Биохимическая характеристика первичных митохондриальных заболеваний

С первой по пятой частях обзора представлены современные представления о структуре и функциях митохондрий в клетке. В шестой части рассматривается совре- менная классификация ПМЗ. В седьмой части обсуждаются подходы к диагностике ПМЗ, в восьмой – подходы к лечению ПМЗ. В заключительной части обсуждаются проблемы пренатальной диагностики при ПМЗ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы исследования
В период с 2016-2019 гг. собраны биообразцы 171 пациента с верифицирован- ным молекулярно-генетическими методами диагнозом ПМЗ. Для выполнения анализа уровня органических кислот методом ГХ-МС исследовали образцы мочи 84 пациентов с ПМЗ (референсные значения определены на основании анализа 650 контрольных об- разцов мочи условно здоровых индивидуумов из биобанка лаборатории наследствен- ных болезней обмена веществ ФГБНУ «МГНЦ»); для определения концентрации ци- токинов FGF-21 и GDF-15 исследовали образцы плазмы крови пациентов с ПМЗ (N=105), а также с подтвержденным диагнозом других групп моногенных наследствен- ных заболеваний (N=107) и группы контроля (N=60 взрослых волонтеров 16-60 л., N=60 здоровых детей 1м.-10л.) в период с 2014 по 2018 гг. Для выполнения респиро- метрического анализа на оксиграфе Oxygraph-2k сформирована выборка из 27 ККФ па- циентов (5 женщин, 22 мужчин, возраст 1 г.-40 л.) с ПМЗ. Для определения референс- ных значений параметров респирометрии исследовали 10 контрольных ККФ (здоровые доноры, 8 мужчин, 2 женщины, возраст 23-45 л.).
Методы исследования
Выделение геномной ДНК из цельной крови с консервантом этилендиаминтет-
рауксусной кислотой (ЭДТА, pH=8.0), мочевого осадка и ККФ выполняли с использо- ванием готового набора реактивов для выделения AxyPrepTm Blood Genomic DNA Miniprep Kit 250-prep (AXYGEN) по методике, рекомендованной изготовителем.
Мультиплексную лигазно-зависимую амплификацию проб (MLPA) исполь- зовали для детекции 13 частых точковых мутаций мтДНК при помощи термостабиль- ной ДНК-лигазы фирмы “New England Biolabs” при 62°C. Продукт амплификации де- тектировали при помощи 9% ПААГ, окрашенном в бромистом этидии и визуализиро- вали на трансиллюминаторе в проходящем UV-свете при длине волны 260 нм.
ПЦР и последующее секвенирование амплификационных фрагментов про- водили методом прямого автоматического нерадиоактивного секвенирования (для ис- следования нуклеотидной последовательности) в двух отдельных реакционных смесях для каждого фрагмента: с прямого и обратного праймеров. Матрицей для проведения секвенирования служили фрагменты, полученные после проведения ПЦР. Автомати- ческое секвенирование проводили согласно протоколу фирмы-производителя на при- боре ABI PRISM 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Результаты секве- нирования анализировали с помощью программ Chromas и Nucleotide BLAST (NCBI, США) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Для детекции крупных делеций мтДНК выполняли ПЦР протяженных фраг- ментов (Long-Range PCR) с использованием полимеразы HF-Fuzz («Dialat LTD», Рос- сия) и парой праймеров, покрывающих регион, в котором описано большинство пато- генных крупных делеций мтДНК (m.6381-m.16566). Полученный фрагмент 10 т.п.н. анализировали в 1% агарозном геле в проходящем УФ-свете (λ=260 нм) при помощи
окрашивания в бромистом этидии.
Таргетное секвенирование 62 ядерных митохондриальных генов и 587 ядер-
ных генов наследственных болезней обмена веществ проведено методом NGS (Next Generation Sequencing) на приборе Ion Torrent PGMTM System for Next-Generation Sequencing (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Пробоподготовку образцов ДНК проводили набором реагентов Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0 (дизайн пула прай- меров по технологии Ampliseq) согласно протоколу производителя. Визуализация вы- равнивания секвенируемых фрагментов на референсную последовательность генома человека Human.hg19 проведена в программе IGV (Integrative Genomics Viewer, Broad Institute, USA) (Robinson J.Y. et al., 2017). Обнаруженные изменения аннотировали с помощью онлайн биоинформатического сервиса ANNOVAR (Wang K. et al., 2010).
Полный анализ последовательности мтДНК включал несколько этапов: с ис- пользованием полимеразы HF-Fuzz («Dialat LTD», Россия) проводили ПЦР с двумя длинными фрагментами мтДНК (по 8,5 и 9 т.п.н. соответственно), покрывающими всю последовательность мтДНК, с последующим выделением их из агарозного геля на ко- лонках Monarch DNA Gel Extraction Kit («New England Biolabs», Великобритания) со- гласно протоколу производителя. Смесь двух фрагментов мтДНК, по 50 нг каждый, использовали для подготовки библиотек для секвенирования с помощью коммерче- ского набора NEBNext® Fast DNA Fragmentation & Library Prep Set for Ion TorrentTM («New England Biolabs», Великобритания) с целью последующего параллельного се- квенирования на приборе IonTorrent («Life Technologies», «Thermo Fisher Scientific», США). Анализ полученных данных проводили с помощью выравнивания секвенируе- мых фрагментов мтДНК относительно референсной последовательности (GenBank NC_012920) в программе IGV. Обнаруженные нуклеотидные замены сравнивали с ба- зой данных по мутациям и полиморфизмам мтДНК MITOMAP (www.mitomap.org).
