ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………………………… 13
1.1. Использование метода штрих-кодирования ДНК для выявления
таксономической принадлежности организмов …………………………………………… 13
1.1.1. Штрих-кодирование ДНК, его суть и основные подходы ……………….. 13
1.1.2. Участок ДНК для «штрих-кодирования» организмов …………………….. 14
1.1.2.1. Рибосомная ДНК (рДНК) ……………………………………………………….. 15
1.1.2.2. Хлоропластная ДНК (хлДНК)…………………………………………………. 18
1.1.2.3. Митохондриальная ДНК (мтДНК) ………………………………………….. 22
1.1.3. Молекулярно-филогенетический анализ ……………………………………….. 24
1.1.4. Метабаркодирование ДНК …………………………………………………………… 26
1.1.5. Материалы для штрих-кодирования ДНК ……………………………………… 29
1.1.6. Ограничения штрих-кодирования ДНК ………………………………………… 30
1.2. Методы молекулярно-генетической идентификации организмов …………. 31
1.2.1. ПЦР в реальном времени с использованием зондов ……………………….. 32
1.2.1.1. Молекулярные маяки («molecular beacons») …………………………….. 32
1.2.1.2 TaqMan зонды …………………………………………………………………………… 33
1.2.2. Секвенирование следующего поколения (NGS) …………………………….. 35
1.2.2.1. 454 (Roche) пиросеквенирование …………………………………………….. 37
1.2.2.2. Ion Torrent ……………………………………………………………………………… 39
1.2.2.3. Illumina (Solexa) …………………………………………………………………….. 40
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ…………………………………………….. 42
2.1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………………………………………. 42
2.1.1. Объект исследования …………………………………………………………………….. 42
2.1.2. Методы исследования ……………………………………………………………………. 43
2.1.2.1. Выделение ДНК из биоматериала с помощью ЦТАБ – буфера …….. 43
2.1.2.2. Выделение ДНК с помощью набора Quick – gDNA MiniPred (Zymo
Research) …………………………………………………………………………………………….. 43
2.1.2.3. Проведение ПЦР………………………………………………………………………. 44
2.1.2.4. Проведение ПЦР в реальном времени ……………………………………….. 45
2.1.2.5. Гель – электрофорез в 2% агарозном геле …………………………………… 45
2.1.2.6. Экстракция ДНК из агарозного геля с помощью набора Cleanup
Standard (Евроген, Россия)……………………………………………………………………. 46
2.1.2.7. Рестрикционный анализ (ПЦР – ПДРФ) …………………………………….. 46
2.1.2.8. Разработка TaqMan зондов ……………………………………………………….. 47
2.1.2.9. ПЦР с TaqMan зондами …………………………………………………………….. 48
2.1.2.10. Секвенирование ……………………………………………………………………… 49
2.1.2.11. Статистические алгоритмы и компьютерные программы,
использованные для анализа полученных последовательностей ……………… 49
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ………………………………………… 51
3.1. Дифференциация видов клопов рода Eurygaster Laporte, 1833 (Hemiptera:
Heteroptera: Scutelleridae), основных вредителей зерновых культур в
европейской части России, на основе морфологических признаков и штрих-
кодирования ДНК……………………………………………………………………………………… 51
3.1.1. Возможности дифференцировки видов клопов рода Eurygaster по
морфологическим характеристикам ………………………………………………………… 51
3.1.2. Идентификация клопов рода Eurygaster на основе секвенирования гена
субъединицы 1 митохондриальной цитохромоксидазы …………………………….. 57
3.1.3. Разработка метода для экспресс – идентификации наиболее
вредоносного вида для злаковых культур – Eu. integriceps…………………………. 63
3.2. Дифференциация коммерчески доступных видов клещей родов Amblyseius
и Neoseiulus (Acari: Phytoseiidae) с помощью молекулярно-генетических
методов ……………………………………………………………………………………………………. 67
3.2.1. Штрих-кодирование ДНК клещей родов Amblyseius и Neoseiulus ……… 67
3.2.2. Разработка метода быстрой дифференциации коммерчески доступных
видов клещей родов Amblyseius и Neoseiulus (Acari: Phytoseiidae) на основе
рестрикционного анализа ……………………………………………………………………….. 73
3.3. Дифференциация подвидов медоносных пчел России на основе штрих-
кодирования ДНК и с помощью мутагенной ПЦР-ПДРФ …………………………….. 75
3.3.1. Штрих-кодирование ДНК подвидов медоносных пчел России …………. 75
3.3.1. Разработка метода дифференциации ключевых пород медоносных пчел
в России на основе мутагенной ПЦР-ПДРФ …………………………………………….. 83
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………………………………………………………………………………… 89
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ …………………… 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………….. 95
ПРИЛОЖЕНИЕ А …………………………………………………………………………………… 128

