Экологическая оценка действия наночастиц различной химической природы на растения

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Ввиду активного применения в последние десятилетия наночастиц различной
химической природы как стимуляторов роста и развития в сельском хозяйстве
обосновывается необходимость дальнейшего исследования воздействия наноматериалов на
качество сельхозпродукции, здоровья и жизни человека в целом. Параллельно с изучением наиболее эффективных концентраций, зависимости стимулирующего действия от размеров и состава ультрадисперсных частиц следует прогнозировать и возможные токсические последствия их применения. В данной главе даются классификация и способы получения наноматериалов, методы их исследования в живых объектах, характеристика использованных в работе наночастиц и биологических объектов исследования – вики и риса.
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И СХЕМЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Лабораторные исследования. В целях детерминации оптимальных, обладающих максимальным положительным эффектом концентраций были приготовлены из расчета 0,01- 500 г/т семян водные суспензии нанопорошков кобальта, железа, оксида титана и оксида кобальта. Для увеличения дисперсности пробы навеску исследуемого образца из расчета каждой концентрации помещали в дистиллированную воду и обрабатывали ультразвуком.
Исследование в условиях лаборатории осуществляли в соответствии с ГОСТ 15150, лабораторную всхожесть и энергию прорастания выявляли по стандартным методикам (Голубева Н.И., Назарова А.А., Полищук С.Д. и др., 2013) согласно ГОСТ 12038-84. Для проращивания использовали культивационную гелеобразную среду на микробиологическом агаре отечественного производства.
Для тестирования использовали семена вики районированных сортов (Vicia sativa L.) ГОСТ 11230-95, внесенных в Государственный реестр. Сортовая чистота вики посевной 98 % и семена риса посевного, сорт Длиннозёрный ГОСТ ISO 7301-2013 сортовая чистота семян I категории составляет не менее 99,5 %.
Оценка фитостимулирующих свойств наночастиц на ранних стадиях развития вики и риса. В термостате при температуре +20 ± 2С и влажности воздуха 80 − 90% на субстрате из кварцевого песка в течении 10 − 17 дней проводили проращивание семян с трехкратной повторностью. По окончании времени проращивания извлекали проростки, отделяли корневую и надземную (ростки) части, взвешивали и подвергали гомогенизации. Активность ферментов определяли в надосадочной жидкости: пероксидазу на фотоэлектроколориметре, супероксиддисмутазу и каталазу спектрофотометрически.
Определение активности фитогормонов. Гомогенат растительных тканей корней и ростков экстрагировали, вытяжки, полученные с помощью этилацетата, упаривали и в полученном остатке определяли индолилуксусную (ИУК) и гибберелловую (ГК), абсцизовую (АБК) кислоты. Оставшуюся надосадочную жидкость защелачивали до рН = 8,
экстрагировали бутанолом, упаривали досуха и в остатке определяли цитокинины. Анализ фитогормонов осуществляли методом жидкостной хроматографии.
Определение аккумуляции наночастиц в растениях. Семена вики и риса в течение 7 – 10 дней проращивали на биологической среде с добавлением наночастиц железа, кобальта, оксидов кобальта и титана в концентрациях, показавших наилучшие и низкие морфофизиологические показатели воздействия − 10 г/т и 100 г/т. Выращенный биологический материал диспергировали в этаноле ультразвуковым гомогенизатором с максимальной мощностью. Образовавшуюся суспензию наносили на медную сетку, имеющую электропроводящую углеродную плёнку и исследовали на просвечивающем электронном микроскопе «Jeol JEM-1400». Распределение металлов в образцах оценивали на электронном микроскопе Neon 40 и автоэмиссионном СЭМ MERLIN.
Определение накопления в растениях под воздействием НЧ других химических элементов из водных суспензий и почвы. Для диагностирования способности наноразмерных железа и кобальта усиливать накопление в тканях растений одних химических элементов и противодействовать поступлению других партии семян (по 1000 штук) выдержали в диспергированных суспензиях железа и кобальта 35-60 нм концентрации 10 г/т и прорастили в течении 20 суток. Все образцы гомогенизировались в шаровой мельнице и на рентгенофлуоресцентном энергодисперсионном спектрометре и анализаторе определяли элементный состав корней и ростков всех опытных партий.
Методика проведения полевых испытаний. Полевые эксперименты базировались на Агротехнологической станции (Рязанская область, п. Стенькино), опытные делянки расположены на серых лесных почвах. В качестве объекта исследования использовали вику, для которой в течение всего вегетационного периода фиксировали следующие параметры: полевая всхожесть и густота стояния, замеры роста и массы растений контрольного и опытных вариантов, забор вегетативных и репродуктивных частей растений и корневой системы для проведения биохимических исследований, урожайность зеленой биомассы и семян.
