Эколого-биологические эффекты воздействия оксида графена на микроклональные проростки гибрида тополь белый × осина и березы пушистой

Современное состояние проблемы исследования. Обзор литературы
Графен – это двумерная аллотропная форма углерода, образованная одиночными
слоями атомов углерода. В графене атомы углерода проявляют sp2-гибридизацию, они
связаны σ- и π-связями в двумерной гексагональной кристаллической решетке с
расстоянием 0,142 нм между соседними атомами. Помимо этого, графен представляет
собой структурный элемент некоторых других аллотропных модификаций углерода,
таких, как графит, углеродные нанотрубки и фуллерены.
Оксид графена представляет собой соединение углерода, кислорода и водорода в
различных соотношениях, полученное обработкой графита сильными окислителями.
Обилие гидрофильных кислородосодержащих групп на поверхности делает его хорошо
диспергируемым в полярных растворителях, в частности, в воде (Dreyer, 2010). Это делает
данный материал очень перспективным для медицинских и биотехнологических
приложений, т.к., с одной стороны, гидрофильность чешуек оксида графена повышает его
биодоступность, а с другой, наличие многочисленных =O, –OH и –COOH групп на
поверхности облегчает функционализацию наноматериала биоактивными молекулами
(антибиотиками, нуклеиновыми кислотами и т.д.).
В ряде исследований показано как положительное (Nair, 2012; Zhang, 2015), так и
отрицательное (Liu, 2015; Ren, 2016) воздействие оксида графена на растения.
Предполагается, что благодаря своей способности переносить воду, оксид графена
улучшает прорастание семян; однако повышенные дозы вызывают окислительный стресс
и генотоксичность (Szollosi, 2020). Учитывая имеющиеся сообщения об экологической
токсичности оксида графена (Zhao, 2017; Freixa, 2018; Wang, 2021), токсичности для
млекопитающих (Sasidharan, 2015; An, 2018), а также о возможности его поступления в
окружающую среду при работе очистных сооружений (Bäuerlein, 2017) и объектов
промышленного производства, на которых синтезируют или используют углеродные
наноструктуры (Murr, 2005; Gottschalk, 2013), всесторонняя оценка экологической
безопасности оксида графена является необходимым условием его практического
использования в эко- и биотехнологиях, а также сельском и лесном хозяйстве.

2 Материалы и методы исследований

Исследования проводились на базе НИИ «Нанотехнологии и наноматериалы» и
НИИ экологии и биотехнологий ТГУ имени Г.Р. Державина (г. Тамбов), а также АО
«ПКВО» (г. Воронеж). Наночастицы оксида графена были получены методом химической
эксфолиации графита (Hummers, 1958). Дисперсии оксида графена готовили в
бидистиллированной воде (рН = 7,1 ± 0,2).
Полученный материал исследовали с помощью спектроскопии комбинационного
рассеяния (Рамановский микроскоп Thermo DXR (Thermo Scientific, США) с лазером 532
нм при мощности 1 мВт через объектив 100х), сканирующей электронной микроскопии
(микроскоп Vega3, Tescan, Чешская Республика) и атомно-силовой микроскопии (AIST-
NT, Россия) в режиме полуконтактного постукивания с наконечниками NTMDT AFM.
Дзета-потенциал коллоидных систем исследовали с помощью анализатора размеров
частиц и дзета-потенциала Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания).
В качестве объектов исследования использовались микропроростки гибрида тополь
белый (Populus alba L., 1753) × осина (Populus tremula L., 1753) и березы пушистой (Betula
pubescens Ehrh., 1789) в условиях культуры in vitro.
Гибрид тополь белый х осина – это искусственно полученный в 1951 г. М.М.
Вересиным гибрид, высаженный в Правобережном лесничестве ВГЛТУ. Береза пушистая
– культура берез второго поколения, полученная Ю.Н. Исаковым и В.В. Иевлевым в 1981
году самоопылением деревьев и высаженная после гибридизации в Семилукском
лесопитомнике. Данные объекты выбраны в связи с их ценными фенотипическими
признаками, такими, как высота и форма ствола, а также засохоустойчивостью (на
примере засухи 2010 года) и устойчивостью к сердцевинной гнили, и, соответственно, с
перспективностью получения на их основе микроклонального посадочного материала с
улучшенными свойствами.
Общее число исследованных микропроростков составило 960 шт., при этом размер
каждой группы составлял 30 шт., повторность – трехкратная.
