Фурокумарины в коррекции нарушений гемостаза, миело- и гепатотоксичности, вызванных применением цисплатина (экспериментальное исследование)

Во введении обоснована актуальность темы диссертации и степень ее разработанности, сформулированы цель и задачи, научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы, методология и методы исследования, положения, выносимые на защиту, степень достоверности и апробации результатов.
В главе 1 проведен анализ отечественных и зарубежных научных источников литературы по теме исследования. В разделе 1.1 описаны тромботические осложнения, их распространенность, а также механизмы их возникновения. В разделе 1.2 представлена характеристика химиотерапевтического препарата цисплатин, механизм его действия, а также описано его токсическое влияние на организм. В разделе 1.3 приведены сведения о системе гемостаза и ее функционировании. Раздел 1.4 содержит информацию о различных группах антикоагулянтных средств, в том числе варфарине. В разделе 1.5 представлены сведения о миелотокисчности, вызванной применением химиотерапевтических препаратов и способах ее нивелирования. В разделе 1.6 описаны свойства фурокумаринов, механизм их действия и фармакологическая активность.
Глава 2 посвящена описанию материалов и методов исследования.
Эксперименты проведены на 260 мышах-самках массой 18-25 г линии CD 1 (питомник НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга). Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены Комиссией по биоэтике НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (протокол No 64). Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.
Исследование показателей системы гемостаза, периферической крови, костного мозга и биохимических параметров крови, проводили на 1-е, 2-е, 5-е, 7-е, 10-е, 15-е, 20-е и 30-е сутки после однократного введения цитостатика, для животных, получавших корректор и препарат сравнения – на 7-е, 10-е, 15-е, 20-е и 30-е сутки.
Для моделирования нарушений свертывающей системы цисплатин (Cisplatin- LANS, Лэнс-Фарм, Россия) мышам-самкам вводили внутрибрюшинно однократно в максимально переносимой дозе 10 мг/кг. Контрольным животным в аналогичных условиях в эквивалентном объеме вводили физиологический раствор.
Для коррекции выявленных нарушений использовали экстракт, полученный из культуры клеток болиголова пятнистого (Conium maculatum L.), содержащий сумму фурокумаринов. Сырье для выделения экстракта было предоставлено кафедрой физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики НИ ТГУ (зав. каф. профессор Карначук О.В.). Экстракт получен на базе НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга из клеточной культуры болиголова пятнистого и содержит не менее 90% суммы фурокумаринов (42,97% изопимпинеллина, 35,18% бергаптена и 15,41% ксантотоксина). Качественный состав ФК определяли с помощью методов ГХ-МС и тонкослойной хроматографии, количественное содержание и чистоту определяли методом ВЭЖХ. Использовали стандартные образцы бергаптена, ксантотоксина и изопимпинеллина (Sigma-Aldrich, США). Полученный экстракт представлял собой желтоватый порошок, нерастворимый в воде. Животным экстракт, содержащий ФК, вводили в дозе 30 мг/кг в 1% крахмальном геле. Подбор дозы был осуществлен на основе данных литературы и результатах предварительных экспериментальных исследований по выбору эффективной дозы.
В качестве препарата сравнения использовали варфарин Никомед (Takeda Pharma A/S, Дания) в дозе 4 мг/кг в 1% крахмальном геле. При выборе дозы руководствовались инструкцией к препарату, а также результатами проведенного исследования по подбору доз. Экстракт и препарат сравнения вводили курсом один раз в сутки после применения цитостатика, начиная с 6-х суток и до выведения животных из эксперимента, для животных на 7-е (однократно) и начиная с 7-х суток и до выведения животных из эксперимента на 10-е сутки (троекратно). При наблюдении на 15-е, 20-е и 30-е сутки исследования животные получали корректор и препарат сравнения в течение 4-х суток.
Исследование показателей системы коагуляционного гемостаза (протромбиновое время (ПВ), международное нормализованное отношение (МНО), активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), концентрация фибриногена) выполняли на полуавтоматическом коагулометре Helena C-4 (Helena Biosciences Europe, Великобритания) с использованием стандартных наборов реагентов (ООО «Технология-Стандарт», Россия). Глобальное исследование состояния гемостатического потенциала осуществляли с помощью метода НПТЭГ на аппаратно-программном комплексе АРП – 01М «Меднорд» (Меднорд, Россия) с определением: константы тромбиновой активности (КТА, о.е.); времени желирования крови (t3, мин); интенсивности коагуляционного драйва (ИКД, о.е.); времени образования сгустка (t5, мин). Измерения и обработка осуществлялась информационной системой ИКС «ГЕМО-3».