Методика выделения биополимеров: полисахаридов, белков и определения их основных характеристик. Определяли содержание белков и полисахаридов в зеленой массе вики, а также в семенах вики второго урожая, полученных при обработке исходных семян наночастицами кобальта и железа, в оптимальных концентрациях 1 г/т; 5 г/т; 10 г/т.
Трава исследовалась биохимически по типовым методикам. Полисахариды определяли по методикам Е.В. Сапожникова (1965) и В.В. Ермакова (1987). Для выделения лектинов использовали сефадекс G-150. Лектины определяли методом, основанным на
гемагглютинирующей способности этих веществ.
Токсикологическая характеристика наночастиц. Применяемые в работе нанопорошки железа, кобальта, оксида кобальта и оксида титана были исследованы на острую и хроническую токсичность (средний размер наночастиц 20-60 нм) в лаборатории Научного центра ФГБОУ ВО РГАТУ, а также в лаборатории арахноэнтомологии ФГБНУ «ВНИИП им. К.И. Скрябина» (таблица 1).
Таблица 1− Острое токсическое действие препарата при пероральном введении крысам
УДПМ
Нанопорошок железа Нанопорошок кобальта Нанопорошок оксида кобальта Нанопорошок оксида титана
LD16 (мг/кг) 3000,0 319,4 167,4 183,8
LD50 (мг/кг) 6710,5±692,6 1233,3±308,4 292,9 ±57,8 320,3±64,9
LD84 (мг/кг) 8333,3 2694,4 635,7 684,0
Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью программ Statistica 12.0 и Microsoft Office Exсel 2013. Нормальность распределения исследуемых групп определяли посредством описательных статистик (критерии Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилка). В случаях нормального распределения данных применялись методы параметрической статистики: однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), критерий Даннетта. В тех эпизодах, когда распределение данных отличалось от нормального, использовались методы непараметрической статистики (тест Манна-Уитни с поправкой Бонферрони, критерий Краскала-Уоллиса).
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Определение витальных, метрических и весовых показателей семян, пророщенных на гелеобразной культивационной среде, содержащей оксидные наночастицы. Сравнительные результаты показаны на рисунке 1.
120 всхожесть СоО всхожесть TiO2
всхожесть семян вики
*
0,01 0,1
120 100 80 60 40 20 0
всхожесть семян риса
100 80 60 40 20 0
*
*
*
всхожесть СоО всхожесть TiO2
*
**
**
*
*
контроль
1,0 10 100 500
контроль
0,01 0,1
1,0 10 100 500
Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) Рисунок 1 − Всхожесть семян вики и риса при взаимодействии с оксидными наноматериалами на гелеобразной культивационной среде Данные свидетельствуют о снижении витальных и морфометрических показателей под воздействием наночастиц оксидов с концентрацией свыше 10 г/т. Аналогично изменялись и такие показатели как масса и длина подземных и надземных частей проростков. Определение витальных, метрических и весовых показателей семян, пророщенных на гелеобразной культивационной среде, содержащей наночастицы железа и кобальта. Для наночастиц железа и кобальта (35-60нм) все морфофизиологические показатели проростков риса и вики остаются выше контроля при концентрациях намного выше 10 г/т семян и даже при 100 г/т угнетения не происходит (рисунки 2,3). 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Fe 35-60 нм Со 35-60 нм ** ** энергия прорастания семян риса, % * * * контроль 0,01 0,1 1 10 100 500 105 100 95 90 85 80 75 70 65 всхожесть семян риса, % Fe 35-60 нм Fe 35-60 нм Со 35-60 нм ** ** * Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05); **− достоверные различия по сравнению с контролем (р ≤ 0,01) Рисунок 2 – Энергия прорастания и всхожесть семян риса, обработанных НП железа и кобальта с размером частиц 35-60 нм Зависимость между дозой НЧ и длиной стебля и корня 3-х дневных проростков вики также имеет несколько пиков и падений (рисунок 3). контроль 0,01 0,1 1 10 100 500 28 26 24 22 20 18 16 14 12 * длина проростков риса, мм * 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 длина проростков вики, мм Fe 35-60 нм Со 35-60 нм ** ** *** ** * ** * * * ** * * * контроль 0,01 0,1 1 10 100 500 Co 35-60 нм Fe 35-60 нм контроль 0,01 0,05 0,1 0,5 1 10 100 500 Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05); **− достоверные различия по сравнению с контролем (р ≤ 0,01) Рисунок 3 – Длина трехдневных ростков риса и вики, выращенных из семян, обработанных НП железа и кобальта с размером частиц 35-60 нм Достоверно значимые