Эффективность комбинации жидкостной цитологии и молекулярно-генетических методов в диагностике рака шейки матки

Клиническая характеристика больных
Научное исследование проведено на клинической базе отделения
онкогинекологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. В анализ вошли
какскрининговые,такидиагностическиерезультаты.Всегобыло
проанализировано 381 история болезни пациенток. Из анализа были исключены
заключения неудовлетворительных (недостаточное количество клеток) и
неадекватныхтонкослойныхмазков(недостаточноеколичество
эндоцервикальных и метаплазированных клеток). Таким образом в работу вошли
145 пациенток с РШМ на стадиях T1a1-T1a2N0M0 и 137 пациенток с
верифицированными гистологически плоскоклеточными интраэпителиальными
поражениями шейки матки, наблюдавшиеся с 2015 по 2020 гг., а также
55 пациенток, у которых предраковые и раковые изменения шейки матки
отсутствовали (норма). При верификации диагноза использовали результаты
гистологического исследования в соответствии со стандартами и алгоритмами
диагностики злокачественных новообразований шейки матки и цитологического
по системе Бетесда.
При клиническом стадировании РШМ использовали классификацию
Международной Федерации Акушеров и Гинекологов (FIGO, 2019) и
классификацию злокачественных опухолей TNM (8-й пересмотр 2016 г.). У
больных РШМ, включенных в исследование, по классификации FIGO стадия
была IA1-IA2, а по распространенности опухолевого процесса (TNM)
T1a1-T1a2N0M0.
Критериями включения пациенток в исследование были:
– наличие среди диагностических мероприятий жидкостной цитологии,
кольпоскопии, биопсия шейки матки с последующим гистологическим
исследованием биоптата;
– возраст больных старше 18 лет;
– отсутствиепредшествующегоспециализированноголеченияв
онкологических учреждениях;
– патоморфологическая верификация заболеваний шейки матки;
– предраковые заболевания шейки матки, рак шейки матки IA1-IA2
(плоскоклеточный рак по морфотипу.
Критериями исключения явились:
– клинические стадии рака шейки матки> IA2;
– декомпенсациясопутствующихзаболеванийсердечно-сосудистой,
дыхательной и выделительной систем;
– беременность, лактация.
Придиагностикекромеклинических,цитологическихметодов,
включающих жидкостную цитологию, методов визуальной диагностики для
дифференциациинормальногосостоянияцервикальногоэпителия,
цервикальной интраэпителиальной неоплазии и инвазивного рака шейки матки
в биоптатах и опухолевых образцах ткани шейки матки, в экзосомах мочи
генетическими методами определяли экспрессию семи микроРНК – микроРНК-
20а, микроРНК-21, микроРНК-23b, микроРНК-143, микроРНК-205, микроРНК-
218, микроРНК-375. Затем с помощью статистического анализа определяли
диагностическую информативность комбинации цитологического (жидкостная
цитология) и генетического методов для дифференциальной диагностики
предраковых заболеваний и рака шейки матки.
Из общего количества больных в исследовании (n=282) плоскоклеточное
интраэпителиальноепоражениешейкиматкибылогистологически
верифицировано у 137 (48,6%) пациенток, а плоскоклеточный рак шейки матки
подтвержден у 145 (51,4%) больных (рисунок 1).
РШМПИП
51,4%48,6%

Рисунок 1. Распределение больных с плоскоклеточным интраэпителиальным поражением и
раком шейки матки

Среди пациенток с РШМ плоскоклеточный рак с ороговением был
установлен у 86 (59,3%), а без ороговения у 59 (40,7%) пациенток. У пациенток
сплоскоклеточныминтраэпителиальнымпоражениемшейкиматки
цитологическоезаключениебылосформированопосистемеБетесда.
Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение (ПИП) низкой степени
(CINI/LSIL) было выявлено у трети пациенток (33,6%), а высокой степени – у
66,4% больных с установленным CIN II/HSIL, CIN III/HSIL и Tis/HSIL
(таблица 1).РаспределениепациентоксРШМвзависимостиот
распространенности опухолевого процесса по системе TNM представлено в
таблице 2. У пациенток с РШМ чаще всего встречалась стадия T1а2N0M0
(73,8%). По клинической классификации FIGO среди пациенток с РШМ в
преобладающем числе случаев встречалась стадия IА2.
Таблица 1 – Цитологическое заключение по системе Бетесда у пациенток с плоскоклеточным
интраэпителиальным поражением шейки матки

