Фотодинамическая терапия перевиваемых опухолей различного гистогенеза у лабораторных животных с фотосенсибилизаторами хлоринового ряда

Материалы и методы
В диссертационной работе использовались фотосенсибилизаторы,
структурные формулы которых представлены в табл. 1.
Таблица 1
Исследованные фотосенсибилизаторы
Фоторан Е6ЛипосомальныйХлорин е6 с ПСМА-
борированный хлоринлигандом

NHN

NHN

H
O
HBH
OHNB
M
ONHCBB BH
OOH
Me
MeH
BB
H BBBH
HBH
I
Структурная формула
H

Структурная формула
борированного хлорина е6хлорина е6,
Структурная формулаконъюгированного с
(патент РФ № 2406726,
Фоторана Е6ПСМА-лигандом
Ольшевская и др., 2009)
Препарат (рег. №: ЛП-ВлекарственнойформеРазработан в Институте
004885от13.06.18).«ЛипосомальныйтонкойхимииРТУ
Действующее вещество -борированныйхлорин»МИРЭА (Грин, 2018). В
тринатриеваясольмолекулыборированногокачествевекторной
хлорина е6 (Фотолон®) ихлоринапомещенывмолекулы,
вспомогательныефосфолипидныевезикулыприсоединеннойк
вещества: повидон К17,размером 200 ± 10 нм.хлоринуе6был
натрия гидроксид.Действующеевещество-использован
Растворпрепарата(13(1)-N-{2-[N-(клозо-пептидомиметик на основе
готовили ex tempore:монокарбадодекаборат-1этил)лизина и глутаминовой
необходимое количествометил] аминоэтил} амид-15 (2),кислоты,соединенных
растворялив17 (3) – диметилового эфираостаткоммочевины
соответствующем объемехлорина е6.(ПСМА-лиганд). Раствор
0,9% раствора хлоридаРаствор препарата готовилидля инфузий готовили ex
натриядоконечнойex tempore, растворяя в воде дляtempore, путем добавления
концентрации 1 мг/мл.инъекцийнепосредственно0,9% раствора хлорида
передвведениемдонатрия до концентрации 1
концентрации 1 мг/мл.мг/мл.

Опухолевые штаммы и лабораторные животные
Штаммы перевиваемых опухолей были получены в ФГБУ «НМИЦ
онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Меланому В16 перевивали от доноров в виде суспензии клеток. Для чего
опухолевые узлы доноров извлекались из псевдокапсулы и измельчались
ножницами до однородного состояния в растворе Хэнкса, после чего по 30-60 мг в
0,03-0,05 мл питательной среды вводилось подкожно в депиллированное бедро
каждому животному. На 4-9 сутки после перевивки, животным с опухолями
диаметром 0,4-0,6 см, проводился сеанс ФДТ.
Саркому М-1 перевивали в виде кусочков опухоли от аутбредных крыс-доноров,
на которых поддерживается штамм. Для этого стерильными ножницами вырезали
опухоль у донора, промывали в растворе Хэнкса и очищали от некротических
участков, а затем разрезали на кусочки размером ~ 1мм*1мм*1мм. Затем, в
стерильную металлическую иглу-троакар помещали фрагмент опухоли и подкожно
вводили в бедро с помощью мандрена. В опытные группы животных с диаметром
опухоли 0,7-1,0 см распределяли на 7-9 день.
Карцинома Эрлиха асцитическую жидкость карциномы от аутбредных мышей-
доноров, на которых поддерживается штамм, по 0,05 мл на мышь вводили
подкожно в область бедра животным опытных групп для воспроизведения
солидной опухоли. В опыт мышей отбирали на 2-3 день, когда диаметр опухоли
достигал 0,4–0,6 см. Шерстный покров на облучаемом бедре перед сеансом ФДТ
во всех группах депилировали.

