Эффекты фактора роста нервов и пептидов врожденного иммунитета, а также их комбинаций с химиопрепаратами, на клетки опухолей мозга in vitro
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Стратегии повышения эффективности химиотерапии интракраниальных опухолей…….17 1.2. Причины резистентности клеток интракраниальных опухолей к химиопрепаратам
1.3. Применение опухолевых и нормальных клеток мозга в качестве моделей для тестирования противоопухолевой активности веществ
1.4. Структурные особенности фактора роста нервов, протегрина-1, кателицидина LL-37, их локализация и эффекты на нормальные и опухолевые клетки человека
1.4.1. Структурные особенности фактора роста нервов, его локализация и эффекты на нормальные и опухолевые клетки
1.4.2. Структурные особенности кателицидина LL-37, протегрина-1, их локализация и эффекты на нормальные клетки
1.5. Механизмы действия химиопрепаратов, фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 на клетки интракраниальных опухолей
1.5.1. Механизмы действия кателицидина LL-37 и протегрина-1 на опухолевые клетки
1.5.2. Рецепторы фактора роста нервов TrkA, р75 и пути их сигнальной трансдукции
1.5.3. Онкогены MYCC, MYCN и их роль в клетках интраканиальных опухолей
1.5.4. Клеточные эффекты интерлейкина-6
1.6. Потенциальные возможности клинического применения фактора роста нервов и калицидина LL-37 в качестве лекарственных препаратов
1.6.1. Потенциальные возможности клинического применения фактора роста нервов
1.6.2. Потенциальные возможности клинического применения кателицидина LL-37
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Группы исследования
2.3. Дизайн исследования
2.4. Метод культивирования клеток
2.4.1. Культивирование клеток глиом С6 и U251…………………………………………….57
2.4.2. Культивирование клеток интракраниальных опухолей и нормальной
нейроглиальной ткани человека……………………………………………………………….57 2.5. Подбор концентраций реагентов и их комбинаций
2.5.1. Подбор доз химиопрепаратов при обособленном действии…………………………..59
2.5.2. Подбор концентраций фактора роста нервов и химиопрепаратов при комбинированном действии…………………………………………………………………….61
2.5.3. Подбор доз фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37
на клетках глиом С6 и U251……………………………………………………………………62 2.6. Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов, фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 на опухолевых и нормальных клетках мозга……………………………………64
2.6.1. Оценка цитотоксической активности соединений с использованием красителя трипанового синего в камере Горяева………………………………………………………64 2.6.2.Оценка цитотоксического действия соединений и их комбинаций с помощью МТТ- теста
2.6.3. Оценка по ИК50 цитотоксической активности комбинаций фактора роста нервов, протегрина-1, кателицидина LL-37 с химиопрепаратами и их эффектов в отношении клеток глиом С6 и U251………………………………………………………………………………………….. .67
2.7. Определение индивидуальной чувствительности клеток интракраниальных опухолей пациентов к химиопрепаратам и фактору роста нервов
2.8. Оценка уровня секреции интерлейкина-6 методом иммуноферментного анализа
2.9. Электронно-микроскопическое исследование ультраструктурных особенностей типов гибели клеток пилоцитарной астроцитомы и медуллобластомы
2.10. Оценка жизнеспособности клеток глиомы U251 с помощью ДНК-связывающих красителей YO-PRO-1 и пропидий йодида методом проточной цитометрии
2.11. Спектрофотометрический метод определения активности каспазы 3
2.12. Иммунофлуоресцентное определение экспрессии TrkA, р75 рецепторов и их соотношения на клетках анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы77 2.13. Идентификация численности копий MYCC и MYCN- онкогенов в интерфазных клетках медуллобластомы с помощью флуоресцентной in situ гибридизации
2.14. Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Определение цитотоксической активности фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 на клетках интракраниальных опухолей
3.1.1. Оценка цитотоксической активности фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 на клетках глиомы С6 крысы
3.1.2. Оценка цитотоксической активности фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 на клетках глиомы U251 человека
3.1.3. Оценка цитотоксического действия фактора роста нервов и химиопрепаратов на клетках пилоцитарной астроцитомы, анапластической астроцитомы, глиобластомы и медулобластомы человека …………………………………………………………………………………………….83
3.1.4. Оценка индивидуальной чувствительности клеток пилоцитарной астроцитомы, анапластической астроцитомы, глиобластомы и медулобластомы человека к химиопрепаратам и фактору роста нервов……………………………………………………85
3.2. Определение цитотоксической активности комбинаций фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 с химиопрепаратами на клетках интракраниальных опухолей…………
3.2.1. Оценка цитотоксической активности комбинаций фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 с химиопрепаратами на клетках глиомы С6 ………………………………..91 3.2.2. Оценка цитотоксической активности комбинаций фактора роста нервов, протегрина-1 и кателицидина LL-37 с химиопрепаратами на клетках глиомы U251 …………………………….92 3.2.3. Комбинированное действие фактора роста нервов и химиопрепаратов на клетки пилоцитарной астроцитомы, анапластической астроцитомы, глиобластомы и медулобластомы человека
3.3. Определение действия фактора роста нервов и его комбинаций с химиопрепаратами на клетки нормальной нейроглиальной ткани мозга человека……………………………………………… .97 3.4. Изучение типов гибели клеток интракраниальных опухолей при действии фактора роста нервов, протегрина-1 и их комбинаций с химиопрепаратами………
3.4.1. Изучение типов гибели клеток глиомы U251 при действии протегрина-1, этопозида и их комбинации………………………………………………………………………………
3.4.2. Изучение типов гибели клеток пилоцитарной астроцитомы при действии цисплатина, темозоломида, фактора роста нервов и их комбинаций
3.4.3. Изучение типов гибели клеток медуллобластомы при действии цисплатина, темозоломида, фактора роста нервов и их комбинаций
3.5. Потенциальные маркеры чувствительности клеток пилоцитарной астроцитомы, анапластической астроцитомы, глиобластомы и медулобластомы человека к фактору роста нервов и химиопрепаратам………………………………………………………………… ……….117
3.5.1. Корреляционные зависимости между химиочувствительностью, степенью злокачественности клеток пилоцитарной астроцитомы, эпендимомы, анапластической астроцитомы, глиобластомы и медулобластомы и уровнем интерлейкина-6
3.5.2. Изменение экспрессии TrkA, p75 рецепторов, их соотношения на клетках анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы при действии фактора роста нервов и его комбинаций с цисплатином и темозоломидом
3.5.3. Влияние фактора роста нервов на количество копий MYCC-, MYCN-онкогенов в клетках медуллобластомы
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Эффекты и механизмы действия фактора роста нервов, протегрина-1,
кателицидина LL-37 и химиопрепаратов на клетки глиомы С6 и глиобластомы человека ..132 4.2. Эффекты фактора роста нервов на клетках интракраниальных опухолей………………138
4.3. Комбинированное действие ростовых факторов, протегрина-1 и кателицидина LL-37
с химиопрепаратами на клетки интракраниальных опухолей…………………………… . ….140 4.4. Жизнеспособность клеток нормальной нейроглиальной ткани аутопсийных образцов мозга человека …
4.5. Анализ типов гибели клеток интракраниальных опухолей при действии фактора роста нервов, протегрина-1, кателицидина LL-37 и их комбинаций с химиопрепаратами …… ….143 4.6. Потенциальные маркеры чувствительности, резистентности интракраниальных
опухолей к фактору роста нервов и химиопрепаратам…………………………… ….. ………144
4.6.1. Применение интерлейкина-6 в качестве прогностического маркера злокачественности и химиочувствительности интракраниальных опухолей ……
4.6.2. TrkA, p75 рецепторы их соотношение как маркеры интракранальных опухолей к действию фактора роста нервов и его комбинаций с цисплатином и темозоломидом …. .147 4.6.3. MYCC, MYCN-онкогены как маркеры интракранальных опухолей к действию фактора роста нервов ……………………………………………………………………………..148
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………………………… ………153 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ1 Группы исследования и клинические данные пациентов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на клетках интракраниальных опухолей, взятых у 98 пациентов в
возрасте от 3 мес до 17 лет (8,3±0,6 года), находившихся на лечении в Городской
клинической больнице скорой медицинской помощи г. Минска в 2008−2013 гг. В
исследование также включены 10 скоропостижно умерших человек в 2009 г. (57,1±4,0 лет), у
которых во время вскрытия в морге Управления судебно-медицинских экспертиз
Государственного комитета судебно-медицинских экспертиз Республики Беларусь по
Минской области была взята нейроглиальная ткань. С целью формирования клинически
относительно однородных групп пациентов из историй болезней получали сведения о
гистологическом типе, степени злокачественности, локализации опухоли в отделах
головного мозга, радикальности хирургического вмешательства, а также о возрасте и поле
пациентов. Сведения позволили сформировать 5 исследовательских групп. В первую группу
вошли 42 пациента с ПА (GrI, 22 мальчика и 20 девочек, 7,9±0,7 года). Вторая группа
включала 9 пациентов с АА (GrIII, 5 мальчиков и 4 девочки, 8,6±1,6 года). Третья группа
включала 9 пациентов с ГБ (GrIV, 9 мальчиков, 10,3±1,9 года). Четвертая группа состояла из
38 детей с МБ (GrIV, 27 мальчиков и 11 девочек, 5,7±0,6 года). В пятую группу вошли 10
скоропостижно умерших человек, у которых во время вскрытия были взяты фрагменты мозга
(8 мужчин и 2 женщины, 57,1±4,0 лет). Общее количество посевов n=10389, аликвот – 1020 и
417 электронограмм. Подбор концентраций химиопрепаратов, NGF, PG-1, LL-37, их
комбинаций, а также определение цитотоксической активности по расчету 50%-ной
ингибирующей концентрации (ИК50) и эффектов комбинаций выполнено на клеточных
линиях глиом крысы С6 и U251 человека.