Подсчет лейкоцитарной формулы в периферической крови, количества ретикулоцитов и миелограмм осуществляли по стандартной методике [Новицкий В.В., Уразова О.И., Хлусова М.Ю., 2005]. Показатели периферической крови (содержание лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, расчетные показатели эритроцитов, концентрации гемоглобина, гематокритного числа) исследовали с использованием автоматического гематологического ветеринарного анализатора Mythic 18 vet (Orphee, Швейцария). Биохимические показатели сыворотки крови – аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ) оценивались с использованием автоматического биохимического анализатора Erba Mannheim XL 100 (Erba Lachema, Чехия) и стандартных наборов для анализаторов производства Erba.
Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использование пакета программ Statistica 10 (StatSoft Inc., США). Для каждой группы рассчитывали среднее арифметическое (Х) и ошибку среднего арифметического (±m). Для оценки межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Уровень значимости критериев задавали p< 0,05%. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3 содержит результаты исследования и их обсуждение. По результатам клоттинговых исследований, в ответ на однократное введение цисплатина в МПД лишь к 5-м суткам было определено статистически значимое сокращение ПВ на 6,8% и снижение МНО на 9,1% от значений контроля (Рисунок 1а), что может свидетельствовать об увеличении активности протромбинового комплекса, повышающего риск развития тромботических осложнений [Kattula S., Byrnes J.R., Wolberg A.S., 2017]. Примечание: здесь и далее – контроль взят за 100%, маркером * обозначены выявленные различия (p<0,05), ** (p<0,01), при сравнении с группой контроля; маркером  обозначали выявленные различия (p<0,05),  (p<0,01), при сравнении с группой цисплатина; маркером # обозначали выявленные различия (p<0,05) при сравнении с группой варфарина Рисунок 1 – Коагулологические показатели – ПВ (а), АПТВ (б) мышей-самок, получавших варфарин или экстракт, содержащий ФК, на фоне однократного введения цисплатина в МПД Далее, с 7-х по 20-е сутки, при продолжающемся снижении значений ПВ и МНО, отмечался рост концентрации фибриногена с максимальной разницей от значений контроля на 7-е (63,6%) и 15-е сутки (58,3%), что также повышает риск тромбообразования [Machlus K.R., Thon J.N., Italiano J.E.Jr, 2014]. Сокращение АПТВ в эти периоды исследования (Рисунок 1б) предположительно связано с повышением уровня фактора VIIIа, участвующего в переходе протромбина в тромбин, рост концентрации которого может привести к увеличению риска тромбообразования [Roshal M., 2013]. К 30-м суткам значения оцениваемых параметров достигали контрольных уровней за исключением АПТВ, величины которого статистически значимо уступали контролю на 21,1%. При использовании глобального теста оценки гемостаза – метода НПТЭГ было выявлено, что однократное введение цисплатина в МПД приводит к волнообразному изменению состояния ГП. На первые сутки после введения цисплатина, формировался гиперкоагуляционный ответ, характеризующийся ростом активности тромбина (по показателю КТА) на 37,8% (Рисунок 2а), сокращением времени достижения точки желирования крови (показатель t3) на 14,3% (Рисунок 2б) и сокращением времени образования поперечно-сшитого фибрина (ПСФ) (показатель t5) на 13,3% в сравнении с группой контроля (Рисунок 2г). Выявленная структурная и хронометрическая гиперкоагуляция предположительно связана с активацией сосудистого эндотелия вследствие повреждающего эффекта цисплатина. Повреждение эндотелия сосудов приводит к снижению антикоагулянтного потенциала сосудистой стенки, высвобождению содержимого телец Вейбла-Палладе (фактор фон Виллебранда, p-селектин и др.), образованию участков деэндотелизации, что вызывает резкую интенсификацию прокоагулянтной активности, сопровождающуюся дисфункцией противосвертывающих механизмов [Lechner D. et al., 2007; Moore R.A. et al., 2011; Oppelt P., Betbadal A., Nayak L., 2015]. Первичный гиперкоагуляционный ответ на вторые сутки сменялся гипокоагуляцией, что подтверждается резким снижением активности тромбина (КТА по НПТЭГ) на 47,0% (Рисунок 2а) и удлинением t5 на 6,4% в сравнении с группой контроля (Рисунок 2г). Подобные изменения могут быть обусловлены коагулопатией потребления, развивающейся в результате чрезмерно интенсифицированных механизмов коагуляции. Максимальный гиперкоагуляционный ответ на введение цисплатина в исследуемой группе, как и при коагулологических исследованиях (сокращение ПВ, АПТВ, снижение значений МНО и повышение концентрации фибриногена), определялся на 