Характеристика регенерации печени при диффузном токсическом повреждении и его коррекция : диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук : 14.03.03
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………………………………… 6
ГЛАВА 1 – СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О РЕГЕНЕРАТОРНОМ ПОТЕНЦИАЛЕ ПЕЧЕНИ В УСЛОВИЯХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ НОРМЫ И ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ (обзор литературы) ……………………… 15
1.1 – Специфика диффузного токсического повреждения печени при воздействии тетрахлорметана…………………………………………………………………. 15 1.2 – Особенности регенерации печени в норме и при токсическом повреждении ………………………………………………………………………………………….. 20 1.2.1 – Паренхиматозные клетки печени и их роль в регенерации …………… 22 1.2.2 – Значение апоптоза и белков теплового шока молекулярной массой 60 и 70 кДа в регенерации печени……………………………………………………………….. 24 1.2.3 – Роль синусоидальных эндотелиальных клеток, резидентных лимфоцитов и тучных клеток в регенерации печени……………………………….. 28 1.2.4 – Роль макрофагов в регенераторных процессах печени …………………. 33 1.2.5 – Регуляция регенерации печени факторами роста и цитокинами …… 39 ГЛАВА 2 – МЕТОДИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………. 47
2.1 – Общая характеристика экспериментальных животных……………………… 47 2.2 – Моделирование диффузного токсического повреждения печени и способа его коррекции……………………………………………………………………………. 48 2.3 – Исследование биохимических показателей крови …………………………….. 50 2.4 – Оценка гематологических показателей экспериментальных животных 50 2.5 – Гистологическое исследование ткани печени……………………………………. 51 2.6 – Иммуногистохимическое исследование ткани печени экспериментальных животных ……………………………………………………………….. 54 2.7 – Оценка апоптоза в ткани печени экспериментальных животных методом TUNEL…………………………………………………………………………………………………… 58 2.8 – Иммуноферментные методы анализа ……………………………………………….. 58
3
2.8.1 – Исследование содержания цитокинов в плазме крови экспериментальных животных ……………………………………………………………….. 59 2.8.2 – Исследование содержания цитокинов в ткани печени экспериментальных животных ……………………………………………………………….. 59
2.10 – Статистические методы анализа, использованные в работе для обработки экспериментальных данных …………………………………………………… 61 ГЛАВА 3 – ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ ПЕЧЕНИ НА РАННИХ СТАДИЯХ ДИФФУЗНОГО ТОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ И ЕГО КОРРЕКЦИЯ……………………………………………………………………………………….. 62
3.1 – Структурные изменения в печени при воздействии тетрахлорметана .. 62 3.2 – Структурные изменения в печени при коррекции токсического повреждения ………………………………………………………………………………………….. 65 3.3 – Показатели клеточной и внутриклеточной регенерации печени в норме при воздействии тетрахлорметана ………………………………………………………….. 66 3.4 – Показатели клеточной и внутриклеточной регенерации печени при коррекции токсического повреждения ……………………………………………………. 68 3.5 – Характеристика альтеративных процессов и апоптоза в ткани печени при токсическом повреждении ……………………………………………………………………… 69 3.6 – Характеристика альтеративных процессов в ткани печени при коррекции токсического повреждения …………………………………………………………………….. 71 3.7 – Продукция белков теплового шока 60 и 70 кДа в норме и при токсическом повреждении печени ………………………………………………………………………………. 71 3.8 – Продукция белков теплового шока 60 и 70 кДа при коррекции токсического повреждении печени …………………………………………………………. 74 3.9 – Коллаген в ткани печени в норме при токсическом повреждении тетрахлорметаном ………………………………………………………………………………….. 75 3.10 – Коллаген в ткани печени при коррекции токсического повреждения . 76 Список статей, опубликованных по материалам главы 3…………………………… 78
4
ГЛАВА 4 – ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ЕГО КОРРЕКЦИИ ………………………………………………………………………………………………. 79
4.1 – Биохимические показатели экспериментальных животных в норме и при токсическом воздействии тетрахлорметана…………………………………………….. 79 4.2 – Биохимические показатели экспериментальных животных при коррекции токсического повреждения ……………………………………………………. 82 4.3 – Изменение гематологических показателей у крыс в норме и при токсическом воздействии тетрахлорметана…………………………………………….. 83 4.4 – Изменение гематологических показателей у крыс при коррекции токсического повреждения …………………………………………………………………….. 84 Список статей, опубликованных по материалам главы 4…………………………… 88 ГЛАВА 5 – РОЛЬ КЛЕТОЧНОГО КОМПОНЕНТА СТРОМЫ ПЕЧЕНИ В РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ПРОЦЕССАХ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ И ЕГО КОРРЕКЦИИ ………………………………………………………………………………………. 89