Определение концентрации цитокинов FGF-21 и GDF-15 в плазме крови им- муноферментным методом проводили с помощью коммерческих наборов Human fibroblast factor-21 ELISA, Human GDF-15 фирмы Biovendor (Czech Republic) по прото- колу производителя на плашечном спектрофлуориметре LS55 Luminescence Spectrometr (Perkin Elmer, Великобритания).
Культивирование фибробластов кожи. Первичные ККФ получены из фраг- мента биопсии кожи внутренней стороны предплечья (0,5 см в диаметре). Клетки вы- ращивали до 85% конфлюэнтности при 37 ̊С в специальной пролиферативной среде “Амниокар” (Пан-Эко ЛТД, Москва). Для исследования клетки субкультивировали в среде DMEM с добавлением 10% бычьей сыворотки (FBS) и 200 мкМ уридина.
Определение концентрации органических кислот в моче методом ГХ-МС в виде триметилсилиловых эфиров проводили аналогично Lefevere с соавт. с модифика- циями (Lefevere M.F. et al., 1989). Анализ выполняли на приборе 7890А/5975С (Agilent
Technologies, США) с колонкой НР-5МS (30 м*0.25 мм*4 мкм). Расчет полученных ре- зультатов осуществляли методом внутреннего стандарта (2-гидроксиизокапроновая кислота концентрацией 380 нМ) и проводили нормализация на уровень креатинина в образце.
Высокоразрешающая респирометрия. Для анализа скорости потребления кис- лорода на ККФ пациентов и контролей использовали метод высокоразрешающей ре- спирометрии на оксиграфе Oxygraph-2k (Oroboros Corp., Австрия), обработку данных производили с помощью программы DatLab 5.0. Суспензию ККФ пациентов и контро- лей в дыхательной среде MIR05 помещали в камеры оксиграфа и проводили 2 иссле- довательских протокола: с интактной мембраной согласно Doerrier C. (Doerrier C. et al., 2018) и с пермеабилизованной мембраной по протоколу Ye F. (Ye F., Hoppel C., 2013).
Активность цитрат-синтазы измеряли согласно протоколу Eigentler на спек- трофотометре UV-1800 фирмы “Shimadzu” (Япония) в 1 мл кювете (Larsen S. et al., 2012) в ККФ, собранных из камер оксиграфа после респирометрического анализа. По- лученный результат нормализован на уровень тотального белка в образце, измеренном методом Брэдфорда на плашечном спектрофлуориметре LS55 Luminescence Spectrometr (Perkin Elmer, США) (Bradford M.M., 1976).
Статистическая обработка данных. Для определения различий между груп- пами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни с уровнем значимости α = 0,05. Для оценки чувствительности и специфичности использовали ROC-анализ и подсчет площади под кривой (AUC) в программе GraphPrism 6.0. Максимальная спе- цифичность (95%) использовалась для определения порогового значения концентра- ции цитокинов FGF-21 и GDF-15. Диагностическая значимость рассчитывалась как по- ложительная прогностическая значимость (Positive Predictive Value, PPV) и отрица- тельная прогностическая значимость (Negative Predictive Value, NPV). Для подсчета корреляций использовали непараметрический регрессионный анализ по Спирмену.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение особенностей спектра органических кислот мочи у пациентов c ПМЗ
Определение уровня органических кислот методом ГХ-МС в моче проведено у 84 пациентов, распределенных по клиническим группам: синдром KSS (N=4), MELAS синдром (N=6), синдром Альперса (N=5), синдром Ли (N=33), синдром Пирсона (N=7), митохондриальная миопатия/энцефалопатия (N=24), DGUOK-ассоциированная гепа- топатия (N=5). Распределение мутаций по генам: MT-ND1 (N=2), MT-ND3 (N=1), MT- ND5 (N=6), MT-ND6 (N=3), MT-ATP6 (N=8), NDUFAF6 (N=1), NDUFS2 (N=1), NDUFS4 (N=1), NDUFV1 (N=1), POLG (N=6), RRM2B (N=1), SCO2 (N=11), SUCLG1 (N=1), SURF1 (N=9), TK2 (N=1), tRNA Leu (UUR) (N=7), tRNA Phe (N=1), TWNK (N=4), FBXL4 (N=1), DGUOK (N=5), COX10 (N=1), NUBPL (N=1); крупные делеции мтДНК (N=11). Среди 84 пациентов с ПМЗ отклонения в спектре и уровне органических кислот выяв- лены в 78% (66/84) случаев. Это согласуется с данными, полученными в других иссле- дованиях (Alban C. et al, 2017). При этом в каждой из клинических групп выявлены пациенты, у которых концентрация метаболитов оказалась в пределах нормы.
Основными патологическими изменениями в спектре органических кислот в моче повышение концентрации следующих метаболитов (Рис. 1А, Б): лактат (77%, 51/66), пируват (42%, 28/66), 2-гидроксиизобутират (86%, 57/66), 3-гидроксибутират
(95%, 63/66), фумарат (92%, 61/66), 4-гидроксифениллактат (27%, 18/66) и 4- гидрок- сифенилпируват (56%, 37/66). Все эти метаболиты относятся к соединениям, связан- ным с нарушением функции митохондрий, и отражают нарушение соотношения редокс-пары НАДН/НАД+ в цитоплазме клетки и внутри митохондрий.
Наибольшие значения концентрации лактата (рис. 1А) наблюдались в группе па- циентов с синдромом Ли (медиана – 27,24 мМ/М CRE, размах 0-19051 мМ/М CRE), митохондриальной миопатией/энцефалопатией (медиана – 41,6 мМ/М CRE, размах 1,65-83640 мМ/М CRE), DGUOK-ассоциированной гепатопатией (медиана – 34,95 мМ/М CRE, размах 16,02-118,2 мМ/М CRE), синдромом Пирсона (медиана – 250,2 мМ/М CRE, размах 22,59-3211 мМ/М CRE).