Клеточные культуры и условия культивирования. Клетки глиом крысы С6 и U251
человека культивировали в среде DМЕМ с 10%-ной ЭТС в СО2-инкубаторе в течение 1-2 сут.
Клетки нейроглиальной ткани выделяли из мозжечка скоропостижно умерших людей в
течение 24 ч с момента смерти. Опухолевые клетки культивировали 2 сут (Freshney R. I. et
al., 2000), клетки нейроглиальной ткани 28 сут (Gibbons H. M., 2010).
Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов, фактора роста нервов,
протегрина-1 и кателицидина LL-37 на опухолевых и нормальных клетках мозга с
использованием красителя трипанового синего в камере Горяева. Суспензию клеток
смешивали с 0,4%-раствором красителя трипанового синего (Alta Aesar, Германия) и
проводили подсчёт жизнеспособных/погибших клеток в камере Горяева. Оценку
цитотоксической активности химиопрепаратов, NGF, PG-1 и LL-37 рассчитывали, как
индекс цитотоксичности (ИЦ), по формуле 1 (Миронов А. Н. и соавт., 2012):
(1)
где N% – ИЦ реагентов, опыт – выживаемость клеток при действии химиопрепаратов,
NGF, PG-1 и LL-37 и их комбинаций с химиопрепаратами, контроль – выживаемость клеток
в контроле.
Оценка цитотоксического действия фактора роста нервов, протегрина-1,
кателицидина LL-37, химиопрепаратов и их комбинаций с помощью МТТ-теста.
Цитотоксичность химиопрепаратов, NGF, PG-1, LL-37 и их комбинаций в отношении клеток
глиом С6, U251 оценивали также с помощью МТТ-теста (Mosmann, 1983). В лунки 96-
луночного планшета вносили по 10000 клеток. NGF, PG-1, LL-37, тестировали в 2-кратных,
химиопрепараты в 2-10-кратных разведениях и инкубировали 1 сут в СО2 инкубаторе. Спустя
1 сут добавляли по 25 мкл/лунку раствора МТТ (5 мг/мл) и инкубировали 3 ч. Вносили 50
мкл/лунку изопропанола с 0,04 N НСl. Измерение оптической плотности проводили при
длине волны 540 нм на спектрофотометре SpectraMax 250 (Molecular Devices, США).
Определяли цитотоксичность действующих веществ по формуле 2:
,(2)
где, ПК (%) ‒ процент погибших клеток в пробе, OD (пробы) – оптическая плотность пробы,
содержащей исследуемый реагент или комбинацию в заданной концентрации; OD(контроль)
‒ средняя оптическая плотность лунок с интактными клетками; OD (0%ЖК) ‒ средняя
оптическая плотность лунок с культуральной средой, не содержавшей клеток.
Оценка по ИК50 цитотоксической активности комбинаций фактора роста нервов,
протегрина-1, кателицидина LL-37 с химиопрепаратами и их эффектов на клетках
глиом С6 и U251. ИК50 комбинаций рассчитывали методом нелинейного регрессионного
анализа с помощью программы OriginPro 8.5. ИК50 химиопрепарата в каждой комбинации
определяли исходя из пропорций по формуле 3: ИК50химиопрепарата = ИК50 комбинации ×
W(3)где W – доля химиопрепарата в комбинации.
Рассчитав ИК50, определяли по формуле 4 комбинационный индекс (КИ, CI) и типы
эффектов комбинаций (синергизм, антагонизм, аддитивность) (Chou, T-C. et al., 2006):
(4), где СI – комбинационный индекс, D1 и D2 – дозы ИК50, веществ
1 и 2, вызывающих гибель клеток при обособленном применении; (Dx)1 и (Dx)2 – дозы ИК50
эти веществ в комбинации.
Аддитивным считали эффект комбинации (ЭК) меньший суммы эффектов комбинантов, но
больший эффекта более активного комбинанта: А + В > ЭК, но АВ> Эmax (А или В), где А и
В – эффекты веществ при обособленном применении. Для аддитивизма КИ=1.
Синергетическим считали эффект ЭК меньший суммарного эффекта равных по эффекту
комбинантов, но больший, чем эффекты одного из веществ: А или В < ЭК, но АВ< ЭΣ(А +
В), для синергизма КИ<1.
Снижением эффекта (антагонизм) считали ЭК меньший, чем эффект более активного
комбинанта:
ЭКАВ< Эmax(А или В), для антагонизма КИ>1.
Оценка жизнеспособности клеток глиомы U251 с помощью ДНК-связывающих
красителей YO-PRO-1 и йодида пропидия методом проточной цитометрии. Для
определения доли опухолевых клеток, погибающих по пути апоптоза или некроза при
действии NGF, PG-1, LL-37 и их комбинаций с химиопрепаратами, клетки (1×106/мл)
окрашивали флуоресцентными ДНК-связывающими красителями YO-PRO-1 и йодидом
пропидия (PI). Пробы и контроль инкубировали 1 сут в СО2 инкубаторе. Затем к 100 мкл
суспензии добавляли 5 мкл раствора YO-PRO-1 (Invitrogen, США) и 10 мкл раствора PI
(Sigma-Aldrich, США). Окраску проводили при комнатной температуре в течение 15 мин в
защищенном от света месте. По завершении инкубации к образцам добавляли по 200 мкл
ФСБ и анализировали на проточном цитофлуориметре Navios™ (Beckman Coulter, США) при
помощи программы Kaluza™.
Оценка уровня секреции интерлейкина-6 опухолевыми клетками при действии
химиопрепаратов и фактора роста нервов методом иммуноферментного анализа.
Концентрацию IL-6 в культуральной среде определяли согласно инструкции по применению
тест-набора для иммуноферментного анализа (BD Biosсiences, США).
Спектрофотометрический метод определения активности каспазы 3. Активность
каспазы-3 оценивали колориметрическим методом по скорости расщепления хромогенного
субстрата Ac-DEVD-pNA, используя набор «Caspase3 Assay Kit, Colorimetric» (Sigma, США).
Клетки глиомы U251 (5 млн/мл) инкубировали с PG-1, этопозидом и их комбинацией 24 ч в
СО2 инкубаторе при 37°С, после чего получали их лизаты и определяли активность в них
каспазы-3, измеряя OD проб при 405 нм.
Электронно-микроскопическое исследование ультраструктурных особенностей
типов гибели клеток пилоцитарной астроцитомы и медуллобластомы при действии
химиопрепаратов, фактора роста нервов и его комбинаций с химиопрепаратами.
Электронно-микроскопическое исследование выполнено согласно методике (Боголепов Н.
Н., 1976) на эксплантах ПА и МБ, обработанных темозоломидом, цисплатином, NGF и его
комбинациями с указанными препаратами. Материал, заключенный в аралдитовые капсулы,
резали на ультрамикротоме LКВ 2088 (Leitz, Швеция) и просматривали под электронным
микроскопом JEM-100CX (JEOL Ltd., Япония) при увеличениях ×4800−14400. Определяли
типы гибели клеток (апоптоз, некроз и смешанный тип) и соответствующие индексы (Сорока
Н. Ф. и соавт., 2007). Количественный анализ клеток проводили с применением программы
ImageJ.
Иммунофлуоресцентное определение экспрессии TrkA, р75 рецепторов и их
соотношения на клетках анапластической астроцитомы, глиобластомы и
медуллобластомы. Экспрессию TrkA, p75 рецепторов изучали на клетках АА, ГБ и МБ,
предварительно обработанных NGF или его комбинациями с цисплатином или
темозоломидом, при действии стократно разведенных первичных Anti-TrkA, Anti-р75 (Pan-
NGFR) и тысячекратно разведенных вторичных кроличьих FITC-конъюгированных антител
Anti-Rabit Ig-FITC по протоколу (Farina A. et al., 2013). Клетки просматривали на
флуоресцентном микроскопе Leitz MPV2 (Carl Zeiss, Германия). Применяя программу
ImageJ, оценивали: интенсивность флуоресценции (пиксел/мкм2) в расчете на одну клетку и
рассчитывали соотношение TrkA/p75-рецепторов. Определяли корреляции между
экспрессией TrkA, p75-рецепторов, их соотношением TrkA/p75 и ИЦ реагентов.
Идентификация численности копий MYCC и MYCN- онкогенов в интерфазных
клетках медуллобластомы с помощью флуоресцентной in situ гибридизации. Для
выявления численности копий (амплификации) MYCC, MYCN-онкогенов в клетках МБ,
наносили ДНК зонды VysisLSI MYCC (8q24.12-q24.13), VysisLSI MYCN (2p24), меченные
флуорохромом SpectrumOrange (Zitterbart K. et al., 2011). Анализ проводили на
флуоресцентном микроскопе Leica DMLB (Германия) с фильтром DAPI Texas SpectrumRed
при увеличении объектива ×100.
Статистическая обработка данных. Статистический анализ выполнен с помощью
программного пакета Statistica (версия 6.0). Каждый опыт проводили не менее чем в трех
(три–пять) независимых повторах. Результаты представляли в виде средней арифметической
(M) и стандартного отклонения (SD). Для сравнения двух групп по выраженности
количественных признаков применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA one-
way) и F-критерий (Фишера). Методом двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA
two-way) установлена зависимость экспрессии TrkA, p75 рецепторов и их соотношения от
типа опухоли и механизма действия реагентов. В случае отклонения нормальности в
независимых выборках и наличия малого количества образцов (n<30) для их сравнения
использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Статистически значимым считали
различие при уровне значимости p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение цитотоксической активности фактора роста нервов, протегрина-1 и
кателицидина LL-37 на клетках интракраниальных опухолей. Для определения
цитотоксической противоопухолевой активности NGF, PG-1 и LL-37 в отношении клеток
глиомы С6 и U251 их действие сравнивали по ИК50 с химиопрепаратами в МТТ тесте или,
обрабатывая клетки витальным красителем трипановым синим (таблица 1).