Используемые протоколы экспериментов на животных были одобрены
Комиссией по биоэтическому контролю за содержанием и использованием
лабораторных животных в научных целях ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава
России (номер разрешения: 1-Д-00004), на 200 аутбредных крысах-самках, весом
180-230 г, 192 аутбредных мышах-самках, 152 мышах линии C57Bl/6 и 152
гибридах линии F1 (СВА х С57 BL/6j). Животные были получены в питомнике
лабораторных животных ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (филиал «Андреевка») и
находилисьнастандартнойсбалансированнойдиетесиспользованием
комбикорма для содержания лабораторных грызунов и фильтрованной воды.
Метод изучения кинетики тканевого распределения
ИзучениекинетикитканевогораспределенияФСвопухолевойи
окружающих тканях бедра проводилось методом лазерной флуоресцентной
диагностики на спектрометрическом комплексе ЛЭСА-01-«Биоспек» (Россия).
Оптическиедатчикиспектрометрическогокомплексаразмещались
перпендикулярно над кожей опухолей в трех точках: в центре и двух местах на
периферии. Интенсивность флуоресценции окружающих тканей измерялась в двух
точках на бедре без опухоли. Время экспозиции составляло 1-2 секунды. Каждая
экспериментальная группа состояла из 8 животных. Селективность накопления ФС
в опухоли по отношению к здоровой ткани оценивалась по индексу контрастности
(ИК – отношение интенсивности флуоресценции опухолевых и здоровых тканей).
Первое измерение проводилось до введения препарата (0 часа) и затем
повторялось каждые 15-30 минут в течение 3-5 часов.
Метод проведения фотодинамической терапии
Животным с перевитой опухолью вводился исследуемый ФС внутривенно
(в/в) или внутрибрюшинно (в/б) в дозах, согласно схеме исследования. За 10 минут
до наступления оптимального времени проведения облучения, животным
обеспечивали общий наркоз – вводили в/б тиопентал натрия (ОАО «Синтез»,
Россия) в дозе 0,05 г/кг массы животного.
По достижении максимального уровня накопления ФС в опухолевых тканях
животные фиксировались в специальном устройстве (Абрамова, 2019), затем,
перпендикулярно к поверхности опухоли, подводился источник лазерного
излучения с заданными параметрами (полупроводниковый лазерный аппарат
«Аткус-2» (Санкт-Петербург) с длиной волны излучения 662 ± 1 нм. Границы поля
облучения превышали видимые границы опухоли не менее чем на 2-4 мм в
сторону здоровых тканей. Мощность лазерного излучения в плоскости объекта
контролировалась с помощью измерителя мощности (ИМ-2, Россия) перед каждым
экспериментом.
После окончания сеанса животные помещались в чистые клетки и получали
надлежащий уход. В контрольных исследованиях также было изучено действие
лазерного излучения без введения ФС.
Схемы экспериментов с Фотораном Е6
ФДТ саркомы М-1
ФДТ Саркомы М-1 крыс с Фотораном Е6 проводилась по схемам,
представленным в табл. 2.
Таблица 2
Схемы ФДТ саркомы М-1
Доза Фоторана Е6, мг/кг Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2 Время экспозиции, мин
1 серия
2,503000,4810
5,03000,4810
10,03000,4810
2 серия
1,253000,2520
2,503000,2520
5,03000,2520
10,03000,2520
ФС вводили в/в. Диаметр светового пятна – 1,5 см. Количество животных в
опытных группах – по 8 особей. Контроль – крысы-опухоленосители без
воздействия по 8 особей к каждой опытной группе.
ФДТ карциномы Эрлиха
ФДТ карциномы Эрлиха мышей с Фотораном Е6 проводилась по схемам,
представленным в табл. 3.
Таблица 3
Схема проведения ФДТ карциномы Эрлиха
Доза Фоторана Е6, мг/кг Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2 Время экспозиции, мин
5,01000,257,0
5,01000,484,0
5,01500,485,5
5,01501,023,0
ФС вводили в/в. Диаметр светового пятна – 1 см. Количество животных в
опытных группах – по 8 особей. Контроль – мыши-опухоленосители без
воздействия, по 8 особей к каждой группе.
ФДТ меланомы В16
ФДТ меланомы В16 мышей с Фотораном Е6 проводилась по схемам,
представленным в табл. 4.
Таблица 4
Схема ФДТ меланомы В16
Доза Фоторана Е6, мг/кг,Е, Дж/см2Ps, Вт/см2Время
способ введенияэкспозиции, мин
I5,0, в/б1150,484,0
II2,5, в/в1520,485,5
III5,0, в/в1150,484,0
IV5,0, в/в1520,485,5
V5,0, в/в1520,2510,0
ФС вводили в/в и в/б. Диаметр светового пятна – 1 см. Количество животных
в опытных группах – по 8 особей. Контролем служили мыши-опухоленосители без
воздействия по 8 особей к каждой группе.
Схемы экспериментов с ЛБХ
ФДТ саркомы М-1
ФДТ саркомы М-1 с ЛБХ проводилась по схемам, представленным в табл. 5.
Таблица 5
Схема ФДТ саркомы М-1
Доза ЛБХ, мг/кг Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2 Время экспозиции, мин
0,751500,2510,0
1,251500,2510,0
2,501500,2510,0
5,01500,2510,0
ФС вводили в/б. Диаметр светового пятна – 1,5 см. Количество крыс в
опытных группах – по 8 особей. Контроль – крысы-опухоленосители без
воздействия – по 8 особей к каждой группе.
ФДТ карциномы Эрлиха
ФДТ карциномы Эрлиха мышей с ЛБХ проводилась по схемам,
представленным в табл. 6-7.
Таблица 6
Схема ФДТ карциномы Эрлиха (в/в введение ФС)
Доза ЛБХ, мг/кг Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2 Время экспозиции, мин
1,251500,485,5
2,501000,484,0
Диаметр светового пятна – 1 см. Количество животных в опытных группах –
по 8 особей. Контролем служили мыши-опухоленосители без воздействия – по 8
особей к каждой группе.
Таблица 7
Схема ФДТ карциномы Эрлиха (в/б введение ФС)
Доза ЛБХ, мг/кг Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2 Время экспозиции, мин
0,701000,484,0
1,251000,484,0
2,501000,286,0
2,501000,484,0
Диаметр светового пятна – 1 см. Количество животных в опытных группах –
по 8 особей. Контролем служили мыши-опухоленосители без воздействия – по 8
особей к каждой группе.
ФДТ меланомы В16
ФДТ меланомы В16 с ЛБХ проводилась по схемам, представленным в табл.8.
Таблица 8
Схема ФДТ меланомы В16
Доза ЛБХ, мг/кг Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2 Время экспозиции, мин
2,51500,485,5
5,01000,484,0
5,01500,446,0
5,03000,4411,0
5,03000,2520
10,01500,2510,0
10,03000,4411,0
ФС вводили в/б. Диаметр светового пятна – 1 см. Количество животных в
опытных группах – по 8 особей. Контролем служили мыши-опухоленосители без
воздействия по 8 особей к каждой дозе.
Схема экспериментов с хлорином е6, конъюгированным с
ПСМА-лигандом
ФДТ меланомы В16 мышей с хлорином е6, конъюгированным с ПСМА-
лигандом, проводилась по схемам, представленным в табл. 9.
Таблица 9
Схема ФДТ меланомы В16
Доза хлорина е6 с ПСМА-Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2Время экспозиции,
лигандом, мг/кгмин
2,51000,444
2,51050,257
2,51440,485
5,01050,257
5,01440,485
ФС вводили в/в. Диаметр светового пятна – 1 см. Количество животных в
опытных группах – по 8 особей. Контролем служили мыши-опухоленосители без
воздействия по 8 особей к каждой дозе ФС.
Методы оценки эффективности противоопухолевой терапии
Эффективность ФДТ оценивалась по критериям, рекомендованным в
руководствепоэкспериментальному(доклиническому)изучениюновых
фармакологических веществ (Миронов, 2012, Хабриев, 2005):
1.По коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К).
Для этого сначала вычисляли объѐмы опухолей по формуле:
V    d1  d 2  d3
где: d1, d2, d3, – три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли, V – объем
опухоли в см3.
Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) рассчитывали по формуле:
Vt  V0
K
V0
где V0 -объем опухоли до воздействия, Vt – объем опухоли на определенный срок
наблюдения;
2.По торможению роста опухоли (ТРО %) по формуле:
Vk  Vo
ТРО %  100 %
Vk
где: Vk – средний объѐм опухоли в контрольной группе, Vo – средний объѐм опухоли
в опытной группе;
3.По проценту животных в группе с полной регрессией (ПР %) опухоли
(К = -1,00). За полную регрессию опухоли принимали отсутствие видимой и
пальпируемой опухоли.
4.По проценту излеченных животных – критерием которого принималось
отсутствие рецидивирования опухоли в течение 90 суток после ФДТ.
5.Процент увеличения продолжительности жизни вычисляется по формуле:
СПЖо−СПЖк
УПЖ =× 100%,
СПЖк