5.1 – Синусоидальные эндотелиальные клетки в норме и при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном …………………………………………………. 89 5.2 – Синусоидальные эндотелиальные клетки при коррекции токсического повреждения печени ………………………………………………………………………………. 91 5.3 – Макрофаги в норме и при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном ………………………………………………………………………………….. 91 5.4 – Макрофаги при коррекции токсического повреждения печени …………. 92 5.5 – Тучные клетки в норме и при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном ………………………………………………………………………………….. 93 5.6 – Тучные клетки при коррекции токсического повреждения печени тетрахлорметаном ………………………………………………………………………………….. 95 5.7 – CD 45+- и CD 3+-лейкоциты в норме и при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном ………………………………………………………………………. 96
5
5.8 – CD 45+ – и CD 3+-лейкоциты при коррекции токсического повреждения печени……………………………………………………………………………………………………. 98 Список статей, опубликованных по материалам главы 5…………………………. 100 ГЛАВА 6 – ЦИТОКИНОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ ПЕЧЕНИ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ И ЕГО КОРРЕКЦИИ ….. 101
6.1 – Цитокиновый профиль плазмы крови экспериментальных животных в норме и при токсическом повреждении ………………………………………………… 101 6.2 – Цитокиновый профиль плазмы крови экспериментальных животных при коррекции токсического повреждения ………………………………………………….. 103 6.3 – Цитокиновый профиль печени экспериментальных животных в норме и при токсическом повреждении……………………………………………………………… 103 6.4 – Цитокиновый профиль печени экспериментальных животных при коррекции токсического повреждения ………………………………………………….. 105 6.5 – Концентрация фактора стволовой клетки в крови в норме и при токсическом повреждении ……………………………………………………………………. 105 6.6 – Концентрация фактора стволовой клетки в крови при коррекции токсического повреждении …………………………………………………………………… 107 6.7 – Концентрация фактора стволовой клетки в печени при коррекции токсического повреждения …………………………………………………………………… 107 6.8 – Концентрация фактора стволовой клетки в печени при коррекции токсического повреждения …………………………………………………………………… 108 Список статей, опубликованных по материалам главы 6…………………………. 109 ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………………………. 110
ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………………………………….. 117 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………………………….. 118 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ…………………….. 119 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………………… 121 ПЕРЕЧЕНЬ ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА…………………………………… 149
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
Патологии печени занимают ведущее место в структуре гастроэнтерологической смертности. В экономически развитых странах заболевания печени входят в число шести основных причин смерти пациентов, составляя 15-20 случаев на 100 тыс. населения [4]. Применение широкого спектра токсичных веществ в промышленных процессах, таких как производство красок, обезжиривание, обработка металлов, обслуживание и производство в авиационной и автомобильной промышленности, возможные аварии на химический объектах, вероятность террористических актов с применением высокотоксичных соединений, рост числа бытовых интоксикаций определяют необходимость исследования регенераторных процессов печени при токсическом повреждении и поиск новых подходов для терапии заболеваний печени.
К числу самых известных высокотоксичных химических агентов относится тетрахлорметан (CCl4), который является гепатотропным ядом и потенциальным канцерогеном (IARC группа 2В). На сегодняшний день, несмотря на введенные ограничения по использованию CCl4, он применяется в промышленности как растворитель масел, жиров, каучука, битумов, смол, а также для производства менее разрушительных хладагентов [6, 12] и анализа водных сред на нефтепродукты. CCl4 способен сохраняться в тропосфере до 30- 50 лет, а период его химического полураспада в воде при 25°С составляет 7000 лет [231]. Токсическое воздействие CCl4, в зависимости от дозировки, способно приводить к различным повреждениям печени, включая некроз гепатоцитов, фиброз, цирроз печени и гепатокарциному [191, 185]. В связи с тем, что повреждение печени CCl4 приводит не только к деструкции гепатоцитов перевенозной зоны, но и носит диффузный характер [18], вовлекая в процесс непаренхиматозные клеточные элементы и внеклеточный матрикс, его можно
7
считать лучшей репрезентативной экспериментальной моделью для изучения стромально-паренхиматозных взаимодействий и их роли в регенерации.
