Экспериментальная терапия ишемии конечностей с помощью трансплантации пластов из мезенхимных стромальных клеток, гиперпродуцирующих гепатоцитарный фактор роста

Иммуноферментный анализ (ИФА). Анализ содержания HGF в среде проводили с помощью наборов Quantikine ELISA Kits (R&D Systems, США) согласно инструкции производителя.
Иммуноблоттинг. Белки лизатов клеток разделяли электрофоретически в ПААГ в денатурирующих условиях по Лэммли и переносили на поливинилиден- дифторидную мембрану. Белки на мембранах выявляли с помощью коммерческих антител в соответствии с протоколами производителей. Детекцию осуществляли с помощью субстрата Clarity ECL (Bio-Rad, США). Полученные данные анализировали с использованием гель-документирующей системы Fusion X (Vilber Lourmat, Франция) и программного пакета GelAnalyzer2010a.
Культура эукариотических клеток. МСК жировой ткани мыши, клетки линий НЕК 293T и Neuro2A культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС; HyClone, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco, США). Для МСК человека вместо DMEM использовали AdvanceSTEMTM (HyClone, США), а для HUVEC (АТСС, CША) среду EGM-2 (Lonza, США). Клетки культивировали в стандартных условиях при 37°С и 5% CO2.
Выделение МСК мыши проводили в соответствии с ранее отработанной и описанной методикой (Zubkova и др., 2016). Измельченные фрагменты подкожной ЖТ инкубировали в среде с 200 ед/мл коллагеназы I (Worthington, США) и 25 ед/мл диспазы (Worthington, США) (1 ч, 37°C, помешивание). Далее центрифугировали 10 мин при 200g, супернатант удаляли. Осадок ресуспендировали в DMEM/10 % ФБС и пропускали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм (BD Falcon, США) для удаления клеточного дебриса. Фильтрат центрифугировали, клеточный осадок высаживали в среде культивирования на культуральные чашки. Для трансплантации или получения клеточных пластов использовали клетки 2-3 пассажей.
МСК человека (здоровые мужчины, n=5) были получены из коллекции биоматериала человека Института регенеративной медицины МНОЦ МГУ им. М.В. Ломоносова (ID: MSU_MSC_AD, www.depository.msu.ru). Все манипуляции с образцами тканей пациентов проводили в соответствии с положениями Хельсинской декларации и были одобрены этическим комитетом МГУ им. М.В. Ломоносова (IRB00010587), protocol #4 (2018).
Получение вирусных частиц. Для получения вирусных частиц использовали генетические конструкции на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (ААВ) AAV Helper-Free System (Stratagene, США). Последовательности, содержащие ген HGF мыши (NM_001289458.1) или человека клонировали в pAAV-MCS (Stratagene, США) для получения векторов pAAV-mHGF и pAAV-hHGF. Плазмиды наращивали в клетках E. сoli штамма DH-5α и выделяли с помощью коммерческих наборов (Qiagen, США). Клетки HEK293T ко-трансфицировали с плазмидами для получения вирусов, кодирующих нужный ген. Для получения вируса, несущего ген GFP, трансфекцию осуществляли pAAV–DJ (Cell Biolabs Inc, США), pHelper и pAAV– hrGFP (Stratagene, США); для гена HGF человека – pAAV-RC, pHelper (обе Stratagene, США) и pAAV-hHGF; для гена HGF мыши pAAV-DJ (Cell Biolabs, США), pHelper и pAAV-mHGF. На третьи сутки после трансфекции суспензию клеток подвергали 4 циклам замораживания/оттаивания. МСК трансдуцировали полученным после центрифугирования супернатантом, содержащим вирусные частицы.
Приготовление кондиционированных сред. МСК или МСК-HGF переводили на DMEM/2% ФБС и культивировали в течение 48 часов. Для оценки нейротрофической активности среды культивирования кондиционированную среду собирали с клеток по достижении ими 70% конфлюэнтного монослоя. Собранную среду центрифугировали 5 мин при 400g, а затем 10 мин при 1000g. Супернатант собирали и хранили при -70оС.