Таблица 1. ИК50 химиопрепаратов, NGF, LL-37, PG-1 при односуточном действии in vitro на
клетки глиом С6 и U251 в МТТ-тесте и экспериментах с обработкой трипановым синим
Глиома С6Глиома U251
ИК50, мкM,ИК50, мкM,
СерияИК50, мкM,ИК50, мкM,
трипановыйтрипановый
МТТ тестМТТ тест
синийсиний
Темозоломид391,5134,81725,71613
Цисплатин81,282,2371,5228,9
NGF0,01480,00250,002140,0035
LL-371,11,13,11,9
PG-110,18,626,110,5
Данные табл. 1 показывают, что наибольшей противоопухолевой активностью в
отношении клеток глиомы С6 и U251 обладает NGF. Тогда как LL-37 и PG-1 также проявляют
выраженное цитотоксическое действие, превосходящее по показателям эффекты цисплатина и
темозоломида, как по результатам МТТ теста, так и при применении красителя трипанового
синего. Клетки U251 оказались устойчивее к LL-37 в 2,9 раза и PG-1 в 2,6 раза в МТТ тесте и в
1,7 и 1,2 раза в тесте с трипановым синим. Кроме того, показатели ИК50 NGF, PG-1 и LL-37
были ниже, чем ИК50 доксорубицина, карбоплатина и этопозида в отношении клеток глиомы
С6 и U251 по результатам МТТ теста и при применении красителя трипанового синего
(данные не показаны).
Также определяли цитотоксическое действие NGF на клетки ПА, АА, ГБ и МБ,
сравнивая показатели с таковыми, характеризующими активность химиопрепаратов (табл. 2).
Рассчитывали среднее значение ИЦ всех химиопрепаратов для каждого типа опухоли.
Таблица 2. Индекс цитотоксичности химиопрепаратов и NGF при in vitro действии на клетки
интракраниальных опухолей
Гистологический тип опухоли
Серия
пилоцитарная анапластическая
экспериментаглиобластомамедуллобластома
астроцитомаастроцитома
Винкристин39,2±1,636,8±2,0*38,1±3,337,8±0,6
Карбоплатин46,6 ± 2,155,0 ± 3,6*33,8 ±3,3*39,9± 1,7
Метотрексат46,4 ± 1,829,7 ± 3,1*43,2 ± 2,241,6 ± 1,6
Темозоломид52,5 ± 2,2*46,0 ± 4,733,6 ±4,934,2 ± 2,3
Циклофосфамид46,0±1,744,2±4,237,7±4,545,7±1,8
Цисплатин51,0 ± 2,0*44,0 ± 4,245,8 ± 2,947,3 ± 2,0*
Цитарабин46,1 ± 1,845,3 ± 3,041,0± 3,041,1 ± 1,8
Этопозид46,8 ± 1,6 49,7 ± 4,0*51,1 ±3,4*39,2 ± 1,8
NGF45,0 ± 1,645,9 ± 3,950,6 ± 2,8*46,0 ± 1,7*
Среднее значение
45,4±0,0341,8 ±0,140,7± 0,338,4±0,08
химиопрепаратов
Символом * обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия от среднего значения химиопрепаратов
Из данных таблицы 2 следует, что цитотоксическое действие NGF на клетки ГБ и МБ по
показателям превышает (p<0,05) действие химиопрепаратов. Цитотоксическое действие NGF
на клетки ПА и АА не отличается (p=0,068 и p=0,52 соответственно) от действия
химиопрепаратов.
Определение цитотоксической активности комбинаций фактора роста нервов,
протегрина-1икателицидинаLL-37схимиопрепаратаминаклетках
интракраниальных опухолей. Проведен сравнительный анализ цитотоксической
активности комбинаций NGF, PG-1 и LL-37 с химиопрепаратами в отношении клеток глиомы
С6. Их эффекты сравнивали по ИК50 с действием химиопрепаратов и пептидов в МТТ-тесте
трипанового синего (табл. 3) и тесте с применением трипанового синего (данные не
показаны).
Таблица 3. ИК50 химиопрепаратов, NGF, LL-37, PG-1 и их комбинаций при действии in vitro
на клетки глиомы С6 в МТТ тесте
ИК50ИК50 PG1 +ИК50 LL37 +ИК50 NGF +
Серия
реагентов химиопрепараты химиопрепаратыхимиопрепараты,
Доксорубицин227,0375,5172,6657,1
Карбоплатин244,11144,455,22847,8
Темозоломид391,51313,41805,15855,2
Цисплатин81,2644,74,01167,0
Этопозид11,527,10,636,4
NGF0,0148
LL-371,1
PG-110,1
По данным МТТ теста (табл. 3) ИК50 комбинаций LL-37 с доксорубицином,
карбоплатином, цисплатином и этопозидом ниже (в 1,3, 4,4, 20,3 и 18,5 раз соответственно),
чем ИК50 химиопрепаратов, что указывает на более выраженную цитотоксическую
активность данных комбинаций в отношении клеток глиомы С6 в сравнении с действием
химиопрепаратов. Только для комбинации LL-37 с этопозидом ИК50 оказалась ниже в 1,7
раза, чем ИК50 кателицидина. Эта комбинация обладала наиболее выраженной
цитотоксической активностью по сравнению с остальными сочетаниями. Аналогичные
данные были получены для ИК50 комбинаций NGF, LL-37, PG-1 с химиопрепаратами при
действии на клетки глиомы С6 в тесте с трипановым синим (данные не показаны).
С целью определения цитотоксической активности комбинаций NGF, PG-1 и LL-37 с
химиопрепаратами в отношении клеток глиомы U251 их действие сравнивали по ИК50 с
действием химиопрепаратов и пептидов в МТТ (табл. 4) и тесте с трипановым синим (данные
не показаны).
Таблица 4. ИК50 химиопрепаратов, NGF, LL-37, PG-1 и их комбинаций при действии in vitro
на клетки глиомы U251 в МТТ-тесте
ИК50ИК50 PG1 +ИК50 LL37 +ИК50 NGF +
Серия
реагентовхимиопрепараты, химиопрепараты,химиопрепараты,
Доксорубицин1554,9730,95265,5600,5
Карбоплатин3652,92938,93513,32880,6
Темозоломид1725,79761,74007,016804,0
Цисплатин371,5237,986,9207,4
Этопозид25,917,017,913,7
NGF0,0214
LL-373,1
PG-126,1
По данным МТТ теста (табл. 4) ИК50 комбинаций PG-1 c доксорубицином (2,1 раза),
карбоплатином (в 1,2 раза), цисплатином (в 1,6 раза) и этопозидом (в 1,5 раза), NGF с
доксорубицином (в 2,6 раза), карбоплатином (в 1,3 раз), цисплатином (в 1,8 раза) и
этопозидом (в 1,9 раза), LL-37 c цисплатином (в 4,3 раза) и LL-37 с этопоидом (в 1,5 раз)
была ниже, чем ИК50 химиопрепаратов, что свидетельствует о более сильном
цитотоксическом действии этих комбинаций по сравнению с химиопрепаратами.
Аналогичные данные были получены для ИК50 комбинаций NGF, LL-37, PG-1 с
химиопрепаратами при действии на клетки глиомы U251 в тесте с трипановым синим
(данные не показаны).
С помощью формулы 4 рассчитывали КИ и определяли эффекты комбинаций
(синергизм, аддитивность) в отношении клеток глиомы С6 и U251 (рис. 1).
10,94
Комбинационный индекс
0,8
0,65
0,6
0,4
0,2
АБPG-1 + доксорубицинPG-1 + этопозид
Рис. 1. Эффекты синергизма (красный цвет) и аддитивизма (зеленый цвет) комбинаций
пептидов с химиопрепаратами на клетках глиомы С6 (А) и U251 (Б)
Оценивали цитотоксическую эффективность комбинаций NGF с химиопрепаратами на
клетках ПА, АА ГБ и МБ, для чего рассчитывали средний ИЦ комбинаций, который
сравнивали с ИЦ NGF (рис. 2).
АБ
ВГ
Рис. 2. Индекс цитотоксичности (%) комбинаций NGF с химиопрепаратами при
односуточном действии in vitro на клетки ПА (А), АА (Б), ГБ (В) и МБ (Г).
Символом * обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия от NGF
Установлено, что ИЦ комбинаций NGF с химиопрепаратами статистически значимо не
отличается от ИЦ NGF при действии на клетки ПА (p=0,73) и АА (p=0,1); статистически
значимо (p=0,005) был ниже ИЦ NGF при действии на клетки ГБ и статистически значимо
(p=0,02) был выше ИЦ NGF при действии на клетки МБ.
Определение действия фактора роста нервов и его комбинаций с химиопрепаратами
на клетки нормальной нейроглиальной ткани мозга человека. Чтобы оценить действие
NGF на клетки нейроглиальной ткани его действие сравнивали с эффектами химиопрепаратов.
Для этого рассчитывали средний ИЦ химиопрепаратов (41,1±0,2%, рис. 3А).
АБ
Рис. 3. Индекс цитотоксичности (%) химиопрепаратов и NGF при обособленном (А) и
комбинированном (Б) действии in vitro на клетки нейроглиальной ткани головного мозга
Символом * обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия от среднего значения ИЦ
химиопрепаратов (3А) или NGF (3Б)
Данные рис. 3 показывают, что ИЦ NGF был достоверно (p=8,7×10-18) ниже ИЦ
химиопрепаратов (за исключением ИЦ карбоплатина), что свидетельствует о менее
выраженном по сравнению с химиопрепаратами действии NGF на клетки нейроглиальной
ткани. Действие комбинаций NGF с химиопрепаратами сравнивали с NGF (рис. 3Б), для чего
рассчитывали средний ИЦ комбинаций NGF с химиопрепаратами. На основании данных на
рис. 3Б можно заключить, что 7 из 8 комбинаций (кроме NGF + винкристин) обладают еще
более выраженным действием (p<0,05) по сравнению с NGF, снижающим цитотоксический
эффект химиопрепаратов на клетки нейроглиальной ткани.
