования [E. Rauscher, et al., 1985]. Нами установлено, что
при использовании разработанных наборов реагентов для определения общей,
панкреатической α-амилаз с субстратом GalG2CNP не обнаружено аналогичного
влияние образца на результат, как в случаях с другими субстратами. Поэтому
определять активность α-амилазы и ее изофермента с данным субстратом можно
как в сыворотке, так и в плазме, полученной с помощью гепарина или солей
ЭДТА [К.А. Черемисина, 2016].
Таблица 4 – Характеристики выборок значений активностей общей α-
амилазы и панкреатической α-амилазы в сыворотке, гепаринизированной и
ЭДТА-плазме крови
Значимость
Средние арифметическиеОтносительная
Фермент
различия
значенияразность средних, %
средних (p=0.05)
СВГЭСВ/ СВ/
СВ/Г СВ/Э Г/ЭГ/Э
± σ, Е/л± σ, Е/л ± σ, Е/лГЭ
О66±13263±12863±123-4,8-4,80,0+++
П36±10435±10035±101-4,3-2,32,1+++
Примечания: – среднее арифметическое значение активности фермента в
соответствующем типе образца; σ – стандартное отклонение; СВ – сыворотка; Г –
гепаринизированная плазма, Э – ЭДТА-плазма; относительная разность средних
, равная (); результаты t-теста (+ различия между средними
значениями незначимы); О – общая, П – панкреатическая α-амилаза.
Таблица 5 – Результаты регрессионного анализа
СВ/ГСВ/ЭГ/Э
Фермент
abrabrabr
О0,97 -1 1,00 0,9321,00 0,9631,00
П0,9601,00 0,9701,00 1,0111,00
Примечания: a, b – параметры уравнения линейной регрессии вида y = ax +
b; r – коэффициент корреляции для пар x/y.
Референтные пределы общей и панкреатической α-амилазы для
сыворотки, плазмы крови и мочи человека
Согласно ГОСТ Р 53022.3-2008 референтный интервал представляет собой
ограниченный референтными пределами и статистически охарактеризованный
диапазон значений результатов лабораторных исследований фермента,
полученный при обследовании группы лиц, отобранных по специальным
критериям. Поскольку активность α-амилазы в биологических жидкостях не
зависит от возраста и пола, то критериями для отбора образцов сыворотки и мочи
были отсутствие заболевания у человека поджелудочной железы, алкоголизма,
травм живота, макроамилаземии, заболеваний желчного пузыря, хирургических
вмешательств, других состояний, для которых показана возможность увеличения
активности фермента в биологических жидкостях. Кроме того, для всех
тестируемых образцов предварительно с помощью диагностических наборов
реагентов, зарегистрированных на территории РФ как медицинские изделия было
установлено, что уровни общей и панкреатической α-амилазы не выходят за
референтные пределы.
Нормальность распределения результатов активностей общей и
панкреатической α-амилазы в сыворотке крови, полученных с помощью
разработанных наборов реагентов, подтверждено с применением критерия
Колмогорова-Смирнова (p≤0,01). Для каждой выборки были рассчитаны среднее
арифметическое значение (M) и среднеквадратичное отклонение (S). Как
известно, при нормальном распределении 95% площади под графиком функции
Гаусса ограничено М ± 1,96S. Между тем, очевидно, что как для общей α-
амилазы, так и для панкреатического изофермента, значения, выходящие за
пределы нижней границы референтного интервала, не имеют диагностического
значения, поэтому принято указывать только верхний предел.
Поскольку нами было доказано, что в качестве образца наряду с сывороткой
может быть использована гепаринизированная и ЭДТА-плазма крови, для
которых показано отсутствие влияния типа образца на результаты определения
активности α-амилазы, то выводы по установлению референтного интервала для
сыворотки крови могут быть экстраполированы и для плазмы. Таким образом,
верхний референтный предел для общей α-амилазы в сыворотке (плазме) крови
составляет 100 Ед/л, в моче – 500 Ед/л. Для панкреатического изофермента – 53 и
350 Ед/л, соответственно.
Внедрение в практику результатов исследования
По результатам работы были разработаны регламенты для производства
следующих наборов реагентов:
1.для определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и
моче «Амилаза-Ново» (до 2017 года – «Амилаза-Ново-1»);
2.для определения активности панкреатической α-амилазы в сыворотке,
плазме крови и моче «Амилаза панкреатическая-Ново» (до 2017 года – «Амилаза
панкреатическая-Ново-1»).