где: СПЖо – средняя продолжительность жизни опытных животных, сут; СПЖк –
средняя продолжительность жизни контрольных животных, сут.
Контроль эффективности лечения также проводился гистохимическими
методами на 21 сутки после сеанса ФДТ. Выделенную ткань опухоли в виде
пластинокфиксировали24чвжидкостиБуэна.Послестандартной
гистологической проводки ориентированные фрагменты тканей заключали в
парафиновую среду Гистомикс на станции заливки HistoStar (Thermo Scientific).
Для морфологических исследований депарафинированные срезы толщиной 5 мкм,
полученные на микротоме Leica RM2235, окрашивали гематоксилином и эозином
(БиоВитрум) и по Ван Гизону для выявления соединительной ткани. Для
верификациивыжившихпослеФДТопухолевыхклетокпроводили
иммуногистохимическиеисследованиясиспользованиемполиклональных
кроличьих антител к онкопротеину р53 (FL393, «Santa Cruz», 1:50) и набора для
выявления кроличьих первичных антител (EnVision+System-HRP (DAB), «Dako»).
При иммуноокрашивании на белок р53 субстратную пероксидазу проявляли
аминоэтилкарбазолом(AEC+,«DAKO»)сдокрашиваниемядерклеток
гематоксилином и заключением гистологических препаратов в водорастворимую
среду (Faramount, «DAKO»). Гистологические срезы исследовали с помощью
микроскопа Leica DM 1000 с микрофотосъемкой на цифровую камеру Leica ICC50
HD при 4-х уровнях увеличений: объективы ×2,5, ×10, ×20 и ×40.
Методы анализа данных и статистики
Полученныерезультатыдлянезависимыхгруппстатистически
обрабатывали в программе Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.). Параметры описательной
статистикипредставленыввидесреднегоарифметическогозначенияи
стандартнойошибкисреднего(M±m).Дляоценкиуровнязначимости
межгрупповых различий полученных показателей использовали U критерий
Манна—Уитни. Различия между показателями принимали значимыми при p<0,05. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ По данным, полученным в исследовании противоопухолевой эффективности ФДТ саркомы М-1 с препаратом Фоторан Е6, в первой серии опытов значимое увеличение продолжительности жизни крыс зарегистрировано после сеансов ФДТ проведенных через 2,5 часа (в период максимального индекса контрастности опухоль/окружающие ткани) после введения ФС в дозах 5,0 и 10,0 мг/кг с дозой света Е= 300 Дж/см2 и Ps=0,48 Вт/см2. Однако результат 100% излеченности был достигнут только на фоне введения максимальной дозы Фоторана Е6. При снижении плотности мощности до 0,25 Вт/см2 при Е=300 Дж/см2 и увеличении времени облучения в два раза, во второй серии экспериментов, максимальная противоопухолевая эффективность наблюдалась уже при дозе 5,0 мг/кг (табл. 10). Таблица 10 Продолжительность жизни и процент излеченных животных после ФДТ саркомы М-1 с Фотораном Е6 Излеченные ПараметрСПЖ, сутУПЖ, % крысы**, % Контроль (n=48)42±3—— I серия (Е=300 Дж/см2; Ps=0,48 Вт/см2) 2,5 мг/кг, (n=8)41±700 Доза Фоторана Е65,0 мг/кг (n=8) 79±16*90*40 10,0 мг/кг (n=8)>90>100*100
II серия (Е=300 Дж/см2; Ps=0,25 Вт/см2)
2,5 мг/кг (n=8) 42±15060
Доза Фоторана Е65,0 мг/кг (n=8)>90>100*100
10,0 мг/кг (n=8)>90>100*100
Примечание: СПЖ — средняя продолжительность жизни, УПЖ — увеличение
продолжительности жизни; n – число животных; *значимое УПЖ по сравнению с
контролем (≥50%). **На 90-е сутки исследования.
По данным иммуногистохимического анализа, при оптимальных режимах
ФДТ в зонах фотодинамического воздействия выживших опухолевых клеток не
обнаружено (рис. 1).