При CCl4-интоксикации сохранившиеся гепатоциты являются основным регенераторным потенциалом. Вместе с этим, регуляция деструктивных и пролиферативных процессов в поврежденной печени во многом зависит от функционального состояния непаренхиматозных клеток [158, 245]. Роль данных клеток в регенерации печени изучена недостаточно, в литературе не представлены данные о их количественном изменении на ранних сроках токсического повреждения. Известно, что синусоидальные эндотелиальные клетки, лимфоциты, тучные клетки, макрофаги являются неотъемлемыми участниками воспалительной реакции [243], развивающейся в ответ на действие гепатотропного яда. Макрофагам печени, обладающим онтогенетической и функциональной гетерогенностью, принадлежит ключевая роль в поддержании гомеостаза и иммунологической толерантности органа в условиях физиологической нормы, а также в регуляции различных стадий патологического процесса при токсическом повреждении [226]. Острое токсическое повреждение печени независимо от вида токсиканта всегда сопровождается макрофагальной инфильтрацией [113]. Установлено, что на начальных этапах токсического повреждения печени преобладают M1-подобные макрофаги, обеспечивающие санацию очага воспаления, за счет фагоцитоза и привлечения нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. Завершающие стадии воспалительного процесса сопровождаются переходом макрофагов к М2- подобному фенотипу, что способствует ангиогенезу и регенерации [154, 156, 162]. Несмотря на противоположные функции подмножеств макрофагов печени в прогрессировании заболевания или его регрессии, они являются перспективной мишенью для новых терапевтических подходов в гепатологии. В качестве агента, изменяющего активность макрофагов, может быть выбрана натриевая соль 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона (АФГ, аминофталгидразид натрия), идентификационный номер в PubChem 9794222.
8
АФГ изменяет функционально-метаболическую активность макрофагов, подавляя продукцию провоспалительных цитокинов [21].
Таким образом, определение количественного соотношения непаренхиматозных клеток в ткани печени, каких как макрофаги, лейкоциты, тучные и синусоидальные эндотелиальные клетки, а также оценка локального и системного уровня биологически активных медиаторов может иметь важное значение при разработке эффективных стратегий терапии токсических повреждений.
Цель исследования – охарактеризовать регенераторные процессы в печени при диффузном токсическом повреждении и его коррекции.
Задачи исследования:
1. Определить регенераторную стратегию гепатоцитов при действии гепатотропного яда тетрахлорметана.
2.Выявить характер альтеративных изменений и реакцию белков теплового шока массой 60 и 70 кДа в гепатоцитах при диффузном токсическом повреждении печени.
3.Оценить реакцию клеточного компонента стромы (CD45+, CD3+ лейкоцитов, F4/80 макрофагов, синусоидальных эндотелиальных и тучных клеток) в регуляции регенераторных процессов печени при диффузном токсическом повреждении.
4. Провести сравнительный анализ особенностей локального и системного цитокинового профиля при диффузном токсическом повреждении печени.
5. Оценить возможность коррекции регенераторных процессов в печени аминофталгидразидом натрия при ее токсическом повреждении.
Научная новизна. В рамках данного исследования впервые на ранних стадиях токсического повреждения печени CCl4 и его коррекции путем воздействия на макрофаги аминофталгидразидом натрия (АФГ) проведена комплексная морфометрическая оценка стромально-паренхиматозных изменений и представлена динамика количественного изменения основных
9
непаренхиматозных клеток (CD3+, CD45+ лейкоциты, тучные клетки, синусоидальные эндотелиальные клетки, макрофаги F4/80).
Установлено, что повреждающее действие гепатотропного яда в ранние сроки характеризуется увеличением индекса альтерации, апоптозом гепатоцитов, накоплением гранул белков теплового шока в цитоплазме клеток печени. Механизмы регенерации печени проявляются в виде компенсаторно- приспособительных реакций, которые выражаются в повышении метаболической активности сохранившихся гепатоцитов, усилении внутриклеточной регенерации за счет увеличения количества двуядерных гепатоцитов и клеточной регенерации, характеризующейся увеличением митотически делящихся гепатоцитов.
Подтверждено, что увеличение количества непаренхиматозных клеток печени, таких как CD3+, CD45+ лейкоциты, тучные клетки, сопровождается развитием острой воспалительной реакции и усилением фиброгенеза. Синусоидальные эндотелиальные клетки и макрофаги печени выступают в роли мишени токсического воздействия.