Объектом исследования служили клопы-черепашки рода Eurygaster (Hemiptera, Heteroptera, Scutelleridae): Eu. integriceps Put. (клоп вредная черепашка), Eu. maura L. (клоп маврская черепашка), Eu. dilaticollis Dohrn (хлебный клоп-черепашка) и Eu. testudinaria Geoffr. (клоп влаголюбивая черепашка). Материал по Eu. integriceps, Eu. maura и Eu. testudinaria собран в окрестностях города Воронежа, Eu. dilaticollis собран на Северо-Западном Кавказе, в Тебердинском государственном заповеднике и на Южном Урале, в Южно-Уральском государственном заповеднике.
Нами было проведено штрих-кодирование клещей родов Amblyseius и Neoseiulus (Arachnida, Mesostigmata, Phytoseiidae): A. swirskii Athias-Henriot, N. barkeri Hughes, N. cucumeris, полученных от Всероссийского научно- исследовательского института защиты растений (ФГБНУ ВИЗР, Сант- Петербург).
Кроме того, материалом для исследований служили различные подвиды медоносных пчел (Apis mellifera Linnaeus, 1758): A. mellifera carpathica и A. mellifera carnica с пасек Майкопского федерального пчеловодческого хозяйства (Республика Адыгея, Россия), A. mellifera caucasica из Краснополянской опытной пчеловодческой станции (Краснодарский край, Россия) и A. mellifera mellifera из Республики Башкортостан, Россия.
Подготовку препаратов и морфологические исследования проводили с помощью бинокулярного светового микроскопа МБС-10. Фотографии образцов были сделаны с помощью камеры Leica DFC495, установленной на бинокулярном микроскопе Leica M205C. Обработка и анализ изображений проводились с использованием программного обеспечения Leica Application Suite v4.5. Рисунки гениталий самцов рода Eurygaster изготавливали с помощью рисовального аппарата RA-6 после выделения гениталий и обработки 4% КОН (Голуб и др., 2012). Морфологическая идентификация проводилась по ранее
разработанным идентификационным ключам (Кириченко, 1951б; Stichel, 1959- 1962; Кержнер и Ячевский, 1964; Голуб, 1980).
Выделение ДНК из насекомых и клещей проводили с помощью набора Quick – gDNA MiniPred (Zymo Research). Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием Taq-полимеразы на приборе Mastercycler personal (Eppendorf, Германия). Смешивали в пробирке 0,25 мл следующие компоненты: 10Х реакционный буфер – 2,5 мкл; 10 мМ dNTP – 1 мкл; 10 мкмоль праймер – 1 мкл; 10 мкмоль обратный праймер – 1 мкл; 25 мМ Mg2+ – 3 мкл; матрица – 1 мкг; термостабильная Taq-полимераза – 2.5 ед.; деионизованная вода – до 25 мкл. Использовались следующие температурные циклы: предварительный нагрев 94 °С 3 мин; 35 циклов денатурация 94 °С 30 сек, отжиг праймеров 51 °С 30 сек, элонгация цепи 72 °С 45 сек; конечная элонгация 72 °С 10 мин.
Визуализацию продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с последующей визуализацией на трансиллюминаторе TCP- 20LM при длине волны 312 нм. В качестве красителя нуклеиновых кислот использовали бромистый этидий. Размер продуктов определяли путём сравнения с маркерами ДНК известной длины (Евроген, Россия). Извлечение из агарозного геля и очистку ампликона проводили с помощью коммерчески доступного набора Cleanup Standard (Евроген, Россия). Секвенирование очищенных продуктов ПЦР проводилось по методу Сенгера на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3730 с использованием BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. В качестве праймеров для секвенирования использовались те же, что и для амплификации целевого фрагмента.
Выравнивание полученных секвенированных нуклеотидных последовательностей выполнялось с помощью инструмента Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/). Последовательности были переведены в аминокислотные последовательности, чтобы убедиться, что они свободны от стоп-кодонов и «пробелов» с помощью EMBOSS Transeq (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/st/emboss_transeq/). Филогенетический анализ проводили с
использованием программного обеспечения Mega 6 (Center for Evolutional Medicine and Informatics, США). Парные генетические расстояния между образцами рассчитывались с использованием модели Кимура-2-параметра (K2P) (Kimura, 1980). Реконструкция генного дерева была выведена с помощью NJ- алгоритма (метода ближайших соседей) (Saitou and Nei, 1987). Реконструкция генетических деревьев была проведена в программе Molecular Evo lutionary Genetics Analysis 6 (MEGA6) (Tamura et al., 2013). Оценку эволюционной дивергенции между группами проводится с использованием 2-параметрической модели Кимуры (Saitou and Nei, 1987). Эволюционное расхождение между видами было оценено как число нуклеотидных замен на сайт, рассчитанное путем усреднения всех пар последовательностей между анализируемыми группами. Анализ проводился с использованием модели K2P (Голуб и др., 2020; Saitou, Nei, 1987).
Полимеразная цепная реакция с TaqMan зондами проводилась на приборе Bio-Rad CFX 96 (Bio-rad, США) с готовой коммерчески доступной смесью для PCR 5Х qPCRmix-HS Low ROX (Евроген, Россия). В пробирке объемом 0,2 мл смешивались компоненты: 10Х реакционный буфер – 2,5 мкл; 10 мМ dNTP – 1 мкл; 10 мкмоль прямой праймер – 1 мкл; 10 мкмоль обратный праймер – 1 мкл; 25 мМ Mg2+ – 3 мкл; матрица – 1 мкл; термостабильная Taq-полимераза – 2.5 ед.; деионизованная вода – до 25 мкл. Были использованы следующие температурные циклы: первоначальный прогрев при 95°С – 3 мин; 38 циклов вида: денатурация при 95°С в течение 30 сек; отжиг праймеров при 54 °С в течение 30 сек; элонгация цепи при 72 °С в течение 30 сек; инкубирование смеси при 72 °С в течение 5 мин.
При проведении рестрикционного анализа к 10 мкл ПЦР продукта добавляли 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, индивидуального для каждой рестриктазы и 10 ед. рестриктазы. Объем доводили до 15 мкл деионизированной водой. Инкубировали смесь в течение 1,5 часов при 37 oС, фермент
инактивировали нагревом до 75 oС в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводили с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Возможности дифференцировки видов клопов рода Eurygaster по
морфологическим характеристикам
Основные морфологические различия между Eu. integriceps, Eu. maura и Eu. testudinaria, как наиболее серьезных вредителей зерновых культур, представлены на рисунках 1-2. Eu. integriceps, Eu. maura и Eu. testudinaria сравнительно слабо различаются по внешним признакам, особенно Eu. maura и Eu. testudinaria. Более отчетливо все 3 вида различаются по признакам эдеагуса.
Более редкий на посевах зерновых культур Восточной Европы и, соответственно, менее вредоносный Eu. austriaca хорошо отличается от анализируемых трёх видов по признакам головы: клипеус спереди закрыт скуловыми пластинками (рис. 2, A). Живущий только в природных степных экосистемах Eu. dilaticollis отличается от других видов рода короткой переднеспинкой, которая лишь незначительно длиннее головы. При этом следует отметить, что внутривидовая изменчивость внешних морфологических признаков трех основных вредных видов – Eu. integriceps, Eu. maura, Eu. testudinaria – довольно сильная и может быть перекрывающейся между видами.
Рисунок 1 – Голова, вид спереди (А, B) и женские медиальные половые пластинки (С, D) Eurygaster maura L. (A, C), Eu. testudinaria (Geoffroy) (B, D)

Рисунок 2 – Структурные особенности видов клопов рода Eurygaster Laporte (A) Eu. austriaca (Schrank), вид головы сзади (a – щит, b – югальная пластина). (B) Eu. integriceps Puton, тот же. (C) Eu. integriceps, тот же. (D) Eu. maura L., тот же. (E) Eu. testudinaria (Geoffroy), тот же
Таким образом, использование только морфологических признаков для идентификации данных видов клопов не может обеспечить оперативности и точности идентификации, вследствие сложности изготовления и изучения микропрепаратов.
Идентификация клопов рода Eurygaster на основе секвенирования гена субъединицы 1 митохондриальной цитохромоксидазы
Рисунок 3 – NJ анализ последовательности гена
цитохромоксидазы клопв рода
Eurygaster
На следующем этапе нами был амплифицирован ген CO1 клопов рода Eurygaster. Секвенированные последовательности ПЦР-продуктов были внесены в систему Genbank, им присвоены соответствующие номера: Eu. integriceps (GenBank: KR105371.1), Eu. maura (GenBank: KR105370.1), Eu. testudinaria (GenBank: KR105369.1). Штрих-кодирование ДНК Eu. integriceps и Eu. dilaticollis (GenBank: KU726545.1) сделано нами впервые в мире.