Концентрация пирувата (рис. 1А) оказалась значительно повышена в группах па- циентов с синдромом Ли (медиана – 7,72 мМ/М CRE, размах 0-268 мМ/М CRE), Пир- сона (медиана – 17,11 мМ/М CRE, размах 1,15-38,47 мМ/М CRE) и DGUOK-ассоции- рованной гепатопатией (медиана – 7,21 мМ/М CRE, размах 1,98-12,54 мМ/М CRE).
Концентрация 3-гидроксибутирата (рис. 1А) превышала нормальные значения в группе пациентов с синдромом Альперса (медиана – 16,12 мМ/М CRE, размах 2,9-100 мМ/М CRE), митохондриальной миопатией/энцефалопатией (медиана – 39,98 мМ/М CRE, размах 0-1963 мМ/М CRE) и в подгруппе пациентов с синдромом MELAS (меди- ана – 30,63 мМ/М CRE, размах 0-1879 мМ/М CRE). При сравнении с группой контроля все подгруппы имели статистически значимые различия (p<0,005). Концентрация фумарата (рис. 1Б) выявлено повышенным у всех подгрупп паци- ентов с ПМЗ, но значительное повышение определено только в группе пациентов с синдромом Пирсона (медиана - 31,9 мМ/М CRE, размах 7,1-74,73 мМ/М CRE) и у па- циентов с митохондриальной миопатией/энцефалопатией (медиана - 18,6 мМ/М CRE, размах 0-606 мМ/М CRE). У пациентов с мутациями в гене DGUOK выявлено стати- стически значимое повышение уровня 4-гидроксифениллактата (медиана - 1376 мМ/М CRE, размах 826-8615 мМ/М CRE), а также 4-гидроксифенилпирувата (медиана - 454,3 мМ/М CRE, размах 168,2-1018 мМ/М CRE), что связано с вовлечением дисфункции печени в патогенез заболевания (Boenzi S., Diodato D., 2018). Наибольшие значения концентраций 4-гидроксифениллактата и 4-гидроксифе- нилпирувата выявлено у пациента с частой мутацией в гене DGUOK NM_080916.2:c.3G>A (p.M1I) и делецией около 9 кб, затрагивающий 2 экзон гена. В исследуемой выборке повышение концентрации этилмалоновой кислоты выявлено у пациентов в группе митохондриальной миопатии/энцефалопатии (медиана – 10,91 мМ/М CRE, размах 0-34,95 мМ/М CRE), синдромом Альперса (медиана – 8,44 мМ/М CRE, размах 0-17,84 мМ/М CRE), Пирсона (медиана – 3,04 мМ/М CRE, размах 1,56- 7,53 мМ/М CRE) и KSS (медиана – 4,875 мМ/М CRE,

Рисунок 1. Концентрация метаболитов, ассоциированных с лактатурией (А) и концентрация метаболитов цикла Кребса (Б) в группах пациентов с ПМЗ.
Примечание: Данные представлены как медиана±межквартильный размах. p-value отмечен звездочкой, использован непараметри- ческий критерий Манна-Уитни при сравнении с контролем. * – p<0,05, **- p<0,005, ***- p<0,0005, ****- p<0,0001. размах 2,39-7,04 мМ/М CRE); статистически достоверного повышения концентрации метилмалоновой кислоты среди подгрупп пациентов с ПМЗ и группой контроля не об- наружено. В Таблице 1 суммированы данные по результатам анализа ROC-кривых и соот- ношения для выражения результатов оценки диагностического теста для спектра мета- болитов, характерных для пациентов с ПМЗ. Наибольшей чувствительностью по ре- зультатам ROC-анализа обладал 3-гидроксибутират (97,44%), а наибольшей специфич- ностью - 4-гидроксифенилпируват (93,8%) и 4-гидроксифениллактат (93,07%). При анализе площади под ROC-кривой (AUC) наибольшей диагностической значимостью теста обладал 3-гидроксибутират (0,9183), самой низкой - 4-гидроксифенилпируват (0,5172). При проведении оценки достоверности теста, наибольшая прогностическая ценность положительного теста выявлена у 4-гидроксифениллактата (94,74%) и пи- рувата (90,3%), данные метаболиты также обладали максимальным отношением прав- доподобия положительного результата теста (117,4 и 61 соответственно) и отношением правдоподобия отрицательного результата теста <1 (0,78 и 0,67 соответственно). В свою очередь, результаты отношений правдоподобия положительного и отрицатель- ного результатов теста дают основания не принимать во внимание диагно стическую значимость в отношении ПМЗ повышение концентрации 2-гидроксиизобутирата. Только у 4 из 6 пациентов с синдромом MELAS выявлены отклонения в спектре органических кислот в моче - у данной группы пациентов выявлен наибольший уро- вень лактата (размах 7,38-153849 мМ/М CRE) и уровень кетоновых тел - 3-гидроксибу- тирата и 2-гидроксиизобутирата поскольку MELAS характеризуется стойкой лактате- мией. (Stojanovic V., Ihle S., 2011). У пациентов с синдромом KSS (2 из 4) не наблюдали повышения уровня органических кислот в моче, в то же время пациенты с синдромом Пирсона (N=6) имели явные статистически значимые отклонения в уровне органиче- ских кислот: повышенный уровень лактата (максимально 3005 мМ/М CRE), 2-гидрок- сиизобутирата и 3-гидроксибутирата, а также фумаровой кислоты. В литературе опи- саны гено-фенотипические корреляции у пациентов с синдромом Ли, вызванном мута- циями в гене SURF1. Пациенты, у которых присутствует частая мутация NM_003172.4:c.845_846delCT в гомозиготном состоянии, имеют более тяжелый фено- тип и прогноз, по сравнению с пациентами, у которых встречаются мутации в гене SURF1 в компаунд-гетерозиготном состоянии (Piekutowska-Abramczuk D. et al., 2009). У пациентов с гомозиготным вариантом NM_003172.4: c.845_846delCT выявлено по- вышение концентрации 2-оксоглутарата (размах 383,77-2385,63 мМ/М CRE), лактата (размах 27,99-155,94 мМ/М CRE), пирувата (размах 7,72-23,24 мМ/М CRE), сукцината (размах 8,15-23,74 мМ/М CRE) и фумарата (размах 12,88-71,75 мМ/М CRE). В то время как у пациентов с компаунд-гетерозиготными мутациями выявлено только повышение 2-кетоглутарата (размах 75,15-212,8 мМ/М CRE) и незначительно фумарата (размах 0- 4,42 мМ/М CRE). Таблица 1. Диагностические характеристики спектра и уровня метаболитов у пациентов с ПМЗ. ПЦПТ - прогностическая ценность положительного теста, ПЦОТ - прогностическая ценность отрицательного теста, ОППР - отношение правдоподобия по- ложительного результата теста, ОПОР - отношение правдоподобия отрицательного результата теста. Параметр/ Метаболит Чувствительность, ROC-анализ Специфичность, ROC-анализ AUC, ROC-анализ Чувствительность теста Специфичность теста ПЦПТ ПЦОТ Индекс точности ОППР ОПОР Лак- тат 83,3% 74,63% 0,8575 60,7% 89,8% 47,7% 93,7% 85,6% 5,9 0,44 Пи- руват 87,95% 63% 0,8514 33,3% 99,4% 90,3% 90,7% 90,7% 61 0,67 3- гид- рокси- бути- рат 97,44% 69,61% 0,9183 73,8% 65,6% 24,7% 94,2% 66,7% 2,14 0,39 2- гидрокси- изобути- рат 65% 66,62% 0,7453 66,7% 23,3% 11,7% 82% 29% 0,87 117,4286 8,323481 1,995518 4,102602 2,046685 1,43 0,787151 0,590788 0,817237 0,3327 0,760624 4-гидрокси- фенил лактат 64,7% 93,07% 0,6331 21,43% 99,82% 94,74% 89,23% 4-гидрокси- Сукци- фенилпи- нат руват 52,94% 64,71% 93,8% 65,69% 0,5172 0,6820 44,05% 30,95% 94,71% 84,49% 56,06% 23,42% 91,70% 88,87% Фума- рат 89,41% 68,43% 0,8468 72,62% 82,30% 38,61% 95,15% 2-кетоглута- рат 65,15% 58% 0,6574 38,10% 81,39% 23,88% 89,56% 89,40% 87,97% 77,37% 81,01% 75,63% Пациенты с ПМЗ сгруппированы в зависимости от функционального дефекта: де- леции мтДНК (N=11), истощение мтДНК (N=16), нарушение АТФазы 6 (N=8), нарушение КДЦМ I (N=20), КДЦМ IV (N=21), мутации мт тРНК (N=8). Сочетанное повышение кон- центрации лактата, пирувата, 3-гидроксибутирата, 2-гидроксиизобутирата, 2-кетоглута- рата, сукцината, малата и значительно фумарата наблюдалось у пациентов с недостаточ- ностью КДЦМ I (у 13/20). Значительное повышение концентрации фумарата связано с компенсаторным механизмом КДЦМ II в ответ на дисфункцию КДЦМ I. Для КДЦМ IV (в 76% случаев, 16/21) наблюдали повышение содержания метаболитов цикла Кребса (сукцинат, фумарат, 2-кетоглутарат) и кетоновых тел (в особенности 3-гидроксибути- рата), связанных с нарушением редокс-пары НАДН/НАД+. В группе пациентов с нару- шением АТФазы выявлено повышение содержания сукцината (в связи с нарушением син- теза АТФ, являющийся кофактором реакции превращения сукцината из сукцинил КоА), фумарата и 2-кетоглутарата. При анализе органических кислот в моче у пациентов с различными формами ПМЗ выявляется как стандартный «набор» патологических метаболитов, отражающий наруше- ние окислительного фосфорилирования, так и абсолютно нормальный профиль органи- ческих кислот. С практической точки зрения, анализ органических кислот мочи должен проводиться всем пациентам с подозрением на митохондриальное заболевание как с це- лью дифференциальной диагностики с органическими ацидуриями, имеющими сходные клинические проявления (например пропионовая и метилмалоновая), так и с целью полу- чения дополнительной доказательной базы о нарушении функции дыхательной цепи ми- тохондрий. Исследование уровня плазменных цитокинов FGF-21 и GDF-15 в группе пациентов с ПМЗ и другими моногенными заболеваниями FGF-21 — это гормоноподобный цитокин, который при нормальных физиологиче- ских условиях в основном синтезируется в печени (гепатокин). Однако при патологиче- ских условиях он может вырабатываться в других органах и тканях, действуя как ауто/па- ракринный фактор (Klaus S. et al., 2021). В 2011 году Suomalainen с соавт. показано, что концентрация данного цитокина повышается у пациентов с ПМЗ (Suomalainen A. et al. 2011). На первом этапе работы определены референсные значения плазменного цитокина FGF-21. Медиана составила 43 пг/мл (межквартильный размах 30-102 пг/мл), пороговое значение - 400 пг/мл, что сопоставимо с результатами международных исследований (Davis R.L. et al., 2016; Lehtonen J.M. et al., 2021; Morovat A. et al., 2017). Медиана значений концентрации цитокина FGF-21 в плазме крови для группы пациентов с ПМЗ составила 232 пг/мл (межквартильный размах составил 64-900 пг/мл). Группа пациентов с ПМЗ по- делена на следующие подгруппы (Рис. 2А): синдром Ли (N=29), НОНЛ (N=22), митохон- дриальная миопатия/энцефалопатия (N=25), MELAS синдром (N=10), синдром KSS (N=5), синдром PEO (N=5), Альперс синдром (N=5), DGUOK- ассоциированная гепатопа- тия (N=4). Не выявлено статистически значимых различий в значении концентраций ци- токина FGF-21 между контрольной группой и пациентами с синдромом Альперса. Наибо- лее значимые статистические различия содержания цитокина FGF-21 выявлены в группе пациентов с