5-7-е сутки, что находит подтверждение в приросте наработки тромбина (КТА) на 41,9%, сокращении t3 и повышении интенсивности протеолиза фибриногена (показатель ИКД) на 37,7%, тогда как время образования сгустка - t5 соответствовало контролю (Рисунок 2). На 10-е сутки от однократного введения МПД цисплатина, наблюдали снижение выраженности прокоагулянтного сдвига ГП, что отражается в снижении интенсивности наработки тромбина (КТА превышало значения контроля на 17,7%, но в пределах статистической ошибки) (Рисунок 2а), двукратном снижении ИКД, уровень которой статистически значимо превышал контрольные значения (Рисунок 2в) и некотором сокращении t3 по отношению к таковому, оцененному на 7-е сутки исследования (Рисунок 2б), при статистически значимом сокращении времени образования ПФС – t5 на 5,9% (Рисунок 2г). Рисунок 2 – Показатели НПТЭГ – КТА (а), t3 (б), ИКД (в), t5 (г) мышей-самок, получавших варфарин или экстракт, содержащий ФК, на фоне однократного введения цисплатина в МПД Выявленная на 10-е сутки сохраняющаяся гиперкоагуляция вероятно также связана с массивным повреждением эндотелия, образованием участков деэндотелизации и обнажением волокон коллагена, поступлением микрочастиц эндотелиальных клеток, обладающих прокоагулянтной активностью, обусловленной наличием «доступных для контакта» фосфатидилсерина и тканевого фактора [Farndale et al., 2004; Lechner D. et al., 2007; Moore R.A. et al., 2011; Francescato H. D.C. et al., 2018]. На 15-е сутки период гиперкоагуляции сменялся гипокоагуляционным состоянием, что проявлялось в снижении КТА и ИКД на 32,8% и 18,6% соответственно, удлинении t3 на 27,3%, значения t5 не отличались от контрольных (Рисунок 2). Подобные изменения предположительно связаны с прогрессирующим развитием нарушения белково-синтетической функции печени, что может выступить триггером геморрагических осложнений [Abdol Razak N.B. et al., 2018]. Состояние гипокоагуляции сохранялось вплоть до 20-30 суток после однократного введения МПД цисплатина: КТА уступал контролю как на 20-е, так и на 30-е сутки на 22,7% и 23,6% соответственно (Рисунок 2а), тогда как ИКД к 20-м суткам был ниже контроля на 10,0%, а к 30-м достигал контрольных значений нормы (Рисунок 2в). Показатель t3 в эти периоды наблюдения не отличался от значений контроля, тогда как величина t5 возрастала на 20-30-е сутки на 7,4% и на 38,8% (Рисунок 2г). Выявленные изменения изученных показателей свидетельствуют о постепенном восстановлении системы регуляции агрегатного состояния крови и, вероятно, структурно-функционального состояния эндотелия сосудов и печени. Таким образом, анализ полученных данных показал, что однократное введение цисплатина приводило к изменениям ГП экспериментальных животных в сторону гиперкоагуляции, с максимальным гиперкоагуляционным ответом на 5-7-е сутки. Для изучения возможных способов коррекции нарушений гемостаза, индуцированных введением цисплатина в МПД, был использован экстракт, содержащий фурокумарины, с учетом данных об их антиоксидантных, противовоспалительных, антипролиферативных свойствах и высоком антикоагулянтном потенциале [Bruni R. et al., 2019]. В качестве препарата сравнения использовали варфарин, принадлежащий к семейству кумаринов. [Popov A. et al., 2013; Witt D.M. et al.,2016]. В результате курсового применения варфарина в дозе 4 мг/кг у мышей-самок на 7-е сутки ПВ и показатель МНО, а также АПТВ увеличивались вплоть до 30-х суток в сравнении с группой, получавшей цисплатин (Рисунок 1а, 1б). На 7-е сутки также снижалась концентрация фибриногена на 55,6% в сравнении со значениями животных, получавших цисплатин, и на 27,3% в сравнении с контролем. На 10-е и 15-е сутки наблюдения концентрация фибриногена у мышей, получавших варфарин, превышала таковую у контрольных животных на 33,3% и 50,0% соответственно. К 20-м суткам отмечено достижение показателями ПВ, МНО, АПТВ контрольных величин, тогда как содержание фибриногена было ниже, чем у животных, получавших цисплатин на 30,8%, превышая величины контрольных животных на 18,2% (Рисунок 1). По данным НПТЭГ при введении варфарина на фоне действия цисплатина к 7-м суткам имело место выраженное угнетение тромбиновой активности и интенсивности свертывания крови (снижение значений КТА на 63,5%, ИКД на 26,0%), с повышением показателя t3 до контрольных значений и увеличением t5 на 6,3% (Рисунок 2). Наблюдаемые изменения параметров НПТЭГ, наряду с изменениями коагулограммы, свидетельствуют о начале гипокоагуляционных изменений, что соответствует данным литературы о наступлении антикоагулянтного эффекта уже через 24 часа после приема варфарина [Лепешко П.Н., Соболь Ю.