аб
вг

Рисунок 1. Морфология саркомы М-1 в контроле (а, б) и зона воздействия
лазерным излучением на 21 сутки после сеанса ФДТ с Фотораном Е6 (в, г).
а — зона роста опухоли с врастанием сосудов в еѐ паренхиму в контроле, окрашивание
гематоксилином и эозином, об.×125; б — иммуногистохимическое окрашивание ядер
опухолевых клеток с антителами к р53 в контроле, об.×250; в — поглощение
макрофагами погибающих структур ткани, окрашивание гематоксилином и эозином,
об.×250; г — отсутствие положительной реакции ядер клеток при иммуноокрашивании
на белок р53, об.×250.

ФС Фоторан Е6 показал высокую противоопухолевую активность и в
результате проведенных комплексных исследований in vivo на карциноме
Эрлиха. Эффективность ФДТ этой опухоли с Фотораном Е6 также зависит от дозы
ФС и параметров лазерного воздействия. Проведение ФДТ в период от 30 до 60
мин после в/в введения ФС в дозе 5,0 мг/кг, в режиме Е=150 Дж/см2 и P=0,48
Вт/см2 позволяет достичь полной регрессии опухолевых узлов и отсутствия их
рецидивирования на протяжении трех месяцев наблюдений (табл. 11), что
подтверждается патоморфологическими исследованиями.
Таблица 11
Продолжительность жизни и процент излеченных животных после ФДТ
с введением Фоторана Е6 в дозе 5,0 мг/кг при различных параметрах
воздействия лазерным излучением на карциному Эрлиха мышей
СПЖ,Излеченные
ПараметрУПЖ, %
суткиживотные**, %
Контроль (n=32)51±2–
Е=100 Дж/см ; Ps=0,25 Вт/см , (n=8)—
Е=100 Дж/см2; Ps=0,48 Вт/см2, (n=8)58±51250
Е=150 Дж/см2; Ps=0,48 Вт/см2, (n=8)>90>100*100
Е=150 Дж/см ; Ps=1,02 Вт/см , (n=8)71±102971
Примечание: СПЖ — средняя продолжительность жизни, УПЖ — увеличение
продолжительности жизни; n-число животных; *значимое УПЖ по сравнению с
контролем (≥50%), **На 90-е сутки исследования.
Максимальный противоопухолевый ответ при лечении меланомы В16 с ФС
Фоторан Е6 достигался при в/в введении препарата в дозе 5 мг/кг, и последующим
через 60 минут облучением в режиме: Е=150 Дж/см2, Ps=0,25 Вт/см2. При этом
сочетании параметров терапии полная регрессия меланомы наблюдалась в 100%
случаев вплоть до 90 суток после облучения (табл. 12), что подтверждается
результатами гистологических исследований.
Таблица 12
Процент животных с полной регрессией опухоли после ФДТ с
Фотораном Е6 при различных параметрах воздействия лазерным излучением
на меланому В16 мышей
Полная регрессия, %
Параметр
на 90 сут
Контроль, (n=32)-
5,0 мг/кг, Е=115 Дж/см ; Ps=0,48 Вт/см , (n=8)89
2,5 мг/кг, Е=150 Дж/см ; Ps=0,48 Вт/см , (n=8)80
5,0 мг/кг, Е=150 Дж/см ; Ps=0,48 Вт/см , (n=8)86
5,0 мг/кг, Е=150 Дж/см ; Ps=0,25 Вт/см , (n=8)100
Примечание: n-число животных.
На основании анализа полученных результатов представляется важным
отметить большую значимость такого параметра, как время экспозиции. Снижение
плотностимощностисветасодновременнымувеличениемприэтом
продолжительности воздействия лазером с 5 до 10 минут привело к повышению
доли полностью излеченных животных на 14%. Также при уменьшении плотности
мощности энергии лазерного облучения существенно снижается выраженность
повреждений здоровых тканей в зоне фотодинамического воздействия. Менее
выраженная инфильтрация ткани под струпом нейтрофильными лейкоцитами в
последней группе отражает более легкое выздоровление после проведенного
сеанса фотодинамической терапии.
Фоторан Е6, уже разрешен для клинического применения, в качестве
воспроизведенного препарата, но противоопухолевая эффективность самого этого
дженерика на биологических моделях ранее не изучалась, а у оригинального
препарата Фотолон® (Белмедпрепараты, Беларусь) доклинические исследования на
саркомеМ-1крыспроводились,нопротивоопухолеваяэффективность
оценивалась только по величине площади некрозов через 24 часа после проведения
сеанса ФДТ с препаратом. Доклинических исследований противоопухолевой
эффективности Фотолона® на опухолевых моделях карциномы Эрлиха и меланомы
В16 не проводилось.
Таким образом, в результате проведенных комплексных исследований в
диссертационной работе показано, что Фоторан Е6 характеризуется высокой
эффективностью и безопасностью. В процессе исследований на различных
морфологических типах опухолейбыла выявлена высокая селективность
накопления ФС в опухолевых узлах с высоким индексом контрастности по
отношению к окружающим тканям и высокий противоопухолевый эффект от
проведения ФДТ с данным препаратом.
Фотодинамическая терапия саркомы М-1 с ЛБХ, проводимая через 3,5-4
часа после в/б введения ФС во всех исследованных дозах: 0,75; 1,25; 2,5; 5,0 мг/кг