увеличения длины стебля наблюдался при 0,05 г/т (+37,2%), 0,5 г/т (+47,2%) и 10 г/т (+52,1%). Далее в целом уменьшается длина ростков и корней, но отклонение от контроля незначительно. При увеличении времени контакта до 7 суток (рисунок 4) длина проростков достигала максимума при 10 г/т (+43,4%). Длина корней имела несколько пиков и превышала контроль при дозах 0,01г/т (+20,1 %), 5 г/т (+22,1%) и 10 г/т (+27,3%). длина надземной части проростков вики, обработанных НЧ металлов 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Со,длина надземной части,мм * Fe,длина надземной части,мм * ** контроль 0,01 0,05 0,1 1 10 100 500 * * длина подземной части проростков вики, обработанных НЧ металлов Со,длина подземной части,мм Fe,длина подземной части,мм *** * * ** 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) Рисунок 4 − Длина семидневных проростков вики, обработанных НЧ размером 35-60 нм Таким образом, наночастицы кобальта и железа проявляют примерно одинаковую корреляционную зависимость: периодическое повышение всхожести и энергии прорастания, длины и массы проростков в интервале концентраций 0,01-100 г/т. Понижение названных показателей происходит, если концентрации превышают 100,0 г/т, что приводит к заключению, что высокие концентрации подавляют (ингибируют) развитие и рост тестируемых растений. На рисунке 5 отчетливо прослеживается более высокая стимулирующая биологическая активность наночастиц металлов по сравнению с оксидами, включая концентрацию 100 г/т. Одной из характеристик действия эффекта малых доз (МД) является немонотонная, «прерывистая» зависимость эффективности воздействия от величины использованной концентрации. Для металлических наночастиц исследуемые параметры проявляют дозовую зависимость величины (энергия прорастания, длина проростков, их вес) колебательного характера и имеют «нулевую» область – такой интервал концентраций между двумя пиками активности, где биологическое действие не проявляется. Возможно, причиной этому служит энергетическая составляющая воздействия наночастиц, определяющая волновой характер распространения пространственных перестроек надмолекулярных структур. контроль 0,01 0,05 0,1 1 10 100 500 0,05 масса 7-дневных проростков риса, г 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 CoO TiO2 * * * Fe * Co * * * * * * * * ** * * * контроль 0,01 0,1 1 10 100 500 Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) Рисунок 5 − Масса ростков риса, выращенных под воздействием НЧ размером 35-60 нм Возможно, причиной этому служит энергетическая составляющая воздействия наночастиц, определяющая волновой характер распространения пространственных перестроек надмолекулярных структур. Влияние размеров наночастиц металлов железа и кобальта на морфофизиологические показатели проростков. Для сравнительной характеристики размеров изучаемых НЧ в эксперименте были использованы наночастицы железа и кобальта размером 20 нм. Наночастицы, имеющие размер до 20 нм демонстрировали высокую биологическую активность при малых концентрациях (рисунок 6). * 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 0,01 0,05 0,1 0,5 1 10 100 500 длина проростков, мм 26 24 22 20 18 16 14 12 10 0,01 0,05 0,1 0,5 1 10 100 500 длина проростков, мм Co 35-60 нм Fe 35-60 нм ** * Co 20 нм Fe 20 нм * * * ** * * * * * * контроль контроль Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) а – размер наночастиц 35-60 нм б – размер наночастиц 10-20 нм Рисунок 6 − Длина 3-х дневных проростков вики, выращенных из обработанных семян Такие нанообъекты, в связи с малым размером, сопоставимы с клеточными порами, и проявляют высокую физико-химическую активность. Результаты опытов показывают, что живые организмы, видимо, не имеют надежной защиты от частиц малых размеров и их опасно применять в биопрепаратах, так как трудно контролировать оптимальные концентрации. Частицы металлов, имеющие большие размеры (около 200 нм) ограниченно проникают внутрь семян, в меньшей степени взаимодействуют с клеточными органеллами и влияют на рост растений в незначительной степени (рисунок 7). Для проявления биологической активности им необходимо длительное время взаимодействия с живой системой, повышающей их количество в клетке и воздействие на её структуры. 