А., 2017]. К 10-м суткам формировался выраженный гипокоагуляционный ответ, о чем свидетельствует снижение КТА и ИКД на 51,5% и 40,8% соответственно, на фоне значительного прироста t3 на 139,3% и t5 на 28,0% относительно группы цисплатина (Рисунок 2). Гипокоагуляционный ответ связан с ингибированием витамин К- зависимой стадии полноценного синтеза ряда факторов свертывания крови в печени и достижением максимума действия варфарина, который приходится на 72-96 ч после введения препарата и усиливается при ежедневном приеме [Palareti G, Legnani C.,1996; Popov A. et al., 2013; Лепешко П.Н., Соболь Ю.А., 2017]. Гипокоагуляционному состоянию в описанный период соответствуют и все показатели коагулограммы помимо фибриногена, концентрация которого возрастает на 10-15-е сутки, приближаясь к соответствующим значениям группы с цисплатином, что, возможно, связано с провоспалительной активностью варфарина, а также его гепатотоксичностью [Belij S. et al., 2012]. На 15-20-е сутки наблюдения антикоагулянтные эффекты варфарина, период полувыведения которого равен в среднем 40 часам [Penumarthy L., Oehme F. W., 1978], не сказываются на состоянии ГП. Показатели коагулограммы и НПТЭГ стремятся к контрольным величинам, что, по-видимому, связано с отменой курса препарата. Наблюдаемое на 30-е сутки увеличение хронометрических характеристик как НПТЭГ, так и коагулограммы, подтверждает гипокоагуляционный статус ГП, и, предположительно, связано с воздействием цисплатина. Таким образом, применение варфарина в качестве корректора цисплатин- индуцированного нарушения гемостаза приводит к нормализации ГП с последующим развитием гипокоагуляции. С учетом того, что фурокумарины обладают антиоксидантными, противовоспалительными, антипролиферативными свойствами и имеют анальгетический и антикоагулянтный потенциал [Bruni R. et al., 2019; Ahmed S. et al., 2020], их можно рассматривать в качестве корректоров нарушений гемостаза, вызванных применением противоопухолевых агентов. По результатам коагулологического исследования при курсовом применении экстракта, содержащего ФК, концентрация фибриногена снижалась с 7-х по 20-е сутки от значений группы цисплатина, оставаясь на уровне контрольных животных на протяжении всего эксперимента. На 7-е сутки также было отмечено сокращение АПТВ на 8,5% в сравнении с величинами животных из группы цисплатина и на 24,4% от контроля, при этом в сравнении с группой, получавшей варфарин, показатель был ниже на всех сроках исследования, кроме 15-х суток (Рисунок 1б). В этот же период было отмечено снижение значений ПВ и МНО относительно группы варфарина, продолжавшееся до 15-х суток (Рисунок 1а). На 10-е и 15-е сутки концентрация фибриногена у животных, получавших ФК, была на 18,8% и 33,3% ниже, чем в группе с варфарином. С 15-х по 30-е сутки наблюдения возрастало АПТВ по сравнению с группой цисплатина, при этом снижаясь на 20-е и 30-е сутки относительно контрольных значений (Рисунок 1б). Показатели ПВ и МНО возрастали на 9,0% и 10,0% на 15-е сутки в сравнении с группой получавшей цисплатин с достижением величин контроля и группы варфарина на 20-е сутки (Рисунок 1а). Данные НПТЭГ показали, что применение ФК, как и в группе с варфарином, на 7-е сутки приводит к снижению КТА (Рисунок 2а) на 59,2%, без изменения ИКД, с возрастанием t3 (Рисунок 2б) до контрольных величин и нахождением t5 на уровне значений группы с цисплатином. К 10-м суткам КТА и ИКД приближались к контрольным значениям, при этом снижаясь от значений группы цисплатина на 9,3% и 21,4% и увеличиваясь в сравнении с варфарином (Рисунок 2а, 2в) на 87,2% и 32,6% соответственно. Показатели t3 и t5 отображали обратную картину – при сходных значениях с группой контроля их значения были значимо выше величин в группе цисплатина на 17,9% и 16,1% и ниже значений группы варфарина на 50,7% и 9,3% (Рисунок 2б, 2г). Совокупность выявленных изменений на 10-е сутки можно характеризовать, как нормокоагуляционный статус ГП. Таким образом, применение экстракта, содержащего сумму ФК, на данном этапе гиперкоагуляционного ответа ГП на введение цисплатина вызывало эффекты, идентичные таковым в группе с варфарином. При этом ФК, в отличие от варфарина, вызывающего гипокоагуляцию, способствовали нормализации состояния ГП. Схожесть направленности эффектов варфарина и ФК на 7-10 сутки может быть связана со структурными особенностями этих соединений. Фурокумарины, имеющие ту же 4-гидроксикумариновую циклическую часть, что и варфарин, предположительно, способны взаимодействовать с витамин К- эпоксид-редуктазой. На 15-20-е сутки у животных, получавших ФК, отмечено умеренное снижение КТА (Рисунок 2а) и изменения ИКД в