Кроме того, разработаны технические условия для выходного контроля
производственных серий наборов, которые регламентируют физические
(технические) параметры, показатели правильности определения активности
ферментов и допустимый разброс результатов, получаемых разными наборами
одной серии.
В соответствии с требованиями Федеральной службы по надзору в сфере
здравоохранения РФ к медицинским изделиям для диагностики ин витро наборы
реагентов прошли технические и клинические испытания, по результатам
которых получены регистрационные удостоверения, разрешающие производство
наборов реагентов, а также их применение в учреждениях здравоохранения РФ.
Наборы реагентов «Амилаза-Ново» и «Амилаза панкреатическая-Ново»
внедрены в производство компанией АО «Вектор-Бест» (Россия).
Наборы реагентов «Амилаза-Ново» и «Амилаза панкреатическая-Ново»
несколько лет применяются в практике клинико-диагностических лабораторий
РФ.
ВЫВОДЫ
1.Разработан новый метод и компонентный состав наборов реагентов
для определения активностей общей и панкреатической α-амилаз кинетическим
колориметрическим методом с субстратом GalG2CNP. Включение в состав
реагентов Triton X-100, ЭДТА, кальция ацетата, азида натрия и дополнительно
БСА в реагент для определения активности панкреатической α-амилазы позволяет
обеспечить их хранение сроком до пяти лет.
2.Аналитические характеристики для разработанных наборов реагентов
для определения активностей общей и панкреатической α-амилаз в крови и моче
человека на основе метода с субстратом GalG2CNP составляют: диапазон
измерения активности общей α-амилазы – 5-1419 Ед/л, панкреатического
изофермента – 4-1390 Ед/л; внутрисерийный коэффициент вариации не
превышает 1,1% и 1,4%, среднесрочный коэффициент вариации – 2,0% и 3,5%,
соответственно.
3.Специфичностьопределенияактивностипанкреатического
изофермента α-амилазы при уровне активности слюнного изофермента
до 1200 Ед/л с использованием разработанного набора реагентов составляет более
97%.
4.Активности общей и панкреатической α-амилаз в образцах крови,
мочи сопоставимы по значениям и имеют коэффициент корреляции 0,99 при
сравнении результатов определения разработанными наборами реагентов и их
импортными аналогами с субстратом EPS-G7.
5.Присутствие в образцах сыворотки крови интерферирующих веществ
– гемоглобина до 5 г/л, триглицеридов до 1500 мг/дл, билирубина до 770
мкмоль/л – не оказывает значимого влияния на результаты определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз данным методом. Доказана
возможность использования предложенных реагентов для определения
активности общей α-амилазы и ее панкреатического изофермента в
гепаринизированной и ЭДТА-плазме крови наряду с сывороткой крови человека.
6.Референтныепределызначенийактивностей общей и
панкреатической α-амилаз в сыворотке (плазме) крови составляют до 100 и до
53 Ед/л и в моче человека до 500 и до 350 Ед/л, соответственно.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Результаты проведенного исследования позволяют сформулировать
практические рекомендации для врачей клинической лабораторной диагностики:
1.Для определения активности общей, панкреатической α-амилазы в
сыворотке, плазме крови и моче человека кинетическим колориметрическим
методом с использованием субстрата GalG2CNP рекомендован для клинико-
лабораторной диагностики.
2.При выборе коммерческих наборов реагентов для выполнения в
клинико-диагностических лабораториях исследований активностей общей и
панкреатической α-амилазы, основанных на использовании различных
субстратов, рекомендуется учитывать преимущества разработанного метода с
субстратом GalG2CNP: устойчивость к влиянию интерферентов, стабильность при
хранении до пяти лет; монореагентный состав набора для определения активности
общей α-амилазы.
3.Для определения активностей общей, панкреатической α-амилаз в
пробах сыворотки крови с признаками гемолиза, гепаринизированной плазмы,
ЭДТА-плазмы крови рекомендуется использовать наборы реагентов с субстратом
GalG2CNP, устойчивые к влиянию данных интерферирующих веществ.
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
В качестве перспектив разработки темы можно рассматривать проведение
межлабораторных сличительных исследований определения активностей общей и
панкреатической α-амилаз в клиническом материале с целью гармонизации
результатов, получаемых в различных клинико-диагностических лабораториях
предложенным методом и другими наиболее распространенными методами,
имеющими метрологическую прослеживаемость результатов измерений величин
активности до первичного международно-признанного стандартного образца.