В качестве основы питательной среды для клонального микроразмножения на этапах
введения в культуру и мультипликации был взят состав питательной среды Мурасиге-
Скуга (Murashige, 1962), МС. На этапе укоренения использовалась среда WPM (Lloyd,
1980). Рабочие растворы оксида графена получали разбавлением исходной суспензии
наноматериала (10 г/л) средами МС и WPM. Затем среды перемешивали стеклянной
палочкой в течение 20 с, после чего обрабатывали в ультразвуковой ванне CD-4800
(Codyson, Китай) 5 мин. Итоговое содержание наноматериала в средах на этапе введения в
культуру: 0,75; 1,5; 3; 6 и 15 мкг/л в MС; на этапе мультипликации – 1,5 мкг/л в MС; на
этапе укоренения – 1,5 мкг/л в WPM. Исследование стабильности питательных сред,
содержащих оксид графена, проводили для свежеприготовленных сред, а также сред,
выдержанных 3 месяца, с помощью прибора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd.,
Великобритания) и сканирующего электронного микроскопа высокого разрешения Merlin
(Carl Zeiss, Германия) с энергодисперсионным анализатором «10mm2 SDD Detector – X-
Act».
Микроклонирование осуществляли общепринятыми методами культивирования in
vitro изолированных органов растений (Бутенко, 1999). Исследование затронуло 4 этапа
микроклонирования: введение в культуру, мультипликацию, укоренение, адаптацию.
На этапе введения в культуру подсчитывали количество стерильных эксплантов (без
грибной и бактериальной инфекции), количество выживших эксплантов и микроклонов,
имеющих менее 30% поражений тканей, анализировали такие морфометрические
параметры растений, как высота растений, количество листьев, число дополнительных
побегов, наличие корней, состояние по 5-ти бальной шкале (5 баллов – идеальное
состояние, 1 балл – очень плохое состояние).
На этапе мультипликации использовали среду МС0, содержащую гормональные
компоненты (бензиламинопурин (БАП) – 0,2 мг/л, индолилуксусная кислота (ИУК) – 0,1
мг/л и гиббереловая кислота (ГК) – 0,3 мг/л) как самостоятельно, так и в смеси с 1,5 мкг/л
оксида графена, а также чистую среду MС и MС с 1,5 мкг/л оксида графена. При этом
оценивали количество выживших побегов, морфометрические параметры побегов
(высота, число листьев, число дополнительных побегов, наличие корней, состояние по
пятибалльной шкале). Кроме того, на этапе мультипликации проводились
гистологические исследования листовых пластинок проростков с помощью аппаратно-
программного комплекса ВидеоТесТ-Морфология 4.0, при этом оценивались плотность
устьиц и размеры устьичной щели (Пронзина, 1960; Дженсен, 1965; Смирнов, 1969).
Помимо этого, измеряли фотосинтетическую активность тканей Fv/Fm с использованием
прибора ИФСР-2 по методу Гентли (Genty, 1989; Цуканова, 2011). Стандартным
перманганатометрическим методом (Кучеренко, 1988) оценивалась активность фермента
класса оксидоредуктаз каталазы.
На этапе укоренения на среде ½ WPM с добавлением 1,5 мкг/л оксида графена
оценивали количество выживших побегов, морфометрические параметры побегов
(высота, число листьев, число дополнительных побегов, наличие корней, количество
корней, состояние по пятибалльной шкале).
На этапе адаптации растения высаживали в технологические кассеты объемом 155
мл каждая, заполненные субстратом, который состоял из торфа с нейтральным рН и
перлита 3:1. Обработку растворами оксида графена (1,5 и 3 мкг/л) осуществляли дважды
(в момент высадки и спустя 1,5 недели) путем введения препаратов под корень (100 мл
раствора на ячейку). Учёт морфометрических показателей количество выживших
растений, число адаптированных растений, морфометрические параметры побегов
(высота, число зеленых листьев, число увядших листьев, число дополнительных побегов,
состояние по пятибалльной шкале) проводили по общепринятым методикам
(Моисейченко, 1996).
Анализ накопления оксида графена в тканях экспериментальных растений
осуществлялся на сканирующих электронных микроскопах Neon 40 и Merlin (Carl Zeiss,
Германия) с микрорентгеновским анализатором.
Статистическая обработка данных осуществлялась на основе методов вариационной
статистики (Доспехов, 2012) с использованием программы Microsoft Excel 2010 (пакет
«Описательная статистика») с применением однофакторного дисперсионного анализа
(ANOVA) при 5%-ном уровне значимости.

3. Результаты

3.1 Результаты анализа образца оксида графена и питательных сред, содержащих
наноматериал
Методом рамановской спектроскопии показаны основные линии (рисунок 1а),
характерные для оксида графена: D (1338 см-1) и G (1590 см-1) (Won-Chun, 2011; Rattana,
2012; Muzyka, 2018).

а)б)
Рисунок 1 – Спектр комбинационного рассеяния (а) и СЭМ-изображение пленки
оксида графена после сушки на подложке (б)

В ходе исследования методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
установлено, что образец имеет пластинчатую структуру без каких-либо других видов
частиц кристаллизованной фазы (рисунок 1б).
Анализ образца методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) показал, что
поперечный размер чешуек варьируется от 0,1 до 3 мкм, в то время как их средняя
толщина менее 1 нм (рисунок 2).
Рисунок 2 – АСМ-изображение чешуек оксида графена

Таким образом, анализ полученного образца оксида графена показал, что материал
имеет характерную пластинчатую морфологию с размером отдельных чешуек от 0,1 до 3
мкм и толщиной менее 1 нм.