пределах контрольных значений, а также прирост по отношению к группам цисплатина и варфарина (Рисунок 2в). Имело место увеличение t3 на 30,3% на 15-е и его снижение на 20-е сутки на 18,9% в сравнении с группой контроля (Рисунок 2б). Показатель t5, соответствовал изменениям в группе, получавшей варфарин на фоне цисплатина, и снижался на 15-е сутки на 12,7% от величин группы цисплатина и 12,7% от группы контроля. При этом на 20-е сутки величина t5, оставаясь ниже значений цисплатина на 8,1%, достигала контроля (Рисунок 2г). В этот период гипокоагуляция, детерминированная цисплатином, компенсируется действием ФК, что подтверждается данными коагулограммы, в сравнении с варфарином, эффекты которого носят следовой характер. Эффект фурокумаринов, приводящий к нормализации параметров НПТЭГ и коагулограммы, может быть связан также с их антиоксидантной активностью. Известно, что фурокумарины способны модулировать передачу сигналов окислительного фактора транскрипции Nrf2 (ядерный фактор 2), благодаря чему происходит подавление активных форм кислорода (АФК) и провоспалительных цитокинов. Помимо этого, фурокумарины могут способствовать повышению устойчивости к окислительному стрессу и др. [Ma Q., 2013; Hassanein E.H.M. et al., 2020]. К 30-м суткам динамика параметров НПТЭГ демонстрирует нормокоагуляционные изменения ГП в отношении прокоагулянтного звена гемостаза с сохраняющейся умеренной хронометрической гипокоагуляцией. Выявленные изменения свидетельствуют о сохранении корректирующего эффекта экстракта, содержащего ФК, и после отмены препарата, тогда как гипокоагуляционные изменения в группе с курсовым приемом варфарина в эти сроки не отличаются от таковых у группы, получавшей цисплатин. Применение экстракта, содержащего фурокумарины, оказывает корректирующее действие на гиперкоагуляцонные изменения, вызванные однократным введением цисплатина в МПД по эффективности сравнимое с варфарином. Преимуществом использования ФК для коррекции нарушений, вызванных цисплатином, оказалось способность к нормализации состояния ГП при гипокоагуляции и высоком риске кровотечения. Для надлежащего функционирования гемостаза необходимо участие таких элементов как сосудистая сеть, печень и костный мозг, обеспечивающих производство факторов свертывания крови, витаминов и клеток. Ввиду низкой селективности химиотерапевтические препараты, воздействуя на быстро делящиеся клетки, помимо клеток опухоли повреждают как кроветворные органы в целом, так и клетки крови в частности, что является одной из наиболее частых причин изменения доз, отсрочки или прекращения терапии [Bloom JC., 1993; Kurtin S., 2012]. В костном мозге (КМ), введение цисплатина в МПД мышам-самкам приводило к снижению общего количества миелокариоцитов от значений контроля (с максимальным отклонением на 2-е сутки на 44,8%) на протяжении всего срока наблюдения за счет понижения содержания незрелых и зрелых нейтрофильных лейкоцитов, эозинофилов и лимфоцитов через сутки поле введения МПД цисплатина (Рисунок 3). Угнетение миелоидного ростка костного мозга сопровождалось снижением общего количества лейкоцитов в периферической крови за счет нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов со 2-х суток исследования. В эритроидном ростке костного мозга признаки анемии сопровождались снижением количества эритронормобластов и нормобластов с первых суток исследования. Сходные изменения наблюдались в периферической крови: уменьшение содержания эритроцитов, гемоглобина и гематокритного числа со 2-х суток и количества ретикулоцитов с 1-х суток исследования. Рисунок 3 – Общее количество миелокариоцитов мышей-самок, получавших варфарин или экстракт, содержащий ФК, на фоне однократного введения цисплатина в МПД Выявленное снижение клеточного пула костного мозга и непосредственно клеток периферической крови, предположительно, связано с усилением процессов апоптоза и повышения в них концентрации АФК, вследствие снижения уровня глутатиона, вызванных применением цисплатина [Prasad S.B., Giri A., Khynriam D.,1998; Смирнов Л. П., Суховская И. В., 2014; Visacri M.B. et al., 2017; Prasad R., Prasad S.B. 2018; Lin S.H. et al., 2020]. Таким образом, введение экспериментальным животным цисплатина в МПД приводило к гипоплазии костного мозга с 1-х суток и к развитию лейкопении и апластической анемии со 2-х суток исследования, сохраняющихся вплоть до 20-х суток с постепенным восстановлением к 30-м суткам наблюдения. Применение варфарина привело к росту общего количества миелокариоцитов с 7-х по 20-е сутки наблюдения с максимальным отклонением на 58,0% на 20-е сутки от значений группы цисплатина (Рисунок 3), при этом значения