Вид
Праймер / зонд
Было построено дерево, отражающее генетическое расстояние между исследуемыми видами клопов (рис. 3). Нами установлено, что различия в нуклеотидных последовательностях гена цитохромоксидазы длиной 658 п.н. наиболее опасного вредителя, вредной черепашки (Eu. integriceps), от таковой каждого из двух других видов этой группы составили более 4%. Внутривидовая вариация нуклеотидной последовательности этого вида составила 0,61%. Нуклеотидные последовательности Eu. maura и Eu. testudinaria полностью совпали. Внутривидовые различия между секвенированными последовательностями ДНК этих видов составили 0,004, или 0,15%.
Разработка метода для экспресс – идентификации наиболее вредоносного вида для злаковых культур – Eu. integriceps
Были разработаны праймеры и потенциальные зонды для быстрой идентификации видов клопов рода Eurygaster (табл. 1):
Таблица 1 – Нуклеотидная последовательность праймеров и зондов для идентификации видов клопов
Eu. maura
Eu. testudinaria Eu. dilaticollis
Eu. integriceps
Eu. maura
Eu. testudinaria Eu. dilaticollis
E. integriceps
Прямой праймер: MTI-f 5’-AGCAGGTGTTTCCTCAATCTTAG Обратный праймер: MT-r 5’-AGTAATAATGCGGTAATTCCAACTG Зонд: FAM-ACCCATTGGTATAACACCTGAACGAACCCCA-BHQ1
Прямой праймер: MTI-f 5’-AGCAGGTGTTTCCTCAATCTTAG Обратный праймер: I-r – 5’-AGTAATAATGCAGTAATTCCAACTG Зонд: FAM-CGACCCGTTGGTATAACACCTGAACGGATCC-BHQ1
Прямой праймер: MT1-f: 5’-ATCAGTTGGAATTACCGCATTATTA Обратный праймер: MTI1-r – 5’-ATGTGTTGAAGTTACGGTCA Зонд: FAM-TACTACTATCATTGCCAGTACTAGCCGGAGC-BHQ1
Прямой праймер: I1-f: 5’-ATCAGTTGGAATTACTGCATTATTA Обратный праймер: MTI1-r: 5’-ATGTGTTGAAGTTACGGTCA Зонд: FAM-TGCTACTATCACTACCAGTACTAGCAGGAGC-BHQ1
В1
В2
При проведении ПЦР реакция оптимизировалась, как по температуре, так и по концентрации ДНК и праймеров/зондов. После многократного проведения
ПЦР в реальном времени с данными зондами так и не удалось достичь 100% положительного результата, как для Eu. integriceps, так и для Eu. maura/Eu. testudinaria. В целом, на 7 положительных результатов приходилось два отрицательных результата. Под отрицательным результатом подразумевается отжиг зонда, предназначенного для одного из видов клопа, на другом виде клопа.
Таким образом, проведение идентификационных процедур на основе Taqman зондов является не подходящим.
Другим способом экспресс идентификации наиболее опасного вида клопа служил ПЦР-ПДРФ. Предварительно нами был проведен анализ нуклеотидных последовательностей гена цитохромоксидазы, длиной 658 п.н. у разных видов клопов-черепашек на наличие сайтов рестрикции, которые бы различались между этими видами и были наиболее удобны при электрофоретическом анализе в агарозном геле. В конечном итоге, нами были выбраны следующие рестриктазы: Ahl I, BamH I, Bst2U I, Psi I.
Рисунок 4 – Рестрикционные фрагменты продуктов ПЦР субъединицы 1 цитохромоксидазы:1 – рестриктаза BamH I; ДНК Eu. maura или Eu. testudinaria; 2 – рестриктаза BamH I; ДНК Eu. integriceps; 3 – рестриктаза Ahl I; ДНК Eu. maura или Eu. testudinaria; 4 – рестриктаза Ahl I; ДНК Eu. integriceps; 5 – рестриктаза Psi I; ДНК Eu. maura или Eu. testudinaria; 6 – рестриктаза Psi I; ДНК Eu. integriceps; 7 – рестриктаза Bst2U I; ДНК Eu. maura или Eu. testudinaria; 8 – рестриктаза Bst2U I; ДНК Eu. integriceps