DGUOK-ассоциированной гепатопатией, MELAS синдромом и митохондри- альной миопатией/энцефалопатией. Самая высокая концентрация FGF-21 выявлена у па- циента с мутациями в гене RRM2B (35777,1 пг/мл). Максимальное значение уровня FGF- 21 у данного пациента может быть связано с тяжелой клинической симптоматикой, как ранее отмечено у Suomalainen (Suomalainen A. et al., 2011). Группу немитохондриальных заболеваний составили пациенты детского возраста (0-18 л.): с миодистрофией Дюшенна (DMD, N=25), спинальной мышечной атрофией (СМА, N=23), лейкодистрофией (N=19), органическими ацидуриями (ОА, N=8), немито- хондриальными гепатопатиями (гликогенозы 1a, 1b, 9a, 0 типов; синдром Алажиля, про- грессивный семейный внутрипеченочный холестаз, галактоземия I типа, N=32). Стати- стически значимые различия концентрации FGF-21 (Рис. 2Б) выявлены в подгруппах па- циентов с миодистрофией Дюшенна, лейкодистрофиями и немитохондриальными гепа- топатиями. У трех пациентов с органическими ацидуриями (пропионовая ацидурия, ме- тилмалоновая ацидурия и глутаровая ацидурия I типа) выявлены высокие значения уровня FGF-21, однако не превышали максимального уровня в группе среди ПМЗ, как показано у Manoli при сравнении уровня FGF-21 между пациентами с метилмалоновой ацидурией и ПМЗ (Manoli I. et al., 2018; Molema F. et al., 2018). GDF-15 – это цитокин суперсемейства трансформирующих ростовых факторов β, который экспрессируется в основном в плаценте, почках, печени, легких, поджелудочной и предстательной железах (Цыганкова П.Г. и др., 2018). Ранее повышение уровня GDF- 15 рассматривалось в качестве биомаркёра ПМЗ (Kalko S.G. et al., 2014). При сравнении содержания GDF-15 в плазме крови между подгруппами контроля взрослых и детей (Рис. 2В) выявлены статистические различия (p<0,0005). Медиана зна- чений концентрации GDF-15 в подгруппе контролей детей составила 907,5 пг/мл (поро- говое значение составило 2400 пг/мл), взрослых - 1985 пг/мл (пороговое значение соста- вило 5000 пг/мл). Пороговое значение GDF-15, полученное в ходе исследования кон- трольной группы, сопоставимо с результатами международных исследований (Maresca A. et al., 2020; Davis R.L. et al., 2016). Подгруппы пациентов с ПМЗ проанализированы от- дельно по возрасту: дети - синдром Ли (N=28), MELAS синдром (N=3), синдром Альперса (N=5), митохондриальная миопатия/энцефалопатия (N=20), DGUOK-ассоциированная ге- патопатия (N=4); взрослые-с оптической нейропатией зрительного нерва Лебера (НОНЛ, N=21), KSS (N=3), синдром MELAS (N=7), митохондриальная миопатия/энцефалопатия (N=5), PEO (N=5). Наибольшие значения концентрации GDF-15 выявлены в группе ми- тохондриальных миопатий/энцефаломиопатий - у пациента с мутациями в гене RRM2B концентрация GDF-15 в плазме крови составила 326320 пг/мл, а также у пациентов с му- тациями в гене DGUOK значения варьировались от 67600 пг/мл до 226800 пг/мл. Рисунок 2. Содержание FGF-21 (A) и GDF-15 (В) в плазме крови у групп пациентов с ПМЗ и пациентов с неПМЗ (Б, Г соответственно) и контрольной группы. Примечание: Данные представлены как медиана±межквартильный размах. * - p<0,05, **- p<0,005, ***- p<0,0005, ****- p<0,0001. Концентрация GDF-15 определена в образцах плазмы крови пациентов детского возраста (0-18 л.) со следующими наследственными заболеваниями, не связанными с пер- вичной патологией митохондрий (Рис. 2Г): миодистрофией Дюшенна (DMD, N=25), спи- нальной мышечной атрофией (СМА, N=23), лейкодистрофией (N=19), органическими ацидуриями (ОА, N=8), немитохондриальными гепатопатиями (гликогенозы 1a, 1b, 9a, 0 типов; болезнь Алажиля, прогрессивный семейный внутрипеченочный холестаз, галакто- земия I типа, N=32). Статистически значимые различия и максимальные концентрации данного цитокина выявлены в группе немитохондриальных гепатопатий (22030 пг/мл). Также высокие значения выявлены у четырех пациентов с пероксисомной патологией и у пациентов с органическими ацидуриями (с мутациями в генах MMACHC и PCCB). При исследовании концентрации цитокинов FGF-21 и GDF-15 (Таблица 2) в плазме крови среди пациентов с ПМЗ и неПМЗ положительная прогностическая значимость для FGF-21 (Positive Predictive Value, PPV) составила 59,15 %, а отрицательная прогностиче- ская значимость (Negative Predictive Value, NPV) - 54,55 %. Для GDF-15 (среди пациентов детского возраста) PPV составила 54,32 %, а NPV - 76,92%; чувствительность теста соста- вила для FGF-21 - 39,25%, для GDF-15 - 67,65%; специфичность теста составила 72,9% и 65,42% и распространенность (Prevalence) 50% и 37,79% для FGF-21 и GDF-15 соответ- ственно. В текущем исследовании показано, что цитокины FGF-21 и GDF-15 не могут ис- пользоваться в качестве универсальных маркеров ПМЗ, поскольку их уровень может по- вышаться при других формах наследственных заболеваний (спинальная мышечная дис- трофия, немитохондриальные гепатопатии и некоторые формы лейкодистрофий). Кроме того, данные маркеры обладают низкой