Выявлено высокое значение дзета-потенциала исходной коллоидной системы (-54,7
мВ), что указывает на ее стабильность и устойчивость к агрегации и седиментации.
Исследование стабильности экспериментальных образцов сред для микроклонирования,
содержащих наночастицы оксида графена, показало, что дзета-потенциал также принимал
достаточно высокие значения (-30 –34 мВ) независимо от времени хранения сред и
концентрации наночастиц в коллоидной системе.
Картирование основных элементов в образцах сред, содержащих наночастицы
оксида графена в концентрации 15 мкг/л, показало отсутствие выраженных очагов
скопления углерода в свежеприготовленных и выдержанных 3 месяца образцах сред.

3.2 Влияние оксида графена на микропроростки на этапе введения в культуру
3.2.1 Гибрид тополь белый × осина
На этапе введения в культуру оксид графена оказал стерилизующие действие на
микропроростки гибрида – при концентрациях выше 0,75 мкг/л количество стерильных
проростков составило 100% при 80% в контрольном варианте (рисунок 3).

Рисунок 3 – Показатели стерильности и выживаемости проростков гибрида белый ×
осина при культивировании с оксидом графена (n=30; * здесь и далее обозначены
варианты, в которых отмечено достоверное различие с контрольными значениями при p < 0,05). Высокая стерильность микроклонов может быть связана с противомикробным действием оксида графена, показанным в значительном числе исследований (Ji, 2016; Egorova, 2018; Fallatah, 2019; Kumar, 2019; Xia, 2019). Количество выживших микроклонов при концентрациях 1,5 и 3 мкг/л, также составило 100%. При дальнейшем повышении концентрации до 6 мкг/л число микроклонов снизилось до 90%, а при 15 мкг/л – до 70%, при 86 в контрольной группе. Данный факт свидетельствует о наличии фитотоксического эффекта, оказываемого оксидом графена в высокой концентрации. О негативном влиянии анализируемого наноматериала на растения также упоминается в ряде работ (Chen, 2018; Wang, 2019). Внесение в культивационную среду оксида графена практически не сказалось на приросте побегов (рисунок 4а). При 1,5 и 6 мкг/л графена длина проростков увеличилась в среднем на 0,3 см, а при 3 мкг/л – на 0,5 см. а)б) Рисунок 4 – Высота проростков (а) и количество листьев (б) гибрида тополь белый × осина под действием оксида графена Максимальное количество листьев наблюдалось в группе 1,5 мкг/л – 5 шт., что в 2,5 раза больше, чем в контрольной группе. При 3 мкг/л отмечено 3 листа, а при 6 и 15 мкг/л показатель (2 шт.) не отличался от контроля (рисунок 4б). Дополнительные побеги отмечены только в вариантах с наноматериалом – 1 дополнительный побег в группе 1,5 мкг/л и по 2 в вариантах 3 и 6 мкг/л. Наличие корней также зафиксировано только у регенерантов, выращенных с добавлением оксида графена в концентрациях 1,5 и 3 мкг/л (таблица 1). Таблица 1. Биоморфологические показатели микроклонов гибрида тополя белого и осины на питательных средах, содержащих оксид графена ВариантЧисло дополнительныхНаличиеСостояние побегов, шт.корнеймикроклонов по 5–ти балльной шкале Контроль005 ОГ 0,75005 ОГ 1,51+5 ОГ 3,02+5 ОГ 6,0203 ОГ 15,0002 Общее состояние микроклонов в группах: контроль, 1,5 и 3 мкг/л по пятибалльной шкале оценивалось как отличное (5 баллов), повышение концентрации до 6 мкг/л снижало показатель до 3-х баллов, а при 15 мкг/л состояние регенерантов оценивалось на 2 балла, что подтверждает негативное влияние оксида графена в высокой концентрации. Таким образом, на этапе введения в культуру, наиболее благоприятными для гибрида тополь тополь × осина стали варианты 1,5 и 3 мкг/л оксида графена. В данных случаях отмечены 100%-я стерильность и 100%-я выживаемость проростков, при 80%-й стерильности и 86%-й выживаемости растений в контрольной группе. В этих же вариантах были максимальные показатели высоты побегов и количества листьев, кроме того, только в этих группах отмечено наличие корней. 3.2.2 Береза пушистая Количество стерильных, т.е. без признаков инфекций микроклонов составило 100% при концентрациях наноматериала выше 1,5 мкг/л, что на 25% выше контрольных показателей (рисунок 5). При 1,5 мкг/л стерильность составила 95%. Рисунок 5 – Показатели стерильности и выживаемости проростков березы пушистой при культивировании с оксидом графена Максимальная выживаемость отмечена в варианте 3 мкг/л – 100%, несколько меньший показатель – 95% отмечен в группе 1,5 мкг/л. Дальнейшее увеличение концентрации при положительном влиянии на стерильность культуры негативно сказалось на выживаемости. При 6 мкг/л выживаемость составила 80%, что только на 5% выше контрольных значений, а при 15 мкг/л показатель снизился на 11% по сравнению с контролем и составил 64%. Высота побегов и количество листьев на проростках достоверно увеличивалось почти в два раза при концентрации оксида графена 1,5 и 3 мкг/л (рисунок 6 а, б). Длина ростков увеличивалась