и с параметрами лазерного воздействия: Е=150 Дж/см2 и Ps=0,25 Вт/см2 вызывала
значимый противоопухолевый ответ (от 70 до 100% излеченных животных).
Максимальный ингибирующий эффект для саркомы М-1 крыс (полная регрессия
опухоли) получен при введении ЛБХ в дозе 2,5 мг/кг и последующем облучении со
световой дозой: Е=150 Дж/см2; Ps=0,25 Вт/см2.
При лечении карциномы Эрлиха с ФС ЛБХ ингибирующий эффект
получен во всех исследуемых группах животных после проведения сеанса ФДТ
через 1-2 часа после в/б введения ФС в дозах: 0,70; 1,25; 2,5 мг/кг и с применением
следующих параметров лазерного воздействия: Е=100 Дж/см2 и Ps=0,28 и 0,48
Вт/см2. Полная регрессия карциномы Эрлиха у 100% животных до 21 суток после
проведения ФДТ достигнута при в/б введении ЛБХ в дозе 2,5 мг/кг, и световой
дозе Е=100 Дж/см2 и Ps=0,48 Вт/см2. И в этой же группе зарегистрирован самый
высокий уровень излеченности на 90 сутки после сеанса ФДТ – 80% животных.
При в/в введении ФС и проведении сеанса лазерного воздействия через 60-90
минут после этого, полная регрессия опухоли у 100% животных до 21 суток после
проведения ФДТ наблюдалась при дозе ЛБХ – 1,25 мг/кг и световой дозе: Е=150
Дж/см2; Ps=0,48 Вт/см2. Проведенные патоморфологические исследования тканей
зоны лазерного воздействия и окружающих тканей, свидетельствуют о том, что
данный препарат эффективно действует в низкой дозе, за счет чего при лизисе
погибающих клеток привлекаются клетки иммунной системы и продукты распада
успевают перевариваться соседними клетками и макрофагами без токсического
воздействия на окружающие ткани.
Противоопухолевый эффект ФДТ с ЛБХ на меланоме В16 зависел от доз
фотосенсибилизатора и световой дозы. Исходя из результатов проведенных
исследований динамики накопления ФС в опухолевых узлах и окружающих их
тканях, оптимальное время лазерного воздействия – через 2 часа после введения
ЛБХ. При проведении ФДТ в оптимальные сроки, а также при подборе доз ФС и
параметров лазерного облучения, была получена полная регрессия опухолей у
100% животных до 21 суток после сеанса терапии с дозой ЛБХ – 10 мг/кг и при
параметрах лазерного воздействия E=300 Дж/см2 и Ps=0,44 Вт/см2.
На основе результатов проведенных исследований (начатых ранее В.В.
Дрожжиной, Ю.С. Осипчук под руководством М.А. Каплана) показано, что
отечественный ФС липосомальный борированный хлорин е6 обладает высокой
противоопухолевой активностью in vivo. Путем подбора доз ФС и параметров
лазерного воздействия был получен максимальный ингибирующий эффект (полная
регрессия опухоли у 100% животных до 21 суток после проведения ФДТ) на всех
исследованных опухолевых моделях: саркоме М-1 крыс, меланоме В16 и
карциноме Эрлиха мышей.
Проведенные исследования с ФС хлорин е6 с ПСМА-лигандом на
меланоме В16 показали, что ФС быстро и с высокой избирательностью
накапливается в опухолевых тканях. Лазерное воздействие с параметрами Е=144
Дж/см2, Ps=0,48 Вт/см2 проведенное через 45 – 60 минут после в/в введения ФС в
дозе 2,5 мг/кг позволяет достичь 100% эрадикации опухолевых узлов и отсутствия
рецидивированиянапротяжениитрехмесяцевнаблюденийсбыстрым
заживлением без образования рубцов и отсутствием деструктивных повреждений
здоровых тканей в области лазерного воздействия, что подтверждается данными
иммуногистохимического анализа. Это предположительно достигается за счет
высокой селективности накопления ФС в опухоли, обусловленного захватом
ПСМА-лиганда ФС рецепторами ПСМА клеток меланомы мышей.
Таким образом, в ходе выполнения диссертационной работы была проведена
оценка эффективности трех отечественных ФС, принадлежащих к классу
хлориновыхсоединений.Былиустановленывэкспериментеinvivo
закономерности накопления этих фотосенсибилизаторов в тканях перевиваемых
опухолей и окружающих их тканях на модели лабораторных животных. Были
определены оптимальные ЛСВИ для проведения лазерного воздействия после
введения исследуемых ФС, в течение которых наблюдается повышенное
накопление их в опухолевых тканях по сравнению с окружающими здоровыми
тканями (Табл. 13).
Таблица 13
Оптимальные лекарственно-световые интервалы для проведения
лазерного воздействия после введения (внутривенного и внутрибрюшинного)
Фоторана е6, ЛБХ и хлорина е6 с ПСМА-лигандом
Фоторан е6ЛБХХлорин е6 с
ПСМА-
лигандом
в/вв/бв/вв/бв/в
Саркома М-190-120150-180-210-240-
минминмин
Карцинома30-60 мин 180-210 60-90 60-120-
Эрлихаминминмин
Меланома В1650-60 мин–90-12045-60 мин
мин