Гистологическое заключениеАбс. число%
CIN I/LSIL4633,6
CIN II/HSIL3223,4
CIN III/HSIL3727,0
Tis/ HSIL2216,0
Всего137100,0

Таблица 2 – Распределение пациенток с РШМ в зависимости от распространенности
опухолевого процесса по системе TNM и FIGO

Стадия РШМАбс. число%
TNMFIGO
T1a1N0M0IA13826,2
T1a2N0M0IA210773,8
Всего145100,0

ВбольшинственаблюденийупациентокРШМпостепени
дифференцировки опухолевых клеток был умереннодифференцированным
(52,4%) (таблица 3).
Таблица 3 – Распределение больных раком шейки матки в зависимости от степени
дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки опухолиАбс. число%
GI (высокодифференцированный)5034,5
GII (умереннодифференцированный)7652,4
GIII (низкодифференцированный)1913,1
Всего145100,0
Среди пациенток с РШМ экзофитная форма роста встречалась у
81 (55,9%), эндофитный рост – у 64 (44,1%).
Возраст пациенток, включенных в исследование, колебался от 21 до 58 лет,
в среднем составив 45,82,4 лет. Средний возраст пациенток с плоскоклеточным
интраэпителиальным поражением составил 42,51,9 лет, а больных РШМ –
48,92,7 лет. Наиболее представленным по числу больных был возрастной
период 41–50 лет: число пациенток с ПИП ШМ в этом возрастном диапазоне
составило 38%, а с РШМ – 40% (таблица 4). По другим возрастным периодам в
диапазоне от 20 до 30 лет число пациенток с ПИП ШМ было выше по сравнению
с числом больных с РШМ (20,4% против 7,6%, р=0,003), а в возрасте 51–60 лет
числом больных с РШМ превалировало над числом пациенток с ПИП ШМ
(29,7% против 11,7%, р=0,0004) (таблица 4).
Таблица 4 – Распределение пациенток с плоскоклеточным интраэпителиальным поражением
и плоскоклеточным раком шейки матки в зависимости от возраста

Возраст,В общем по группеПИП ШМРШМ
р
летабс. ч.%абс. ч.%абс. ч.%
20–303913,82820,4117,60,003
31–407426,24129,93322,80,22
41–5011039,05238,05840,00,82
51–605920,91611,74329,70,0004
Всего282100,0137100,0145100,0

Среди сопутствующей генитальной патологии чаще встречались острые и
хронические воспалительные заболевания наружных половых органов в
анамнезе (у больных ПИП ШМ в 27,0 и 29,9%, у больных РШМ в 37,2 и 35,9%,
соответственно (таблица 5). На третьем месте по числу генитальной патологии
наблюдалижелезистуюгиперплазиюэндометрия(гистологическое
исследование соскоба эндометрия) у пациенток с ПИП ШМ в 10,9% и у больных
РШМ в 12,4%. Среди методов контрацепции пациентки чаще всего использовали
внутриматочные контрацептивы и барьерную контрацепцию (пациентки с
ПИП ШМ в 24,8 и 22,6%, больные РШМ в 20,0 и 24,8%, соответственно)
(таблица 6).
Таблица 5 – Структура сопутствующей генитальной патологии пациенток с плоскоклеточным
интраэпителиальным поражением и плоскоклеточным раком шейки матки

ПИП ШМРШМ
Сопутствующие заболевания гениталийр
абс. ч.%абс. ч.%
Острые воспалительные заболевания
3727,05437,2>0,05
наружных половых органов в анамнезе
Хронические воспалительные заболевания
4129,95235,9>0,05
наружных половых органов
Хронический аднексит118,01611,0>0,05
Кисты яичников118,01711,7>0,05
Миома матки42,974,8>0,05
Железистая гиперплазия эндометрия1510,91812,4>0,05
Генитальный эндометриоз32,264,1>0,05
Всего137100,0145100,0

Таблица 6 – Структура методов контрацепции, используемых пациентками с
плоскоклеточным интраэпителиальным поражением и плоскоклеточным раком шейки матки