на 1,8 и 1 см, а количество листьев в 2 и 1,5 раза, соответственно. а)б) Рисунок 6 – Высота проростков (а) и количество листьев (б) березы пушистой под действием оксида графена В то же время при 15 мкг/л оксида графена в питательной среде подавляло развитие проростков, длина побегов уменьшилась на 0,4 см. В остальных случаях показатели не отличались от контрольных. Стоит отметить, что в группе 1,5 мкг/л было зафиксировано наличие корней у проростков (таблица 2), тогда как в контрольной группе корней не наблюдалось. В той же группе зафиксировано отличное состояние проростков по пятибалльной шкале. Таблица 2. Биоморфологические показатели микроклонов березы пушистой ВариантЧисло дополнительныхНаличиеСостояние побегов, шт.корнеймикроклонов по 5–ти балльной шкале Контроль004 ОГ 0,75004 ОГ 1,50+5 ОГ 3,0005 ОГ 6,0003 ОГ 15,0002 Таким образом, в ходе исследования установлено положительное влияние оксида графена в концентрации 1,5 – 15 мкг/л на защищенность клонов от фитопатогенов на стадии введения в культуру, а также повышение выживаемости проростков при 1,5 – 6 мкг/л. Однако стимуляция дальнейшего роста отмечена только в вариантах 1,5 и 3 мкг/л, а при 15 мкг/л наблюдалось подавление развития проростков. Также в варианте 1,5 мкг/л отмечено наличие корней и лучшее состояние побегов по пятибалльной шкале. 3.3 Влияние оксида графена на микропроростки на этапе мультипликации. 3.3.1 Гибрид тополь белый × осина В ходе исследования влияния оксида графена на этапе мультипликации установлено, что внесение наночастиц способствовало увеличению выживших микроклонов до 100% (рисунок 7а) при 80% в контрольном варианте и в варианте с фитогормонами без наноматериала. а)б) Рисунок 7 – Выживаемость (а) и высота проростков (б) регенерантов гибрида тополь белый × осина под действием оксида графена После культивирования в течение 1 месяца на питательных средах, содержащих гормональные компоненты 0,2 мг/л БАП+0,1 мг/л ИУК+0,3 мг/л ГК у микроклонов гибрида тополя белого и осины, наблюдалось снижение высоты побегов (рисунок 7б), однако было отмечено увеличение количества образуемых дополнительных побегов до 4 шт. в среде содержащей гормоны и оксид графена. Максимальная высота побегов была в группе культивируемой в среде с добавлением наночастиц без гормонов – 3,9 см, против 3,5 в контроле. Кроме того, только в варианте среды с наночастицами оксида графена отмечено наличие корней, в этом же случае наблюдалось максимальное число листьев – 5 (таблица 3). Таблица 3. Биоморфологические показатели микроклонов гибрида тополя белого и осины на этапе мультипликации ВариантЧислоЧислоНаличиеСостояние листьев, дополнительныхкорней микроклонов шт.побегов, шт.по 5–ти балльной шкале Контроль4±0,3005 0,2БАП+0,1ИУК+0,3ГК4±0,1305 ОГ1,55±0,11+5 ОГ1,5+0,2БАП+0,1ИУК+0,3ГК4±0,2405 Таким образом, можно сделать вывод, что на этапе мультипликации внесение оксида графена увеличивало выживаемость растений, а также стимулировало прирост побегов, листьев и образование корней, однако существенно снижало появление дополнительных побегов. Проведенный гистологический анализ (рисунок 8а, б) показал увеличение раскрытия устьичной щели (рисунок 9а) на фоне уменьшения плотности устьиц на 1 мм2 (рисунок 9б) при внесении в культуральную среду оксида графена, что может проявиться в высокой жароустойчивости данных растений. а)б) Рисунок 8 – Устьица микроклона гибрида тополя белого × осины контрольной группы (а) и на питательной среде с оксидом графена (б) а)б) Рисунок 9 – Гистоморфологические параметры (а) и плотность (б) устьиц гибрида тополя белого × осины а)б) Рисунок 10 – Эффективность фотосинтеза (а) и активность каталазы (б) гибрида тополя белого × осины Биохимический анализ проростков показал небольшое увеличение активности фотосинтеза под действием оксида графена (рисунок 10а, б) в отсутствие различий в действии других факторов, при более низкой (относительно контроля) дисперсии показателя в пределах одного растения (0,016 против 0,003 отн. ед.), что указывает не только на более высокий потенциал устойчивости данных растений, но и на стабильность их состояния. Активность каталазы, наоборот, несколько снижалась в опытном варианте – 3, 845 мг Н2О2/мин против 4,565 в контрольном варианте. Снижение активности каталазы может быть вызвано как повреждением структуры фермента, так и нарушением пути биосинтеза каталазы. Поступающие в клетки растений токсиканты могут связываться с –SH, –NH2, – COOH группами аминокислот, входящих в состав фермента, что может привести к подавлению ферментативной активности (Петухов, 2019). Таким образом, культивирование микропроростков на питательных средах, содержащих гормоны, показало некоторое снижение высоты побегов, однако было отмечено увеличение количества образуемых дополнительных побегов до 4 шт. в среде, содержащей гормоны и оксид графена. Максимальная