При проведении рестрикционного анализа были получены положительные результаты (патент РФ No 2617935 C1). Теоретически ожидаемые фрагменты ДНК были получены для всех, анализируемых видов и для всех используемых рестриктаз (рис. 4). Примечательно, что для идентификации Eu. integriceps можно использовать любую из представленных рестриктаз.
Дифференциация коммерчески доступных видов клещей родов Amblyseius и Neoseiulus (Acari: Phytoseiidae) с помощью молекулярно-генетических методов
Нами предварительно было проведено штрих – кодирование ДНК клещей родов Amblyseius и Neoseiulus на основе анализа нуклеотидной последовательности участка ДНК, включающего следующие гены: 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2,28S рРНК. Полученные последовательности были внесены в базу данных Genbank под соответствующими номерами: Neoseiulus cucumeris—GenBank: KX348006, Neoseiulus barkeri—GenBank: KX348007, Amblyseius swirskii—GenBank: KX348008. Длина секвенированных фрагментов составила 623, 639 и 610 п. н. соответственно. Мы проанализировали амплифицированные последовательности на наличие консервативных и вариабельных областей для каждого из изученных видов. Однако, несмотря на то, что используемый метод дал достоверные результаты, идентификация этих видов клещей путем амплификации ДНК с последующим секвенированием продуктов ПЦР имеет серьезные недостатки — она трудоемкая и дорогостоящая. Поэтому мы попытались разработать новый экспресс-тест для идентификации видов клещей родов Amblyseius и Neoseiulus с использованием рестрикционного анализа. В ходе предварительного биоинформатического анализа нами было выявлено, что наиболее оптимальным является использование в качестве рестриктаз следующие: AccB1 I, AspLE, Ssp.
Далее нами был апробирован данный подход и были получены положительные результаты. Образовались уникальные фрагменты для каждого из вида клещей (рис. 5). При обработке рестриктазой AccB1 I продукта ПЦР
образца ДНК N. cucumeris образовались фрагменты ДНК длиной 509 и 129 п.н., рестриктазы AspLE и Ssp не имели сайты рестрикции. При обработке рестриктазой Ssp I продукта ПЦР образца ДНК N. barkeri образовались фрагменты ДНК длиной 381 и 260 п.н., рестриктазы AccB1 I и AspLE не имели сайты рестрикции. При обработке рестриктазой AspLE продукта ПЦР образца ДНК A. swirskii образовались фрагменты ДНК длиной 405 и 227 п.н., рестриктазы AccB1 I и Ssp I не имели сайты рестрикции (патент РФ No2631933 C1).
Рисунок 5 – Электрофореграмма рестрикции продуктов ПЦР клещей родов Amblyseius и Neoseiulus: 1 – Рестриктаза AccB1 I; 2 – Рестриктаза AspLE; 3 – Рестриктаза Ssp I; М – маркер длин фрагментов ДНК, значения выражены в пар нуклеотидов
Таким образом, разработанный нами метод ПЦР – ПДРФ позволяет быстро и точно идентифицировать коммерчески используемые виды клещей родов Amblyseius и Neoseiulus без предварительного секвенирования ДНК.
Дифференциация подвидов медоносных пчел России на основе штрих- кодирования ДНК и с помощью мутагенной ПЦР-ПДРФ
При проведении штрих-кодирования цитохромоксидазы субъединицы 1 ключевых подвидов медоносных пчел было выявлено, что у A. mellifera mellifera имеется две ярко выраженные гаплогруппы. A. mellifera carnica и A. mellifera carpatica можно отличить от двух других подвидов (A. mellifera mellifera и A.
mellifera caucasica) по присутствию (A/G) SNP в 99 нуклеотиде области Фолмера, который состоит из 658 пар оснований. В то же время имеется SNP (G/A) в 448 нуклеотиде типичная только для A. mellifera carnica. Однако в 2-х случаях данной SNP не наблюдалось. Таким образом, в 13% случаев последовательность гена цитохромоксидазы субъединицы 1 A. mellifera carnica совпадала с A. mellifera carpatica. Для A. mellifera caucasica не характерен ни один из вышеперечисленных полиморфизмов.
Следующим этапом явилось разработка молекулярно-генетического метода для быстрой идентификации подвидов пчел на основе полиморфизма длины рестрикционных фрагментов с помощью мутагенной ПЦР-ПДРФ (патент РФ No2653435 C1). Разработанные маркеры и ожидаемые длины фрагментов представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Длины фрагментов, полученных после проведения ПЦР-ПДРФ Подвид медоносной пчелы
Праймеры
AmEu1-f, AmEu1-r
AmCarp-f, AmCarp-r
Рестриктаза
Alu I
HspA I
107, 32 139
141 141
111, 30
139 139
111, 30 141
A. mellifera mellifera G1
A. mellifera mellifera G2
A. mellifera carpatica
A. mellifera carnica
A. mellifera caucasica
AmEu2-f, AmEu2-r
Hinf I
150
122, 28
150
150
150
AmCar-f, AmCar-r
Msp I
148
148
148
118, 30
148
Примечание: G1 – гаплотип No1, G2 – гаплотип
Для A. mellifera carpatica и A. mellifera carnica при обработке рестриктазой
HspA I продукта ПЦР, полученного с помощью пары праймеров AmCarp-f и AmCarp-r, образуется фрагменты длинами 111 и 30 п.н. (рис. 6, А). Для остальных подвидов не происходит разделения на 2 фрагмента.
АБ
Рисунок 6 – Продукты ПЦР, полученные с помощью праймеров AmCarp-f
и AmCarp-r после обработки рестриктазой HspA I (А) и Msp I (Б): M – маркеры известной длины (п.н.); 1 – продукт ПЦР до рестрикции; 2 – A. mellifera carpatica; 3 – A. mellifera carnica; 4 – A. mellifera mellifera, гаплотип 1; 5 – A. mellifera mellifera, гаплотип 2; 6 – A. mellifera caucasica
A. mellifera carnica можно отличить от других подвидов пчел при обработке рестриктазой Msp I продукта ПЦР, полученного с помощью пары праймеров AmCar-f и AmCar-f (рис. 6, Б). Образуются фрагменты длиной 118 и 30 п.н. Для других подвидов не происходит разделения на 2 фрагмента.
Однако, необходимо отметить, что в 13% случаев наблюдается идентичная картина электрофореза для A. mellifera carnica и A. mellifera carpatica. Таким образом, в некоторых случая невозможно дифференцировать A. mellifera carnica и A. mellifera carpatica. Для среднерусской породы пчел первого гаплотипа при обработке рестриктазой Alu I продукта ПЦР, полученного с помощью пары праймеров AmEu1-f и AmEu1-r, образуется фрагменты длинами 107 и 32 п.н. (рис. 7, А). Для других трёх подвидов, а также второго гаплотипа среднерусской пчелы не происходит разделения на 2 фрагмента. Для A. mellifera mellifera второго гаплотипа при обработке рестриктазой Hinf I продукта ПЦР, полученного с помощью пары праймеров AmEu2-f и AmEu2-r, образуется фрагменты длинами 122 и 28 п.н. (рис. 7, Б). Для других трёх подвидов, а также
первого гаплотипа среднерусской пчелы не происходит разделения на 2 фрагмента.
АБ
Рисунок 7 – Продукты ПЦР, полученные с помощью праймеров AmCarp-f и AmCarp-r после обработки рестриктазой Alu I (А) и Hinf I (Б): M – маркеры известной длины (п.н.); 1 – продукт ПЦР до рестрикции; 2 – A. mellifera carpatica; 3 – A. mellifera carnica; 4 – A. mellifera mellifera, гаплотип 1; 5 – A. mellifera
mellifera, гаплотип 2; 6 – A. mellifera caucasica
Для A. mellifera caucasica отсутствуют сайты рестрикции для всех вышеперечисленных ферментов рестрикции. Поэтому для идентификации данного подвида медоносных пчел необходимо проведение ПЦР со всеми вышеперечисленными праймерами и ферментами рестрикции.
В результате проведенных исследований были сделаны следующие выводы:
1. Использование только морфологических признаков не может обеспечить оперативности и точности идентификации насекомых и клещей, вследствие сложности изготовления и изучения микропрепаратов.
2. На основе секвенированных последовательностей были выявлены участки ДНК изучаемых видов (подвидов), которые позволили их дифференцировать в пределах рода.
3. Штрих-кодирование ДНК Eu. integriceps, как самого опасного вредителя в составе рода Eurygaster, и обитающего только в природных экосистемах Eu. dilaticollis сделаны впервые в мире нами.
4. Проведен филогенетический анализ всех имеющихся последовательностей ДНК вредителей из рода Eurygaster, энтомофагов рода Amblyseius (Neoseiulus), а также ключевых пород медоносных пчел в международных базах данных. Удаленность филогенетического расстояния изучаемых объектов, а также наличие консервативных участков позволяет разработать маркеры для экспресс – идентификации видов.
5. Показано, что использование TaqMan зондов для дифференциации основных вредителей зерновых культур (клопов рода Eurygaster) не является подходящим методом для видовой идентификации.
6. Разработаны схемы проведения ПЦР-ПДРФ для видовой идентификации Eurygaster ssp. и быстрой дифференциации коммерчески доступных видов клещей родов Amblyseius и Neoseiulus.
7. Установлены отличия в нуклеотидной последовательности между 4 основными породами медоносной пчелы (A. mellifera carpathica, A. mellifera caucasica, A. mellifera carnica и A. mellifera mellifera), которые позволили нам разработать метод экспресс-идентификации перечисленных пород пчел на основе мутагенного рестрикционного анализа (ПЦР-ПДРФ). Было выявлено, что для среднерусской породы пчел характерно 2 гаплотипа. Последовательность цитохромоксидазы субъединицы 1 для A. mellifera carpatica зарегистрирована нами впервые в мире.