специфичностью, чувствительностью и прогно- стической диагностической значимостью. Таблица 2. Диагностические характеристики содержания цитокинов у пациентов с ПМЗ Пара- Чув- метр/ стви- Цитокин тель- ность FGF-21 39,25% GDF-15 67,69% Специ- PPV фич- ность NPV Ин- Отношение декс правдоподо- точно- бия положи- сти тельного ре- зультата те- ста 56,07% 1,44 66,28% 1,96 Отношение правдоподо- бия отрица- тельного ре- зультата теста 0,83 0,49 72,90% 59,15% 54,55% 65,42% 54,32% 76,92% Высокоразрешающая респирометрия на ККФ пациентов с ПМЗ и контрольной группы Для оценки функционирования системы окислительного фосфорилирования (OXPHOS) проводили респирометрию высокого разрешения (от англ. High-Resolution Respirometry) на интактных и пермеабилизованных ККФ здоровых доноров (N=10) и па- циентов с подтвержденным молекулярно-генетическими методами диагнозом ПМЗ (N=27). Для респирометрического анализа оценивали соотношения скоростей дыхания при добавлении различных субстратов/ингибиторов/разобщителей ДЦМ. Для валидации метода проанализировано 10 контрольных ККФ (от здоровых доно- ров). В интактном протоколе зарегистрирована типичная кривая и проанализированы сле- дующие параметры респирометрического графика (Рис. 3): R, ROUTINE (рутинная ско- рость потребления кислорода на эндогенных субстратах), L, LEAK (скорость потребления кислорода после добавления ингибитора КДЦМ V олигомицина), E, ETS (максимальная мощность работы цепи переносчиков электронов за счет разобщителя FCCP) и антими- цин-нечувствительное дыхание за счет ингибирования антимицином А (ROX), которое вычиталось из каждого параметра респирометрии. Соотношения респирометрии: R/E, L/E, netR/E ((R-L)/E)) и их референсные значения представлены в табл. 3. (Doerrier C. et al., 2018). Рисунок 3. Типичный график кривой потребления кислорода при использовании интактного протокола. Примечение: Здесь и далее: красная линия - траектория изменения скорости потребления кислорода ККФ контроля, синяя линия - траектория концентрации кислорода в камере оксиграфа с помещенными ККФ контроля в дыхательной среде MIR05). Mal+Pyr - ма- лат+пируват, Omy - олигомицин, FCCP - титрование FCCP, Rot - ротенон, Ama - антими- цин А. Таблица 3. Референсные значения соотношений респирометрии для контрольных ККФ при использовании интактного протокола и мировые литературные данные. Параметр R/E L/E netR/E Значение контрольных ККФ (среднее±ст.отклонение) 0,37 ±0,03 0,11 ±0,03 0,25 ±0,03 Литературные данные (Hutter E. et al. 2004) (среднее±ст.отклонение) 0,34 ± 0,03 0,14 ± 0,02 0,20 ± 0,02 На рис. 4 представлен график типичной кривой потребления кислорода контроль- ной ККФ с использованием пермеабилизованного протокола. Используемые соотноше- ния респирометрии при проведении пермеабилизованного протокола и их референсные значения представлены в табл. 4. Рисунок 4. Типичный график кривой потребления кислорода при использовании пермеабилизованного протокола. Примечание: Mal+Pyr - малат+пируват, Dig - дигитонин, ADP - АДФ, Glu - глутамат, Suc - сукцинат, FCCP - титрование FCCP, Rot - ротенон, Ama - антимицин А, asc+TMPD - аскорбат+ТМПД, Azide Na - азид натрия. Таблица 4. Референсные значения соотношений респирометрии для контрольных ККФ при использовании пермеабилизованного протокола. Параметр CI/ETS CI+II/ETS CIIETS/ETS CIV/ETS CI/CI+II CIETS/ETS Значение контрольных ККФ (среднее±ст.отклонение) 0,38±0,11 0,55±0,13 0,43±0,07 1,09±0,21 0,68±0,07 0,57±0,07 Среди 27 исследуемых пациентов в интактном протоколе выявлены отклонения на 20 (74%) ККФ. При дальнейшем проведении респирометрического протокола на 15 пер- меабилизованных ККФ пациентов, отклонения выявлены у 13 (87%) больных. У 17 пациентов с патогенными (известными) мутациями мтДНК m.10158T>C, m.3460G>A (N=6), m.11778G>A (N=4), m.3472T>C, m.4171C>A, m.14597A>G (N=2), m.3260A>G, а также пациента с компаунд-гетерозиготными мутациями в гене NUBPL, в интактном протоколе (рис. 5) выявлены изменения в контрольных соотношениях респи- рометрии (FCR, от англ. Flux Control Ratios). Средние значения соотношений респиро- метрии R/E, L/E, netR/E ККФ пациентов соответственно в 1,9, 1,7, 2 раз превышало дан- ные значения у группы ККФ контроля и статистически различались (p<0,001). ККФ 12 пациентов с патогенными (известными) мутациями мтДНК m.10158T>C, m.14597A>G (N=2), m.3460G>A (N=4), m.4171C>A, m.11778G>A (N=2), m.3260A>G, а также пациента с компаунд-гетерозиготными мутациями в гене NUBPL, проанализиро- ваны с помощью протокола с пермеабилизованной дигитонином мембраной (рис. 6). Со- отношения CI/ETS и СIETS/ETS снижены у пациентов с ПМЗ в 1,5 и 1,2 раз соответственно по сравнению с контролем (рис. 7), что говорит о нарушении НАДН-зависимого пути из- за дисфункции КДЦМ I. Отмечено повышение соотношений CI+II/ETS, CIIETS/ETS и сни- жение CI/CI+II по сравнению с контролем в 1,2, 1,22 и 1,5 раз соответственно, что связано с компенсаторной реакцией на нарушение КДЦМ I.