ПИП ШМРШМ
Методы контрацепциир
абс. ч.%абс. ч.%
Гормональные контрацептивные средства42,964,10,86
Внутриматочные контрацептивы3424,84833,10,49
Барьерная контрацепция3122,63624,80,82
Физиологический метод по циклу1813,12617,90,38
Не предохранялись5036,52920,00,003

При РШМ IA1 стадии (инвазия ≤3 мм и ≤7 мм в горизонтальном
распространении) выполняли конизацию шейки матки с последующим
выскабливанием оставшейся части цервикального канала(таблица 7).
Пациенткам, не заинтересованным в сохранении репродуктивной функции, и
пациенткам постменопаузального возраста выполняли экстирпацию матки
(операция I тип по Piver) с тазовой лимфаденэктомией. При РШМ IA2 стадии
(инвазия >3 мм и ≤5 мм и ≤7 мм в горизонтальном распространении) выполняли
модифицированную расширенную экстирпацию матки (операция II тип по
Piver/тип В по Querleu–Morrow) (таблица 7).
Таблица 7 – Распределение пациенток с РШМ в зависимости от оперативного метода лечения
Стадия РШМКонизацияII тип по Piver /Тип В по
I тип по Piver
TNMFIGOшейки маткиQuerleu–Morrow

T1a1N0M0IA128 (19,3)10 (6,9)-
T1a2N0M0IA2–107 (73,8)

Таким образом, для оценки диагностической информативности были
сформированы две группы с плоскоклеточным РШМ и плоскоклеточным
интраэпителиальным поражением низкой и высокой степени, не отличающиеся
повозрасту,структуресопутствующейгенитальнойпатологии,
анамнестическим сведениям.