С учетом выраженной зависимости эффективности терапии, а также
частоты возникновения постморбидных осложнений и степени их тяжести от
своевременности постановки диагноза, перспективы дальнейшей разработки
состоят в расширении объемов оказания медицинской помощи на раннем
госпитальном этапе.
Целесообразнопроведениеисследованийпоустановлению
физиологических значений активностей различных изоферментов α-амилазы в
крови и моче с учетом возрастных, половых и региональных особенностей.
Необходимо продолжить более детальное изучение динамики развития
патологической амилаземии и амилазурии с целью уточнения лабораторных
критериев, позволяющих осуществить своевременный выбор наиболее
эффективныхтерапевтическихорганосохраняющихстратегийи
здоровьесберегающих технологий.
Актуальность темы исследования
Разработка новых методов исследования химического состава
биологических жидкостей человека и их внедрение в клиническую лабораторную
диагностику способствует совершенствованию эффективности лечения
заболеваний, обеспечению сохранения здоровья населения и сокращению сроков
временной нетрудоспособности пациентов. В этой связи формирование новых
подходов в энзимодиагностике сохраняет свою актуальность.
В клинической лабораторной диагностике определение активности α-
амилазы (EC 3.2.1.1) в крови и моче человека принято использовать для
диагностики и мониторинга широкого спектра заболеваний поджелудочной
железы (острый и хронический панкреатит, панкреолитиаз, кисты и опухоли
поджелудочной железы), слюнных желез, желчевыводящих путей, органов
брюшной полости (некроз, ишемия и перфорация). Также причинами
повышения активности α-амилазы в сыворотке крови и моче могут быть
сахарный диабет, болезни простаты, почечная недостаточность и другие
патологические состояния. В целом, принято считать, что повышение
активности α-амилазы в крови и моче прямо или косвенно связано с
воспалением поджелудочной железы или его распространением на данный орган
(так называемый реактивный панкреатит), а дифференциальная диагностика
заболеваний гастропанкреатодуоденальной зоны нередко бывает значительно
затруднена. Наряду с этим наиболее информативным считается определение
активности изоферментов α-амилазы ввиду того, что она является секреторным
ферментом, участвующим в процессе пищеварения и продуцируемым, в
основном, слюнными железами (слюнная α-амилаза) и поджелудочной железой
(панкреатическая α-амилаза). Увеличение активности фермента в несколько раз
выше референтных значений может свидетельствовать о наличии у пациента
острого панкреатита. При этом увеличивается активность панкреатического
изофермента, тогда как уровень слюнного остается в норме.
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) частота
распространённости острого панкреатита в мире достигает 10% от всей
неотложной хирургической патологии органов брюшной полости. При этом по
разным оценкам у около 20% пациентов развиваются серьезные осложнения,
некоторые из которых приводят к смерти. В целом острый панкреатит
диагностируется у 10-30 человек на 100 тысяч населения. За последние несколько
десятков лет в индустриальных странах, в том числе и в России, наметилась
тенденция к увеличению случаев данного заболевания. У более 80% пациентов
заболевание разрешается, не причиняя большого ущерба здоровью, и только в
редких случаях переходит в хроническую форму [91, 102]. Вместе с тем по
разным оценкам у около 20% (по данным ВОЗ – 15-30%) пациентов развиваются
серьезные осложнения, в частности панкреонекроз.
Ввиду полиморфизма клинической симптоматики острого панкреатита в
дебюте заболевания с одной стороны, с другой – необходимости скорейшей
постановки диагноза и своевременного назначения лечения, существует
потребность в адекватном клинико-диагностическом сопровождении пациента, в
рамках которого главную роль играет выявление изоферментов α-амилазы.
Существующие методы определения активности α-амилазы обладают рядом
недостатков, негативно влияющих на доступность анализа и достоверность
результатов. В связи с этим, разработка и внедрение в практику наборов
реагентов для определения активности изоферментов α-амилазы представляет
собой актуальную медико-биологическую проблему.