высота побегов была в группе культивируемой в среде с добавлением наночастиц без гормонов – 3,8 см, против 3,5 в контроле. Внесение наночастиц также способствовало увеличению выживших микроклонов до 100%. Кроме того, только в варианте среды с наночастицами оксида графена отмечено наличие корней, в этом же случае наблюдалось максимальное число листьев – 5. Гистологический анализ показал увеличение раскрытия устьичной щели на фоне высокой плотности устьиц на 1 мм2 при внесении в культуральную среду оксида графена, что может проявиться в высокой жароустойчивости данных растений. В то же время биохимический анализ проростков показал, что при существенной активации фотосинтетических процессов наблюдалось небольшое снижение активности каталазы, что может быть свидетельством подавления активности фермента наноматериалом. 3.3.2 Береза пушистая При культивировании регенерантов березы пушистой на этапе мультипликации установлено, так же как и в случае с гибридом тополь × осина, внесение оксида графена в культивационную среду повышало жизнеспособность проростков. В вариантах с оксидом графена показатель составил 100%, в то время как в контроле показатель составил 80%, в группе только с фитогормонами 78% (рисунок 11а). а)б) Рисунок 11 – Жизнеспособность (а) и высота (б) микропрорстков березы пушистой Анализ высоты проростков показал, что максимальная высота микроклонов была в группе оксида графена – 3,8 см, против 2,3 в контроле (рисунок 11б). В варианте с фитогормонами без наноматериала наблюдался минимальный показатель – 1,5 см, т.е. внесение гормонов ингибировало прирост побегов. В то же время, в группах, получавших гормоны, на фоне снижения длины проростов наблюдалось появление дополнительных побегов, когда как в контроле и в варианте с оксидом графена было только по одному ростку (таблица 4). Число листьев – 4 наблюдалось во всех вариантах, кроме контроля, где отмечено только 3 листа. На данном этапе также зафиксировано появление корней при 1,5 мкг/л оксида графена в среде без гормонов. Отличное состояние проростков наблюдалось в группе с фитогормонами и с оксидом графена по отдельности. В контрольной группе и группе 1,5 мкг/л оксида графена + 0,2БАП+0,1ИУК+0,3ГК состояние оценивалось как хорошее (4 балла). Таблица 4. Биоморфологические показатели регенерантов на этапе мультипликации ВариантЧислоЧислоНаличиеСостояние листьев, дополнительныхкорнеймикроклонов по шт.побегов, шт.5–ти балльной шкале Контроль3004 0,2БАП+0,1ИУК+0.3ГК4305 ОГ 1,5 мкг/л40+5 ОГ 1,5 мкг/л +4304 0,2БАП+0.1ИУК+0,3ГК Результаты гистологического исследования листовой пластины (рисунок 12а, б) регенерантов березы показал значительное увеличение площади устьичной щели и степени ее раскрытия на фоне уменьшения площади и плотности устьиц в группе GO (рисунок 13а, б). а)б) Рисунок 12 - Устьица листа микроклона березы пушистой контрольной (а) и экспериментальной (б) группы а)б) Рисунок 13 – Гистоморфологические параметры (а) и плотность (б) устьиц березы пушистой С учетом данных, полученных в ходе анализа морфологических параметров проростков, можно предположить включение компенсаторных механизмов – при снижении числа устьиц на единицу площади, за счет увеличения их раскрытия происходит повышение эффективности процесса транспирации. В ходе анализа биохимических параметров показано увеличение активности фотосинтеза почти в 2 раза (рисунок 14а), что согласуется с результатами морфометрических исследований – именно в этой группе наблюдался максимальный прирост биомассы. а)б) Рисунок 14 – Эффективность фотосинтеза (а) и активность каталазы (б) в проростках березы пушистой Как видно из рисунка 14б, активность фермента каталазы также повышалась почти в 1,5 раза в варианте с оксидом графена. Сопоставляя данные биохимического и морфометрического анализа, можно предположить, что внесение оксида графена в культивационную среду благоприятно сказывается на развитии растений. В ходе оценки влияния оксида графена на проростки березы на этапе мультипликации показано, что наноматериал в составе культивационной среды повышает выживаемость проростков на 20%, стимулирует рост регенерантов. В то же время наличие корней было отмечено только у растений, выращенных в среде с оксидом графена без гормонов, а наличие дополнительных побегов только в вариантах с фитогормонами. Данные по выживаемости регенерантов и морфометрического анализа коррелируют с результатами биохимических исследований – в группе оксида графена активность фотосинтеза и фермента каталазы были в 2 и 1.5 раза выше, чем в контроле. Как известно, при снижении активности фотосинтеза наблюдается изменение морфометрических параметров, в частности уменьшение размеров листовой пластины. Фермент каталаза наиболее активен в молодых жизнеспособных тканях и органах растений, при снижении жизнеспособности активность фермента закономерно снижается (Карасев, 2015; Sharma, 2014). Результаты гистологического анализа указывают на снижение числа устьиц в варианте с оксидом графена и, связанное с этим, компенсаторное повышение функциональной активности имеющихся устьиц. Таким образом, оксид графена на стадии оказал разнонаправленное действие на проростки березы пушистой на этапе мультипликации. 