Актуальность работы. Разнообразие жизни является основой
стабильности и устойчивости любой экосистемы и биосферы в целом.
«Предполагается, что общее число существующих видов на Земле достигает 8,7
млн, из которых более 75 % не описаны (Mora et al., 2011). С огромным
биоразнообразием связаны многие практические проблемы в сельском
хозяйстве, возникающие при обеспечении защиты растений, при борьбе с
вредителями и переносчиками болезней, при контроле над инвазивными
видами животных и растений, а также мониторинге состояния окружающей
среды» (Кокина, 2015).
К примеру, в мировой фауне в 2010 году насчитывалось 42 тысячи видов,
входящих в отряд полужесткокрылых насекомых, или клопов (Heteroptera)
(Винокуров и др., 2010). В настоящее время их еще больше. В 6 томов каталога
полужесткокрылых Палеарктики (Catalogue…, 1995–2006, 2013) включено, в
общей сложности, 9365 видов из 1632 родов и 66 семейств. В настоящее время
палеарктических видов также значительно больше, поскольку ежегодно
открываются и описываются новые для науки виды.
По характеру трофических связей в составе отряда полужесткокрылых
большинство видов – фитофаги, но также достаточно много зоофагов и
фитозоофагов, есть также и кровососущие эктопаразиты. Среди клопов-
фитофагов, распространённых в России, насчитывается несколько десятков
видов, вредных для сельскохозяйственных культур, лесных и парковых
насаждений. Кроме того, 2 вида являются кровососами, причиняющими вред
непосредственно организму человека (Cimex lectularius и C. hemipterus).
К видам, сильно вредящим сельскохозяйственным культурам, относятся,
прежде всего, представители рода Eurygaster (вредная черепашка) из семейства
щитников-черепашек (Scutelleridae), родов Eurydema (крестоцветные клопы) и
Aelia (остроголовые клопы) из семейства щитников (Pentatomidae), ряд видов из
семейства клопов-слепняков (Miridae) – хлебные клопики (Trigonotylus
caelestialium, T. ruficornis), виды рода Polymerus (P. conatus, P. vulneratus),
странствующие слепняки (Notostira elongata и N. erratica), грушевая
кружевница (Stephanitis pyri) из семейства клопов-кружевниц (Tingidae) и ряд
других.
И среди перечисленных выше, и среди других представителей отряда
полужесткокрылых насекомых существуют не просто виды, повреждающие
культурные и дикорастущие растения, а первостепенные вредители сельского
хозяйства, лесных и культурных насаждений, такие как вредная черепашка
(Eurygaster integiceps), инвазивные американские виды дубовая и платановая
коритухи (Corythucha arcuata и C. ciliata), инвазивный тропический мраморный
клоп (Halyomorpha halys). Кроме того, как оказалось, инвазивный тропический
постельный клоп (Cimex hemipterus), интенсивно осваивающий населенные
пункты России, оказался гораздо более вредоносным, чем постельный клоп C.
lectularius, распространенный по всему миру.
В составе родов, к которым относятся вредные виды полужесткокрылых,
почти всегда представлены виды, которые вредят в меньшей степени или
вообще не вредят. При этом вредные и не вредящие виды обычно
морфологически очень близки к настоящим вредителям в составе этих же
родов, что вызывает серьезные, а в ряде случаев неразрешимые, проблемы с
точной идентификацией конкретных вредных видов.
Для определения видов полужесткокрылых, как и насекомых других
отрядов, разработаны и опубликованы определители, включающие виды,
распространенные на различных территориях России, других государств и
природных территорий. К таким руководствам относится, например, серия
определителей насекомых Европейской части СССР (1964–1987). Аналогичная
серия определителей опубликована для идентификации насекомых Дальнего
Востока СССР и России (1986 и др.). Кроме того, специалистами-
систематиками разработан и опубликован ряд специальных определителей. Они
включают только основные вредные виды или еще крайне близкие к ним виды,
не вредящие или слабо вредящие, но живущие на тех же самых
сельскохозяйственных культурах и породах деревьев, что и вредители. К таким
руководствам относится, в частности, серия определителей вредных и полезных
насекомых сельскохозяйственных культур в СССР (1980-1984).
Разработчиками таких специализированных определителей являются
специалисты-систематики по отдельным таксономическим группам, в том
числе и по отряду полужесткокрылых насекомых.
Кроме общих и специальных определителей опубликован ряд
справочников, включающих основные вредные виды насекомых и
сопутствующие им виды, относящиеся к категориям второстепенных и
потенциальных вредителей. К ним относится, например, серия справочников
«Насекомые и клещи – вредители сельскохозяйственных культур» (1972–1999).
В практике защиты растений всегда требуется оперативная
идентификация вредителей, появляющихся на посевных культурах, посадках
свеклы, картофеля, подсолнечника, на плодово-ягодных культурах, в лесных
насаждениях. Требуется идентификация не только взрослых насекомых
(имаго), но также их личинок и яйцекладок. Приведенные выше определители
позволяют идентифицировать только имаго. Определителей по личинкам очень
мало, а по яйцекладкам подобные справочники почти отсутствуют.
Определение насекомых, в том числе вредных, по преимагинальным фазам
развития значительно сложнее, чем по признакам имаго. Но даже оперативное
определение взрослых насекомых и идентификация вредителей обычно
оказываются очень трудной или даже непреодолимой преградой при
планировании и проведении защитных мероприятий для работников
сельскохозяйственных предприятий. Отличия в морфологических структурах
(деталях строения, окраске, размерах и пропорциях частей тела) вредных видов
от близких им видов, не являющихся вредителями, бывают настолько тонкими
или незначительными, что неподготовленный в достаточной мере агроном не в
состоянии их уловить и оценить. Специалисты-систематики при определении
близких между собой видов обычно используют микропрепараты, в том числе
препараты гениталий. Для их изготовления требуются серьезные навыки в этой
работе, которые достигаются в течение многих месяцев или даже лет. Работа по
приготовлению микропрепаратов проводится только с использованием
светооптических приборов и химических соединений. Она требует
значительного времени даже для опытного специалиста-энтомолога.
Использования для идентификации приведенных выше общих и специальных
определителей требует длительной предварительной подготовки под
руководством специалистов-энтомологов. Определение же личинок, особенно
младших возрастов, и яйцекладок часто вообще представляет собой
невыполнимую задачу. Кроме того, данная проблема осложняется нехваткой
узконаправленных специалистов по таксономическому определению видов.
Ограничения, присущие системам идентификации на основе морфологии,
указывают на необходимость нового подхода к распознаванию таксонов. В
настоящее время отсутствует системный подход по генетическому
определению видовой принадлежности тех или иных насекомых и клещей.
Ранее был разработан «способ идентификации видов неизвестного
организма» Джона А. Вебстера (Патент РФ № 2011681 C1, 20.11.1984),
предусматривающий выделение ДНК этого организма, обработку ДНК
рестриктазой, гибридизацию на фильтрах фрагментов ДНК с меченым
нуклеотидным зондом и детекцию гибридных последовательностей с
последующим анализом ее результатов. Очевидно, что его метод является
очень трудоемким и отнимает много времени. Кроме того, отсутствует
международная база данных по рестрикционным полиморфизмам широких
групп организмов. «Были разработаны системы по RAPD-PCR анализу, а также