Установлено, что фотодинамическая терапия с препаратом Фоторан Е6 и
ЛБХ подавляет рост саркомы М-1, карциномы Эрлиха и меланомы В16 при всех
исследованных дозах ФС и параметрах облучения. ФДТ с хлорином е6 с ПСМА-
лигандом подавляет рост меланомы В16 при всех исследованных дозах ФС и
параметрах облучения. Средняя продолжительность жизни по сравнению с
контролем увеличивалась во всех опытных группах. Таким образом, установлена
высокаяэффективностьданныхфотосенсибилизаторовипоказана
перспективностьихприменениядлятерапиизлокачественныхопухолей
различного гистогенеза.
На основании подбора параметров лазерного воздействия разработаны
методики проведения ФДТ, применение которых позволяет добиться полного
излечения экспериментальных опухолей различного гистогенеза с каждым из
изученных фотосенсибилизаторов вплоть до 90 суток после сеанса ФДТ (Табл. 14).
Таблица 14
Режимы проведения ФДТ, приводящие к полному излечению изученных
опухолей вплоть до 90 суток после сеанса ФДТ
ФоторанЛБХХлорин Е6 с
Е6ПСМА-
лигандом
Саркома М-1Доза ФС, мг/кг5,02,5
Е, Дж/см300150
Ps, Вт/см0,250,25
Карцинома Эрлиха Доза ФС, мг/кг5,01,25 2,50
Е, Дж/см150150 100
Ps, Вт/см0,480,48 0,48
Меланома В16Доза ФС, мг/кг5,010,02,5
Е, Дж/см150300144
Ps, Вт/см0,250,440,48