Замена m.641A>T в гене tRNA-Phe, кодирующий митохондриальную транспорт- ную РНК фенилаланин, ингибирует синтез митохондриальных белков (субъединиц КДЦМ и факторов сборки) и как следствие, снижается активность всех КДЦМ (Itkis Y.S. et al., 2019). При исследовании фибробластов в интактном протоколе выявлены измене- ния, характерные для ПМЗ. Показатели R/E, netR/E на ККФ пациента в 1,7 и 1,8 раз соот- ветственно превышали данные значения на ККФ контроля. Однако при использовании протокола с дигитонином в соотношениях респирометрии не выявлено отклонений. При
нормализации первичных данных на уровень активности цитрат-синтазы, получены до- стоверные отличия от контроля, выявлено функциональное снижение активности КДЦМ I, II, IV (рис. 8, 9). Полученные данные указывают на нарушение системы окислительного фосфорилирования в митохондриях пациента с вовлечением КДЦМ I, II, IV.
Рисунок 5. Графики результатов оксиграфии (сверху) на интактных ККФ контроля (зеленый) и пациента с заменой m.3460 (красный). Контрольные значения респирометрии (снизу, FCR, интактный протокол) пациентов с подтвержденным диагнозом первичного МЗ и контрольными ККФ.
Примечание: M+P – малат+пируват, Omy – олигомицин, F – титрование FCCP, Rot – роте- нон, Ama – антимицин А. Данные представлены как медиана±межквартильный размах. ****- p<0,0001. Рисунок 6. Графики результатов оксиграфии на пермеабилизованных ККФ кон- троля (зеленый) и пациента с мутацией m.3460G>A (красный).
Рисунок 7. Контрольные значения респирометрии (FCR) пациентов с подтвер- жденным диагнозом первичного МЗ и контрольными ККФ в пермеабилизованном прото- коле.
Примечание: Данные представлены как медиана±межквартильный размах. * – p<0,05, **- p<0,005, ***- p<0,0005, ****- p<0,0001. Рисунок 8. Графики результатов респирометрии на пермеабилизованных ККФ контроля (зеленый) и пациента с заменой m.641A>T (красный).
На ККФ пациентов с гомозиготным однонуклеотидным вариантом NM:032317: с.152A>G гене DNAJC30, ассоциированном с аутосомно-рецессивной формой НОНЛ, проведены интактный и пермеабилизованный протоколы (Stenton S.L. et al., 2021). По ре- зультатам интактного протокола (рис. 10, слева) выявлены статистически значимые от- клонения в соотношениях респирометрии у пациентов М14 и М16 по сравнению с кон- трольной группой. Средние значения соотношений R/E и netR/E превышали значения в 1,7 и 1,8 раз и в 1,3 и 1,29 раз у пациентов М14 и М16 соответственно, по сравнению с контрольной группой. На протоколе с пермеабилизованной мембраной статистически до- стоверных различий не обнаружено (рис. 10, справа).
Результаты высокоразрешающей респирометрии на ККФ у двух пациентов с гете- роплазмичеcкой заменой (24% и 25% соответственно) в крови m.13513G>A не показали отклонений от нормы в интактном протоколе. Также в исследование вошли пять ККФ пациентов с известными патогенными мутациями мтДНК m.14484T>C (N=2),

m.14487T>C (N=1) и m.3635G>A (N=2) в гомоплазмическом состоянии, которые не пока- зали отклонений в соотношениях респирометрии по сравнению с контролем в интактном протоколе.