Анализ распределения МСК по фазам клеточного цикла. Суспензию клеток фиксировали ледяным 70% этанолом. Затем клетки инкубировали в 2 N HCl/0,5% Тритоне Х-100, кислоту нейтрализовали 0,1 М боратным буфером (рН 8,5). Клетки окрашивали йодидом пропидия (50 мкг/мкл) и анализировали на цитометре BD FACS CantoTM II (BD Pharmingen, США). Для анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла использовали программное обеспечение FCS Express 4 (De Novo Software, Канада).
Изучение влияния трансдукции ААВ-HGF на дифференцировочный потенциал МСК. Для анализа остеогенной дифференцировки клеток использовали набор MesenCult Osteogenic Stimulatory Kit (Stemcell Technologies, Канада), для анализа адипогенной MesenCult Adipogenic Stimulatory Supplement (Stemcell Technologies, Канада). Остеогенный дифференцировочный потенциал клеток анализировали окрашиванием реагентом Alizarin Red (Chemicon, США) При этом подсчитывали относительную Alizarin Red+ площадь. Адипогенную дифференцировку оценивали с помощью красителя Oil Red (Millipore, США). Подсчитывали процент Oil Red+ клеток от общего числа клеток.
Модель ангиогенеза in vitro. Клетки HUVEC высаживали на декстрановые «шарики» Cytodex (Sigma-Aldrich, США) из расчета 400 клеток/шарик. Прикрепившиеся клетки окрашивали 5 мкМ флуоресцентным красителем CMFDA (Invitrogen, США) и ресуспендировали в растворе, содержащем 2 мг/мл фибриногена и 0,15 единиц/мл апротинина (Sigma-Aldrich, США) вместе с суспензией МСК или МСК-HGF человека (2-й день после трансдукции, 8×104 клеток/мл). В ряде случаев МСК и МСК-HGF визуализировали флуоресцентным красителем PKH26 (Sigma-Aldrich, США). Полученную суспензию вносили в лунки культурального планшета и добавляли 0, 16 единиц тромбина (Sigma-Aldrich, США). Через 3 суток гели фиксировали 4% формалином. Длину и количество «сосудистых отростков» измеряли с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, США).
Эксплантная культура дорсальных ганглиев. Экспланты спинальных ганглиев неонатальных мышей культивировали на чашках, предварительно обработанных раствором поли-Д-лизина (0,1 мг/мл; Sigma-Aldrich, США). При оценке нейротрофических свойств модифицированных клеток ганглии культивировали в среде, собранной с МСК (концентрация HGF около 1 нг/мл) или МСК-HGF (концентрация HGF 135 нг/мл) при 37оС и 5% СО2 на протяжении 48 ч. Образцы ганглиев иммуннофлуоресцентно окрашивали против маркеров аксонов NF200 и против маркера глиальных клеток S100. Количество нейритов определяли по методу Zhang, Li, (2013). При подсчете количества глиальных клеток учитывалось общее число S100+ клеток, приходящихся на каждый эксплант.
Получение клеточных пластов. Для формирования пластов суспензию МСК или МСК-HGF высаживали на 12 луночный планшет (площадь лунки = 3,8 см2) из расчета 1х106 клеток/лунка. Клетки культивировали в среде DMEM/10% ФБС объемом 3 мл при 37°С и 5% CO2 в течение 48 часов, среду не меняли. Бесферментативное снятие пластов осуществляли в соответствии с разработанной ранее в лаборатории методикой с использованием раствора Версена (0,02% ЭДТА в PBS) (ПанЭко, Россия) и легкого потряхивания планшета (Макаревич и др., 2015). В сравнительном исследовании показано что по своим характеристикам клеточные пласты из МСК, полученные разработанным методом, не отличаются от пластав из МСК, полученных на культуральных чашках, покрытых термочувствительным полимером. Для детекции на трансплантированных пластов на гистологическом препарате мышцы клеточные пласты инкубировали с красителем CMFDA (Invitrogen, США) в течение часа перед снятием с чашки для последующей трансплантации.