28 24 20 16 длина проростков риса, мм 0,048 0,046 0,044 0,042 0,040 0,038 0,036 0,034 0,032 0,030 0,028 0,026 масса проростков риса, г длина надземной части длина подземной части ** * масса надземной части масса подземной части * * * * * контроль 0,01 0,1 1 10 100 1000 контроль 0,01 0,1 1 10 100 1000 Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) Рисунок 7 – Морфометрические показатели проростков риса при взаимодействии с частицами железа 200 нм Анализируя результаты проведенных экспериментов можно заключить, что способность клеточной стенки фракционировать поступающие частицы обусловлена размером клеточных пор, и наночастицы могут проникать внутрь клетки в том случае, если их размер сопоставим с диаметром крупных пор. Однако, они могут изменять пропускную способность клеток, приводить к образованию новых пор. По этой причине наночастицы размером 35-60 нм биологически активны, их влияние соответствуют эффекту “низкой дозы”. Размер частиц 200 нм ограничивает их доступ к клеточным органеллам, но длительное взаимодействие и увеличение их количества способствует биоаккумуляции, они становятся способными влиять на клеточную структуру. Рецепторы на поверхности клетки формируют связи с лигандами, в том числе с наночастицами и передают сигнал внутрь клеточного пространства, запускающий биохимические реакции различного характера. ГЛАВА 4. ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ НАНОЧАСТИЦ НАКАПЛИВАТЬСЯ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ВОЗМОЖНЫХ ОТДАЛЕННЫХ ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДОВ КОБАЛЬТА И ТИТАНА Возможность накопления наночастиц в проростках исследуемых растений. Тестируемые образцы растений после обработки коллоидным раствором частиц размером 200 нм были исследованы на аналитическом электронном просвечивающем микроскопе «JEM-1400». Электронно-микроскопическое исследование дало следующие результаты: такие частицы благодаря выраженным адгезионным свойствам в значительной мере адсорбируются на поверхности растений (рисунок 8). Однако, проведенный затем элементный анализ достоверного накопления данных частиц в тканях растений не показал. Рисунок 8 − Снимок наночастиц на поверхности, полученный на электронном микроскопе в результате обработки наночастицами оксида титана Аккумуляция наночастиц металлов не найдена, оксиды, наоборот, накапливаются в большей степени в ростках и корнях и разрушают активные митохондриальные ферменты. Как видно из рисунка 9 наночастицы в тест-объектах образуют агрегаты, окруженные «коронами» из биополимеров вокруг чужеродных частиц. Наночастицы оксида титана создают скопления не крупнее 80 нм, в то время как наноксид кобальта способен образовывать агломераты до 300 нм. Анализ наличия наночастиц показал, что TiO2 и CoO накапливаются и в ростках, и в корнях риса и вики. а – контроль б – оксид кобальта в – оксид титана Рисунок 9 − Фотографии вершков пророщенной вики с видимыми включениями наночастиц, размер 35-60нм 14 Оценка фитостимулирующих свойств наночастиц и их токического действия на ранних стадиях развития растений. Под действием стрессовых ситуаций в клетках растений повышается количество молекул, имеющих чрезвычайную реактивность – так называемых «активных форм кислорода» (АФК). Антиоксидантный фермент супероксиддисмутаза (СОД) выходит первым на защиту и убирает супероксидные радикалы, окисляющие макромолекулы, затем работающие на одном субстрате – перекиси водорода − пероксидаза и каталаза обезвреживают АФК (таблица 3). Таблица 3 − Активность пероксидазы (в ед.опт.пл/г сырой ткани) и супероксиддисмутазы (в усл.ед.акт./г сырой ткани) в корнях и ростках риса под действием наночастиц железа и кобальта 35-60 нм; n=10 ПЕРОКСИДАЗА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА Вариант Корни аб.значение Ростки Корни % аб.значение % аб.значение % Ростки аб.значение % 91,06±0,54 - Контроль 9,14±0,52 Fe0,01 10,45±1,34 +9,3 - 5,93±0,61 - 6,51±1,13 +9,8 6,50±0,96 +9,4 6,36±1,03 +7,3 5,82±0,85 -1,8 5,68±0,83 -4,2 40,51±0,68 - 43,07±0,7 +6,3 80,65±1,15* -11,4 Fe 0,10 10,41±1,22 Fe1,00 11,08±1,55* Fe10 11,36±1,12* Fe100 9,30±1,03 -2,7 Fe1000 8,67±0,80 -9,3 5,45±0,7 -8,1 44,64±1,36 47,83±1,13* 57,47±0,92* 79,81±1,36* 53,62±1,73* 41,45±1,37 44,69±3,77 +10,2 +18,1 +41,9 +97,0 +32,4 +2,3 +10,3 +14,1 +22,3 +47,7 +52,3 88,23±1,69 -3,1 96,03±0,75 +5,5 98,28±1,65 +7,9 99,45±0,93* +9,2 77,16±1,1* -15,3 98,18±1,45 +7,8 92,24±2,27 +1,3 94,57±1,89 +3,9 102,92±1,69* +13,0 111,04±1,78* +21,9 132,23±2,99** +45,2 +8,9 +15,9 +18,8 Co 0,01 Co 0,10 Co 1,00 Co 10 Co 100 Co 1000 10,58±1,16 11,14±1,33* 12,01±1,97* 11,99±1,10* 