Изучение типов гибели клеток интракраниальных опухолей при действии фактора
роста нервов, протегрина-1 и их комбинаций с химиопрепаратами. Поскольку
комбинация PG-1 c этопозидом оказывает синергетический эффект (рис. 1Б), было изучено
ее действие в отношении типов гибели клеток глиомы U251с помощью окрашивания их ДНК
красителями PI и YO-PRO-1 на проточном цитометре (рис. 4).
АБВГ
Рис. 4. Проточно-цитометрический анализ типов гибели клеток глиомы U251 человека с
помощью красителей PI и YO-PRO-1 при односуточном in vitro действии этопозида (Б), PG-1
(В) и их комбинации (Г) в сравнении с контролем (А).
В квадратах С3 – живые клетки, C1 и C2 – поздний апоптоз или некроз, C4 – ранний апоптоз
Данные на рис. 4 показывают, что после 24 ч действия этопозида 50,7±5,2% клеток
глиомы U251 гибнут по типу апоптоза (p<0,0001) и 6,3±2,0% клеток гибнут по типу некроза.
При 24 ч действии PG-1 53,1±2,8% клеток глиомы U251 гибнут по пути некроза (p<0,0001).
При действии комбинации PG-1 с этопозидом 70,4±11,4% клеток глиомы U251 гибнут по
типу апоптоза (p<0,0001) и 12,4±4,7% – по типу некроза (p<0,0054). Таким образом,
комбинация PG-1 с этопозидом оказывает синергетический эффект на гибель клеток глиомы
U251 за счет повышения (p<0,0001) доли клеток, погибших по пути аптопоза и некроза по
сравнению с действием этопозида и PG-1 соответственно. С целью верификации гибели
клеток глиомы U251 по типу апоптоза при действии этопозида, PG-1 и их комбинации была
определена спектрофотометрически активность каспазы-3 (рис. 5).
Рис. 5. Активность каспазы-3 в лизатах клеток глиомы U251 при односуточном in vitro
действии этопозида, PG-1 и их комбинации в сравнении с контролем
символом * обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия от контроля
Результаты на рис. 5 показывают, что при односуточном действии этопозида
наблюдается стимулирование активности каспазы-3 на 40% (p=0,036) по сравнению с
необработанными клетками глиомы U251 в контроле. При действии PG-1 и комбинации PG-1
с этопозидом статистически значимого изменения активности каспазы-3 в лизатах клеток не
наблюдалось.
В ходе электронно-микроскопического анализа клеток ПА и МБ установлены типы их
гибели при обособленном и комбинированном действии цисплатина, темозоломида и NGF
(табл. 5).
Таблица 5. Интенсивность спонтанного и индуцированного типов гибели клеток ПА и МБ при
действии химиопрепаратов, NGF и его комбинаций с химиопрепаратами
Процент погибших клеток (абсолютный индекс)
пилоцитарная астроцитома
NGF +NGF +
Тип гибеликонтрольцисплатинтемозоломидNGF
цисплатинтемозоломид
Апоптоз6,9 ±0,5#32,0±1,9#^4,7±0,9†º #^––19,0±2,6#
Некроз39,1 ±2,6*60,0±1,1*^ 85,8±1,4†º * ^√ 80,0±6,4*^75,0±4,8º *^57,1±3,3*^
Смешанный тип–8,0±0,8*#9,5±1,3 #20,0±6,4*# 25,0±4,8º #14,5±1,7#
медуллобластома
Апоптоз9,9 ±1,995,2±1,5#37,5±6,3†º ^––9,2±1,4#^
Некроз7,6 ±1,34,8±0,9*50,0±8,0†*^93,7±2,0*^ 53,4±3,8†º *69,3±2,8*^
Смешанный тип7,6 ±1,2–12,5±3,5*#6,3±0,8*#46,6±4,5†º *21,5±2,2*#
Знаками † и º обозначены отличия (p<0,05) процента погибших клеток при действии комбинации
химиопрепарата с NGF по сравнению с обособленным применением реагентов. Статистически значимые
отличия численности клеток обозначены символами:* – от погибших по типу апоптоза, # – некроза, ^ – по
смешанному типу, знаком
Данные табл. 5 показывают, что при действии комбинации NGF с цисплатином на
клетки ПА и МБ увеличивается (p<0,05) их гибель по типу некроза, а при действии
комбинации NGF с темозоломидом усиливается (p<0,05) гибель опухолевых клеток по
смешанному типу по сравнению с химиопрепаратами.
Потенциальные маркеры чувствительности клеток пилоцитарной астроцитомы,
анапластической астроцитомы, глиобластомы и медулобластомы человека к фактору
роста нервов и химиопрепаратам. Определены корреляции между уровнем секреции IL-6 и
степенью злокачественности, чувствительностью клеток ПА, АА, эпендимомы, ГБ и МБ при
действии химиопрепаратов и NGF. Установлено, что уровень IL-6 коррелирует со степенью
злокачественности опухолей (табл. 6).
Таблица 6. Коэффициенты корреляции между степенью злокачественности клеток
интракраниальных опухолей и секрецией IL-6 при действии in vitro химиопрепаратов и NGF
Уровень секреции IL-6 (нг/л),КоэффиУровень
степень злокачественности опухоли, Grциент значимост
Реагент
низкозлокачественные высокозлокачественныекорреля и r, р
I–II, n=16III–IV, n=21ции, r
Контроль115,3±8,71212,3±44,6*0,70 p < 0,001
Винкристин66,9±13,5805,1±84,6*0,61 p < 0,001
Карбоплатин84,6±8,1801,7±64,7*0,58 p < 0,001
Метотрексат81,5±7,3844,1±53,2*0,57 p < 0,001
Темозоломид–784,2±78,2––
Циклофосфамид81,5±12,6747,5±51,9*0,64 p < 0,001
Цисплатин111,1±16,0997,4±90,3*0,65 p < 0,001
Цитарабин120,7±13,6737,9±72,8*0,53 p< 0,001
Этопозид103,2±12,0864,7±57,3*0,61 p < 0,001
NGF99,6±10,4728,8±64,6*0,64 p < 0,001
Жирным шрифтом обозначены статистически значимые (p<0,05) корреляционной зависимости, при степенях
свободы df=109, n – количество пациентов, символ * обозначает статистически значимые (p<0,05) отличия
между уровнем секреции IL-6 при действии реагентов в группах низко- (ПА и эпендимома) и
высокозлокачественных опухолей (АА, ГБ и МБ)
Данные табл. 6 документируют наличие статистически значимых (p<0,001)
положительных корреляций между степенью злокачественности опухолей (ПА, АА, ГБ, МБ
и эпендимома) и уровнем IL-6. Определены отрицательная корреляция (r=-0,60) между ИЦ
химиопрепаратов и уровнем IL-6, секретируемого клетками эпендимомы. Такого же знака
корреляции обнаружены между ИЦ NGF и IL-6, секретируемого клетками эпендимомы (r=-
0,95, p<0,0001) и ГБ (-0,49, p<0,05). Полученные результаты позволяют в перспективе
использовать оценку IL-6 в качестве прогностического маркера злокачественности и
химиорезистентности опухолей мозга.
Изучена экспрессия TrkA, р75 рецепторов и определено их соотношение TrkA/р75 на
клетках АА, ГБ и МБ при действии NGF и его комбинаций с цисплатином или
темозоломидом. Для чего оценивали экспрессию рецепторов в пересчете на одну клетку (рис.
6).
АБ
Рис. 6. Серии экспериментов, где в опухолевых клетках доминировала экспрессия p75
рецептора (группа «p75») (А) и TrkA рецептора (группа «TrkA») (Б).
Символом * обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия экспрессии TrkA от р75 рецептора
Анализ полученных результатов позволил распределить серии экспериментов по двум
группам, в каждой из которых статистически значимо (p<0,05) преобладала экспрессия TrkA
или p75 рецепторов. К группе «p75» (рис. 6А) были отнесены 5 серий опытов, в каждой из
которых на клетках одного типа опухоли действовали одним из реагентов: NGF и
комбинация NGF с темозоломидом на МБ; NGF, комбинация NGF с цисплатином на ГБ; NGF
с темозоломидом на АА. К группе «TrkA» (рис. 6Б) были отнесены четыре серии: при
действии комбинации NGF с цисплатином в отношении клеток МБ, комбинации NGF с
темозоломидом на ГБ; NGF, комбинации NGF с цисплатином на клетки АА. Необходимо
отметить, что экспрессия p75 рецепторов статистически значимо (p<0,05) отличалась от
TrkA рецепторов как внутри каждой из указанных групп («TrkA», «p75»), так и между ними.
Установлена зависимость между ИЦ NGF, комбинаций с цисплатином или темозоломидом и
экспрессией TrkA, p75 рецепторов, их соотношением TrkA/р75 на клетках опухолей (табл. 7).