При сравнении полученных параметров между собой обращает на себя
внимание высокая эффективность действия на саркому М-1 крыс режимов
проведения ФДТ с более длительным облучением с относительно низкой
плотностью мощности 0,25 Вт/см2, по сравнению с карциномой Эрлиха – на эту
опухоль эффективнее оказывали ингибирующее влияние режимы с коротким, но
более интенсивным облучением. Что же касается меланомы В16 – добиться ее
элиминации с наименьшими параметрами проведения облучения и небольшой
дозой вводимого ФС удалось с хлорином е6 конъюгированным с ПСМА-лигандом.
Следует отметить тот факт, что все три исследованных ФС, дают
возможность добиваться элиминации экспериментальных опухолей гораздо
эффективнее, чем другие препараты хлоринового ряда, давно используемые в
клинической практике. Они приводят к полному противоопухолевому ответу при
меньших дозах ФС и при более щадящих режимах лазерного воздействия. Для
сравнения в Таблице 15 приводятся сведения по параметрам ФДТ, приводящим к
полной регрессии опухоли Саркома М-1 лабораторных животных до 21 суток с
различными ФС хлоринового ряда. Эти данныебыли получены ранее
сотрудниками лаборатории экспериментальной фотодинамической терапии МРНЦ
им. А.Ф. Цыба (Бурмистрова Н.В., Дрожжина В.В., Михайловская А.А., Осипчук
Ю.С. под руководством М.А. Каплана) на том же оборудовании, с применением
тех же методик и на тех же тест-моделях.
Таблица 15
Режимы проведения ФДТ, приводящие к полной регрессии саркомы
М-1 крыс на 21 сутки после сеанса ФДТ
Саркома М-1
Доза ФС, мг/кг Е, Дж/см2 Ps, Вт/см2
Хлорин е610,02000,51
Радахлорин10,03000,36
Борированный хлорин5,03000,25
Фотодитазин10,06000,51
Фотолон10,03000,51
Амидоаминхлорин2,53000,51
Липосомальный амидоаминхлорин1,251500,51

При сравнении видно, что разработанные в диссертационной работе
методики проведения ФДТ саркомы М-1 отличаются тем, что требуют введения
более низких доз новых фотосенсибилизаторов и гораздо более щадящих режимов
лазерного воздействия для достижения аналогичного терапевтического ответа, чем
с использующимися сейчас в лечебной практике препаратами.
Полученные данные важны для понимания особенностей терапевтического
действия ФДТ с данными ФС хлоринового ряда. Присоединение к хлорину е6
лиганда таргетного к ПСМА-рецепторам, предположительно имеющимся в
меланоме В-16 мышей, улучшает проникновение хлорина е6 в опухолевые клетки
и позволяет добиться полной регрессии опухоли. Включение бора в состав
хлориновогофотосенсибилизаторавлипосомальнойформеповышает
опухолетропностьифотодинамическуюэффективность,атакжеделает
перспективным применение данного ФС в методиках, включающих сочетание
ФДТ с нейтрон-захватной терапией. Все это обуславливает перспективность
дальнейших испытаний данных веществ в клинической практике.