анализу микросаттелитных участков ДНК. Однако, данные методы являются
трудоемкими и имеют низкую воспроизводимость, помимо этого, RAPD анализ
имеет высокую погрешность вследствие контаминации исходных образцов
ДНК. Методы идентификации таксонов по анализу смесей ДНК из разных
видов организмов в настоящий момент не разработаны» (Кокина, 2015).
Микрогеномные идентификационные системы, позволяющие различать
организмы с помощью анализа небольшого сегмента генома (штрих-кода),
представляют собой чрезвычайно перспективный подход в диагностике
биологического разнообразия (Garrity et al., 2009). Эти «штрих-коды ДНК»
представляют собой практический стандартизированный инструмент
идентификации на уровне видов, который можно использовать для оценки
биоразнообразия (Adamowicz and Steinke, 2015), изучения истории жизни и
экологических исследований, для обеспечения подлинности и безопасности
пищевых продуктов и лекарственных препаратов, а также для
криминалистического анализа.
Цель исследования – разработать методы экспресс – идентификации
сельскохозяйственно значимых насекомых и клещей на основе штрих-
кодирования ДНК.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Провести штрих-кодирование ДНК клопов рода Eurygaster, коммерчески
значимых клещей родов Amblyseius и Neoseiulus, а также подвидов
медоносных пчел России.
2. На основе секвенированных последовательностей выявить участки ДНК
изучаемых видов (подвидов), которые позволят их дифференцировать друг.
3. Провести филогенетический анализ имеющихся последовательностей ДНК
вредителей из рода Eurygaster, энтомофагов родов Amblyseius и Neoseiulus,
ключевых подвидов медоносных пчел в международных базах данных.
4. Рассмотреть возможность применения ПЦР с TaqMan зондами для быстрой
идентификации видов клопов рода Eurygaster.
5. Разработать схемы проведения ПЦР-ПДРФ, которые позволят быстро
определять таксономическую принадлежность клопов рода Eurygaster,
клещей родов Amblyseius и Neoseiulus, а также подвидов медоносных пчел.
Научная новизна. Штрих-кодирование ДНК Eu. integriceps (GenBank:
KR105371.1), как самого опасного вредителя зерновых культур в составе рода
Eurygaster, а также обитающего только в природных экосистемах Eu. dilaticollis
(GenBank: KU726545.1) сделаны впервые нами. Разработан метод
идентификации вредной черепашки (Eurygaster integriceps) на основе
рестрикционного анализа, который позволяет в течение нескольких часов
идентифицировать вредителя на его ранних «стадиях развития (яйца, личинки)
в независимости от пола насекомого, а также без привлечения
узкоспециализированного специалиста-энтомолога» (патент РФ №2617935 C1).
Разработан метод быстрой дифференциации коммерчески доступных
видов клещей родов Amblyseius и Neoseiulus (Acari: Phytoseiidae) «на основе
рестрикционного анализа предварительно амплифицированного участка ДНК,
включающего гены 18S рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК» (патент РФ
№2631933 C1).
Нами «был проведен анализ нуклеотидной последовательности участка
гена цитохромоксидазы субъединицы 1 митохондриальной ДНК для разных
пород медоносных пчел. Установлены отличия в нуклеотидной
последовательности между 4 основными породами медоносной пчелы (Apis
mellifera carpathica, Apis mellifera caucasica, Apis mellifera carnica и Apis
mellifera mellifera), которые позволили нам разработать метод экспресс-
идентификации перечисленных пород пчел на основе мутагенного
рестрикционного анализа (ПЦР-ПДРФ). Было выявлено, что для среднерусской
породы пчел характерно 2 гаплотипа» (патент РФ № 2653435 C1).
Последовательность цитохромоксидазы субъединицы 1 для A. mellifera
carpatica зарегистрирована впервые нами.
Теоретическая и практическая значимость. Внедрение предлагаемых
методов идентификации насекомых и клещей на основе штрих-кодирования
ДНК в сельское хозяйство позволит обеспечивать частных аграриев, для
которых характерны низкие финансовые показатели, новыми и эффективными
технологическими решениями. Данные решения направлены на экономию
материалов и денежных средств, обеспечивают высокие показатели
производительности сельскохозяйственной отрасли, с учётом текущих
финансовых возможностей, а также безопасность предлагаемой продукции.
Полученные в ходе исследования результаты и усовершенствованные методики
идентификации могут быть в дальнейшем использованы для изучения
биоразнообразия, для проверки подлинности продуктов питания и контроля над
инвазивными видами насекомых, а также для мониторинга состояния
окружающей среды.
Методология и методы научного исследования. Исследование было
выполнено с использованием усовершенствованных методов молекулярной
биологии, а также современных методов биоинформатики и филогенетического
анализа. Подробное описание использованных в ходе работы методов
представлено в главе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту.
1. Три вида клопа: Eurygaster maura, Eurygaster testudinarius,
Eurygaster dilaticollis невозможно дифференцировать на основе классического
штрих-кодирования ДНК насекомых. В то же время Eurygaster integriceps
(наиболее вредоносный) легко идентифицируется по гену цитохромоксидазы,
отличающему данный вид от других видов того же рода.
2. Использование TaqMan зондов для дифференциации основных
вредителей зерновых культур (клопов рода Eurygaster) не является
подходящим методом для видовой идентификации.
3. Проведение ПЦР — ПДРФ с помощью рестриктаз AccB1 I, AspLE,
Ssp I позволяет быстро и точно идентифицировать коммерчески используемые
виды клещей родов Amblyseius и Neoseiulus без секвенирования ДНК.
4. Обнаружены SNP специфичные для конкретных подвидов пчел,
которые позволили разработать молекулярно-генетический метод для быстрой
идентификации подвидов медоносных пчел на основе полиморфизма длины
рестрикционных фрагментов.
Апробация результатов работы. Основные результаты
диссертационной работы были представлены на XXIII и XXIV Международной
научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»
(Москва, 2016 и 2017), на региональной научной конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых «Инновационные технологии на базе
фундаментальных научных разработок – прорыв в будущее» от Фонда
содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по
программе «У.М.Н.И.К.» (Воронеж, 2015).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы
изложены в 13 публикациях, из них 2 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ
и 4 – в журналах, индексируемых в Web of Science и Scopus; имеется 3 патента
РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 145
страницах. Состоит из введения, основной части, содержащей 13 таблиц и 17
рисунков, заключения, списка литературы (включает 295 наименования, в том
числе 259 – на иностранном языке), перечня сокращений и условных
обозначений, и приложения.
Благодарность. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-
14-00176, гранта Президента Российской Федерации для государственной
поддержки молодых российских ученых и ведущих научных школ (НШ-
2535.2020.11). Автор искренне признателен и выражает благодарность
сотрудникам кафедры зоологии и паразитологии Воронежского
государственного университета В. Б. Голубу и В. А. Соболевой за
предоставление материала для исследования и помощь в идентификации видов
насекомых отряда полужесткокрылых по морфологическим характеристикам,
М. Ю. Сыромятникову за помощь в освоении методик проведения
лабораторных исследований.