Таблица 7. Коэффициенты корреляций экспрессии TrkA, p75 рецепторов, TrkA/р75 с ИЦ
NGF и его комбинаций с химиопрепаратами при действии на клетки опухолей
Коэффициент корреляции с индексом цитотоксичности, r. Уровень
значимости, р
Серияанапластическая астроцитомаглиобластомамедуллобластома
df
эксперимента
TrkA/p7TrkA/p
TrkAp75TrkAp75TrkA/p75TrkAp75
NGF188-
0,13-0,320,43*0,27-0,71*0,44*0,120,26
0,28
NGF +цисплатин 188-0,190,68*-0,20 -0,65*-0,06-0,47* -0,04 -0,30,25
NGF +188
0,42*-0,51*0,46*0,50*-0,53*0,63*0,270,34-0,01
темозоломид
Жирным шрифтом и *обозначены статистически значимые (р<0,05) коэффициенты корреляций между ИЦ и
экспрессией TrkA и p75 рецепторов, их соотношением, df – число степеней свободы для каждой серии
экспериментов
Статистически значимые корреляции различного знака между экспрессией TrkA, p75
рецепторов, TrkA/р75 и ИЦ реагентов выявлены для клеток АА и ГБ. Это свидетельствует,
что в результате гибели опухолевых клеток наблюдается активация сигнальных каскадов,
запускаемых через рецепторы. TrkA рецепторы активируется в клетках АА и ГБ при
действии NGF и комбинации NGF с темозоломидом. При действии комбинации NGF с
цисплатином наблюдается гибель клеток АА и ГБ, опосредованная взаимодействием с р75
рецепторами. Изучено действие NGF на численность копий MYCC, MYCN-онкогенов в
клетках МБ (рис. 7).
АБ
Рис. 7. Содержание клеток МБ с различным числом копий MYCN-онкогена (А) и MYCC-
онкогена (Б) при односуточном in vitro действии NGF.
Символом * обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия от контроля
Данные рис. 7 показывают, что действие NGF снижает (p<0,05) долю клеток МБ,
содержащих 6n, 8n копий MYCN-онкогена и 3n, 8n копий MYCC-онкогена, но увеличивает
(p<0,05) содержание клеток с диплоидным набором обоих онкогенов.
Результаты исследования позволили поставить вопрос: как чувствительность клеток МБ
зависит от количества копий онкогенов? Для этого рассчитывали среднее количество копий
MYCC, MYCN-онкогенов в клетках МБ от каждого пациента как отношение суммы
произведений численности клеток, содержащих конкретный набор онкогена на число копий
онкогена к 100% клеток в каждой серии. Определяли коэффициенты корреляций между
средним количеством копий онкогенов и ИЦ NGF(табл. 8).
Таблица 8. Коэффициент корреляции (r) между средним количеством копий MYCC, MYCN-
онкогенов в клетках МБ и ИЦ NGF, гибелью клеток в контроле
ОнкогенИндекс
MYCNMYCCцитоток-
Серия опыта
dfсреднеесреднеесичности
корреляция,
количествоколичество корреляция,r (гибель),
r
копийкопий%
Контроль72,7±0,30,272,9±0,40,0322,1±2,0
-0,65
NGF72,5±0,2-0,332,3±0,07*46,2±3,8*
p<0,0001
Жирным шрифтом обозначены статистически значимые (p<0,05) значения коэффициента корреляции r при
степенях свободы df=n-2. Символом * обозначены статистически значимые отличия от контроля при p<0,05
Результаты в табл. 8, свидетельствуют о наличии статистически значимой (p<0,0001)
отрицательной корреляции (r=-0,65) между средним числом копий MYCC-онкогена и ИЦ
NGF. Этот факт доказывает участие MYCC-онкогена в снижении чувствительности клеток
МБ к NGF.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленные данные позволяют заключить, что NGF, LL-37 и PG-1 обладают
выраженной противоопухолевой активностью, даже превосходящей по показателям
эффективность действия химиопрепаратов на клетки глиомы С6 крысы и глиомы U251
человека in vitro. Кроме того, показатели цитотоксической активности NGF в отношении
клеток ПА и АА сопоставимы с показателями, характеризующими противоопухолевое
действие химиопрепаратов, или превышают их в случае клеток ГБ и МБ.
Для комбинаций PG-1 с карбоплатином, доксорубицином, цисплатином и LL-37 с
этопозидом установлен синергизм их цитотоксической активности в отношении клеток
глиомы крысы С6. Тогда как в отношении клеток глиомы U251 человека синергизм
цитотоксического действия проявляет только комбинация PG-1 с этопозидом. При
сочетанном действии NGF с химиопрепаратами также наблюдается повышение
цитотоксической активности в отношении клеток ПА и АА, ГБ и МБ пациентов. Вместе с
тем клетки опухолей пациентов обладают персонифицированной чувствительностью к
химиопрепаратам, что позволяет сравнивать по значению ИЦ действие и выбрать наиболее
эффективный химиопрепарат для конкретного пациента.
Совместное использование NGF с химиопрепаратами оказывает in vitro действие,
снижающее цитотоксический эффект химиопрепаратов в отношении клеток нормальной
нейроглиальной ткани мозга. На основании этих данных можно заключить, что
комбинированное применение NGF с химиопрепаратами позволяет снизить дозу
химиопрепарата, при сохранении цитотоксического эффекта в отношении клеток опухолей
при менее токсичном действии на клетки нормальной нейроглиальной ткани мозга.
Данные о цитотоксической активности LL-37 и PG-1, NGF и их комбинаций с
химиопрепаратами на клетки глиом С6, U251 и NGF и его комбинаций с химиопрепаратами
на клетки интракраниальных опухолей человека позволяют рассматривать NGF, LL-37 и PG-
1 и их комбинации с химиопрепаратами в качестве потенциальных препаратов для
дальнейших доклинических и клинических испытаний. Проведенное исследование эффектов
NGF (уровень секреции IL-6, типы гибели клеток, число копий MYCC, MYCN-онкогенов),
комбинаций NGF с химиопрепаратами (типы гибели клеток, уровень экспрессии TrkA, p75
рецепторов, TrkA/p75) на клетках ПА, АА, ГБ, МБ и пептидов PG-1, LL-37 (исследование
характера клеточной гибели и др.) на клетки глиомы U251 предоставляет важную
информацию для разработки таких противоопухолевых препаратов.
Проведение стратификации у 18 пациентов с медуллобластомой по группам риска,
определяющим интенсивность и продолжительность химиотерапии на основе оценки
амплификации MYCC, MYCN онкогенов FISH анализом, внедрено в клиническую практику
РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии Министерства здравоохранения
Республики Беларусь. Обнаружение амплификации в 22,2% пациентов с МБ и данные по
общей выживаемости у пациентов с МБ (выживаемость у пациентов с наличием
амплификации составляет – 0%, а у пациентов без амплификации – 68%), свидетельствуют о
высокой корреляции между данными показателями и эффективностью терапии. Это
позволяет рекомендовать оценку амплификации MYCC-, MYCN-онкогенов у пациентов с МБ
в качестве молекулярно-генетического критерия (маркера) прогнозирования исхода терапии.
ВЫВОДЫ
1. Фактор роста нервов (NGF), кателицидин LL-37 и протегрин PG-1 проявляют in vitro
цитотоксическую активность, превосходящую по показателям активность химиопрепаратов в
отношении клеток глиом С6 и U251. Кроме того, NGF демонстрирует in vitro
цитотоксическую активность, сопоставимую с действием химиопрепаратов, в отношении
клеток пилоцитарной, анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы
человека. Полученные данные позволяют рассматривать NGF и пептиды в качестве
потенциальных противоопухолевых препаратов для терапии опухолей головного мозга.
2. Для комбинаций PG-1 с карбоплатином, доксорубицином, цисплатином, этопозидом,
а также LL-37 с этопозидом, выявлен синергизм цитотоксического действия на клетки глиом
С6 и U251 in vitro. Цитотоксическая активность NGF в комбинации с химиопрепаратами
была существенно выше активности индивидуального препарата NGF в отношении клеток
медуллобластомы, в то время как показатели активности комбинаций NGF с
химиопрепаратами в отношении клеток пилоцитарной и анапластической астроцитом были
сопоставимы с показателями обособленного действия NGF, а для клеток глиобластомы даже
несколько более низкими. Полученные результаты дают основание рассматривать
комбинации NGF, PG-1, LL-37 с химиопрепаратами в качестве потенциальной схемы для
комбинированной терапии определенных типов опухолей мозга у пациентов.
3. NGF и семь из восьми его комбинаций с химиопрепаратами оказывают in vitro
эффекты, снижающее токсическое действие химиопрепаратов на клетки нормальной
нейроглиальной ткани мозга. Вместе с тем, по сравнению с химиопрепаратами, NGF
обладает более слабым цитотоксическим in vitro действием, которое еще более снижается
при их комбинированном применении на клетки нормальной нейроглиальной ткани мозга.
4. В результате анализа механизма синергического действия PG-1 с этопозидом на
клетки глиомы U251 показано, что при совместном действии этих соединений in vitro
наблюдается увеличение гибели клеток по пути апоптоза по сравнению с действием
этопозида и PG-1. При действии этопозида отмечается повышение активности каспазы-3, что
подтверждает апоптотическую гибель клеток U251. При комбинированном действии NGF с
химиопрепаратамиотмечаетсягибельклетокпилоцитарнойастроцитомыи
медуллобластомы по смешанному типу и некрозу, чем по пути апоптоза при обособленном
действии NGF и химиопрпаратов.
5. Обнаружены корреляции между степенью злокачественности пилоцитарной
астроцитомы, анапластической астроцитомы, эпендимомы, глиобластомы, медуллобластомы,
их чувствительностью к химиопрепаратам, NGF и уровнем секреции интерлейкина-6, что
позволят в перспективе использовать уровень интерлейкина-6 в качестве диагностического
маркера злокачественности и химиорезистентности клеток опухолей мозга.
6. Цитотоксическая активность NGF и его комбинаций с цисплатином или
темозоломидом на клетки анапластической астроцитомы и глиобластомы коррелирует с
экспрессией на них TrkA, p75 рецепторов, их соотношения TrkA/p75, показывая, что
TrkA/p75 может служить маркером чувствительности клеток анапластической астроцитомы и
глиобластомы к NGF и его комбинациям с химиопрепаратами.