держались на уровне контрольных величин в течение всего периода исследования, за исключением 10-х суток. В миелоидном ростке КМ в тех же условиях отмечено увеличение количества зрелых нейтрофилов с 10-х по 20-е сутки с наибольшим отклонением от значений цисплатина на 20-е сутки (81,3%), лимфоцитов на 7-е и 20-е сутки с максимальным отклонением на 7-е сутки (109,4%) и моноцитов на 20-е сутки на 66,7% относительно группы цисплатина. Изменения в периферической крови в группе животных, получавших варфарин, соответствовали изменениям в костном мозге: содержание лейкоцитов возрастало от значений группы цисплатина на 7-е сутки на 43,3% за счет повышения лимфоцитов. В эритроидном ростке костного мозга мышей-самок применение варфарина сравнении с группой, получавшей цисплатин, приводило к увеличению количества эритронормобластов на 10-е, 15-е и 30-е сутки с максимальной разницей на 30-е сутки (166,7%), и нормобластов на всех сроках исследования, за исключением 20-х суток. При этом значения перечисленных выше показателей не отличались от величин контрольных животных. В периферической крови в тех же условиях на 7-е сутки возрастало количество эритроцитов, ретикулоцитов и концентрация гемоглобина на 15,1%, 17,3% и 16,9% соответственно. На 10-е сутки исследования у животных, получавших варфарин на фоне действия цисплатина, был отмечен рост гематокритного числа, дальнейшее увеличение количества ретикулоцитов и эритроцитов, вплоть до 15-х суток. При этом содержание эритроцитов и концентрация гемоглобина у группы, получавших варфарин, держались на уровне контрольных величин. После введения варфарина показатели эритроидного ростка костного мозга и периферической крови приближались к значениям группы контроля, кроме эритронормобластов, количество которых возрастало с 10-х по 15-е сутки с пиком отклонения на 15-е сутки на 180,4%, превышая контрольные значения (компенсаторная реакция на анемию, вызванную цисплатином). Полученные данные свидетельствуют о нормализации состояния костного мозга и периферической крови после повреждений, вызванных приемом цисплатина, предположительно за счет влияния варфарина на активность антиоксидантных ферментов [Belij S. et al., 2012]. При этом общее количество лейкоцитов и содержание лимфоцитов, при достижении контрольных величин на 7-е сутки, к 10-м суткам приближались к значениям показателей в группе цисплатина. Тогда как в период с 15- х по 30-е сутки динамика этих показателей у животных, получавших варфарин, соответствовала таковой в группе цисплатина. Подобные изменения могут быть связаны с иммуномодулирующим эффектом варфарина, у которого отмечены как иммуностимулирующие, так и супрессивные эффекты в различных экспериментальных моделях [Belij S. et al., 2012; Popov A. et al., 2013]. Таким образом, курсовое применение варфарина приводило к купированию проявлений гипоплазии в костном мозге и нивелированию эффектов анемии в периферической крови. Применение экстракта, содержащего ФК, на фоне действия цисплатина привело к увеличению общего количества миелокариоцитов на всех сроках наблюдения за исключением 20-х суток (Рисунок 3) в 2 раза превышая значения в группе цитостатика на 7-е сутки, и достижению контрольных величин на 15-е сутки. При этом в миелоидном ростке костного мозга, при применении ФК, с 7-х по 15-е сутки отмечено увеличение и дальнейшее приближение к контрольным величинам количества миелобластов, зрелых нейтрофилов и лимфоцитов. В периферической крови отмечены соответствующие изменения в динамике лейкоцитов. В условиях проведенного исследования выявленные изменения у группы, получавшей ФК, в сравнении со значениями группы цисплатина, свидетельствуют о коррекции цисплатин-индуцированного повреждения клеток костного мозга и периферической крови, предположительно за счет антиоксидантных свойств. Фурокумарины, аналогично флавоноидам, оказывают выраженное антиоксидантное и противовоспалительное действие за счет способности влиять на продукцию и элиминацию АФК, а также на процессы, связанные с повреждением, вызванным свободными радикалами [Budzynska B. et al., 2015]. В эритроидном ростке КМ под влиянием экстракта было отмечено увеличение количества нормобластов от группы цисплатина на 7-е, 10-е и 30-е сутки исследования с максимальным отклонением 7-е сутки (147,1%) и снижение числа клеток относительно значений группы, получавшей варфарин на 27,6% на 15-е сутки. Полученные результаты соотносятся с изменением динамики количества ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови. Таким образом, применение экстракта, содержащего ФК на фоне действия цисплатина, нивелировало проявления миелосупрессии в костном мозге и приводило к снижению лейкопении и симптомов анемии в периферической крови. Существенную роль в нормальном функционировании системы гемостаза играет печень, которая служит местом синтеза ряда факторов свертывающей, противосвёртывающей и фибринолитической систем. В связи с этим повреждение печени может привести к комплексным нарушениям в системе гемостаза [Минов А.