3.4 Влияние оксида графена на микропроростки на этапе укоренения На этапе укоренения оксид графена подавлял корнеобразование на 27% у регенерантов гибрида тополь белый × осина (рисунок 15а). В ходе работ по укоренению микропроростков березы пушистой установлено, что оксид графена оказал положительное действие на ризогенез (рисунок 15б): к концу эксперимента наличие корней было отмечено у 37% растений в контрольной группе, а в случае с оксидом графена корни имелись у 47% проростков. Таким образом, на данном этапе в формировании ответных реакций растений ключевую роль играют их видовые особенности. а)б) Рисунок 15 – Динамика корнеобразования микроклонов гибрида тополя белого х осина (а) и береза пушистая (б). Результаты, показывающие как подавление, так и стимуляцию графенопобными материалами развития корней представлены в ряде работ (Liu, 2015; Hao, 2018; Yang, 2007 Cheng, 2016; Sunho, 2020; Liu, 2015). Показано, что графен проникает в оболочку семян томата, что может способствовать лучшему поглощению воды и приводить к более быстрому прорастанию (Zhang, 2015). Также было выдвинуто предположение, согласно которому кислородсодержащие функциональные группы оксида графена собирают воду, а гидрофобные домены sp2 доставляют ее к проросткам, что ускоряет вегетацию (He, 2018). Графеноподобные материалы могут способствовать поглощению воды и питательных веществ за счет увеличения эффективных площадей поверхности эпидермальных (ризодермальных) клеток корня, прикрепляясь к их поверхности и увеличивая область поглощения ионов на поверхности корня (Xu et al., 2020). 3.5 Влияние оксида графена на проростки древесных культур на этапе адаптации 3.5.1 Гибрид тополь белый × осина Анализ выживаемости растений регенерантов гибрида тополь белый × осина на этапе адаптации показал значительное снижение жизнеспособности побегов (-17%) при обработке их раствором оксида графена в концентрации 3 мкг/л (рисунок 16а). Более низкая доза наноматериала (1,5 мкг/л) не оказала влияния на регенеранты. Максимальный показатель выживаемости отмечен в варианте с эталонным стимулятором роста, прибавка составила 10%. а)б) Рисунок 16 – Влияние оксида графена на выживаемость регенерантов гибрида тополь белый × осина Предполагается, что токсическое действие графена на растения связано с вызываемым им окислительным стрессом (Sasidharan, 2011; Anjum, 2014; Lee, Kim, 2014). Избыточное производство H2O2 может вызвать существенное торможение роста растений и уменьшение биомассы (Ocsoy, 2014). В ходе оценки влияния растворов оксида графена на адаптацию микропроростков установлено небольшое стимулирующее действие оксида графена в концентрации 1,5 мкг/л на прирост стебля (рисунок 16б), в данном случае высота растений увеличивалась в среднем на 0,4 см относительно контроля, схожие показатели отмечены в варианте с Эпином. Увеличение концентрации наноматериала подавляло рост побегов на 25 %. Максимальное количество зеленых листьев (10 шт.) наблюдалось в группе, культивируемой с применением стимулятора роста, в этом же варианте отмечена минимальная доля увядших листьев по отношению к общему числу (рисунок 17а). В случае с низкой концентрацией оксида графена количество зеленых листьев достоверно не отличалось от контрольных значений, однако число увядших листьев было в 2 раза больше, чем в контрольной группе – 4 против 2. При концентрации 3 мкг/л оксида графена из 7-ми развившихся листьев в среднем увядали 3, что говорит об ингибирующем действии наноматериала. а)б) Рисунок 17 – Состояние вегетативных органов регенерантов (а) и число адаптированных растений гибрида тополь белый × осина На этапе адаптации все анализируемые показатели снижались при максимальной концентрации оксида графена. Так и количество адаптированных растений в данной группе было на 35% меньше, чем в контрольном варианте (рисунок 17б). Графен в дозе 1,5 мкг/л не оказал влияния на адаптируемость регенерантов. Лучшие показатели вновь наблюдались в группе со стимулятором роста – 60%, против 50% в контроле. Не отмечено появления дополнительных побегов ни в одном из вариантов. Худшее состояние побегов было при максимальной концентрации оксида графена – 3 балла (таблица 5). Таблица 5. Показатели эффективности адаптации микроклонов культур гибрида тополь белый × осина ВариантЧисло дополнительных побегов, шт Состояние микроклонов по 5–ти балльной шкале Контроль04 Эпин05 ОГ 1,5 мкг/л04 ОГ 3 мкг/л03 Таким образом, раствор оксида графена в концентрации 1,5 мкг/л в целом не оказал существенного влияния на растения, в то время как при обработке раствором 3 мкг/л оксида графена отмечено негативное влияние на все анализируемые показатели. 