Впервые проведен сравнительный анализ локального и системного цитокинового профиля в ранние сроки после воздействия гепатотропного яда. В ответ на токсическое повреждение CCl4 на локальном уровне (в ткани печени) на ряду с увеличением количества макрофагов и синусоидальных клеток возрастает концентрации провоспалительных цитокинов IL-1α, IL-18, TNF-α, тогда как на системном уровне (плазма крови) воспалительная реакция развивается за счет повышенной продукции TNF-α. Подавление выработки противовоспалительного цитокина IL-10 на системном уровне компенсируется путем повышения локальной концентрации данного цитокина. Диффузное повреждение печени сопровождается выбросом фактора стволовой клетки в системный кровоток предположительно в результате повышенного синтеза данного ростового фактора гепатоцитами и печеночными макрофагами, что необходимо для привлечения стволовых клеток из костного мозга к регенерирующему органу.
10
Воздействие на макрофаги АФГ при CCl4-интоксикации способствует увеличению числа макрофагов (F4/80) и синусоидальных эндотелиальных клеток в ткани печени, уменьшает количество очаговых некрозов гепатоцитов, снижает степень фиброза и инфильтрации ткани лейкоцитами CD3+, CD45+. Действие аминофталгидразида (АФГ), обладающего свойством модуляции активности моноцитов-макрофагов и антиокислительной активностью, сопровождается нормализацией биохимический показателей, а также снижением концентрации провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-18 в плазме крови и уменьшением уровня IL-6 и IFN-γ в ткани печени. Применение АФГ оказывает протективное действие на гепатоциты при воздействии CCl4, что особенно выражено на поздних сроках эксперимента и проявляется в уменьшении числа TUNEL-позитивных гепатоцитов, а также в увеличении количества клеток с гранулами белков теплового шока HSP60, обладающих цитопротекторной функцией.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют общепринятые представления о механизмах регенерации печени на ранних сроках после воздействия гепатотропного яда. Практическая значимость работы обусловлена новыми данными об изменении количественного соотношения непаренхиматозных клеток печени на ранних стадиях диффузного токсического повреждения. Материалы работы могут быть включены в качестве дополнительных клинико-диагностических методов, а также для разработки подходов коррекции токсического повреждения печени, основанных на изменении морфофункционального состояния макрофагов. Теоретические и практические аспекты диссертационной работы могут быть использованы в образовательном процессе для подготовки специалистов медико-биологического профиля.
Положения, выносимые на защиту:
1. При диффузном токсическом повреждении печени усиление процессов альтерации сопровождается возрастанием показателей клеточной и внутриклеточной регенерации, а также повышением метаболической активности
11
сохранившихся гепатоцитов. Уменьшение количества синусоидальных эндотелиальных клеток и макрофагов печени, которые являются реактивным компонентом стромы, свидетельствует о том, что данные типы клеток выступают в роли мишени токсического воздействия.
2. При интоксикации CCl4 апоптоз является одним из механизмов гибели гепатоцитов, о чем свидетельствует увеличение количества TUNEL-позитивных клеток по мере возрастания срока воздействия токсиканта. Увеличение содержания HSP70 в гепатоцитах на 3 сутки и HSP60 на 7 сутки при воздействии токсиканта можно рассматривать как адаптивную реакцию, предотвращающую избыточный апоптоз гепатоцитов.
3. В ответ на токсическое повреждение на локальном уровне (в ткани печени) иммунный ответ обусловлен увеличением концентрации провоспалительных цитокинов IL-1α, IL-18, TNF-α, тогда как на системном уровне (плазма крови) воспалительная реакция развивается за счет повышенной продукции TNF-α. Подавление выработки противовоспалительного цитокина IL-10 на системном уровне компенсируется путем повышения локальной концентрации данного медиатора.
4. Применение метода коррекции, с использованием аминофталгидразида, способствует снижению лейкоцитарной инфильтрации, нивелирует воспалительные процессы в печени за счет влияния на секреторную активность иммунокомпетентных клеток, уменьшая концентрацию провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-18 в плазме крови и IL-6, IFN-γ в гомогенатах, что снижает апоптоз, фиброз, тяжесть холестаза и приводит к нормализации синтеза белка.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе курса «Патохимия, диагностика» на кафедре медицинской биохимии и биофизики Института естественных наук и математики ФГАОУ ВО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина», а также в научных разработках лаборатории морфологии и биохимии ФГБУН Институт иммунологии и физиологии УрО РАН.