Экспериментальные животные. Эксперименты выполнены на самцах мышей линии C57/Bl6 возрастом 9–10 недель. Для модели эксплантов ганглиев брали неонатальных мышей той же линии возрастом 2 дня. Наркоз осуществляли введением 300 мкл 2,5% раствора авертина интраперитонеально. Все манипуляции с животными, разработанные в соответствии с национальными и европейскими директивами, были одобрены комитетом по этике Института
экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава РФ (протокол #385.06.2009)
Моделирование ишемии задней конечности. Ишемию задней конечности вызывали у анестезированных мышей путем резекции бедренной артерии, которую иссекали целиком от начала бифуркации брюшной аорты до разделения на а. poplitae и а. saphenous (Couffinhal et al., 1998). Прооперированных животных разделяли на экспериментальные группы (n=8-9). Животным из групп (1) «МСК пласт» и (2) «МСК-HGF пласт» трансплантировали на область иссечения бедренной артерии клеточные пласты из немодифицированных и модифицированных клеток соответственно. Группам (3) «МСК» и (4) «МСК-HGF» внутримышечно вводили то же количество клеток в виде суспензии, равномерно распределяя между мышцами m. tibialis anterior, m. biceps femoris и m. quadriceps femoris. После моделирования ишемии животным группы (5) «контроль» лечение не проводили. Часть животных выводили из эксперимента на 14 день и извлекали m. tibialis anterior ишемизированной конечности для гистологического анализа.
Оценка восстановления кровотока и васкуляризации ишемизированной конечности. Для оценки кровотока в ишемизированной конечности применяли лазерный допплеровский сканер LDI2 (Moor, Великобритания). Измерения проводили на наркотизированных животных сразу после операции, на 7, 14 и 21 сутки. С помощью программы Moor Image Review рассчитывали относительные показатели состояния кровотока в ишемизированной конечности по отношению к интактной. В обработку включали средние значения нескольких последовательных измерений при условии, что разница между ними не превышала 10%. Для оценки васкуляризации и восстановления иннервации в ишемизированной конечности проводили иммунофлуоресцентный анализ срезов m. tibialis anterior, которые окрашивали антителами к маркерам сосудов (CD31 и α-SMA) и аксонов – NF200. Для каждого среза осуществляли количественный анализ CD31+ и α-SMA+ структур, а также оценивали относительную NF200+ площадь. Для оценки площади некротизированной ткани криосрезы мышц окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Далее с помощью программы ImageJ вычисляли площадь некроза, которую выражали как процент площади среза мышцы.
Подготовка препаратов тканей. Образцы мышц после извлечения замораживали в жидком азоте в среде TissueTek (Sakura Finetek, Нидерланды) и хранили при -70С. Гистологический анализ проводили на криосрезах толщиной 7-10 мкм.
Иммунофлуоресцентное окрашивание. Фиксацию и окрашивание препаратов проводили по стандартному протоколу с использованием специфических антител (a/т) к соответствующим антигенам. В качестве первичных a/т использовали: для срезов мышц – кроличьи а/т vs. NF200 (Sigma- Aldrich, США), крысиные а/т vs. CD31 (BD Pharmingen, США), кроличьи а/т vs. α-SMA (Abcam, США); для эксплантов ганглиев – кроличьи a/т vs. S100B
(Abcam, США) и NF200. В качестве вторичных a/т использовали Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific, США). Ядра клеток окрашивали DAPI.
Микроскопия. Просмотр и оцифровку препаратов осуществляли с помощью микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss, Германия).