3.5.2 Береза пушистая Оксид графена в концентрации 1,5 мкг/л не оказал достоверного влияния на выживаемость растений, однако при повышении концентрации до 3 мкг/л показатель уменьшался до 10% относительно контроля (рисунок 18а). Максимальный показатель выживаемости наблюдался при обработке растений стимулятором роста (+5%). а)б) Рисунок 18 – Выживаемость (а) и высота (б) регенерантов березы пушистой Максимальная высота растений наблюдалась в группе обработанной Эпином – 4,4 см, против 4 см в контроле. При 1,5 мкг/л оксида графена значения высоты побегов были на уровне контрольных, а при 3 мкг/л показатель уменьшился на 25% и составил в среднем 3 см (рисунок 18б). Внесение оксида графена в концентрации 1,5 мкг/л благоприятно сказалось на развитии листьев. В этом варианте увеличилось среднее количество зеленых листьев на одном растении (+1), а также уменьшилось число увядших листьев – 3 шт. по сравнению с 4-мя в контроле (рисунок 19а). Худшие показатели зафиксированы в варианте 3 мкг/л оксида графена – на 4 зеленых листа, 4 увядших. а)б) Рисунок 19 – Состояние вегетативных органов (а) и эффективность адаптации (б) регенерантов березы пушистой Установлено положительное влияние оксида графена в дозе 1,5 мкг/л на адаптированность растений (рисунок 19б) – 60% (на уровне регулятора роста) при 52% в контроле. 3 мкг/л наноматериала снизили число адаптированных растений на 35%. Как и в случае с гибридом, наилучшее состояние растений было в группе, культивируемой с применением стимулятора, худшее состояние отмечено в варианте 3 мкг/л. Таким образом, увеличение концентрации наноматериала в растворе до 3 мкг/л вызывало негативное влияние на проростки анализируемых культур. Количество выживших микроклонов гибрида тополь белый × осина снизилось на 17%, березы пушистой на 10% относительно контроля, высота растений уменьшилась на 25%. Также наблюдалось уменьшение числа зеленых листьев и адаптированных микроклонов – в случае с тополем адаптировалось 15% растений в группе 3 мкг/л против 55 в контроле, в случае с березой 17 против 52%. Кроме того, общее состояние проростков данной группы оценивалось только на 3 балла (таблица 6). Таблица 6. Биоморфологические показатели микроклонов березы пушистой на этапе адаптации ВариантЧисло дополнительныхСостояние микроклонов побегов, штпо 5–ти бальной шкале Контроль04 Эпин05 ОГ 3,0 мкг/л04 ОГ 4,5 мкг/л03 Среди предполагаемых механизмов токсического действия графеноподобных материалов на растения, помимо указанного выше окислительного стресса, рассматривается возможность ингибирования синтеза сахаров и аминокислот, а также повышенная проницаемость клеток для других токсикантов (Hu, 2015). Помимо этого, описывается потеря электролитов корнями пшеницы под воздействием оксида графена в высоких дозировках (Chen, 2018), а также увеличение числа хромосомных аберраций и митотических аномалий в корневой меристеме (Vochita, 2019), что также может быть причиной фитотоксичности. 3.6 Анализ накопления оксида графена в древесных культурах Электронно-микроскопический анализ накопления оксида графена в корнях и стеблях растений осуществляли на этапе адаптации в группах 3 мкг/л наноматериала. Исследование показало отсутствие биоаккумуляции оксида графена в проростках обеих культур. При этом в литературе описывается проникновение этого материала в другие растения, например, в проростки гороха, через корневую систему (Chen, 2019; Park, 2019). Вероятно, отмеченные различия связаны с разным размером чешуек использованного наноматериала или с видовыми особенностями растений. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, по результатам диссертационного исследования можно сформулировать следующие выводы. 1.Исследуемый образец оксида графена имеет характерную пластинчатую морфологию с размером отдельных чешуек от 0,1 до 3 мкм и толщиной менее 1 нм. Значение дзета–потенциала в исходной суспензии составляло –54,7 мВ, что говорит о высокой стабильности коллоидной системы и её устойчивости к агрегации и седиментации. Дзета–потенциал экспериментальных образцов сред, содержащих оксид графена, также принимал достаточно высокие значения (–30 –35 мВ) независимо от времени хранения сред и концентрации наночастиц в коллоидной системе. Картирование основных элементов в образцах сред, содержащих наночастицы оксида графена в максимальной концентрации (15 мкг/л), показали отсутствие выраженных очагов скопления углерода в свежеприготовленных и выдержанных 3 месяца образцах сред, что говорит о равномерном распределении наноматериала в матрице среды. 2.