12
Достоверность полученных результатов. Теоретические заключения, положенные в основу работы, выведены на основании анализа большого объёма современной научной литературы по исследуемому вопросу, что определяет направление исследования. Степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом выборки, использованием современных высокоинформативных методов (биохимические методы исследования, иммуноферментный анализ, иммуногистохимическое окрашивание) и высоко- технологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов. Полученные результаты не противоречат данным, представленным в независимых источниках другими авторами. Научные положения и выводы, сформулированные в работе, соответствуют заявленной цели и задачам.
Личный вклад автора. Соискатель степени кандидата биологических наук Шафигуллина З. А. принимала непосредственное участие в выполнении всех этапов диссертационного исследования. Экспериментальная часть, поиск и анализ литературы по теме исследования, статистическая обработка результатов, написание и оформление диссертации выполнено автором самостоятельно. Результаты исследования в виде публикаций в научных периодических изданиях и докладов на конференциях представлены совместно с соавторами.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследования доложены на I Международной (71 Всероссийской) научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Россия, г. Екатеринбург, 2016 г.), «Первой Всероссийской научной конференции «Токсикология и радиобиология XXI века» (Россия, г. Санкт-Петербург, 2017 г.), XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Россия, г. Санкт-Петербург, 2017 г.), V съезде Российского общества патологоанатомов (Россия, Челябинск, 2017 г.), XI Всероссийском конгрессе молодых ученых-биологов с международным участием «Симбиоз-Россия 2019» (Россия, г. Пермь, 2019 г.), 2020 Уральском
13
Симпозиуме по Биомедицинской
Информационным Технологиям (2020 Ural Symposium on Biomedical Engineering, Radioelectronics and Information Technology (USBEREIT)) (Россия, г. Екатеринбург, 2020 г.), Международной конференции «Актуальные вопросы органической химии и биотехнологии» (Россия, г. Екатеринбург, 2020 г.), Второй всероссийской научной конференции «Токсикология и радиобиология XXI века» (Россия, г. Санкт-Петербург, 2020), Научно-практической конференции с международным участием «Путь в науку», (Россия, г. Москва, 2020), Научно-практической конференции с международным участием «Применение высоких инновационных технологий в профилактической медицине» (Республика Узбекистан, г. Андижан, 2020). Результаты диссертационного исследования были апробированы на VI Международном интеллектуальном конкурсе «Discovery Science: University – 2017» (Россия, Москва, 2017 г.) и отмечены дипломом победителя, представлены на конкурсе работ молодых ученых и специалистов 2019 г. (Организаторы: редакция журнала «Токсикологический вестник» и учредитель журнала «Токсикологический вестник» – ФБУЗ РПОХБВ Роспотребнадзор; Россия, г. Москва, 2019 г.) и отмечены дипломом за лучшую работу в области лекарственной токсикологии.
Публикации. Всего по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 1 статья (Q1), индексируемая в базе данных Web of Science, 2 статьи, индексируемые в базе данных Scopus, 6 статей в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 3 – тезисы докладов российских и международных конференций.
Конкурсная поддержка. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта No 19-315-90012 и бюджетной программы ИИФ УрО РАН No Гос. регистрации – АААА-А18-118020590107-0.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания экспериментальных животных и методики эксперимента, 4 глав с результатами собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной
Инженерии, Радиоэлектронике и
14
литературы, включающего 250 источников, среди которых 44 русскоязычных и 206 англоязычных. Работа содержит 16 таблиц и 10 рисунков.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность к.б.н., старшему научному сотруднику ИИФ УрО РАН Гетте И. Ф. за совместное проведение биохимических исследований, д.м.н., профессору УГМУ Сенцову В. Г. за помощь в дизайне модели токсического повреждения, д.м.н., профессору Абидову М. Т. за предоставление аминофталгидразида натрия, используемого при коррекции токсического повреждения печени. Особую благодарность автор выражает ведущему научному сотруднику ИИФ УрО РАН, к.м.н., доценту Медведевой С. Ю. за неоценимую помощь в моделировании диффузного токсического повреждения и описании патологических изменений печени.
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.8 (211 отзывов)
5 (8 отзывов)
4.2 (6 отзывов)
4.8 (2878 отзывов)
5 (21 отзыв)
4.7 (46 отзывов)
4.5 (9 отзывов)
5 (285 отзывов)
5 (1241 отзыв)