7. При in vitro применении NGF наблюдается увеличение содержания опухолевых
клеток с диплоидным числом копий MYCN, MYCC-онкогенов и уменьшение доли клеток
медуллобластомы с повышенным числом копий обоих онкогенов, обладающих пониженной
чувствительностью к NGF, что позволяет рассматривать численность копий MYCC-онкогена
в качестве маркера резистентности медуллобластомы к NGF и химиотерапии.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Результаты о прямом цитотоксическом действии NGF, LL-37 и PG-1 и их комбинаций
с химиопрепаратами с синергетическим эффектом на клетки глиом С6, U251, а также NGF и
его некоторых комбинаций с химиопрепаратами в отношении клеток ПА, АА, ГБ и МБ
пациентов позволяют рассматривать NGF, LL-37 и PG-1 и их комбинации с
химиопрепаратами, как прототипы лекарственных препаратов и объекты для доклинических
и клинических испытаний.
2. Установленные зависимости между уровнем секреции IL-6 клетками ПА,
эпендимомы, АА, ГБ, МБ и степенью злокачественности опухолей их химиорезистентностью
при действии химиопрепаратов, NGF, а также экспрессией TrkA, p75 рецепторов, TrkA/р75
на клетках АА, ГБ и чувствительностью к NGF, комбинациям NGF c цисплатином или
темозоломидом, отрицательная корреляция между численностью копий MYCC-онкогена в
клетках МБ и индексом цитотоксичности NGF свидетельствуют о перспективности
использования уровня секреции IL-6, численности копий MYCC-онкогена и экспрессии TrkA,
p75 рецепторов, их соотношения TrkA/р75 в качестве диагностических и прогностических
маркеров и мишеней для таргетной терапии опухолей мозга.
3. Разработанный и использованный в работе вариант метода «индивидуального
подбора химиопрепарата или комбинации химиопрепаратов для лечения медуллобластомы,
атипичной тератоидной/рабдоидной опухоли, нейробластомы, астроцитомы, эпендимомы у
ребенка», основанный на определении гибели клеток в камере Горяева при окрашивании
трипановым синим ИЦ, позволяет установить и выбрать химиопрепарат или их комбинацию
с наибольшим цитотоксическим действием на клетки опухоли у конкретного пациента, а
также внести в протоколы химиотерапии соответствующие коррективы.
Полученные сведения могут использоваться в учебном процессе на биологических и
медицинских факультетах ВУЗов, а также в клинической практике онкологических
стационаров специализированных медицинских учреждений.
Актуальность темы исследования. Онкологические заболевания представляют серьезную социально-экономическую проблему [1]. По материалам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Международного агентства по изучению рака – Globocan в мире в 2020 г. зарегистрировано 19292789 новых случаев заболеваний раком, из которых 9958133 случаев закончились летальным исходом (51,6%) [2]. По прогнозам ВОЗ к 2040 г заболеваемость и смертность от рака увеличатся на 70% и составят соответственно 29,5 и 16,4 млн. случаев [2]. У детей и подростков интракраниальные опухоли по распространенности занимают второе место, уступая только лейкозам [3]. Опухоли мозга являются гетерогенной группой, включающей как высокозлокачественные, так и низкозлокачественные гистологические типы. К наиболее частым злокачественным интракраниальным опухолям у детей относятся: медуллобластома (МБ) и нейробластома, к доброкачественным – пилоцитарная астроцитома (ПА) и эпендимома [4]. Частота распространения МБ в мире у пациентов младше 15-летнего возраста составляет 25% от всех опухолей ЦНС [4]. На долю глиом приходится 70% из 22000 новых случаев первичных опухолей мозга, выявляемых ежегодно у взрослого населения США, из которых 40% составляют злокачественные формы: глиобластомы (ГБ) и анапластические астроцитомы (АА) [5]. Показатель 5-летеней выживаемости пациентов с ГБ составляет менее 5% [6]. Средняя продолжительность жизни этих пациентов при консервативном лечении – 14 недель, при хирургической резекции, сочетаемой с радиотерапией – 36, при дополнении химиотерапией – 40–50 недель [7].
Вследствие существующей опасности повреждения жизненно важных центров или диффузного характера роста интракраниальных опухолей, их оперативное вмешательство не всегда возможно, что делает актуальным совершенствование методов лучевой и химиотерапии. На сегодняшний день наиболее эффективными для лечения интракраниальных опухолей у детей и взрослых используются следующие химиопрепараты: темозоломид (ТMZ), цисплатин (CSP), карбоплатин, этопозид, метотрексат, цитарабин, винкристин, циклофосфамид и доксорубицин [8, 9, 10, 11, 12]. Однако, применение химиотерапии сопровождается рядом проблем: 1) слабая проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для химиопрепаратов [13]; 2) их высокая цитотоксичность, приводящая к неблагоприятным побочным реакциям со стороны физиологических систем, нередко вынуждающим прекратить химиотерапию; 3) неселективное действие химиопрепаратов, в результате которого гибнут не только опухолевые, но и нормальные высокопролиферирующие клетки (эпителиоциты и клетки красного костного мозга), что приводит к существенному ухудшению состояния здоровья пациентов; 4) множественная лекарственная устойчивость опухолевых и стволовых клеток злокачественных опухолей, что часто приводит к их метастазам и рецидивам у пролеченных пациентов [14, 15]; 5) отсутствие унифицированных схем применения химиопрепаратов с учетом характера преимущественного морфологического состава обычно гетерогенных неоплазий, степени их злокачественности и индивидуальной чувствительности к ним опухолевых клеток и возрастного ценза пациентов [5, 16]; 6) недостаточная изученность механизмов действия новых химиопрепаратов и их клиренса [17].
В связи с этим возникает острая необходимость в новых соединениях, проявляющих селективную противоопухолевую активность на опухолевые клетки, но не вызывающих развития МЛУ и не повреждающих нормальные (здоровые) ткани организма [18, 19]. Для внедрения в клиническую практику нового лекарственного средства необходимо проведение доклинических и клинических испытаний, результатом которых является безопасность, качество и эффективность применения лекарственных субстанций [18, 20]. Начальный этап указанных исследований включает скрининг лекарственных веществ, обладающих противоопухолевой активностью с использованием моделей in vitro, в качестве которых в биологии, фармакологии и медицине используют клетки человека и животных [18, 20]. Скрининг лекарственных средств in vitro позволяет выявить «кандидаты» – вещества, предназначенные для дальнейшего тестирования in vivo, сократить объем и сроки последующих исследований [20]. Это в итоге способствует получению статистически значимых данных о биологической активности большого количества соединений и снижению финансовых затрат. Применение моделей in vitro также актуально и с точки зрения гуманного обращения с животными. Кроме того, использование методов in vitro дает возможность изучить молекулярные механизмы действия противоопухолевых веществ [18, 19]. В качестве таких «кандидатов» в онкологии могут рассматриваться эндогенные регуляторные белки – ростовые факторы и катионные антимикробные пептиды (АМП) системы врожденного иммунитета человека или их комбинации с химиопрепаратами.
Степень разработанности темы. К настоящему времени описано более 160 ростовых факторов [21]. Из них фактор роста нервов (NGF) входящий в семейство нейротрофинов, представляет наибольний интерес для терапии заболеваний нервной системы. NGF связывается с двумя рецепторами: р75 и TrkA [22]. Рецептор р75 (NGFR) является низкоаффинным рецептором для всех нейтрофинов (NGF, BDNF, NT3, NT4). Нейротрофная рецепторная тирозинкиназа 1 (NTRK1 или TrkA) представляет собой высокоаффинный рецептор NGF [23, 24, 25, 26]. Взаимодействие NGF с рецептором TrkA способствует выживаемости, поддержанию и дифференцировке симпатических холинэргических нейронов и глиальных клеток [22]. В то же время NGF, связываясь с рецептором р75, индуцирует апоптоз клеток [26, 27]. Установлены и противоопухолевые эффекты NGF в отношении некоторых типов опухолей. Например, к таким эффектам относятся ингибирование NGF ангиогенеза и инвазии нейробластомы [28]. Интересно, что экспрессия TrkA рецептора на клетках нейробластомы служит благоприятным прогностическим маркером исхода заболевания и предпосылкой к ее спонтанной регрессии [29, 30, 31]. Изменение же TrkA/р75 рецепторов на клетках феохромоцитомы РС12 предопределяет их чувствительность к доксорубицину и CSP [32, 33]. Между тем, не изученым остается характер действия NGF, его комбинаций с химиопрепаратами, а также взаимосвязь этих эффектов с экспрессией TrkA, р75 рецепторов и их соотношением на клетках интракраниальных опухолей у детей. Также в литературе нет сведений о типах гибели клеток интракраниальных опухолей при действии комбинаций NGF с химиопрепаратами.
На сегодняшний день известно более 5000 АМП [34]. Большинство АМП – это молекулы, состоящие из 12–50 аминокислот с высоким содержанием аргинина и/или лизина. Хотя первоначально пептиды были названы антимикробными, как соединения, обладающие антибиотической активностью в отношении бактерий, одноклеточных грибов, простейших и вирусов, как оказалось, многие АМП обладают иммуномодулирующим, ранозаживляющим действием, в то время как некоторые пептиды ‒ проявляют выраженную цитотоксическую активность против неопластических клеток, резистентных к применяемым в медицине химиопрепаратам [35, 36, 37]. Пептиды имеют различные структуры, наличие и выраженность того или иного эффекта зависит от структурных особенностей каждого пептида. Для изучения механизмов противоопухолевого действия автором были выбраны два пептида с различной структурой из семейства кателицидинов: кателицидин LL-37 c α-спиральной структурой из азурофильных гранул нейротфилов человека и протегрин-1 (PG-1) ‒ пептид с конформацией β- шпильки из нейтрофилов свиньи. В высоких концентрациях, эти пептиды являются токсичными для клеток человека [31, 38], что создает препятствие для их внедрения в медицинскую практику. Одним из путей решения этой проблемы может быть поиск путей снижения эффективной концентрации LL-37 и PG-1. Снижение эффективной концентрации, в свою очередь, может быть достигнуто комбинированным применением LL-37 и PG-1 с веществами, обладающими синергичным действием с данными кателицидинами. В частности, актуальным является поиск комбинаций АМП с ростовыми факторами или химиопрепаратами, обладающих цитотоксической активностью против клеток опухолей головного мозга.