Степень разработанности темы исследования
За последние несколько десятилетий были предложены различные
подходы к определению активности α-амилазы, основанные на способности
последней гидролизовать внутренние α-1,4-гликозидные связи олиго- и
полисахаридов. Наибольшее распространение получили методы с использованием
в качестве субстратов 4,6-ethylidene-(G7)-p-nitrophenyl-(G1)-α,D-maltoheptaoside
(EPS-G7) и 2-chloro-4-nitrophenyl-α-d-maltotrioside (CNPG3), которые применяются
при создании наборов реагентов для определения активности α-амилазы и ее
изоферментов [66, 72]. Между тем, результаты различных исследований
показывают, что данные субстраты обладают рядом недостатков [66, 95, 96, 110,
100, 120, 129]. В связи с этим, во многих развитых странах систематически
ведутся работы по разработке современных методов определения активности α-
амилазы и ее панкреатического изофермента, в том числе с использованием
новых субстратов. К настоящему времени из доступных источников известно о
многих таких безуспешных попытках [41, 57, 108, 131, 133, 139]. Исходя из
вышеизложенного, разработка новых методов определения активности α-амилазы
и оптимизация реагентных систем с улучшенными характеристиками является
актуальной и важной технологической задачей клинической лабораторной науки.
Целесообразность разработки и внедрения в практику отечественных наборов
реагентов очевидна и актуальна.
Одним из таких потенциальных субстратов, перспективным для создания с
его использованием нового метода для определения активности α-амилазы и ее
изоферментов может быть рассмотрен субстрат 2-хлор-4-нитрофенил-4-О-β-D-
галактопиранозилмальтозид (англ. 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-
galactopyranosylmaltoside; GalG2CNP) [138], применение которого может
позволить устранить проблемы, возникающие при использовании субстратов
EPS-G7 и CNPG3, а также упростить анализ активности данных изоферментов.
Очевидно, что для использования субстрата GalG2CNP необходимо разработать
реагенты, пригодные для использования в производстве, а также методику,
позволяющую их применение в практике лабораторной медицины. Данная работа
посвящена разработке нового метода определения активностей общей и
панкреатической α-амилаз с субстратом GalG2CNP, а также наборов реагентов на
основе кинетического анализа, которые могут быть внедрены в производство и
применены в лабораторной диагностике.
Цель исследования
Разработать новый метод определения активностей общей и
панкреатической α-амилаз с субстратом GalG2CNP в крови и в моче человека на
основе кинетического колориметрического анализа, адаптированный к
широкому применению в клинико-лабораторной практике.
Задачи исследования:
1. Разработать новый кинетический колориметрический метод с
использованием в качестве субстрата GalG2CNP, а также компонентный состав
реагентов для определения активностей общей и панкреатической α-амилаз в
крови и в моче человека.
2. Провести аналитическую валидацию наборов реагентов на основе
разработанного метода путем определения ключевых аналитических
характеристик для оценки возможности его применения в клинической
лабораторной диагностике, в том числе, оценки специфичности определения
активности панкреатического изофермента α-амилазы, возможности длительного
хранения реагентов и адаптации к фотометрическим анализаторам различного
типа.
3. Определить в экспериментальных условиях воздействие факторов
(гемолиз, липемия, гипербилирубинемия), влияющих на результаты
лабораторных исследований активностей изоферментов α-амилазы, а также
возможность использования в качестве диагностического биоматериала плазму
крови человека, стабилизированную гепарином или ЭДТА.
4. Установить референтные величины активностей общей и
панкреатической α-амилаз в крови и в моче человека при использовании
разработанного метода и провести анализ ключевых аналитических
характеристик разработанных наборов реагентов в сопоставлении с другими
наборами реагентов, основанных на использовании альтернативных субстратов.
Научная новизна
Разработан новый кинетический колориметрический метод определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз с использованием в качестве
субстрата GalG2CNP.
Впервые разработаны и апробированы наборы реагентов для определения
активностей общей и панкреатической α-амилаз кинетическим
колориметрическим методом с использованием в качестве субстрата GalG2CNP,
удовлетворяющие требованиям, предъявляемым к медицинским изделиям для
диагностики ин витро в Российской Федерации.
Для повышения стабильности реагентов для определения активностей
общей и панкреатической α-амилаз оптимизирован состав компонентов, а также
включены дополнительные компоненты. Показано, что введение в состав реагента
для определения активности общей α-амилазы таких компонентов как Triton X-
100, ЭДТА, а также консерванта кальция ацетата позволяет обеспечить
стабильность реагента сроком более двух лет. Показано, что включение в состав
реагента 1 (содержащего антитела к слюнной α-амилазе) набора реагентов для
определения активности панкреатической α-амилазы таких компонентов как
ЭДТА, БСА, консерванта ацетата кальция, а также включение в состав реагента 2
(содержащего субстрат GalG2CNP) ЭДТА и добавление консерванта азида натрия
также позволяет увеличить срок их хранения до пяти лет.