ВЫВОДЫ
1.УстановленызакономерностинакопленияФСвосновныхтипах
перевиваемых опухолей – саркоме М-1, карциноме Эрлиха и меланоме В-16 и в
окружающих их тканях на моделях лабораторных животных. Проведена оценка
селективности накопления ФС в опухолевых узлах. Установлено оптимальное
время для проведения лазерного воздействия после введения исследуемых ФС для
каждого исследованного гистотипа опухолей.
2.ФДТ с ФС хлоринового ряда: Фотораном Е6 и ЛБХ подавляет рост основных
типов перевиваемых опухолей – саркомы М-1 крыс, карциномы Эрлиха мышей и
меланомы В-16 мышей, а ФДТ с хлорином е6 с ПСМА-лигандом подавляет рост
меланомы В-16 мышей при всех исследованных дозах ФС и параметрах облучения.
Средняя продолжительность жизни по сравнению с контролем увеличивалась во
всех опытных группах. Таким образом, установлена высокая эффективность и
перспективность применения данных фотосенсибилизаторов.
3.На основании подбора параметров лазерного воздействия разработаны
режимы проведения ФДТ, применяя которые возможно добиться полного
излечения экспериментальных опухолей различного гистогенеза с каждым из
изученных фотосенсибилизаторов вплоть до 90 суток после сеанса ФДТ
4.Высокий противоопухолевый эффект разработанных методик проведения
ФДТ подтвержден данными гистологических исследований. При оптимальных
режимах проведения ФДТ в зонах фотодинамического воздействия на 21-е сутки
после терапии выживших опухолевых клеток не обнаружено.
5.Все изученные фотосенсибилизаторы перспективны для дальнейших
испытаний в качестве высокоэффективных клинических препаратов.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1.Абрамова, О.Б. Фотодинамическая терапия карциномы Эрлиха мышей с
липосомальным борированным хлорином е6 / О.Б. Абрамова, В.В. Дрожжина,
Т.П. Чурикова [и др.] // Радиация и Риск. Москва. — 2020. — Том 29, №3. С. 42-51
2.Абрамова, О.Б. Фотодинамическая терапия саркомы М-1 крыс с
фотосенсибилизатором Фоторан Е6 / О.Б. Абрамова, В.В. Южаков, М.А. Каплан
[и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Москва. — 2020. —
T. 170, № 10. С. 492-498
Abramova, O.B. Photodynamic Therapy of Sarcoma M-1 in Rats with Photosensitizer
Photoran E6 / O.B. Abramova, V.V. Yuzhakov, M.A. Kaplan et al // Bull Exp Biol Med
. — 2021. — 170, 479–484
3.Бурмистрова, Н.В. Фотодинамическая активность липосомального
борированного хлорина е6 / Н.В. Бурмистрова, В.В. Дрожжина, О.Б. Абрамова [и
др.] // Радиация и риск. Москва. — 2019. — T. 28, № 4. С. 96-107
4.Абрамова, О.Б. Фотодинамическая терапия меланомы В16 с использованием
конъюгата хлорина е6 с ПСМА-лигандом / О.Б. Абрамова, М.А. Каплан, М.А.
Грин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2021. — №
4. – С. 481-485
Abramova, O.B. Photodynamic Therapy of Melanoma B16 with Chlorin E6 conjugated
with a PSMA-ligand / O.B. Abramova, M.A. Kaplan, M.A. Grin et al // Bull Exp Biol
Med . — 2021. — 171, 468–471
5.Абрамова, О.Б. Одноразовое устройство для фиксации мелких лабораторных
животных для проведения фотодинамической терапии / О.Б. Абрамова // Патент
РФ № 190718, 2019 г.
6.Абрамова, О.Б. Способ фотодинамической терапии перевивной
поверхностной солидной соединительнотканной саркомы М-1 крыс / О.Б.
Абрамова, В.В. Дрожжина, М.А. Каплан // Патент РФ № 2704202, 2019 г.
7.Абрамова, О.Б. Способ фотодинамической терапии перевивной
эктодермальной опухоли меланомы В16 мышей / О.Б. Абрамова, В.В. Дрожжина,
Т.П. Чурикова [и др.] // Патент РФ № 2724867, 2020 г.
8.Каприн, А.Д. Способ фотодинамической терапии перевивной опухоли
меланома В16 мышей с фотосенсибилизатором хлоринового ряда с ПСМА-
лигандом / А.Д. Каприн, С.А. Иванов, О.Б. Абрамова [и др.] // Патент РФ №
2739193, 2020 г.
9.Абрамова, О.Б. Способ оценки противоопухолевой эффективности
фотодинамической терапии / О.Б. Абрамова, В.В. Дрожжина, Е.А. Береговская [и
др.] // Патент РФ № 2738301, 2020 г.
10. Абрамова, О.Б. Систематизация результатов исследований по параметрам
фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами, приводящими
к регрессии и полному излечению экспериментальных перевиваемых опухолей у
лабораторных животных / О.Б. Абрамова, В.В. Дрожжина, Е.А. Береговская, Т.П.
Чурикова // БД № 2019621515, 2019 г.
11. Абрамова, О.Б. Мультимедийная лекция на тему: “Изучение
противоопухолевой эффективности фотодинамической терапии” / О.Б. Абрамова
// БД № 2019621561, 2019 г.
12. Абрамова, О.Б. Систематизация результатов исследований по параметрам
фотодинамической терапии с фотосенсибилизаторами хлоринового ряда,
приводящим к регрессии и полному излечению экспериментальных перевиваемых
опухолей у лабораторных животных / О.Б. Абрамова, В.В. Дрожжина, Е.А.
Береговская [и др.] // БД № 2019621829, 2019 г.
13. Абрамова, О.Б. Соотношение морфологических характеристик клеток
периферической крови и интегральных медицинских показателей на разных
стадиях развития меланомы В16 мышей и после проведения фотодинамической
терапии с Фотораном Е6, приводящей к полному излечению опухоли / О.Б.
Абрамова, В.В. Дрожжина, Е.А. Береговская [и др.] // БД №2020621986, 2020 г.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК – активные формы кислорода
ИК – индекс контрастности
К – коэффициент абсолютного прироста опухоли
КЭ – карцинома Эрлиха
ЛБХ – липосомальный борированный хлорин е6
ЛСВИ – лекарственно-световой интервал
нм – нанометр
Отн. ед. – относительные единицы
ПВП – поливинилпирролидон
ПР% – полная регрессия опухоли
ПСМА – простат специфический мембранный антиген
СПЖ – средняя продолжительность жизни
ТРО% – торможение роста опухоли
УПЖ% – увеличение продолжительности жизни по сравнению с контролем
ФДТ – фотодинамическая терапия
ФС – фотосенсибилизатор
Е – плотность энергии лазерного излучения
Ps – плотность мощности лазерного излучения
в/в – внутривенно
в/б – внутрибрюшинно