13,14±1,13** 9,47±1,56 +10,7 +16,5 +25,6 +25,4 +37,4 -0,9 6,13±1,31 +3,4 6,23±1,32 +5,1 6,85±0,97* +15,5 46,23±1,17 6,19±0,89 +4,4 49,56±1,45* 5,05±0,91 -14,8 59,84±2,63* 4,91±0,98* -17,2 61,70±1,49** Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05); **− достоверные различия по сравнению с контролем (р ≤ 0,01) Активность ферментов имеет общие закономерности корреляции от концентраций наночастиц и проецируется на наблюдаемые изменения морфофизиологических показателей риса и вики. Так, активность пероксидазы не превышает контроль в пределах 21% при концентрациях НЧ до 100 г/т. Дальнейшее увеличение концентрации снижает активности фермента, либо увеличение происходит более чем на 30%, что являться признаком угнетения роста и развития растений. В ростках оптимальное увеличение активности пероксидазы фиксировалось при концентрациях 0,01-10 г/т, а затем происходило снижение активности. Активность СОД в корнях изменялась «куполообразно», достигая пика при 100,0 г/т (80-90% выше контроля). В ростках её активность увеличивалась на 21,9% при 100,0 г/т, а при 1000 г/т данное превышение составило уже 45,32%. Активность перечисленных ферментов отражает биологическую активность или токсичность вещества, воздействующего на растительный организм и клеточные структуры. Воздействие наноразмерных (до 20 нм) частиц вызвало увеличение активности пероксидазы в проростках риса и вики, причем в концентрации кобальта 1 г/т превышение к контролю составило уже 36,8%, следовательно, происходило торможение развития. Влияние наночастиц железа повышало активность пероксидазы до 24% в концентрации 10 г/т. Активность супероксиддиссмутазы как в корнях, так и в ростках по всем вариантам была выше контроля, достигнув пика при 100,0 г/т, но в ростках была ниже активности пероксидазы и ниже 30%. Активность антиоксидантных ферментов определяет жизнеспособность растений. Высокая степень изменения активности данных ферментов является признаком низкой устойчивости растений к антропогенным нагрузкам. Полученные результаты свидетельствуют, что частицы, имеющие размер 35-60 нм, как и в случае изучения морфофизиологических показателей, способствуют нормальному развитию растений в концентрациях ниже 100 г/т. Для частиц ≤ 20 нм положительная динамика наблюдается в концентрациях 0,01-10 г/т. Влияние наночастиц на содержание протонов в клетках проростков риса. Современные исследования, характеризующие среду клетки, удостоверяют влияние протонов на проницаемость клеточной мембраны, активность ферментов, направление ферментативных реакций. Измеряя водородный показатель свежеприготовленных суспензий УДП, мы установили зависимость его величины от размера, состава и концентрации наночастиц в растворе (таблица 4). Механизм растворения металлов группы железа представляет собой по мнению Подобаева А.Н. процесс их взаимодействия с адсорбированным молекулами воды и образования «поверхностного комплекса с переносом заряда». Данные, полученные при измерении водородного показателя, указывают на совокупность следующих процессов: Fe + H2O → Fe(H2O)+ads + e, (1а) Fe(H2O)+ads → Fe(OH)ads +H+ + (1-δ)e, (1б) Fe(OH)ads ↔ Fe(O)ads +H+ + e, (1в) где (1а), (1б) и (1в) − взаимодействие атомов железа с водой по стадиям, (H2O)+ads – поверхностный комплекс с переносом заряда, образованный потерявшей часть заряда электрона (0<<1) молекулой воды, (OH)ads и (O)ads – адсорбированные гидроксогруппы и атомы кислорода. Десорбция воды на поверхности НЧ кобальта (2) приводит к образованию комплекса [Co(H2O)6]3 + и высвобождению катионов водорода: 4 [Co(H2O)6]3+ + 2H2O ↔ [Co(H2O)6]2+ + 4H+ (2) Таблица 4 − Количество протонов водорода в водной суспензии НЧ железа и кобальта в концентрации 10 г/т металла Измерения [H+], моль/л количество протонов водорода на 100 мл масса зерен, обработанных УДП металла количество протонов водорода, приходящееся на одно зерно контроль 10-7 6,03×1015 30,725 4,96×1012 УДП Fe 1,348× 10-6 8,123×1016 30,127г 6,89×1013 Co 1,147×10-6 6,914×1016 31,015г 5,73×1013 Установлено, что в водной суспензии, содержащей Fe размером наночастиц 35-60 нм и концентрацией 100 г/т, число протонов водорода повысилось в 4,48 раза, а с концентрацией 10 г/т возросло в 13,53 раза по сравнению с их количеством в дистиллированной воде. Низкая концентрация ультрадисперсного металла предполагает лучшую доступность его поверхностных атомов для взаимодействия с водой и продуктивное образование