Рисунок 9. Результаты респирометрического анализа на интактных ККФ пациента с заменой m.641A>T и на ККФ контрольной группы (слева, эксперименты выполнены в трипликате). Результаты респирометрического анализа пермеабилизованных ККФ паци- ента с заменой m.641A>T и контрольных ККФ, нормализованных на уровень активности цитрат-синтазы (справа, эксперименты выполнены в трипликате). * – p<0,05, **- p<0,005, ***- p<0,0005, ****- p<0,0001. Рисунок 10. Результаты респирометрического анализа на интактных ККФ пациен- тов с высоковероятной заменой в гене DNAJC30 и на ККФ контрольной группы (слева, эксперименты выполнены в трипликате). Результаты респирометрического анализа пер- меабилизованных ККФ пациентов с высоковероятной заменой в гене DNAJC30 и ККФ контрольной группы (справа). Данные представлены как среднее±стандартное отклоне- ние. **- p<0,005. Полученные результаты свидетельствуют о том, что метод высокоразрешающей респирометрии может применяться для подтверждения патогенности новых выявленных вариантов нуклеотидной последовательности и также при исследовании патогенности ра- нее не описанных мутаций в генах. Однако будет ли выявлен функциональный дефект - зависит от расположения варианта (насколько вариант влияет на конформацию белка, структуру ДЦМ), в случаях выявления вариантов в мтДНК - в каком состоянии гетеро- плазмии обнаружено изменение. ВЫВОДЫ 1. На основании анализа чувствительности и специфичности теста по определе- нию концентрации метаболитов в моче установлено, что диагностическая значимость биомаркеров при ПМЗ убывает в ряду: 3-гидроксибутират (AUC=0,9183), лактат (AUC=0,8575), пируват (AUC=0,8514). Пируват и 4-гидроксифениллактат обладали мак- симальным отношением правдоподобия положительного результата теста (117,4 и 61 со- ответственно) и отношением правдоподобия отрицательного результата теста <1 (0,78 и 0,67 соответственно). 2. Выявлен уникальный спектр органических кислот в моче, характерный для ми- тохондриальной гепатопатии, вызванной генетическими вариантами в гене DGUOK (наравне с повышением уровня лактата, пирувата, 3-гидроксибутирата, выявлено повы- шение концентрации 4-гидроксифениллактата, 4-гидроксифенилпирувата). 3. Показаны статистические значимые различия концентрации цитокинов FGF-21 (p <0,0001) и GDF-15 (p <0,0005 - дети; p <0,05 - взрослые) в группе пациентов с ПМЗ по сравнению с группой контроля. Для ПМЗ тест по определению концентрации цитокинов FGF-21 и GDF-15 в плазме крови обладает низкой положительной прогностической зна- чимостью (PPV - 56% для FGF-21 и PPV - 58% для GDF-15); низкой чувствительностью и специфичностью (77% и 62,5% для FGF-21 и 88,7%/53,49 % (дети/взрослые) и 65%/73,3% (дети/взрослые) для GDF-15 соответственно). 4. Определены референсные значения соотношений респирометрии в интактном и пермеабилизованном протоколах на линиях клеток кожных фибробластов контрольных образцов. Для интактного протокола референсные значения составляют: R/E (0,37±0,03), L/E (0,11±0,03), netR/E (0,25±0,03). Для пермеабилизованного протокола референсные значения составляют: CI/ETS (0,38±0,11), CI+II/ETS (0,55±0,13), CIIETS/ETS (0,43±0,07), CIV/ETS (1,09±0,21), CI/CI+II (0,68±0,07), CIETS/ETS (0,57±0,07). 5. На линиях клеток кожных фибробластов пациентов с известными вариантами мтДНК m.10158T>C, m.3460G>A, m.11778G>A, m.3472T>C, m.4171C>A, m.14597A>G, m.3260A>G, а также для NM_025152: c.[815-27T>C];[1A>T] в гене NUBPL обнаружены отклонения в соотношениях респирометрии R/E (p<0,0001), L/E (p<0,0001), netR/E (p<0,0001) по сравнению с контролем при использовании интактного протокола; в перме- абилизованном протоколе выявлены статически достоверные различия соотношений CI/ETS (p<0,05), СIETS/ETS (p<0,005), CI+II/ETS (p<0,05), CIIETS/ETS (p<0,005), CIV/ETS (p<0,05) и CI/CI+II (p<0,0001). Параметры R/E, netR/E, CI/CI+II можно использовать в каче- стве функциональных маркеров нарушения системы окислительного фосфорилирования. 6. Проведено уточнение функциональной значимости двух генетических вариан- тов с неизвестным клиническим значением: NM:032317: с.152A>G в гене DNAJC30 у па- циентов с аутосомно-рецессивной формой НОНЛ и m.641A>Т в гене tRNA-Phe у паци- ентки с эпилептической энцефалопатией методом высокоразрешающей респирометрии
на линиях клеток кожных фибробластов. Показано, что данные варианты влияют на функ- циональную активность митохондрий, выраженную в неэффективном уровне окисли- тельного фосфорилирования.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Следует обращать внимание в диагностической практике на повышение кон- центрации лактата, пирувата, 3-гидроксибутирата и метаболитов цикла Кребса (малат, фумарат, сукцинат, 2-оксоглутарат) в моче при анализе методом ГХ-МС, поскольку в 78% случаев изменения концентрации данных метаболитов выявляются у пациентов с ПМЗ.
2. Для постановки диагноза необходимо комплексно оценивать биохимические маркеры. Так, наиболее высокие концентрации цитокинов FGF-21 и GDF-15 в плазме крови выявлены в группе DGUOK-ассоциированных гепатопатий. В группе немитохон- дриальных гепатопатий концентрации данных цитокинов также повышены. При анализе уровня органических кислот в моче у пациентов с DGUOK-ассоциированной гепатопа- тией наблюдается повышение 4-гидроксифенилактата и 4-гидроксифенилпирувата.
3. Респирометрический анализ на ККФ пациентов с ПМЗ может использоваться в качестве функционального теста митохондриальной дисфункции при обнаружении но- вых генетических вариантов/генов. Однако стоит отметить, что наличие нормальных по- казателей респирометрического анализа не исключает ПМЗ.