На этапе введения в культуру наиболее благоприятными для гибрида тополь белый × осина, а также березы пушистой стали варианты 1,5 и 3 мкг/л оксида графена в составе культивационной среды. В данных группах отмечено 20%-е повышение стерильности и 14%–ный прирост выживаемости проростков гибрида тополь белый × осина. В случае березы показатели стерильности и выживаемости проростков возрастали на 20 – 25%. В этих же вариантах были максимальные показатели высоты побегов (+10 и 17%) и количества листьев (в 2,5 и 1,5 раза), кроме того, только в этих группах отмечено наличие корней. В то же время при воздействии 15 мкг/л при 100%-ой стерильности наблюдалось подавление развития проростков обеих пород, что свидетельствует о токсическом действии наноматериала и позволяет говорить о данной концентрации как о пороговой. При этом концентрация 0,75 мкг/л являлась недействующей, т.к. показатели растений практически не отличались от контроля. 3.На этапе мультипликации при культивировании микропроростков гибрида тополь белый × осина внесение 1,5 мкг/л оксида графена в питательную среду способствовало повышению выживаемости до 100 % (при 80% в контроле), независимо от содержания фитогормонов. В среде с оксидом графена без фитогормонов отмечена максимальная высота растений, наибольшее количество листьев и наличие корней. На среде, содержащей наноматериал и фитогормоны, было отмечено увеличение количества образуемых дополнительных побегов до 4 шт. (контроль – 0). Гистологический анализ показал увеличение раскрытия устьичной щели на фоне уменьшения плотности устьиц на 1 мм2 при внесении в культуральную среду оксида графена, что может проявиться в высокой жароустойчивости данных растений. В то же время биохимический анализ проростков показал, что при существенной активации фотосинтетических процессов наблюдалось некоторое снижение активности каталазы, что может быть свидетельством подавления активности фермента наноматериалом. 4.Наноматериал в составе культивационной среды на этапе мультипликации повышал выживаемость проростков березы на 20%, стимулировал рост регенерантов, а также в среде без гормонов активировал ризогенез. Гистологическое исследование показало значительное увеличение площади устьичной щели и степени ее раскрытия на фоне уменьшения площади и плотности устьиц в группе с оксидом графена. Также оксид графена в составе культивационной среды повышал активность фотосинтеза и фермента каталазы были в 2 и 1,5 раза соответственно. 5.На этапе укоренения оксид графена подавлял корнеобразование на 27% у регенерантов гибрида тополь белый × осина. В ходе работ по укоренению микропроростков березы пушистой установлено, что оксид графена оказал положительное действие на ризогенез: к концу эксперимента наличие корней было отмечено у 37% растений в контрольной группе, а в случае с оксидом графена корни имелись у 47% проростков. Таким образом, на данном этапе в формировании ответных реакций растений ключевую роль играют их видовые особенности. 6.На этапе адаптации к нестерильным условиям усиливалась тенденция снижения стимулирующей эффективности оксида графена при росте токсических проявлений. Суспензия наноматериала в концентрации 3 мкг/л снижала выживаемость растений гибрида тополь белый × осина на 17% и высоту побегов на 25%. Также при 3 мкг/л наноматериала уменьшалось количество зеленых листьев на растениях в два раза относительно контроля, а число увядших листьев, наоборот, увеличивалось. Количество адаптированных клонов снизилось на 35%. Оксид графена в концентрации 1,5 мкг в целом не оказал влияния на побеги гибрида тополь белый × осина за исключением небольшого прироста стебля и увеличения числа увядших листьев. 7.В случае с березой пушистой исследуемый наноматериал в концентрации 3 мкг/л снижал выживаемость на 10%, подавлял развитие проростков – высота растений была ниже на 25%, количество зеленых листьев на одно растение уменьшилось на 20%, а число адаптированных растений снизилось на 35%. В то же время доза оксида графена 1,5 мкг/л благоприятно сказалась на развитии листьев – увеличилось среднее число зеленых листьев на растении (+1) и уменьшилось число увядших (-1). Число адаптированных растений в данной группе повысилось на 8%. 8.Бионакопления оксида графена в экспериментальных растениях не обнаружено, что, вероятно, связано с достаточно крупным размером его чешуек, затрудняющих проникновение в организм растения через корневую систему. 9.Таким образом, наиболее эффективным для стимуляции микропроростков гибрида тополь белый × осина и березы пушистой является использование оксида графена в концентрации 1,5–3 мкг/л в составе культивационных сред на стадиях введения в культуру и мультипликации. Использование наноматериала в более высоких концентрациях и на более поздних стадиях приводит к развитию токсических эффектов, проявление которых видоспецифично. Концентрация 0,75 мкг/л не оказывала воздействия на растения.