Статистический анализ. Данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего или стандартного отклонения. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы “Statistica 8.0” (StatSoft). Для сравнения средних величин и определения достоверности различий между группами использовали t–критерий Стьюдента или непараметрический коэффициент Манна-Уитни. Для множественных сравнений использовали ANOVA с поправкой Бонферрони. Различия считались достоверными при уровне значимости р <0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние генетической модификации МСК на динамику продукции HGF, пролиферативные свойства и способность МСК к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях МСК получали из жировой ткани мыши и модифицировали с помощью ААВ вектора, несущего ген HGF мыши. Для оценки эффективности трансдукции выбранным вектором МСК ЖТ использовали МСК, модифицированные ААВ- GFP. Высокая доля МСК, экспрессирующих GFP (90%±3; n=3; данные FACS анализа) свидетельствует об эффективности используемой системы трансдукции клеток (Рис. 1A). С помощью ИФА наблюдали значительное увеличение продукции HGF модифицированными клетками (Рис. 1Б). Максимум секреции HGF приходился на 11 день после модификации (23,6 нг/103 клеток/48 ч), это значение более чем в 100 раз превышало показатель для немодифицированных клеток (0,15 нг/103 клеток/48 ч). После 13 дня наблюдалось прогрессирующе снижение продукции HGF, однако на 31 день она превышала продукцию в немодифицированных клетках почти в 20 раз (3 нг/103 клеток/48 ч). С помощью анализа клеточного цикла было продемонстрировано, что МСК после модификации ААВ-HGF продолжают пролиферировать, однако число делящихся клеток после трансдукции уменьшается на 13% (Рис. 1B). При индукции адипогенной дифференцировки подсчет процентного отношения Oil Red+ клеток к общему числу клеток не выявил значимых различий между группами «МСК» (51,8±5%) и «МСК-HGF» (53,2± 8%), (n=3). Также при индукции остеогенной дифференцировки подсчет доли минерализованного матрикса, окрашиваемого красителем Alizarin Red, не выявил значимых различий между МСК и МСК-HGF (32,6±11% и 30,5±6% соответственно, n=3). Таким образом, генетическая модификация сопровождалась небольшим снижением пролиферативной активности клеток, но не повлияла на способность МСК к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях. Рис. 1. Характеристика МСК-HGF. (А) — МСК-GFP на 5-й день после трансдукции. (Б) — Динамика продукции HGF модифицированными МСК. (В) — анализ клеточного цикла МСК и МСК-HGF. (Г) — Дифференцировка МСК и МСК-HGF в адипогенном и остеогенном направлениях. Масштабный отрезок = 100 мкм. n=3. 2. Влияние генетической модификации на ангиогенную активность МСК Для исследования ангиогенных свойств МСК-HGF использовали трехмерную модель ангиогенеза в фибриновом геле, отработанную в лаборатории ранее (Zubkova et al., 2016). Данную работу проводили с использованием МСК ЖТ человека, модифицированных вектором с геном HGF человека. Это было обусловлено тем, что для данного фрагмента работы не удалось получить чистую культуру ЭК мыши. Уровень секреции HGF модифицированными МСК человека достигал пика на 5-й день после трансдукции, при этом продукция HGF составляла 19 нг/103 клеток/48 ч, что превышало продукцию HGF немодифицированными МСК более чем в 100 раз (0,17 нг/103 клеток/48 ч). Поскольку уровень продукции HGF МСК-HGF человека и мыши оказались сходным, мы посчитали возможным оценить влияние генетической модификации на ангиогенные свойства клеток с использованием МСК человека. В ходе эксперимента суспензию МСК или МСК-HGF добавляли в фибриновый гель, в котором находились декстрановые шарики с иммобилизованными на них клетками HUVEC. Добавление МСК-HGF увеличивало в 2,5 раза и количество, и длину формирующихся сосудоподобных структур на 3-й день со-культивирования по сравнению с эффектом немодифицированных клеток (Рис. 2Б-Г). С помощью МСК и МСК-HGF, меченных витальным красителем, было выявлено, что часть клеток непосредственно участвует в формировании «сосудов», плотно примыкая к ЭК. (Рис. 2А). Полученные результаты указывают на значительное повышение способности МСК-HGF стимулировать ангиогенез в модели in vitro по сравнению с эффектом немодифицированных клеток. Рис. 2. Оценка ангиогенных свойств МСК и МСК-HGF in vitro. (А) — Участие МСК (PKH26, красный) в формировании сосудоподобных структур. (Б) — сосудоподобные структуры (CMFDA, зеленый) в фибриновом геле в присутствии МСК или МСК-HGF за 3-е суток. (B, Г) — Количество и длина «отростков». Средние значения ± стандартное отклонение, *p<0,05 (критерий Стьюдента), n=9. 