Экспрессия онкогенов MYC семейства (MYCC, MYCN) ассоциирована с активацией пролиферации, репликации ДНК, трансформации клеток МБ и нейробластомы [39, 40]. Установлено, что экспрессия MYCC-онкогена изменяет чувствительность перевиваемых клонов D341, D425 МБ к химиопрепаратам [39]. В научной литературе нет сведений о действии NGF на численность копий MYCC, MYCN-онкогенов в клетках МБ. Проведение такого исследования позволит использовать NGF для повышения чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам.
Для повышения эффективности химиотерапии перспективными являются исследования, направленные на выявление потенциальных диагностических и прогностических маркеров интракраниальных опухолей. В качестве таких возможных маркеров могут рассматриваться интерлейкины семейства цитокинов, обладающие провоспалительными эффектами. Известно, что уровень секреции интерлейкина-6 (IL-6) клетками множественной лейкемии, почечной аденокарциномы, рака предстательной, молочной желез, желудка, легкого связан с агрессивностью заболеваний и развитием устойчивости их клеток к химиопрепаратам [41, 42]. Проведение исследования на клетках интракраниальных опухолей позволит установить роль IL-6 в качестве потенциального маркера их злокачественности и резистентности к химиопрепаратам.
Исследования, приведенные в настоящей работе, актуальны, поскольку углубление представлений о механизмах действия NGF, PG-1, LL-37 и их комбинаций с химиопрепаратами на клетки опухолей мозга позволит выявить новые возможности коррекции патологических процессов, и в перспективе снизить негативное цитотоксическое действие химиопрепаратов на здоровые клетки организма человека, а также создать новые схемы лечения онкологических заболеваний.
Таким образом, целью работы являлось изучение молекулярно-клеточных механизмов обособленного и комбинированного действия фактора роста нервов, пептидов семейства кателицидинов (LL-37, PG-1) и химиопрепаратов на клетки опухолей головного мозга (глиомы С6, U251, пилоцитарная астроцитома, анапластическая астроцитома, глиобластома и медуллобластома) при применении индивидуальных фракций этих соединений и их комбинаций с различными химиопрепаратами in vitro.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Оценить цитотоксическую активность NGF, PG-1, LL-37 и их комбинаций с
химиопрепаратами в отношении клеток глиом С6, U251, пилоцитарной астроцитомы,
анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы человека in vitro.
2. Охарактеризовать in vitro действие NGF и его комбинаций с химиопрепаратами на клетки
здоровой нейроглиальной ткани мозга человека.
3.Изучить типы гибели клеток глиомы U251, пилоцитарной астроцитомы и
медуллобластомы при in vitro действии NGF, PG-1, LL-37, цисплатина, темозоломида, этопозида и их комбинаций.
4. Провести анализ, направленный на выявление корреляционных связей чувствительности, степени злокачественности клеток пилоцитарной астроцитомы, анапластической астроцитомы, эпендимомы, глиобластомы и медуллобластомы с уровнем секреции IL-6 в среде при действии in vitro химиопрепаратов и NGF.
5. Исследовать экспрессию рецепторов TrkA, p75 и их соотношение на клетках анаплас- тической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы, установить их взаимосвязь с чувствительностью клеток опухолей к NGF, его комбинациям с цисплатином или темозоломидом.
6.Оценить изменение количества копий онкогенов (MYCC, MYCN) в клетках медуллобластомы при in vitro действии NGF.
Научная новизна. Впервые установлено, что NGF, LL-37 и PG-1 проявляют высокую
цитотоксичность по отношению к культивируемым клеткам глиом С6, U251, а также NGF обладает высокой цитотоксичностью по отношению к клеткам ПА, АА, ГБ и МБ человека, в большинстве случаев, превышающую цитотоксическую активность исследованных химиопрепаратов.
Впервые констатировано, что комбинации NGF с химиопрепаратами проявляют цитотоксическое действие на клетки ПА, АА, ГБ и МБ. Впервые показано, что комбинации PG- 1 c карбоплатином или доксорубицином, а также LL-37 c этопозидом оказывают синергетические цитотоксические эффекты на клетки глиомы С6. Комбинация PG-1 c этопозидом обладает синергетическим цитотоксическим действием на клетки глиомы U251 человека. Впервые установлено, что при комбинированном действии NGF с цисплатином или темозоломидом на клетки ПА и МБ наблюдается смена типов их гибели в сторону более разрушительных (некроз, смешанный тип) по сравнению с индивидуальным применением указанных химиопрепаратов и NGF, вызывающих апоптоз. При синергичном цитотоксическом действии комбинации PG-1 с этопозидом по сравнению с действием этопозида наблюдается увеличение доли клеток глиомы U251, погибших по типам апоптоза и некроза.
Впервые показано, что добавление NGF к химиопрепаратам снижает их цитотоксический эффект на клетки здоровой нейроглиальной ткани мозга человека.
Впервые показано, что уровень секреции IL-6 клетками ПА, эпендимомы, АА, ГБ и МБ коррелирует со степенью злокачественности опухолей. Установлена взаимосвязь между уровнем IL-6 и чувствительностью клеток высокозлокачественных (АА, ГБ, МБ) опухолей к химиопрепаратам и NGF.
Впервые продемонстрировано, что чувствительность клеток АА и ГБ к комбинациям NGF с цисплатином или темозоломидом предопределяется соотносительной экспрессией рецепторов TrkA/p75, что позволяет рассматривать данный показатель в качестве маркера ответа клеток АА, ГБ на действие комбинаций NGF с цисплатином или темозоломидом.
Впервые показано, что в результате действия NGF наблюдается уменьшение численности клеток МБ, содержащих аномально повышенное количество копий MYCC-, MYCN-онкогенов и повышение количества опухолевых клеток, содержащих диплоидный набор копий генов MYCC и MYCN, что позволяет рассматривать число копий MYCC-онкогена в геноме в качестве маркера резистентности МБ к NGF и химиотерапии.
Теоретическая и практическая значимость работы. На опухолевых клетках исследованы эффекты соединений, относящихся к совершенно разным группам биологически активных молекул – NGF, относящегося к семейству нейротрофинов и пептидов, проявляющих антимикробные свойства. Установлено, что кроме известных видов активности эти соединения не только могут вызывать гибель опухолевых клеток, но и усиливать противоопухолевые свойства друг друга, а также и действия целого спектра химиопрепаратов. Получены новые данные, расширяющие представления о роли NGF и пептидов врожденного иммунитета в противоопухолевой защите. Установлены пути клеточной гибели при воздействии NGF, PG-1, LL-37 и их комбинаций с химиотерапевтическими препаратами на клетки С6, U251, ПА, АА, ГБ и МБ человека, а также ряд факторов (IL-6, TrkA/p75), являющихся маркерами эффективности противоопухолевого действия изученных веществ и их комбинаций. Результаты, показывающие прямое цитотоксическое действие NGF, LL-37, PG-1 и их комбинаций с химиопрепаратами на клетки С6, U251, ПА, АА, ГБ и МБ человека, являются первым этапом скрининга NGF, LL-37, PG-1 и их комбинаций в качестве кандидатов для доклинических испытаний, в частности, позволяют спланировать дальнейшие исследования по изучению введения NGF, LL-37, PG-1 и их комбинаций с химиопрепаратами животным с перевиваемыми опухолями.
Полученные результаты показывают, что максимальный цитотоксический эффект на клетки пилоцитарной астроцитомы и медуллобластомы человека оказывает комбинация NGF c этопозидом, на клетки анапластической астроцитомы – комбинация NGF c цисплатином и на клетки глиобластомы – комбинация NGF с карбоплатином. Что может являться основой для создания новых схем лечения данных опухолей у животных и человека. Также полученные результаты показывают, что при химиотерапии опухолей можно вводить NGF в качестве хемопротектора.
Методология и методы исследования. Работа выполнена на клетках интракраниальных опухолей, взятых у 98 пациентов в возрасте от 3 мес до 17 лет (8,3±0,6 года), находившихся на лечении в Городской клинической больнице скорой медицинской помощи г. Минска. В исследование также включены 10 скоропостижно умерших человек (57,1±4,0 лет), у которых во время вскрытия в морге Управления судебно-медицинских экспертиз Государственного комитета судебно-медицинских экспертиз Республики Беларусь по Минской области была взята нормальная нейроглиальная ткань мозга. С целью формирования клинически относительно однородных групп пациентов из историй болезней получали сведения о гистологическом типе, степени злокачественности, локализации опухоли в отделах головного мозга, радикальности хирургического вмешательства у пациентов. Сведения позволили сформировать 5 исследуемых групп. В первую группу вошли 42 пациента с ПА (GrI, 22 мальчика и 20 девочек, 7,9±0,7 года). Вторая группа включала 9 пациентов с АА (GrIII, 5 мальчиков и 4 девочки, 8,6±1,6 года). Третья группа включала 9 пациентов с ГБ (GrIV, 9 мальчиков, 10,3±1,9 года). Четвертая группа состояла из 38 детей с МБ (GrIV, 27 мальчиков и 11 девочек, 5,7±0,6 года). В пятую группу вошли 10 скоропостижно умерших человек, у которых во время вскрытия были взяты фрагменты мозга (8 мужчин и 2 женщины, 57,1±4,0 лет). Отдельную группу составили линии клеток глиомы С6 и U251, на которых проводили подбор концентраций химиопрепаратов, NGF, PG-1, LL-37, их комбинаций, а также определяли их цитотоксическую активность по расчету 50%-ной ингибирующей концентрации (ИК50) и эффекты комбинаций.