ионов водорода, что показано на примере частиц размером до 20 нм: увеличение количества протонов зарегистрировано в 15 и 17 раз в суспензиях с концентрациями 10 г/т и 0,01 г/т соответственно. Приведенная зависимость отмечена и для наночастиц кобальта, возможно в этом заключена их высокая биологическая активность при низких концентрациях. рН суспензии нанооксида кобальта меняется в узком интервале, за 5 часов от 7,08 до 6,25. Главная энергетическая единица живой клетки – АТФ – катализируется АТФ-синтазой. Встроенный в клеточную мембрану АТФ-синтазный комплекс является эффективным преобразователем энергии и приводится в действие трансмембранной разностью потенциала ионов водорода ΔμН+. Увеличение количества протонов, вызывающих возрастание электрохимического потенциала, согласуется с изменением физиологических показателей прорастания и развития, то есть наночастицы являются биосовместимыми источниками дополнительной энергии. Оценка активности фитогомонов. На этапах прорастания и роста меняется активность и соотношение фитгормонов, коррелирующих процессы онтогенеза, то есть морфофизиологические изменения, обусловлены изменением гормонального фона. Изучена активность индолилуксусной (ИУК), гибберелловой (ГК) абсцизовой (АБК) кислот и цитокининов (ЦК) в проростках вики под воздействием наночастиц железа, кобальта, оксидов титана и кобальта. В интервале концентраций 0,01-100 г/т активность АБК снижается, индуцируется активность ИУК, ЦК и ГК, повышающая фотосинтетическое фосфорилирование и интенсивность фотосинтеза. Наблюдаемое под действием нанокобальта в концентрациях 0,5-10,0 г/т возрастание содержания ИУК (рисунок 10а) проецируется на морфометрические изменения и увеличение энергетической эффективности дыхания. 6 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 **** 6 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 * *** к-ль 0,01 0,05 0,1 0,5 1,0 10,0 100,0 1000,0 к-ль 0,01 0,05 0,1 0,5 1,0 10,0 100,0 1000,0 Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) а) б) Рисунок 10 − Содержание индолилуксусной кислоты в опытных образцах вики под действием наночастиц кобальта размером а) 35-60нм; б) до 20 нм Активность цитокининов и гибберелловой кислоты достоверно возрастает до концентрации 10 г/т при уменьшении содержания абсцизовой кислоты, количество которой изменяется незначительно. Обусловленность активности фитогормонов концентрацией НЧ − «доза-эффект» зависимость − справедлива как для наночастиц размером 35-60 нм, так и частиц размером до 20 нм. Для последних увеличение активности ЦК, ГБ и ИУК достоверно при концентрациях 0,05 и 0,5-10,0 г/т (рисунок 10б). Воздействие наночастиц оксида кобальта в концентрации 1,0 г/т увеличивает активности АБК на 11,2%, а при 100 г/т - на 41,1%, что подтверждает негативное влияние наночастиц оксидов в концентрациях свыше 10,0 г/т. Наночастицы, обладающие высокой поверхностной энергией и уникальными свойствами сообщают клеткам посредством трансмембранных рецепторов информацию, приводящую к изменению соотношения эндогенных фитогормонов, закономерно изменяется состояние биомембран и совершается опосредованная регуляция синтеза белка. Так, под влиянием наночастиц преобразование гормонального статуса ведет к перестройке метаболизма и фотосинтетических процессов. содержание нг/г сырой массы содержание нг/г сырой массы Синергические и антагонистические свойства наночастиц металлов. Явления синергизма и антагонизма среди химических элементов в процессе роста и развития растений активно изучается с середины 20 века. Способность наночастиц приумножать накопление (синергизм) одних химических элементов и препятствовать аккумуляции (антагонизм) других была рассмотрена на примере риса и вики, выращенных под воздействием наночастиц железа и кобальта размером 35-60 нм. Проростки были исследованы на рентгенофлуоресцентном энергодисперсионном спектрометре. Нанодисперсное железо способствовало умножению в корнях вики калия (+0,32), фосфора (+0,13), серы (+0,23), натрия (+0,05) и хлора (+0,06), однако, на массосодержание кальция не повлияло. Наноразмерный кобальт проявил синергизм к фосфору (+0,6), калию (+0,15) и магнию (+0,09), но снизил содержание кальция. а) б) Рисунок 11 − Содержание химических элементов в ростках риса с НЧ а) Fe и б) Co Наножелезо в ростках риса благоприятствовало накоплению натрия (+0,4), магния (+0,2), кальция (+0,3), фосфора (+0,2) и кремния; кобальт повысил