В ходе клинических испытаний разработанных наборов реагентов изучены
факторы, влияющие на результаты лабораторных исследований, обоснована и
доказана возможность использования как сыворотки крови, так и плазмы крови,
полученной с помощью гепарина или солей ЭДТА, установлены референтные
величины и пределы колебаний активностей общей и панкреатической α-амилаз
для сыворотки крови, плазмы крови и мочи человека для метода с
использованием в качестве субстрата GalG2CNP.
Теоретическая и практическая значимость работы
Впервые разработана идея, обогащающая научную концепцию о
методологии теоретического обоснования принципа нового метода исследования
химического состава биоматериалов, а именно, определения активностей общей и
панкреатической α-амилаз кинетическим колориметрическим методом с
использованием в качестве субстрата GalG2CNP и экспериментальной апробации
наборов реагентов, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к наборам
реагентов для диагностики ин витро в Российской Федерации. По результатам
серии лабораторных испытаний разработаны оптимальные составы монореагента
для определения общей α-амилазы и набора из двух реагентов для определения
панкреатической α-амилазы на основе кинетического колориметрического метода
с субстратом GalG2CNP. Показано, что расширение состава компонентов
позволяет повысить стабильность разработанных реагентов, обеспечивая тем
самым срок их хранения не менее двух лет.
Определена область применения кинетического колориметрического метода
анализа активностей общей и панкреатической α-амилаз с использованием в
качестве субстрата GalG2CNP. Установлены референтные пределы активностей
общей и панкреатической α-амилаз для сыворотки, гепаринизированной плазмы
крови, ЭДТА-плазмы крови и мочи человека. Показано, что аналитическая
специфичность определения активности панкреатической α-амилазы составляет
не менее 97%. На основе оценки аналитической вариации результатов
активностей общей и панкреатической α-амилаз как для одной серии измерений,
так и для среднесрочного периода времени при использовании разработанных
наборов реагентов, сформулированы методические подходы организации
обеспечения своевременного выявления внутри- и межлабораторных ошибок.
Разработаны технические условия для производства набора реагента для
определения активности общей α-амилазы, набора реагентов для определения
активности панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче
человека с целью их применения в качестве медицинского изделия для
диагностики ин витро в практической работе клинико-диагностических
лабораторий. Созданы экспериментальные серии наборов «Амилаза-Ново» и
«Амилаза панкреатическая-Ново», которые прошли экспертизу в Федеральной
службе по надзору в сфере здравоохранения РФ, зарегистрированы в
установленном порядке и разрешены к производству и применению на
территории РФ. Разработаны производственные регламенты и организовано
промышленное производство данных наборов реагентов.
Методология и методы исследования
Применительно к проблематике диссертации результативно использован
комплекс клинических, лабораторных, инструментальных, статистических
методов исследования и анализ литературы. Особое внимание уделено
спектроскопическим методам исследования с использованием
спектрофотометров, полуавтоматических и автоматических биохимических
анализаторов. В работе в качестве объекта исследования использованы образцы
сыворотки (n=358), гепаринизированной (n=100), ЭДТА-плазмы (n=100) крови и
мочи (n=139), полученных от госпитализированных и амбулаторных пациентов и
условно-здоровых добровольцев. Методология проведенных исследований
основывается на ГОСТах, публикациях IFCC (Международная федерация
клинической химии и лабораторной медицины), CLSI (институт клинико-
лабораторных стандартов) [7, 9, 81, 86].
Положения, выносимые на защиту
1. Разработан новый кинетический колориметрический метод
определения активности α-амилазы с использованием в качестве субстрата
GalG2CNP. На его основе разработаны наборы реагентов для определения
активности общей α-амилазы и активности панкреатического изофермента α-
амилазы в крови и в моче человека.
2. Разработанные наборы реагентов превосходят по аналитическим
характеристикам и потребительским свойствам наборы реагентов, основанных на
использовании субстрата EPS-G7. Наиболее существенными преимуществами
данных наборов являются: устойчивость к влиянию интерферентов, что
обеспечивает возможность использования сыворотки крови, содержащей
гемоглобин в концентрации до 5 г/л, а также гепаринизированной и ЭДТА-
плазмы крови человека; высокая стабильность при хранении до пяти лет;
монореагентный состав набора для определения активности общей α-амилазы.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обуславливается использованием
современных, хорошо апробированных спектроскопических методов
исследования, кинетических методов определения активности ферментов,
метрологически-поверенного оборудования, а также корректным применением
статистического анализа данных, и подтверждается результатами сравнения
активностей общей и панкреатической α-амилаз предложенным набором
реагентов и импортным аналогом, а также результатами внедрения в практику
лабораторной диагностики лечебно-профилактических учреждений Российской
Федерации.