Полученные в ходе работы сведения позволяют нам сделать вывод о том,
что морфологические различия между основными вредителями зерновых
культур в европейской части России, Eu. integriceps Puton, Eu. maura (Linnaeus),
Eu. testudinaria (Geoffroy) и Eu. austriaca (Schrank) имеют различные уровни и
диагностическое значение. Eu. austriaca имеет наиболее четкие отличия по
внешним признакам от других видов этой группы вредителей. Eu. integriceps,
Eu. maura и Eu. testudinaria сравнительно слабо различаются по внешним
признакам, особенно Eu. maura и Eu. testudinaria. Более отчетливо все три вида
различаются по признакам эдеагуса. Однако на практике использование только
морфологических признаков не может обеспечить оперативности и точности
идентификации, вследствие сложности изготовления и изучения
микропрепаратов.
Использование метода штрих-кодирования ДНК для идентификации
особей, относящихся к роду Eurygaster, позволило установить, что различия в
нуклеотидных последовательностях гена цитохромоксидазы длиной 658 п.н.
между Eu. integriceps, Eu. maura и Eu. testudinaria имеют неодинаковый
уровень. Eu. integriceps имеет более существенное отличие по особенностям
гена COI от двух других близких видов, что обеспечивает возможность
оперативного и точного выявления этого вида, как наиболее опасного
вредителя зерновых культур на юге европейской части России и в других
субаридных и аридных регионах Евразии. Комплексное использование
молекулярно-генетического и морфологического методов, несомненно,
обеспечит абсолютную точность определения этого вида и дифференцировки
от других близких видов рода Eurygaster. Различия в нуклеотидных
последовательностях гена COI Eu. maura и Eu. testudinaria не установлены.
Этот факт коррелирует с очень слабыми морфологическими различиями между
двумя симпатрическими видами.
Более высокая внутривидовая изменчивость нуклеотидных
последовательностей гена COI Eu. integriceps, по сравнению с изменчивостью
Eu. maura и Eu. testudinaria, возможно, связана со значительной миграционной
активностью первого вида в периоды подготовки к зимней диапаузе и выхода
из нее. После зимовки высока вероятность спаривания особей, происходящих
из разных популяций, и, соответственно, межпопуляционного обмена
генофондами. В дереве, отражающем генетические расстояния между видами,
наиболее удалены друг от друга две ветви, включающие, соответственно,
группы изученных палеарктических и неарктических видов. Эта генетическая
удаленность двух групп отражает географическую дизъюнкцию их ареалов и
автохтонные формообразовательные процессы в пределах одного рода на двух
континентах в кайнозое. В группе палеарктических видов генетически наиболее
близки между собой Eu. maura, Eu. testudinaria и Eu. dilaticollis. Eu. integriceps
удален от этой группы, но в меньшей степени, чем Eu. austriaca; последний и
по морфологическим признакам является наиболее обособленным среди
изученных палеарктических видов.
Штрих-кодирование ДНК Eu. integriceps, как самого опасного вредителя в
составе рода Eurygaster, и обитающего только в природных экосистемах Eu.
dilaticollis сделаны впервые нами. Кроме того, были разработаны методы для
быстрой молекулярно-генетической идентификации наиболее вредоносного
вида – Eu. integriceps, а также дифференциации коммерчески доступных видов
клещей родов Amblyseius (Neoseiulus) на основе рестрикционного анализа
предварительно амплифицированного участка ДНК, включающего гены 18S
рРНК, ITS1, 5.8S рРНК, ITS2, 28S рРНК. К преимуществам данных методов
можно отнести: скорость анализа, определение видовой принадлежности
независимо от стадии развития и пола организма, идентификация видов-
двойников вредителей с/х культур, отсутствие потребности в
узконаправленных специалистах, комплексный подход. Внедрение подобных
методов позволит коммерциализовать услуги по экспресс – идентификации
биоматериала.
Нами было проведено штрих-кодирование ДНК для разных пород
медоносных пчел, которые используются пчеловодами в России. В ходе
анализа нами было показано, что разные подвиды медоносных пчел отличаются
по нуклеотидной последовательности гена цитохромоксидазы субъединицы 1
митохондриальной ДНК. В ходе биоинформатического анализа стало ясно, что
стандартные прямые праймеры для амплификации Folmer региона у
перепончатокрылых – LepF1 и LCO1490 – имеют низкий уровень
гомологичности к ДНК различных подвидов пчел. Этот факт необходимо
учитывать при проведении штрих-кодирования ДНК, поскольку до 40%
нуклеотидов в праймере может не совпадать с матрицей ДНК медоносной
пчелы, что налагает повышенные требованию к анализируемому материалу.
Нами предложен альтернативный прямой высокоспецифичный праймер
(AmCarp-f), который вместе с праймером LepR1 амплифицирует более
короткий участок гена цитохромоксидазы субъединицы 1 – 693 п.н., но
который содержит все необходимые для дифференциации подвидов пчел SNP.
Несмотря на то, что данный ген цитохромоксидазы субъединицы 1
митохондриальной ДНК используется в основном для идентификации видов
животных, в том числе пчел, нами показано, что нуклеотидная
последовательность гена может различаться и у подвидов пчел. При этом
наблюдались стабильные в пределах конкретного подвида, SNP. Было
выявлено, что для среднерусской породы пчел характерно 2 гаплотипа.
Последовательность цитохромоксидазы субъединицы 1 для A. mellifera
carpatica зарегистрирована впервые в мире нами.
В ходе работы нами были разработаны генетические маркеры для быстрой
идентификации подвида пчелы на основе проведения ПЦР-ПДРФ. В данном
методе нами использовались праймеры с искусственно внесенными
нуклеотидными заменами на 3’– конце, поскольку нами не были
идентифицированы сайты рестрикции, которые были характерны для всех SNP.
Несмотря на то, что имеется несоответствие нуклеотидной последовательности
на 3’– конце мутагенный праймер успешно гибридизовался на матрице ДНК
медоносной пчелы. Тем не менее, в редких случаях, когда матрица ДНК сильно
деградировала (например, вследствие длительного хранения образцов),
мутагенный праймер может не гибридизоватьтся на такой ДНК. В таком случае
необходимо проведение ПЦР в два этапа: на первом этапе проводится ПЦР с
праймерам AmCarp-f/AmCar-r, которые амплифицируют последовательность
ДНК размером 572 п.н., содержащую все необходимые для дифференциации
пчел SNP, при этом используемые праймеры высокоспецифичные к
исследуемой ДНК; на втором этапе в качестве матрицы используется 1 мкл
ПЦР-смеси, полученной в ходе первого этапа, и соответствующая пара
праймеров к конкретному подвиду пчелы, которую необходимо
верифицировать, либо, если подвид пчелы неизвестен, проводится скрининг со
всеми имеющимися парами праймеров и соответствующими ферментами
рестрикции. Потенциально, возможно использовать альтернативные ферменты
рестрикции с аналогичными сайтами рестрикции: AluBI вместо AluI; HinP1I,
AspLEI, BstHHI, CfoI, GlaI, Hin6I, Hin6I вместо HspAI; HpaII, BsiSI, HapII
вместо MspI. Однако, использование всех вышеречисленных ферментов
рестрикции необходимо верифцировать экспериментальным путем.
Таким образом, полученные в ходе работы данные и разработанные
методы идентификации могут быть в дальнейшем использованы для изучения
биоразнообразия, для проверки подлинности продуктов питания и контроля над
инвазивными видами насекомых, а также для мониторинга состояния
окружающей среды. Внедрение подобных методов позволит
коммерциализовать услуги по экспресс – идентификации биоматериала.
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
В – вольт
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
Ед. – единиц
Мкл – микролитр
мкмоль – микромоль
мМ – миллимоль
мРНК – матричная РНК
нм – нанометр
П.Н. – пар нуклеотидов
ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПЦР – полимеразная цепная реакция
рДНК – рибосомная ДНК
РНК – рибонуклеиновая кислота
тРНК – транспортная РНК
хлДНК – хлоропластная ДНК
ЦТАБ – цетилтриметиламмония бромид
эДНК – экологическая ДНК («ДНК окружающей среды»)
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭТЦ – электрон-транспортная цепь
atpF-atpH – спейсер между генами, кодирующими субъединицы АТФ – синтазы
BOLD – Barcode of life data systems
BSA – бычий сывороточный альбумин
СОI – субъединица 1 цитохромоксидазы мтДНК
dNTP – дезоксинуклеозид трифосфат
ETS – последовательности внешних транскрибируемых спейсеров
рибосомальных генов
GenBank – генетический банк
ITS – последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров
рибосомальных генов
matK – хлоропластный ген, кодирующий матуразу К
mQ H2O – деионизированная вода
ndhF – ген субъединицы никотинамид-дегидрогеназы
NGS – секвенирование следующего поколения
pH – мера кислотности водных растворов
psbK-psbI – спейсер генов, кодирующих компоненты фотосистемы II
RAPD – произвольно (случайно) амплифицированная полиморфная ДНК
rbcL – ген большой субъединицы рибулозобисфосфат-карбоксилазы
rpoB – ген β-субъединицы РНК- полимеразы
rpoC1 – ген γ-субъединицы РНК-полимеразы
rpS4-trnT – спейсер между геном рибосомального белка 4 малой субъединицы и
треониновой тРНК
SBS – секвенирование путем синтеза
SNP – однонуклеотидный полиморфизм
TAE – трис-ацетатный буфер
trnH-psbA – спейсер между генами гистидиновой тРНК и геном,
контролирующим синтез белка D1 фотосистемы II
trnL-trnF – вариабельный участок между генами тРНК лейцина и фенилаланина,
гена trnL