Результаты исследования
В работе было установлено, что у больных РШМ по сравнению с условно
здоровой тканью экспрессия микроРНК-20а и микроРНК-21 в цервикальном
эпителии была статистически значимо выше как при стандартном попарном
сравнении, так и с контролем над ожидаемой долей ложных отклонений (false
discovery rate, FDR) с поправкой Бенджамини-Хохберга, а экспрессия
микроРНК-23bимикроРНК-375ниже.ЭкспрессиямикроРНК-205,
микроРНК-143 и микроРНК-218 в цервикальном эпителии при РШМ отличалась
от условно здоровой ткани только по критерию Манна-Уитни, но контроль над
долей ложных отклонений (FDR) не позволил считать данные отличия
статистически значимыми (FDR>5%).
Для больных с ПИП ВС было выявлено, что клеточная экспрессия
микроРНК-21 и микроРНК-23b была статистически значимо выше по
отношению к условно здоровой ткани. Выраженное различие экспрессии в ткани
ШМ установлено между пациентками с РШМ и ПИП ВС для микроРНК-20а и –
375, тогда как экспрессия микроРНК-21 и микроРНК-23b между этими
подгруппами пациенток не различалась.
Итак, у пациенток с РШМ на стадиях T1a1-T1a2N0M0 в цервикальном
эпителии относительно контрольной условно здоровой ткани установлено
надежно воспроизводимое усиление экспрессии проопухолевой микроРНК-20а,
-21 и снижение экспрессии антиопухолевой микроРНК-23b, -375, а также
тенденция к усилению тканевой экспрессии микроРНК-205 и ослаблению
экспрессии микроРНК-143 и микроРНК-218, что важно учитывать при
выявлении РШМ. Выраженное различие экспрессии в ткани ШМ установлено
между пациентками с РШМ и ПИП ВС для микроРНК-20а и -375, что явилось
основанием для использования сравнения уровня этих микроРНК с целью
проведения дифференциальной диагностики между РШМ и ПИП ВС.
Установленные закономерности были основанием для проведения
последующего ROC-анализа для поиска дифференциальных разделительных
уровней экспрессии микроРНК в цервикальном эпителии с целью разграничения
предраковой патологии и рака ШМ.
У пациенток с РШМ в зависимости от степени дифференцировки
опухолевых клеток изменялась экспрессия только микроРНК-20а, микроРНК-21
и микроРНК-23b. У больных с низкодифференцированным раком по сравнению
с высокой и средней степенью дифференцировки раковых клеток экспрессия
микроРНК-20а, микроРНК-21 была выше (p<0,05), а уровень микроРНК-23b ниже (p<0,05). С увеличением размеров опухоли было сопряжено изменение экспрессии микроРНК-21 и микроРНК-23b (p<0,05). Увеличениеразмераопухоликоррелировалосповышением экспрессии микроРНК-21 и снижением экспрессии в опухолевых образцах микроРНК-23b. Таким образом, изученные микроРНК-20а и микроРНК-21, участвующие в канцерогенезе, могут определять онконастороженность при выявлении их повышенной экспрессии в экзосомах мочи и в биопсийном материале. Ограничение экспрессии микроРНК-23b и микроРНК-375 как антиопухолевых факторов также способствовало развитию злокачественного заболевания. В отношении двух микроРНК – микроРНК-20а и микроРНК-375 отмечено различие экспрессии в цервикальном эпителии между пациентками с РШМ и ПИП ВС, что свидетельствовало о целесообразности их использования при дифференциальной диагностике. Статистически значимые разделительные уровни сut-off для отнесения пациенток в группу риска по развитию у них рака шейки матки были установлены для четырех из семи микроРНК: микроРНК-20а, микроРНК-21, микроРНК-23b,микроРНК-375.Наибольшаяинформативностьоценки экспрессии для определения риска развития РШМ имела место для микроРНК-23b(AUC=0,8570,049)имикроРНК-21(AUC=0,8120,031), поскольку именно для этих микроРНК значение площади под ROC-кривой (AUC) было наибольшим. С помощью ROC-анализа выявлено, что о высоком риске развития РШМ можно заключить при снижении экспрессии микроРНК-23b ниже -0,70 (диагностическая чувствительность 89,6% и специфичность 75%), превышении экспрессии микроРНК-21 выше 0,81 (диагностическая чувствительность 73,1% и специфичность 83,1%), превышении экспрессии микроРНК-20а выше 0,73 (диагностическаячувствительность74,2%испецифичность81,4%). РазделительныйуровеньдлямикроРНК-375составилменее-0,69 (диагностическая чувствительность 71,3% и специфичность 81%). Отношение шансов развития рака шейки матки у пациенток при изменении экспрессии микроРНК в цервикальном эпителии с учетом разделительного уровня было наивысшим для микроРНК-23b (ОШ=7,37; р<0,0001) и микроРНК-21 (ОШ=6,74; р<0,0001). Далее была проведена оценка информативности дифференциальной диагностики между РШМ и ПИП ВС путем анализа экспрессии микроРНК в цервикальном эпителии. Разделительный статистически значимый уровень был установлен для двух микроРНК: микроРНК-20а (р<0,0001) и микроРНК-375 (р=0,004). При превышенииэкспрессиимикроРНК-20а выше 0,82, с диагностической чувствительностью 74,8% и специфичностью 75,8% можно заключить о наличии РШМ и отвергнуть ПИП ВС. Для микроРНК-375 такой уровень был -0,77. При снижении экспрессии микроРНК-75 менее -0,77, с диагностической чувствительностью 70% и специфичностью 74,2% можно сделать вывод о наличии РШМ и отвергнуть ПИП ВС. На следующем этапе работы исследовали информативность жидкостной цитологии в комплексе с генетической оценкой экспрессионного статуса микроРНК цервикального эпителия. При применении стандартной жидкостной цитологииполученныезаключениясравнивалисверифицированными диагнозами при гистологическом исследовании тканевых образцов шейки матки. Из 