Ф., Дзядзько А.М., Руммо О.О., 2010; Куркина И.А., Маевская М.В., Ивашкин В.Т., 2015]. В сыворотке крови животных, получавших цисплатин в сравнении с соответствующими значениями контроля, было выявлено увеличение активности АЛТ и АСТ на 2-е сутки на 17,9% и 22,7% соответственно, с последующим снижением АЛТ на 10-е сутки на 17,8%, а АСТ – на 5-е и 10-е сутки и возрастанием на 15-е сутки на 46,3 % (Рисунок 4а, 4б). Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови в сравнении с контролем возрастала на 5-е и 10-е сутки на 34,5% и 10,5% и снижалась на 7-е и 20-е сутки исследования (Рисунок 4в) на 15,2% и 9,3% соответственно. Повышение уровня АЛТ, АСТ и ЩФ можно объяснить возникновением синдрома цитолиза, вызванного цисплатином. Действительно, цисплатин вызывает повреждение печени через активацию путей воспалительного и окислительного стресса наряду с ассоциированным апоптозом и аномалиями в структуре и функции печени [Omar H.A. et al., 2016]. При этом снижение активности трансаминаз, наблюдаемое на 5-е и 10-е сутки, может свидетельствовать о восстановительных процессах в печени [Кузнецова О.В., Рыбин А.И., Дубинина В.Г., 2013; Ademiluyi A.O. et al., 2014]. Рисунок 4 – Биохимические показатели сыворотки – АЛТ (а), АСТ (б), ЩФ (в) мышей- самок, получавших варфарин или экстракт, содержащий ФК, на фоне однократного введения цисплатина в МПД Применение цисплатина в МПД вызывает гепатотоксичность, проявляющуюся в изменении активности трансаминаз и ЩФ, свидетельствующих о повреждении гепатоцитов и холестазе. После применения варфарина на фоне действия цисплатина у мышей-самок в сыворотке крови было обнаружено значительное увеличение активности АЛТ на 7-е сутки на 55,4%, относительно величин группы цисплатина и на 30,2% от значений контроля (Рисунок 4а). На 15-е и 30-е сутки активность АЛТ снижалась в сравнении со значениями животных, получавших цисплатин на 22,4% и 24,3%, достигая контрольных величин на 20-е сутки наблюдения. Активность АСТ в тех же условиях возрастала на 7-е и 10- е сутки с наибольшим отклонением на 7-е сутки на 70,7% и последующим снижением на 15-и 20-е сутки на 23,0% и 25,0%, достигая значений группы цисплатина и контроля на 30-е сутки (Рисунок 4б). Активность ЩФ в группе варфарина на фоне действия цисплатина увеличивалась на 7-е и 20-е сутки на 30,8% и 44,1%, со снижением на 10-е и 30-е сутки на 15,7% и 21,0% соответственно (Рисунок 4в). Рост активности АЛТ, АСТ и ЩФ через 24 часа после приема варфарина свидетельствует об усугублении повреждения печени, вызванного приемом цисплатина. Отмечено, что варфарин, метаболизирующийся системой цитохрома P450, как и другие производные кумаринов (фенпрокумон и аценокумарол), способен вызывать повреждения печени. При этом отмечено, что варфариновые повреждения встречаются редко и имеют легкую или среднюю степень тяжести [Palareti G, Legnani C.,1996; Arora N., Goldhaber S.Z., 2006; Alaklabi A.A. et al., 2017; Qamar A. et al., 2018]. К 10-15-м суткам активность АЛТ и АСТ и ЩФ начинает снижаться, приближаясь к контрольным значениям, что связано с прекращением приема варфарина. После отмены препарата на 15-е сутки наблюдется значительное увеличение активности ЩФ, что соотносится с данными D.B. Jones и соавт. (1980) о том, что у пациента с холестатической желтухой на фоне применения варфарина при отмене препарата резко поднимался уровень ЩФ при нормальных значениях АСТ. Таким образом, при приеме варфарина на фоне действия цисплатина наблюдается усиление признаков цисплатин-индуцированной гепатотоксичности. Использование экстракта, содержащего ФК, после применения цисплатина приводило к увеличению активности АЛТ на 7-е сутки на 14,8% с последующим снижением с 10-х по 30-е сутки, за исключением 20-х суток наблюдения. При этом с 7-х по 15-е сутки активность АЛТ у животных, получавших экстракт, также снижалась и относительно группы варфарина (Рисунок 4а). В тех же условиях активность АСТ возрастала на 7-е и 10-е сутки на 30,6% и 16,9%, достигая контрольных величин (Рисунок 4б). На 15-е сутки относительно группы цисплатина активность АСТ снижалась на 28,4%, с последующим увеличением на 30-е сутки. В сравнении с группой варфарина активность АСТ при действии ФК снижалась на 7-е и 10-е сутки на 23,5% и 23,6% с