содержание калия (+0,9), кальция (+0,3), магния (+0,2), хлора (+0,9). Содержание кобальта и железа зафиксировано в норме (рисунок 11). Приведенные изменения элементного состава проростков вики и риса служат одним из факторов, объясняющих механизм фитостимулирующего действия нанометаллов. ГЛАВА 5. ПОЛЕВЫЕ ИСПЫТАНИЯ Влияние наночастиц на урожайность, рост и развитие растений. Эффективное воздействие наночастиц, установленное в процессе лабораторных исследований, изучалось в условиях полевого опыта на примере вики под действием двух видов техногенных наночастиц: железа и кобальта. Семена растений перед посадкой в полевых условиях были обработаны суспензиями нанопорошков размером 35-60 нм в наиболее оптимальных по результатам лабораторных испытаний концентрациях: 1−10 г/т. 19 При одноразовом воздействии на семена вики наночастицами кобальта и железа перед их посевом, в процессе роста наблюдали увеличение всхожести на 10,4%, энергия прорастания увеличилась в среднем на 8,8%, зеленая масса вики увеличилась на 26,7 − 31,2%, повысилась устойчивость растений к засухе и полеганию. НЧ железа и кобальта в концентрациях 5 г/т и 10 г/т способствовали увеличению урожайности вики до 42 %. Наблюдалось повышение содержания белка и закономерное снижение количества сырой клетчатки, выросло содержание полисахаридов. Количество в растениях микроэлементов, которыми обрабатывали семена, практически не изменилось. Так, в опытных растениях количество кобальта сохранялось на уровне 0,13 − 0,18 мг/кг сухой травы, а в растениях контрольной группы содержание кобальта составило 0,12 мг/кг сухой травы. 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 содержание лектинов, мг/л 14 12 10 8 6 4 2 0 содержание углеводов, г Со 5 г/т * * контроль Со 5 г/т Со 10 г/т * * контроль Со 10 г/т Примечание: *− достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05) Под влиянием наночастиц кобальта и железа наблюдалось увеличение содержания протеина в семенах вики, при этом количество лектина уменьшилось на 39%, что наблюдалось в случае использования кобальта с концентрацией 5 г/т. Выход водорастворимых полисахаридов из семян вики повысился по сравнению с растениями контрольной группы на 31−35% (рисунок 10). Доказанное уменьшение содержания лектина, видимо, обусловлено более высокой концентрацией полисахаридов, способных связываться с лектинами белка. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наночастицы железа и кобальта размером 35-60 нм увеличили энергию прорастания и всхожесть до 28% по отношению к контролю, длина проростков превысила контроль на 23−27%, а их вес на 32−36%. Такие частицы обладают выраженной биологической активностью в концентрациях до 100 г/т, а по некоторым показателям и до 500 г/т. Рисунок 10 – содержание углеводов и лектинов в семенах вики, обработанных наночастицами Со 35-60 нм НЧ размером до 20 нм демонстрировали высокую биологическую активность в концентрациях до 10 г/т, повышая энергию прорастания и всхожесть на 16-20%. Длина 3-х дневных ростков и корней превышала контроль на 60% и 128%, а масса на 58% и 65% соответственно. Эти показатели существенно выше, чем у НЧ 35-60 нм, что объясняется высокой проникающей способностью таких частиц. Нанопорошки «крупных» частиц размером 200 нм напротив, проявляли эффект только при высоких (существенно больше 100 г/т) концентрациях, при которых проявлялось усиление регуляторного сигнала за счет биоаккумуляции. НЧ оксидов кобальта и титана давали незначительный положительный результат в концентрациях до 10 г/т. В дозах, превышающих 10 г/т, данные наночастицы не обладали значительным стимулирующим действием, а в высоких концентрациях (100 г/т, 500 г/т) существенно снижали показатели (до 40%), констатировалось угнетение развития. Установленное накопление нанодисперсных оксидов кобальта и титана в структуре растений может способствовать их переносу от растений к животным, создавать возможность вымывания грунтовыми водами, поэтому они обладают определённой экологической опасностью, их применение следует строго контролировать. Проведенные исследования убедительно показывают, что высокие концентрации (>100 г/т) наночастиц кобальта и железа 35-60нм, средние и высокие концентрации (>10 г/т) частиц металлов размера 20нм и наночастиц оксидов кобальта и титана действуют на клетки растительных тканей как резкий абиотический стресс, супрессивно изменяя биохимические и физиологические процессы.