91 верифицированного гистологически диагноза ПИП ВС при жидкостном цитологическом исследовании было выявлено 52 случая, относящихся к ПИП ВС. Следовательно, диагностическая чувствительность жидкостной цитологии при выявлении ПИП ВС составила 57,1%. Из 290 негативных заключений по «ПИП ВС» при гистологическом исследовании с результатами жидкостной цитологии совпало 269 наблюдений. В итоге диагностическая специфичность соответствовала 92,8%. Положительный прогностический результатметодаотносительноПИП ВСсоставил71,2%,негативный прогностический результат имел значение 87,3%. Особо важное значение придавали диагностической информативности жидкостной цитологии в отношении диагноза РШМ. При жидкостном цитологическом исследовании из 145 верифицированных гистологически диагнозов РШМ было выявлено 107 случаев со злокачественной опухолью. Диагностическая чувствительность жидкостной цитологии при выявлении РШМ составила 73,8%. Диагностическая специфичность соответствовала 94,1%. Положительный прогностический результат метода составил 88,4%, а негативный – 85,4%. Эффективность или точность жидкостной цитологии для диагностики ПИП ВС – 84,25% и РШМ – 86,35%. Чувствительность (73,8%) и специфичность (94,1%) жидкостного теста была выше при выявлении РШМ по сравнению с ПИП ШМ. На следующем этапе рассчитывали информативность оптимизированной жидкостной цитологии для выявления РШМ. Пациенткам одновременно проводили жидкостное цитологическое и генетическое исследования. При выявлении РШМ путем жидкостной цитологии и отклонении экспрессии микроРНК-21 или микроРНК23b (либо двух микроРНК) от разделительной точки, тест считали положительным. Если РШМ не был выявлен при жидкостной цитологии либо отсутствовало изменение экспрессии двух микроРНК – микроРНК-21 или микроРНК-23b при положительной стандартной жидкостной цитологии, то тест считали отрицательным. Диагностическая чувствительность оптимизированной жидкостной цитологии с помощью генетических методов для оценки риска развития РШМ составила 80%, а специфичность метода 97,9%. Таким образом, оптимизация жидкостной цитологии путем оценки экспрессии микроРНК-21 и микроРНК23b позволила повысить диагностическую чувствительность с 73,8% до 80%, а специфичность с 94,1% до 97,9%. Информативность дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС путем жидкостной цитологии характеризовалась диагностической чувствительностью 87%испецифичностью78,8%.Длярасчетаинформативности дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС учитывали только больных, у которых при жидкостной цитологии фигурировали два диагноза – РШМ и ПИП ВС. Оптимизация жидкостной цитологии путем оценки экспрессии микроРНК- 20а и микроРНК-375 позволила повысить диагностическую чувствительность стандартного жидкостного цитологического исследования с 87% до 95,1%, а специфичность с 78,8% до 93,9%. Таким образом, оптимизация жидкостной цитологии генетическими методамипозволиласократитьчислоложноотрицательныхи ложноположительных результатов метода. В работе были выявлены наиболее информативные пары микроРНК, определяемые в биопсийном материале и в моче, анализ экспрессии которых расширил возможности жидкостной цитологии как с точки зрения метода диагностики РШМ (микроРНК-21 и микроРНК-23b), так и с позиции дифференциальной диагностики между РШМ и ПИП ВС (микроРНК-20а имикроРНК-375). Поскольку определение уровня экспрессии микроРНК в цервикальном эпителии доступно после проведения биопсии или операций на шейке матки, то дальнейшая перспектива видится в разработке неинвазивного способа получения биологического материала для исследования, так как гистологическое исследование при постановке диагноза является ведущим. Экзосомы относятся к внеклеточным везикулам размером 50–150 нм и выполняют функции межклеточной коммуникации. При формировании экзосомы пузырек образуется внутри клетки, внутри пузырька образуются еще пузырьки, далее эндосома подходит к клеточной мембране, сливается с ней и частьпузырьковвыходитвовнеклеточноепространство.Механизм коммуникации экзосомы и клетки-мишени до конца не изучен: взаимодействие происходит по механизму лиганд-рецептор либо слияния пузырька с плазматической мембраной и содержимое попадает внутрь клетки-мишени. Экзосомы в своем составе могут содержать фрагменты ДНК и РНК, включая некодирующие микроРНК. Доставляя микроРНК к клетке-мишени, можно изменить экспрессию генов этой клетки, главным образом, ингибируя трансляцию мРНК. МикроРНК, упакованная в экзосомы, на пути от клетки- донора до клетки-мишени защищены от нуклеаз. Экзосомы встречаются практически во всех биологических жидкостях (кровь, моча, слюна и др.). Их обнаружение в биологических жидкостях получило название жидкой биопсии и направленонавыявлениеопухолейпринеинвазивнойдиагностике (Пантелеев М.А. и соавт., 2017). Например, в опухолевых экзосомах происходит выраженный прирост экспрессии CD63 (Yoshioka Y., 2013). В выделенных экзосомах мочи у пациенток с РШМ, а также при ПИП ВС и у здоровых доноров, была проведена оценка уровня экспрессии четырех микроРНК, задействованных при оптимизации жидкостной цитологии – микроРНК-20а, микроРНК-21, микроРНК-23b и микроРНК-375. микроРНК-20а, микроРНК-21 и микроРНК-375 в экзосомах мочи встречалисьспревышением70%.