Клетки глиом крысы С6 и U251, интракраниальных опухолей и нейроглиальной ткани мозга человека культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DМЕМ) с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) при стандартных условиях. Опухолевые клетки культивировали в течение 1-2 сут, клетки нейроглиальной ткани – в течение 28 сут. Оценку односуточного цитотоксического действия химиопрепаратов, NGF, PG-1, LL-37, их комбинаций на опухолевых и клетках нейроглиальной ткани проводили, подсчитывая погибшие клетки в камере Горяева с использованием красителя трипанового синего. Цитотоксичность химиопрепаратов, NGF, PG-1, LL-37 и их комбинаций на клетках глиом С6, U251 также оценивали в 4-6 концентрациях с помощью МТТ-теста. Цитотоксическое действие в этом случае сравнивали по значениям ИК50. С помощью показателя ИК50, определяли комбинационный индекс (КИ, CI) и типы эффектов комбинаций (синергизм, антагонизм, аддитивность). При применении PG-1, этопозида и их комбинации оценивали гибель клеток глиомы U251 по типу апоптоза или некроза методом проточной цитометрии с использованием окраски суспензии флуоресцентными ДНК-связывающими красителями YO-PRO-1 и йодидом пропидия (PI). Также оценивали активность каспазы-3 колориметрическим методом по скорости расщепления хромогенного субстрата Ac-DEVD-pNA, используя набор «Caspase3 Assay Kit, Colorimetric» (Sigma, США). При действии химиопрепаратов, NGF и их комбинаций наблюдали морфологические изменения в клетках ПА и МБ с помощью электронного микроскопа JEM-100CX (JEOL Ltd., Япония) при увеличениях ×4800−14400. Оценку уровня секреции IL-6 клетками ПА, АА, ГБ, МБ и эпендимомы, проводили методом иммуноферментного анализа с помощью тест-набора для определения IL-6 человека (BD Biosсiences, США).
При применении цисплатина, темозоломида, NGF и их комбинаций изучали экспрессию TrkA, p75 рецепторов, их соотношение TrkA/р75 на клетках АА, ГБ и МБ с помощью первичных Anti-TrkA, Anti-р75 (Pan-NGFR) и вторичных кроличьих FITC-конъюгированных Anti-Rabit Ig-FITC антител методом иммунофлуоресцентной микроскопии. Определяли соотношение TrkA/p75 и корреляции между экспрессией TrkA, p75-рецепторов, TrkA/p75 и индексом цитотоксичности (ИЦ) исследуемых соединений.
Амплификацию (число копий) онкогенов MYCC и MYCN в интерфазных клетках МБ пациентов выявляли методом флуоресцентной гибридизации in situ с помощью ДНК зондов VysisLSI MYCC (8q24.12-q24.13), VysisLSI MYCN (2p24), меченных флуорохромом SpectrumOrange. Оценивали корреляции между числом копий онкогенов и ИЦ NGF.
Статистический анализ выполняли с помощью программного пакета Statistica (версия 6.0). Результаты представляли в виде средней арифметической (M) и стандартного отклонения (SD). Для сравнения двух групп по выраженности количественных признаков применяли однофакторный (ANOVA one-way), двухфакторный (ANOVA two-way) дисперсионный анализ и F-критерий (Фишера). В случае отклонения нормальности в независимых выборках и наличия малого количества образцов (n<30) для их сравнения использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.
Положения диссертации, выносимые на защиту.
1 NGF, кателицидин LL-37 человека и протегрин-1 свиньи проявляют выраженную цитотоксическую активность, превосходящую активность химиопрепаратов, в отношении клеток глиом С6 и U251 in vitro. Цитотоксическая активность NGF сопоставима с действием химиопрепаратов на клетки пилоцитарной астроцитомы и анапластической астроцитомы и превышает по эффективности действие химиопрепаратов на клетки глиобластомы и медуллобалстомы in vitro.
2. Для комбинаций PG-1 с карбоплатином, доксорубицином, цисплатином, этопозидом и LL-37 с этопозидом выявлен синергизм их цитотоксического in vitro действия на клетки глиом С6 и U251. Комбинированное действие NGF с химиопрепаратами проявляет активность, сопоставимую с действием NGF в отношении клеток пилоцитарной астроцитомы и анапластической астроцитомы, тогда как действие комбинаций было менее выражено по сравнению с действием NGF на клетках глиобластомы и более выраженно по сравнению с действием NGF на клетках медуллобластомы in vitro. 3. Применение in vitro NGF оказывает действие, защищающее клетки здоровой нейроглиальной ткани мозга человека от повреждающего действия химиопрепаратов. При добавлении NGF к химиопрепаратам в семи из восьми комбинаций наблюдается действие, снижающее цитотоксический эффект химиопрепаратов в отношении нормальных клеток нейроглиальной ткани мозга человека.
4. Комбинация этопозида и PG-1 оказывает in vitro синергическое цитотоксическое действие на клетки глиомы U251, выражающееся в увеличении доли клеток, гибнущих по апоптотическому пути и в результате некроза, по сравнению с индивидуальным воздействием PG-1 и этопозида. При действии этопозида повышается активность каспазы-3 в клетках U251 глиомы, подтверждая их гибель по пути апоптоза. В результате комбинирования NGF с цисплатином или темозоломидом наблюдается гибель клеток пилоцитарной астроцитомы и медуллобластомы по смешанному типу или по пути некроза, в отличие от их гибели по пути апоптоза при индивидуальном применении указанных химиопрепаратов и NGF.
5. При культивировании клеток пилоцитарной астроцитомы, анапластической астроцитомы, эпендимомы, глиобластомы и медуллобластомы in vitro в течение 24 ч, концентрация IL-6 в культуральной среде положительно коррелирует со степенью злокачественности клеток, а также отрицательно коррелирует с чувствительностью клеток анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы к NGF и химиопрепаратам.
6. Соотносительная экспрессия TrkA/p75 рецепторов на клетках анапластической астроцитомы и глиобластомы положительно коррелирует с их чувствительностью к NGF и его комбинации с темозоломидом и отрицательно коррелирует с чувствительностью клеток глиобластомы к комбинации NGF с цисплатином.
7. В результате in vitro действия NGF на клетки медуллобластомы наблюдается увеличение доли клеток с диплоидным набором копий онкогенов MYCN и MYCC и снижение доли клеток с аномально повышенным количеством копий онкогенов, обладающих пониженной чувствительностью к NGF.
Личный вклад соискателя ученой степени. Личный вклад автора работы заключался в проведении экспериментов, анализе клинической информации и литературных сведений, статистической обработке и интерпретации, обобщении полученных данных и научной редакции рукописи. Исключение составил FISH анализ, выполненный для оценки численности копий MYCC-, MYCN-онкогенов в МБ (выполнен на базе лаборатории цитогенетики РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь, г. Минск). Диссертантом осуществлялось также написание статей и тезисов, либо принималось активное участие в подготовке соответствующих материалов. Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности полученных в работе данных определяется достаточным и репрезентативным количеством экспериментального материала (n=98 пациентов с интракраниальными опухолями, 10 лиц у которых была взята нейроглиальная ткань, 10389 посевов, 1020 аликвот и 417 электроннограмм), применением адекватных методов исследования, в том числе методов статистического анализа.
Информация о внедрении результатов исследования. Результаты работы защищены патентами Республики Беларусь No 15518 «Способ индивидуального подбора химиопрепарата или комбинации химиопрепаратов для лечения медуллобластомы у ребенка», No 15520 «Способ индивидуального подбора химиопрепарата или комбинации химиопрепаратов для лечения астроцитомы у ребенка», No 1563327 «Способ индивидуального подбора химиопрепарата или комбинации химиопрепаратов для лечения глиальной опухоли центральной нервной системы», No 16006 «Способ индивидуального подбора химиопрепарата или их комбинации для оптимизации лечения эпендимомы у ребенка», No 17256 «Способ индивидуального подбора химиопрепарата или комбинации химиопрепаратов для лечения атипичной тератоидной / рабдоидной опухоли человека», No 17752 «Способ определения чувствительности клеток нейробластомы человека к химиопрепарату или их комбинации химиопрепаратов». Результаты работы, в частности, «Способ оценки индивидуальной чувствительности клеток нейроэпителиальных опухолей человека к химиопрепаратам» внедрены в клиническую практику онкогематологического отделения для детей старшего возраста Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь и в курс лекций кафедр детской онкологии и гематологии Белорусской медицинской академии последипломного образования и экологической и медицинской генетики по дисциплинам «стволовая клетка» и «цитология и гистология» Международного государственного экологического университета им. А. Д. Сахарова, а также кафедры биотехнологии по дисциплинам «молекулярная биология клетки» и «генотерапия» Полесского государственного университета. Проведение стратификации пациентов с медуллобластомой по группам риска, определяющим интенсивность и продолжительность химиотерапии на основе амплификации MYCC, MYCN-онкогенов FISH анализом внедрено в клиническую практику Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь.
Информация о публикациях. По теме работы опубликовано 30 печатных работ: из них 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук. В том числе 3 статьи - в международных научных журналах на английском языке, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, 1 статья в журналах, индексируемых в базе данных Scopus. Также опубликованы: одна глава в коллективной монографии на английском языке, 2 статьи в сборниках конференций, 9 тезисов докладов и 6 патентов на изобретения Республики Беларусь.
Публикации автора в научных журналах
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.6 (522 отзыва)
5 (18 отзывов)
4.1 (20 отзывов)
4.5 (9 отзывов)
4.6 (30 отзывов)
4.9 (343 отзыва)
4.7 (96 отзывов)
4.7 (46 отзывов)
4.6 (30 отзывов)