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?

Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

Читать

Публикации автора в научных журналах

Дифференциация пород пчел на основе анализа генов субъединицы 1 цитохромоксидазы и цитохрома B

М.Ю. Сыромятников,А.В. Кокина, Л.А. Бурмистрова, А.В. Бородачев, В.Н. Попов // Пчеловодство.– 2— № – С. 20

Диагностика группы видов рода Polymerus Hahn (Heteroptera, Miridae), включающей вредителей агрокультур в восточно-европейской лесостепи, по морфологическим и молекулярным признакам

В.Б. Голуб, М.Ю. Сыромятников, А.В. Кокина, В.А. Соболева,Е.В. Нестерова, В.Н. Попов // Энтомологическое обозрение. – 2– Т. –№ – С. 666

DNA barcoding and morphological analysis for rapid identification of most economically important crop-infesting Sunn pests belonging to Eurygaster Laporte, 1833 (Hemiptera, Scutelleridae)

M.Y. Syromyatnikov,V.B. Golub, A.V. Kokina, V.A. Soboleva, V.N. Popov // Zookeys. – 2–Vol. – P. 51

A Molecular Method for the Identification of Honey Bee Subspecies Used by Beekeepers in Russia

M.Y. Syromyatnikov, A.V. Borodachev,A.V. Kokina, V.N. Popov // Insects. – 2– Vol. – No. – е

A simple molecular method for rapid identification of commercially used Amblyseius and Neoseiulus species (Acari: Phytoseiidae)

M.Y. Syromyatnikov, A.V. Kokina, N.A. Belyakova, E.G. Kozlova, V.N. Popov //Zootaxa. – 2– Vol. 4– No. – P. 270

The Use of DNA Barcoding and Metabarcoding for Food and Environment Quality Control

A.V. Kokina, M.Y. Syromyatnikov, O.V.Savinkova, V.N. Popov // Springer Geography. – 2– P. 111

Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее

Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее

Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее

Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

Хочешь уникальную работу?

Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

Пишу качественные выпускные квалификационные работы и магистерские диссертации. Опыт написания работ - более восьми лет. Всегда на связи.

#Кандидатские #Магистерские

28 Выполненных работ

Профессиональный журналист, филолог со стажем более 10 лет. Имею профильную диссертацию по специализации "Радиовещание". Подробно и серьезно разрабатываю темы научных... Читать все

Профессиональный журналист, филолог со стажем более 10 лет. Имею профильную диссертацию по специализации "Радиовещание". Подробно и серьезно разрабатываю темы научных исследований, связанных с журналистикой, филологией и литературой

#Кандидатские #Магистерские

33 Выполненных работы

Имеют опыт грамотного написания диссертационных работ по медицине, а также отдельных ее частей (литературный обзор, цели и задачи исследования, материалы и методы, выв... Читать все

Имеют опыт грамотного написания диссертационных работ по медицине, а также отдельных ее частей (литературный обзор, цели и задачи исследования, материалы и методы, выводы).Пишу статьи в РИНЦ, ВАК.Оформление патентов от идеи до регистрации.

#Кандидатские #Магистерские

100 Выполненных работ

Специальность "Государственное и муниципальное управление" Кандидатскую диссертацию защитил в 2006 г. Дополнительное образование: Оценка стоимости (бизнеса) и госфин... Читать все

Специальность "Государственное и муниципальное управление" Кандидатскую диссертацию защитил в 2006 г. Дополнительное образование: Оценка стоимости (бизнеса) и госфинансы (Казначейство). Работаю в финансовой сфере более 10 лет. Банки,риски

#Кандидатские #Магистерские

123 Выполненных работы

Имею 3 высших образования в сфере Экологии и техносферной безопасности (бакалавриат, магистратура, аспирантура), работаю на кафедре экологии одного из опорных ВУЗов РФ... Читать все

Имею 3 высших образования в сфере Экологии и техносферной безопасности (бакалавриат, магистратура, аспирантура), работаю на кафедре экологии одного из опорных ВУЗов РФ. Большой опыт в написании курсовых, дипломов, диссертаций.

#Кандидатские #Магистерские

27 Выполненных работ

Специализируюсь на правовых дипломных работах, магистерских и кандидатских диссертациях

#Кандидатские #Магистерские

495 Выполненных работ

Преподаватель одного из лучших ВУЗов страны, научный работник, редактор научного журнала, общественный деятель. Пишу все виды работ - от эссе до докторской диссертации... Читать все

Преподаватель одного из лучших ВУЗов страны, научный работник, редактор научного журнала, общественный деятель. Пишу все виды работ - от эссе до докторской диссертации. Опыт работы 7 лет. Всегда на связи и готова прийти на помощь. Вместе удовлетворим самого требовательного научного руководителя. Возможно полное сопровождение: от статуса студента до получения научной степени.

#Кандидатские #Магистерские

47 Выполненных работ

Окончила магистратуру Воронежского государственного университета в 2009 г. В 2014 г. защитила кандидатскую диссертацию. С 2010 г. преподаю в Воронежском государственно... Читать все

Окончила магистратуру Воронежского государственного университета в 2009 г. В 2014 г. защитила кандидатскую диссертацию. С 2010 г. преподаю в Воронежском государственном университете инженерных технологий.

#Кандидатские #Магистерские

66 Выполненных работ

Практикую гражданское, семейное право. Преподаю указанные дисциплины в ВУЗе. Выполняла работы на заказ в течение двух лет. Обучалась в аспирантуре, подготовила диссерт... Читать все

Практикую гражданское, семейное право. Преподаю указанные дисциплины в ВУЗе. Выполняла работы на заказ в течение двух лет. Обучалась в аспирантуре, подготовила диссертационное исследование, которое сейчас находится на рассмотрении в совете.

#Кандидатские #Магистерские

18 Выполненных работ