микроРНК-23bвэкзосомахмочи экспрессировалась редко независимо от патологии шейки матки, что снижало целесообразность ее исследования для диагностики в данной биологической среде. Выраженность экспрессии микроРНК была различной в зависимости от патологии шейки матки. При РШМ в отличие от здоровых доноров в экзосомах мочи уровень экспрессии микроРНК-20а был повышен (0,68±0,13 против 0,06±0,05, р=0,0001). Проведение ROC-анализа позволило определить уровень экспрессиимикроРНК-20авэкзосомахмочи,превышениекоторого сопровождалось повышением риска РШМ. Так, если экспрессия микроРНК-20а в экзосомах мочи у пациенток была выше 0,46, то с диагностической чувствительностью 86,8% и специфичностью 82,1% можно сформировать заключение о повышении риска РШМ. Разделительный уровень экспрессии микроРНК-20авэкзосомахмочидляпроведениядифференциальной диагностики между РШМ и ПИП ВС был 0,53. Если экспрессия микроРНК-20а в экзосомах мочи у пациенток с патологией шейки матки превышала 0,53, то с диагностической чувствительностью 91,2% и специфичностью 76% можно говорить в пользу диагноза РШМ альтернативно ПИП ВС. микроРНК-20а часто экспрессируется в экзосомах мочи и генетическая оценка уровня экспрессии позволяет эффективно использовать тест для диагностики РШМ. В отношении микроРНК-21 установлен высокий уровень экспрессии в экзосомах мочи как при РШМ (0,99±0,15), так и при ПИП ВС (0,78±0,22). Выраженность экспрессии микроРНК-21 в экзосомах мочи при патологии шейки матки была статистически значимо выше по сравнению со здоровыми донорами, но дифференциальная информативность между РШМ и ПИП ВС оказалась низкой. Следовательно, определение уровня экспрессии микроРНК-21 в экзосомах мочи имеет высокую диагностическую информативность как при предраковых, так и злокачественных изменениях шейки матки с низкой разделительной способностью двух процессов. Уровни экспрессии микроРНК-375 в экзосомах мочи у пациенток с РШМ (-0,562±0,08) и у здоровых доноров (-0,04±0,01) статистически значимо различались(р=0,002).ПоследующийROCанализпозволилвыявить дифференциально разделительный уровень между нормой и РШМ – -0,45. Если экспрессия микроРНК-375 в экзосомах мочи у пациенток ниже -0,45, то с диагностической чувствительностью 76,9% и специфичностью 79,3% можно сформировать заключение о повышении риска РШМ. У пациенток с ПИП ВС уровень экспрессии микроРНК-375 был низким (-0,13±0,06). Различие экспрессии изучаемой микроРНК между пациентками РШМ и ПИП ВС было статистически значимым (р=0,005). Таким образом, наиболее информативным генетическим тестом оценки экспрессии микроРНК в экзосомах мочи был метод анализа экспрессии микроРНК-20а и сравнения ее уровня с найденными точками cut-off для разделения состояний РШМ и норма, РШМ и ПИП ВС, а также уровня микроРНК-21 для диагностики РШМ. Эти две микроРНК были использованы для оптимизации метода жидкостной цитологии: микроРНК-21 для диагностики РШМ, а микроРНК-20а для дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС. На следующем этапе рассчитывали информативность оптимизированной жидкостной цитологии для выявления РШМ. Пациенткам одновременно проводили жидкостное цитологическое и генетическое исследование экзосом мочи. При выявлении РШМ путем жидкостной цитологии и отклонении экспрессии микроРНК-21 в экзосомах мочи от разделительной точки, тест считали положительным. Если рак ШМ не был выявлен при жидкостной цитологии либо отсутствовало изменение экспрессии микроРНК-21 в везикулах при положительной стандартной жидкостной цитологии, то тест считали отрицательным. Диагностическаячувствительностьоптимизированнойжидкостной цитологии с помощью генетических методов оценки экспрессии микроРНК-21 в экзосомах мочи для определения риска развития РШМ составила 80%. Таким образом, оптимизация жидкостной цитологии путем оценки экспрессии микроРНК-21 в везикулах мочи позволила повысить диагностическую чувствительность с 71,7% до 80%. Диагностическаячувствительностьоптимизированнойжидкостной цитологии с помощью генетического метода оценки экспрессии микроРНК-20а в экзосомах мочи для дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС составила 82,5%, а специфичность 92%. Таким образом, оптимизация жидкостной цитологии путем оценки экспрессии микроРНК-20а в везикулах мочипозволилаповыситьдиагностическуючувствительностьпри дифференциальной диагностике РШМ и ПИП ВС с 75,4% до 82,5%, а диагностическую специфичность с 76% до 92%. Итак, оценка экспрессии микроРНК-20а и микроРНК-21 в везикулах мочи при РШМ перспективна ввиду того, что позволяет собрать биологический материал неинвазивным способом, имеет высокую статистически значимую информативность при самостоятельной оценке показателей и расширяет диагностическую информативность стандартных методом диагностики, таких как жидкостная цитология. Сопоставление полученных сведений в работе позволило разработать схему алгоритма для оптимизации жидкостной цитологии с помощью генетических исследований микроРНК цервикального эпителия (рисунок 2). СозданиеалгоритмавыявлениябольныхРШМипроведение дифференциального диагноза с ПИП ВС позволило сформулировать следующее диагностическое правило: 1.Если при жидкостной цитологии получено заключение «Рак шейки матки» и 2.Если REмикроРНК-21≥0,81 или 3.Если REмикроРНК-23b ≤ -0,70 или 4.Если REмикроРНК-21 ≥0,81 и REмикроРНК-23b ≤ -0,70, то выявляем рак шейки матки. Жидкостная цитология РШМ+ (ДЧ=73,8%) REмикроРНК-21:REмикроРНК-23b: <0,81≥0,81≤-0,7>-0,7
РШМ