Первостепенным фактором, предопределяющим биологическую активность, является взаимодействие наночастиц с жидкой средой. Зафиксированное увеличение в несколько раз количества ионов Н+, очевидно приводит к их биоаккумуляции, биосовместимости, увеличению энергии, необходимой для прорастания семян.
На этапах прорастания меняется количество и соотношение фитогормонов регулирующих развитие проростков. Под воздействием концентраций до 100 г/т НЧ железа и кобальта размером как 35-60 нм, так и 20 нм, снижается АБК повышается активность ИУК, цитокининов и гиббереллинов. В проростках, семена которых обрабатывались нанопорошками оксидов кобальта и титана, содержание АБК повышалось, а ИУК снижалось значительно при концентрациях, превышающих 10 г/т, что подтверждает токсичность оксидных наночастиц и «доза-эффект» зависимость.
Измерение активности антиоксидантых ферментов в ростках и корнях обработанных растений позволило утверждать о низком содержании АФК, то есть отсутствии стресса,
вызванного НЧ железа и кобальта в низких и средних концентрациях. Электронно- микроскопический анализ ростков и корней риса и вики не обнаружил в составе фракций изучаемых нанометаллов, что указывает на отсутствие токсического действия. Установленный синергизм НЧ железа и кобальта комплиментарно воздействует на биометрические показатели экспериментальных растений.
В полевых условиях под действием наночастиц железа и кобальта в концентрациях 5 г/т и 10 г/т повысилось содержание водорастворимых полисахаридов, при этом содержание лектинов снизилось, что является преимуществом для кормовых культур.
Наночастицы малых размеров, отличающиеся высоким химическим потенциалом на межфазных границах и значительной удельной поверхностью, характеризуются аномальной растворимостью и реакционной способностью. Биологический эффект в малых дозах обусловлен воздействием «агент (препарат) – клетка» запускающим через систему интегринов каскад перестроек малого матрикса ведущий к изменению активности ферментативных систем и хода процессов биологического синтеза. Малый матрикс передает информацию, полученную от высокоэнергетических, обладающих исключительными свойствами наночастиц с высокой степенью надежности и малыми энергозатратами, универсально для различных биологических объектов.
Таким образом, показана зависимость изменения морфофизиологических и биохимических показателей изучаемых растений от дозы, размера и состава воздействующих наночастиц. Механизм их действия изучен недостаточно, но приведенные факты неоспоримо свидетельствуют, что наночастицы являются биорегуляторами роста и развития живых организмов.
Проведенная исследовательская работа позволила сформулировать основные выводы:
1. Кобальт и железо в наноразмерном состоянии 35-60 нм оказали положительное
влияние на морфофизиологические показатели растений. Наночастицы размером до 20 нм демонстрировали высокую биологическую активность в концентрациях до 10 г/т, а частицы размером 200 нм только при высоких концентрациях и длительном контакте с семенами тестируемых культур. Нанопорошки оксидов кобальта и титана в дозах, превышающих 10 г/т, не обладали значительным стимулирующим действием, а в дозах выше 100 г/т оказывали негативное воздействие.
2. Выявлено изменение рН среды под воздействие исследуемых нанопорошков.
Концентрации железа и кобальта до 10 г/т размером до 20 нм и 35-60 нм существенно
повысили концентрацию протонов водорода в водной суспензии, что активизировало проницаемость мембран, усиливая их биосовместимость.
На этапах прорастания семян и роста проростков под воздействием низких концентраций частиц железа и кобальта размером как 35-60 нм, так и 20 нм изменилось количество и соотношение фитогормонов регулирующих развитие проростков. Установлено изменение активности ферментов-антиоксидантов: пероксидазы, супероксиддисмутазы.
3. Изменение соотношения макро- и микроэлементов в исследуемых образцах под действием наночастиц кобальта и железа способствовало увеличению биометрических показателей в среднем на 23−36%. Накопления тяжелых металлов не обнаружено.
4. Предпосевная обработка семян вики нанопорошками кобальта и железа повысила урожайность вики, увеличилось содержание протеинов и полисахаридов на 30−35%, а количество лектинов снизилось на 22−39%. По данным энергодисперсионного анализа содержание кобальта и железа в зеленой массе вики не превышало допустимых значений.