3. Анализ нейротрофической активности продуктов секреции МСК-HGF Учитывая известные нейротрофические свойства HGF (Yamane et al., 2019), была проведена оценка способности продуктов секреции МСК-HGF стимулировать отрастание нейритов и миграцию глиальных клеток на 13 эксплантной модели спинальных ганглиев мыши. Ганглии неонатальных мышей культивировали в среде, собранной с МСК или МСК-HGF, в течение 48 ч. После чего оценивали отрастание нейритов и суммарное количество глиальных S100+ клеток, выползающих из ганглия. По результатам подсчета в группе «МСК- HGF» по сравнению с группой «МСК» длина нейритов была в 1,4 раз выше (Рис. 3A, В), а количество глиальных клеток в 1,6 раз выше (Рис. 3Б, Д). В группе «МСК-HGF» также наблюдалась тенденция к увеличению количества нейритов, но различия не достигли достоверной величины (Рис.3 Г). Рис 3. Оценка нейротрофических свойств продуктов секреции МСК и МСК-HGF in vitro. (А-Б) — Иммунофлуоресцентное окрашивание спинальных ганглиев после 48 ч культивирования в экспериментальных средах: (A) —визуализация отростков нейронов, (Б) — визуализация глиальных клеток. Масштабный отрезок=50 мкм. (В) Длина нейритов. (Г) Количество нейритов. (Д) количество S100+ клеток. Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, *p <0,0001 (критерий Стьюдента), n=9. Полученные результаты свидетельствуют об увеличении нейротрофических свойств продуктов секреции МСК после их модификации ААВ с геном HGF. 4. Получение клеточных пластов из МСК и их характеристика Для последующей трансплантации были получены клеточные пласты из модифицированных и немодифицированных МСК ЖТ. Для получения использовали метод, разработанный в лаборатории ангиогенеза ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ (Макаревич П.И. с соавт. 2015) (см. Материалы и методы). Учитывая значительное возрастание продукции HGF клетками между 5 и 8 днем после модификации (рис.1Б), для формирования пластов суспензию из МСК- HGF высаживали на 12 луночный планшет на 5 день после трансдукции и снимали для последующей трансплантации через 48 часов. Рис. 4. Иммунофлуоресцентный анализ срезов клеточных пластов. Иммунофлуоресцентный анализ клеточных пластов показал, что небольшая часть клеток в составе пластов пролиферирует, клетки формируют щелевые контакты через коннексин 43, не уходят в апоптоз и синтезируют белки внеклеточного матрикса (коллаген1 и 3 типов, фибронектин) (Рис 4). При сравнении по этим параметрам пластов из МСК и МСК-HGF достоверных различий не выявлено. 5. Исследование терапевтической эффективности трансплантации пластов из МСК-HGF на модели ишемии задней конечности мыши Полученные пласты из МСК и МСК-HGF трансплантировали мышам с моделированной ишемией задней конечности, как описано в разделе Материалы и Методы. Схема эксперимента представлена на рисунке 5. Терапевтические эффекты трансплантации пластов из МСК-HGF оценивали в сравнении с трансплантацией пластов из немодифицированных МСК, суспензии из немодифицированных и модифицированных МСК по динамике восстановления кровотока в конечности, количеству сосудов и нервных окончаний, а также размеру некроза в ишемизированной мышце. Предварительно в отдельном эксперименте с использованием клеток, меченных витальным красителем, оценивали длительность сохранения пласта в прооперированной конечности после трансплантации. Было установлено, что пласт визуализируется на ишемизированной мышце не менее 14 дней после трансплантации (Рис 6Б). Рис. 5. Схема эксперимента. 5.1. Влияние трансплантации пластов из МСК на восстановление кровотока в ишемизированной конечности. Оценка восстановления кровотока (перфузии конечности кровью) в динамике с помощью лазерного допплеровского сканирования показала, что на 7 сутки достоверно более высокая перфузия конечности по сравнению с контролем (спонтанное восстановление) наблюдалась только в группе «МСК- HGF пласт» (Рис. 6B). К 14 дню все экспериментальные группы (МСК суспензия, МСК-HGF суспензия, МСК пласт и МСК-HGF пласт) продемонстрировали показатели восстановления кровотока, превосходящие значения контрольной группы. Однако наиболее эффективное восстановление перфузии наблюдали в группе «МСК-HGF пласт». Рис. 6. Оценка эффективности трансплантации клеточных пластов. (А) — Клеточный пласт перед трансплантацией. (Б) — Пласт, меченный CMFDA (зеленый), на скелетной мышце на 14-й день после трансплантации. (В) — Кривые восстановления кровотока в ишемизированной задней конечности мыши. (Г) — Примеры допплерограмм ишемизированных задних конечностей в экспериментальных группах на 14-й и 21-й дни. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. *p <0,05 vs. «Контроль», #p <0,05 vs. МСК и МСК-HGF суспензия (U- критерий Манна — Уитни). К 21 дню перфузия конечности в группе «МСК-HGF пласт» достигала 67%, что было в 1,7 раз выше показателя для контрольной группы (*p=0,004), достоверно выше, чем для «МСК-HGF суспензия» (48%, #p=0,020) и чем (46%, #p=0,01) и в 1,3 раза превышала значение в группе «МСК пласт», но различия не достигли достоверности. Таким образом, трансплантации пластов из МСК-HGF наиболее эффективно восстанавливала кровоток в ишемизированной конечности мыши в сравнении с трансплантацией суспензии МСК и МСК-HGF и пластов из немодифицированных МСК. 5.2. Влияние трансплантации пластов из МСК-HGF на восстановление плотности сосудов и нервных окончаний и размер некроза в ишемизированных мышцах конечности мыши. На 14-й день после операций часть животных выводили из эксперимента и брали для гистологического анализа ишемизированную переднюю большеберцовую мышцу (m. tibialis anterior). Для исследования механизма восстановления кровотока в ишемизированной конечности был проведен анализ плотности сосудов, визуализированных иммунофлуоресцентным окрашиванием против маркеров эндотелиальных (СD31) и гладкомышечных клеток (α-SMA) с последующим подсчетом количества капилляров (CD31+ сосудов без просвета) и артериол (CD31+, α-SMA+ сосудов с просветом). Наибольшая плотность капилляров отмечалась в группе с трансплантацией пластов из МСК-HGF. Ее значение в 1,5 раза превосходило значение в контрольной группе. Между контролем и группами «МСК», «МСК пласт» и «МСК-HGF» наблюдаемая тенденция увеличения плотности капилляров не достигла статистической значимости (Рис.7 А, Б). Рис. 7. Оценка плотности сосудов в ишемизированной скелетной мышце. (А) — Срезы m. tibialis anterior, иммунофлуоресцентно окрашенные против CD31 (зеленый) и α-SMA (красный). Ядра клеток окрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок = 50 мкм. (Б) — Количество капилляров. (В) — Количество артерий в поле зрения. Среднее ± стандартная ошибка среднего. U-критерий Манна — Уитни, n = 4 -5 для каждой группы. Трансплантация пластов из МСК-HGF была также наиболее эффективна с точки зрения стимуляции артериогенеза, однако в данном случае значимое увеличение плотности CD31+, α-SMA+ сосудов наблюдали также и у животных, которым вводили МСК-HGF в виде суспензии и трансплантировали МСК в виде пластов (Рис.7 А, B). С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания срезов мышцы против маркера растущих аксонов NF200 анализировали количество нервных волокон, как один из показателей восстановления нарушенной ишемическим повреждением иннервации. В группах животных, которым трансплантировали МСК-HGF в виде пластов или суспензии, плотность нервных окончаний была достоверно увеличена по сравнению с контролем. Так, площадь NF200+ структур составляла 0,54% для «МСК-HGF», что было достоверно выше значений для контрольной группы (0,36%, p <0,05). Максимальную площадь, занимаемую нервными волокнами, зафиксировали в группе «МСК-HGF пласт» - 0,71%. Это значение достоверно превышало показатели остальных групп (Рис 8 А, Б). Рис. 8. Влияние трансплантации пластов из МСК на плотность нервных окончаний в ишемизированной скелетной мышце. (А) —Срезы m. tibialis anterior, иммунофлуоресцентно окрашенные против CD31 (красный) и NF200 (зеленый). Ядра клеток окрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок = 50 мкм. (Б) — Относительная площадь, занимаемая нервными окончаниями. Среднее ± стандартная ошибка среднего. U-критерий Манна — Уитни, n = 4 - 5 для каждой группы. Уменьшение некроза в мышце является важным показателем тканепротективного эффекта разрабатываемого метода. Площадь некротизированной ткани, оцененная окрашиванием срезов мышц гематоксилином-эозином, снижалась во всех экспериментальных группах по сравнению с контрольной. Наиболее эффективное воздействие наблюдали в группе «МСК-HGF пласт», где площадь некроза снижалась в два раза по сравнению с контролем. Уменьшение площади некроза в остальных группах варьировало от 20 до 25 % в сравнении с контролем, но не достигало достоверности (Рис. 