РШМ+ (ДЧ=80%)Выявление
РШМ

REмикроРНК-20аREмикроРНК-375

<0,82≥0,82≤-0,77>-0,77

ПИП ВСДиф.диагноз
с ПИП ВС
РШМ+ (ДЧ=95,1%)

Рисунок 2. Схема алгоритма для оптимизации жидкостной цитологии с помощью
генетических исследований микроРНК цервикального эпителия

Информационная значимость оптимизированной жидкостной цитологии с
помощью генетических методов оценки экспрессии микроРНК в цервикальном
эпителии при выявлении рака шейки матки (первый этап) следующая:
чувствительность – 80%, специфичность – 97,9%.
На следующем этапе у больных с выявленным РШМ оценивали
экспрессию микроРНК-20а и микроРНК-375 в цервикальном эпителии для
дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС (рисунок 3).
1. Если в цервикальном эпителии REмикроРНК-20а≥0,82
или
2. Если REмикроРНК-375≤ -0,77
или
3. Если REмикроРНК-20а ≥0,82 и REмикроРНК-375 ≤ -0,77,
то формируем заключение о раке шейки матки и отвергаем заключение
«ПИП ВС».
Жидкостная цитология

ПИП ВСРШМ+(ДЧ=75,4%,ДС=76%)