последующим увеличением на 20-е и 30-е сутки исследования. В сравнении с группой цисплатина, активность ЩФ при применении ФК падала на 10-е сутки на 22,7% с достижением значений контроля на 15-е сутки и последующим увеличением к 20-м суткам на 28,3% (Рисунок 4в). Активность ЩФ при действии экстракта снижалась на 18,8% и 13,5% на 7-е и 15-е сутки с последующим повышением на 30-е сутки исследования относительно группы животных, получавших варфарин. Снижение активности АЛТ, АСТ и ЩФ с 10-х суток свидетельствует о нивелировании повреждающего действия цисплатина на клетки печени и, предположительно, связано с антиоксидантными свойствами ФК. Так, в ряде исследований показано, что пероральное введение линейных фурокумаринов, в частности, изопимпинеллина и императорина, модулирует активность цитохромов P450 и глутатион S-трансферазы в различных органах и тканях мышей. Эти два семейства ферментов участвуют в метаболизме ксенобиотиков [Kleiner H.E. et al., 2008; Liu W.X. et al., 2012]. Бергаптен обладает гепатопротекторными свойствами при ацетаминофен-индуцированной гепатотоксичности, где центральную роль играет оксидативный стресс. Во время введения экстракта, содержащего ФК на фоне применения цитостатика, отмечено снижение цисплатин-индуцированной гепатотоксичности. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на наличие большого количества побочных эффектов, химиотерапия остается одним из самых эффективных способов лечения больных со злокачественными новообразованиями. Применение цисплатина сопровождается такими побочными эффектами как нефротоксичность, гепатотоксичность, кардиотоксичность, миелотоксичность и также увеличением риска тромбоэмболических осложнений. Возникновение ТО, как и миелотоксичности у онкологических больных, приводит к отсроченному проведению химиотерапии, а в некоторых случаях и к отказу от нее, что может поставить под угрозу контроль над заболеванием и выживаемостью пациентов. Применение антикоагулянтов для лечения и профилактики ТО у онкологических больных осложнено высоким риском кровотечений и склонностью к высокой частоте рецидивов [De Cicco M., 2004; Haddad T.C., Greeno E.W., 2006; Falanga A., Marchetti M., 2013]. Разработана модель нарушения гемостаза при введении цисплатина в МПД, характеризующаяся волнообразными нарушениями гемостатического потенциала от гиперкоагуляции к гипокоагуляционным изменениям. В качестве возможных корректоров нарушений систем гемостаза и крови, вызванных применением цисплатина, перспективно рассматривать группу фурокумаринов. Выявлено, что применение фурокумаринов на фоне действия МПД цисплатина у экспериментальных животных купирует гиперкоагуляцию, не вызывая гипокоагуляционных изменений, в отличие от группы получавшей варфарин. Отмечена нормализация состояния костного мозга и периферической крови у мышей- самок после применения экстракта, содержащего ФК, а также нивелирование гепатотоксичности, вызванной применением цисплатина. ВЫВОДЫ 1. Максимально переносимая доза цисплатина, вызывая цитостатическую миелосупрессию, анемию и нарушения функции печени, приводит к преходящим фазным нарушениям в системе гемостаза: от гиперкоагуляции к гипокоагуляции (за счет коагулопатии потребления), сменяющейся повторным, наиболее выраженным, прокоагулянтным ответом с нормализацией показателей лишь к 30 суткам наблюдения. 2. Варфарин предупреждает развитие второй фазы цисплатин- индуцированной гиперкоагуляции с последующим формированием гипокоагуляционного ответа и ускоренным переходом к нормокоагуляции в условиях отмены препарата. 3. Курсовой прием варфарина, на максимуме антикоагулянтного действия снижает проявления цитостатической миелосупрессии, нейтропении и анемии, но не сокращает сроков их восстановления до конца периода наблюдения. 4. Курсовой прием варфарина, на высоте антикоагулянтного эффекта приводит к выраженному росту активности трансаминаз и щелочной фосфатазы, купируемым при окончании его действия и последующим восстановлением до контрольных уровней к окончанию периода наблюдения. 5. Применение экстракта, содержащего сумму фурокумаринов, купирует цисплатин-индуцированное прокоагулянтное состояние гемостаза на пике гиперкоагуляционного ответа и обеспечивает поддержание нормокоагуляции до 30-х суток исследования. 6. Курсовое применение экстракта, содержащего сумму фурокумаринов, снижает проявления цитостатической миелосупрессии, нейтропении и анемии, сокращая сроки их восстановления до уровней контроля. 7. Применение экстракта, содержащего сумму фурокумаринов, снижает активность трансаминаз и щелочной фосфатазы, нивелируя повреждающее действие цисплатина на клетки печени.