9). Таким образом, трансплантация пластов из МСК-HGF наиболее эффективно стимулируют восстановление кровотока в ишемизированной конечности мыши, оказывает наиболее выраженный васкулогенный и нейротрофический эффекты, и уменьшает степень ишемического повреждения мышц конечности по сравнению с трансплантацией суспензии МСК или пластов из немодифицированных клеток. Рис 9. Сравнительный анализ размера некроза в ишемизированной мышце. (А) — Срезы m. tibialis anterior, окрашенные гематоксилином-эозином. Линией обозначены границы зоны некроза. (Б) — Относительная площадь некроза; Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. *p=0,025 vs. «Контроль». (U-критерий Манна — Уитни), n = 4 - 5 для каждой группы. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данном исследовании впервые были получены модифицированные МСК ЖТ, гиперпродуцирующие HGF. Клетки трансдуцировали одной из последних модификаций наиболее перспективного с клинической точки зрения вирусного вектора – ААВ DJ. Эффективность трансдукции достигла 90%, при этом гиперпродукция HGF сохранялась в течение месяца наблюдения. Генетическая модификация не влияла на способность клеток к адипогенной и остеогенной дифференцировке, однако незначительно снижала пролиферативную активность клеток. Полученные МСК-HGF проявляли более выраженные ангиогенные и нейротрофические свойства на моделях in vitro, что вероятно в первую очередь было обусловлено высоким содержанием HGF в секретоме клеток, а также возможным кооперативным действием HGF и других ФР, присутствующих в секретоме МСК, в частности, GDNF. Для дальнейшей оптимизации эффективности клеточной терапии были получены пласты из модифицированных клеток. Было продемонстрировано, что пласты из МСК- HGF существенно не отличаются по основным характеристикам от пластов из МСК и пригодны для трансплантации животным. При изучении регенеративного потенциала пластов из МСК-HGF in vivo было показано, что по сравнению с введением МСК и МСК-HGF в виде суспензии или трансплантации МСК в виде пластов они наиболее эффективно стимулируют восстановление перфузии конечности, наиболее эффективно стимулируют ангио-артериогенез и восстановление плотности нервных окончаний в ишемизированной мышце, уменьшают некроз ишемизированной мышцы. По всей видимости, наблюдаемый терапевтический эффект пластов из МСК-HGF является следствием длительного присутствия в ткани трансплантированных в виде пластов жизнеспособных клеток, секретирующих HGF, а также ряд других биологически активных соединений. Разработанная на экспериментальном этапе технология трансплантации генетически модифицированных МСК-HGF в виде клеточных пластов может лечь в основу дальнейшей разработки подходов, направленных на лечение пациентов с тяжелыми ишемическими поражениями тканей нижних конечностей, где нарушения кровоснабжения сопровождаются нарушением периферической иннервации. ВЫВОДЫ 1. Генетическая модификация МСК жировой ткани с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора (ААВ-DJ), несущего ген HGF мыши, увеличивает продукцию HGF более, чем в 100 раз по сравнению с немодифицированными клетками на 11 день после трансдукции (0,15 нг/103 клеток/48 ч vs 23,6 нг/103 клеток/48 ч) c последующим снижением продукции к 31 дню до (3 нг/103 клеток/48 ч) клеток, что в 20 раз превышает продукцию немодифицированными МСК. 2. Генетическая модификация МСК ААВ-DJ с геном HGF незначительно снижает пролиферативную активность клеток, но не изменяет способность МСК к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях. 3. Модифицированные МСК, гиперпродуцирующие HGF, более эффективно стимулируют ангиогенез в модели in vitro, чем немодифицированные МСК. 4. Продукты секреции МСК-HGF более эффективно стимулируют отрастание нейритов и миграцию глиальных клеток на модели спинальных ганглиев, чем продукты секреции немодифицированных клеток. 5. В составе клеточных пластов и МСК, и МСК-HGF синтезируют белки внеклеточного матрикса (коллагены 1 и 3 типов и фибронектин), формируют щелевые контакты через коннексин 43, не уходят в апоптоз, часть клеток пролиферирует. 6. Трансплантация клеточных пластов из МСК-HGF наиболее эффективно стимулирует восстановление кровотока, васкуляризации и иннервации, уменьшает выраженность некроза в мышцах ишемизированной конечности мыши по сравнению с введением суспензии равного количества модифицированных и немодифицированных клеток и трансплантацией пластов из немодифицированных МСК.