микроРНК-20а
экзосомы мочи

<0,53≥053(ДЧ=82,5%,ДС=92%) РШМ+ Рисунок 3. Схема алгоритма для оптимизации жидкостной цитологии с помощью генетических исследований микроРНК экзосом мочи При оценке экспрессии микроРНК-20а в экзосомах мочи оптимизация жидкостнойцитологии происходила в направлении дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС. У больных с выявленным РШМ оценивали экспрессию микроРНК-20а в экзосомах мочи для дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС. Если в экзосомах мочи REмикроРНК-20а≥0,53 дополнительно к положительному заключению жидкостной цитологии о РШМ, то формируем заключение о раке шейки матки и отвергаем заключение «ПИП ВС». Если в экзосомах мочи REмикроРНК-20а <0,53, то формируем заключение о ПИП ВС. Информационная значимость оптимизированной жидкостной цитологии с помощью генетических методов оценки экспрессии микроРНК в экзосомах мочи при дифференциальной диагностике следующая: чувствительность – 82,5%, специфичность – 92%. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований уровня микроРНК в патологически измененной ткани шейки матки и в экзосомах мочи в направлении разработки методов диагностики рака шейки матки и определения риска злокачественной трансформации предопухолевой патологии. ВЫВОДЫ 1.Повышениедиагностическойинформативностижидкостной цитологии в выявлении РШМ заключается в оценке экспрессии микроРНК-21 и микроРНК-23b и повышает диагностическую чувствительность метода с 73,8% до 80%, а специфичность с 94,1% до 97,7%. При превышении экспрессии микроРНК-21 в цервикальном эпителии выше 0,81 риск развития РШМ возрастает в 6,7 раз (р<0,0001), а при снижении экспрессии микроРНК-23b ниже -0,70 кратность повышения риска РШМ составляет 7,37 (р<0,0001). 2.Повышениедиагностическойинформативностижидкостной цитологии для дифференциальной диагностики РШМ с плоскоклеточными интраэпителиальнымипоражениямизаключаетсявоценкеэкспрессии микроРНК-20а и микроРНК-375 и повышает диагностическую чувствительность метода с 87% до 95,1%, а специфичность с 78,8% до 93,9%. Вероятность РШМ при дифференциальной диагностике с ПИП ВС повышается при превышении уровня экспрессии микроРНК-20а в цервикальном эпителии выше 0,82 (р<0,0001) и снижении экспрессии микроРНК-375 ниже -0,77 (р=0,004). 3.Для диагностики рака шейки матки дополнительно к жидкостной цитологии диагностически информативным является определение в экзосомах мочи уровня экспрессии микроРНК-21 (диагностическая чувствительность 80%, специфичность 65,5%, р<0,001), а для дифференциальной диагностики рака шейки матки с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями высокой степени уровня экспрессии микроРНК-20а (диагностическая чувствительность 82,5%, специфичность 92%, р<0,001). 4.В зависимости от степени дифференцировки опухолевых клеток у больных РШМ изменяется клеточная экспрессия микроРНК-20а, микроРНК-21 и микроРНК-23b. У пациентов с низкодифференцированным РШМ по сравнению с высокой и средней дифференциацией раковых клеток экспрессия микроРНК-20а, микроРНК-21 в цервикальном эпителии выше (p<0,05), а уровень микроРНК-23b ниже (p<0,05). С увеличением размеров опухоли сопряжено изменение экспрессии микроРНК-21 и микроРНК-23b (p<0,05). Для клеточнойэкспрессиимикроРНК-143,микроРНК-205имикроРНК-218 ассоциации с клиническими характеристиками заболевания не установлено. 5. Алгоритм повышения диагностической информативности жидкостной цитологии посредством комплексирования с генетическими методами для раннейдиагностикиракашейкиматкизаключаетсявсоблюдении диагностического правила. Если при жидкостной цитологии получено заключение «Рак шейки матки» и уровень экспрессии микроРНК-21≥0,81 и/или экспрессия микроРНК-23b≤-0,70, то диагноз злокачественного заболевания формируетсясчувствительностью80%испецифичностью97,9%. Дополнительным условием при дифференциальной диагностике РШМ и ПИП ВС и формировании заключения о злокачественном процессе является повышение в цервикальном эпителии экспрессии микроРНК-20а≥0,82 и/или снижение экспрессии микроРНК-375≤-0,77, повышение уровня экспрессии микроРНК-20а в экзосомах мочи выше 0,53. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1.Для повышения диагностической информативности жидкостной цитологии у пациенток с патологией шейки матки методом ПЦР в режиме реальноговременирекомендуетсяопределитьуровеньэкспрессии микроРНК-20а, микроРНК-21, микроРНК-23b и микроРНК-375. 2.Дляпроведениянеинвазивнойдиагностикизлокачественной трансформации плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки рекомендуется оценить в экзосомах мочи экспрессию микроРНК-20а.