Результаты исследования были доложены на Всероссийской научной
конференции молодых ученных «Проблемы биомедицинской науки третьего
тысячелетия» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.), научно-образовательном форуме
«Актуальные проблемы современной лабораторной диагностики» (г. Барнаул,
2010 г.), научно-образовательном форуме «Современная лабораторная медицина:
значение новых лабораторных тестов и технологий в клинической практике» (г.
Смоленск, 2010 г.), научно-практической конференции «Лабораторное
обеспечение стандартов медицинской помощи» (г. Москва, 2010 г.), научно-
образовательном форуме «Инновационная лабораторная медицина: современные
технологии и новые тесты в клинической практике» (г. Хабаровск, 2011 г.),
Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская биохимия и
клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных
исследований» (г. Омск, 2011 г.), краевой научно-практической конференции
«Лабораторная диагностика – возможности теории и практики» (г. Пермь, 24
апреля 2015 г.), III Всероссийской научной конференции молодых ученых
«Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (г. Санкт-Петербург,
12-14 сентября 2016 г.), Международной научно-практической конференции
«Молекулы и системы для диагностики и адресной терапии» (г. Томск, 1-3 ноября
2017 г.), XXV Всероссийской научно-практическая конференции с
международным участием (г. Москва, 16–18 сентября 2020 г.).
Публикации по результатам исследования
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи в
научных журналах, рецензируемых ВАК Министерства образования и науки РФ.
Получено 2 патента РФ.
Внедрение результатов исследования в практику
Данные исследования использованы для подготовки производственных
регламентов и технических условий для промышленного производства наборов
реагентов для определения активности изоферментов α-амилазы в сыворотке,
плазме крови и моче человека кинетическим колориметрическим методом с
субстратом GalG2CNP. Результаты исследований подтверждены актами о
внедрении научно-исследовательской работы в производство компании
АО «Вектор-Бест» г. Новосибирск.
Набор реагент для определения активности общей α-амилазы «Амилаза-
Ново» (РУ от 20.11.2019 № РЗН 2017/6217) и набор реагентов для определения
активности панкреатического изофермента α-амилазы «Амилаза панкреатическая-
Ново» (РУ от 09.11.2017 № РЗН 2017/6451) прошли регистрацию в надзорных
органах и разрешены к производству, продаже и применению на территории
Российской Федерации как медицинские изделия для диагностики ин витро.
Зарегистрированные в Российской Федерации диагностические наборы
реагентов, разработанные в ходе данного исследования, используются в лечебно-
профилактических учреждениях здравоохранения во всех регионах страны.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно выполнен весь объем работ с помощью
специальных методов исследования, а также анализ полученных данных.
Совместно с соавторами обсуждалась постановка задач и выбор методов. Автор
осуществлял планирование и проведении экспериментов, статистическую
обработку полученных данных по разделам диссертации, связанных с выбором
биологического материала, пригодного для исследования. В ходе выполнения
работы, автором проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной
литературы по изучаемой проблеме. Автором самостоятельно проведен анализ
полученных результатов и сформулированы выводы.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют шифру специальности:
14.03.10 клиническая лабораторная диагностика, п. 7, п. 8 паспорта
специальности, а именно: «оптимизация и разработка новых методов
исследования химического и клеточного состава биоматериалов, установление
референтных величин, предела колебаний каждого параметра биологических
жидкостей. Факторы, влияющие на результаты лабораторных исследований,
выявление внутри- и межлабораторных ошибок».
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит
из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
главы о результатах собственных исследований и их обсуждения, выводов и
указателя цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 13
рисунками и содержит 5 приложений. Список литературы состоит из 146
источников, в том числе 119 – зарубежных авторов.
Глава 1 СОВРЕМЕННЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
Читать «Разработка, клинико-лабораторная апробация и аналитическая валидация нового метода определения активности общей и панкреатической альфа-амилазы»
Публикации автора в научных журналах
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.8 (1033 отзыва)
4.8 (37 отзывов)
4.8 (13 отзывов)
4.8 (373 отзыва)
4.8 (40 отзывов)
4.8 (2878 отзывов)
4.4 (93 отзыва)
4.9 (522 отзыва)
4.9 (37 отзывов)
