Идентификация и количественное определение баклофена в биологических объектах хроматографическими и тандемными методами

Актуальность темы. Проблема немедицинского употребления лекарств
последнее десятилетие стала одной из самых острых. На эту тему ведутся
споры, запрещают продажу некоторых препаратов без рецепта. Но желающих
получить «аптечный наркотик» по-прежнему остается значительное количество
[22].
Особую озабоченность вызывает злоупотребление лекарственными
препаратами, оказывающими обезболивающее, а также снотворное и
седативное действие. Свободный доступ к таким веществам в аптечной сети
способствует распространению токсикомании. По данным статистических
исследований, повышение спроса на подобные препараты привело к
увеличению числа острых отравлений, в том числе и со смертельным исходом.
К их числу следует отнести буторфанол, донормил, кетанал, имован,
феназепам, амитриптилин, декстрометорфан. При этом круг таких препаратов
постоянно расширяется, сюда входит такое лекарственное средство как
баклофен. В связи с этим чаще стали появляться сообщения об отравлениях
баклофеном [8, 45, 63, 80, 91-92].
В 2012 г в отделении острых отравлений КГБУЗ «Красноярская
межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи им. Н.С.
Карповича» (КГБУЗ «КМКБСМП им. Н.С. Карповича») зафиксировано 15
случаев острых отравлений баклофеном, в 2011 г – 16 случаев, в 2010 г – 23
случая.
Наличие случаев отравления баклофеном обусловливает необходимость
изучения данного соединения в химико-токсикологическом и судебно-
химическом аспекте.
Баклофен по своей химической структуре является производным γ-
аминомасляной кислоты (ГАМК). Основное проявление его
фармакологической активности – антиспастическое действие, уменьшение
мышечного напряжения; кроме того, баклофен оказывает также
анальгезирующее действие [25].
Для анализа баклофена используют спектроскопические и
хроматографические методы: метод газовой хроматографии [64], газовой
хромато-масс-спектрометрии [116] и высокоэффективной жидкостной
хроматографии с ультрафиолетовым [79, 106], флуоресцентным [69], масс-
селективным [73, 77] или электрохимическим детекторами, а также
капиллярный электрофорез [54, 59].
Вместе с тем, анализ литературных данных показал, что
систематического исследования баклофена в химико-токсикологическом и
судебно-химическом плане не проводилось.
Разработанные методики определения баклофена предусматривают
использование дорогостоящих и труднодоступных реагентов и детекторов и
сложны для использования при рутинном анализе.
Для подтверждения диагноза отравления баклофеном необходимо иметь
надежные, достоверные и доступные методы его качественного и
количественного определения в биологических объектах.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась
разработка новых и усовершенствование существующих хроматографических
методик идентификации и количественного определения баклофена в
биологических объектах при судебно-химическом и химико-
токсикологическом исследовании.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
1. Изучить хроматографические условия определения баклофена
методами ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС/МС.
2. Оценить возможности применения существующих методик
скрининга, используемых в химико-токсикологическом анализе и судебно-
химических исследованиях, для идентификации баклофена в биологических
объектах.
3. Разработать алгоритмы пробоподготовки для хроматографического
определения баклофена в биологических объектах.
4. Создать хроматографические методики анализа биологических
объектов для идентификации и количественного определения баклофена и
апробировать их на реальных образцах, установить метрологические
характеристики разработанных методик.
5. На основании разработанных методик предложить схемы судебно-
химического и химико-токсикологического исследования для идентификации и
количественного определения баклофена в биологических объектах.
Научная новизна. Установлено, что при исследовании баклофена
методом ГХ/МС необходимо проведение стадии дериватизации. Впервые
доказано влияние различных модификаторов подвижной фазы на
аналитический сигнал баклофена при определении его методом ВЭЖХ-УФ.
Подобраны условия MRM-переходов баклофена при использовании метода
ВЭЖХ-МС/МС. Показана необходимость использования метода ВЭЖХ с
различными вариантами детектирования при определении баклофена в
образцах крови и мочи.
Практическая значимость. Впервые предложен комплекс методик
обнаружения, идентификации и количественного определения баклофена в
биологических объектах хроматографическими и тандемными методами для
целей химико-токсикологических и судебно-химических исследований.
Полученные результаты используются на кафедрах биологической химии с
курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ
ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф.
В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РФ и фармацевтической химии ГБОУ
ВПО «Сибирский государственный медицинский университет»
Минздравсоцразвития России в качестве лекционного материала и
методических рекомендаций для практических занятий по темам
«Хроматография» и «Спектрофотометрия».
Разработанные методики внедрены в практику судебно-химических
отделений КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской
экспертизы», ОГУЗ «Челябинское областное бюро судебно-медицинской
экспертизы», отдела газожидкостной, жидкостной и времяпролетной масс-
спектрометрии Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ
ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф.
В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РФ. Разработано информационное письмо
«Об определении баклофена в биологических объектах», предназначенное для
судебных экспертов-химиков бюро судебно-медицинской экспертизы, врачей-
лаборантов химико-токсикологических лабораторий.
Основные положения, выносимые на защиту:
 хроматографические условия определения баклофена методами ГХ/МС,
ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-МС/МС;
 способы пробоподготовки биологических объектов для определения
баклофена;
 результаты разработки методик идентификации и количественного
определения баклофена в биологических объектах, проверки
правильности и повторяемости разработанных методик;
 результаты апробации разработанных методик для идентификации и
количественного определения баклофена в реальных биологических
объектах.
Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная
работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры
аналитической и органической химии Института цветных металлов и
материаловедения Сибирского федерального университета и кафедры
фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского
университета.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены на VI Всероссийской научно-технической конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь и наука в третьем
тысячелетии» (Красноярск, 2010); на VI Всероссийской конференции молодых
учёных, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012»
(Санкт-Петербург, 2012); на I Международной научно-практической
конференции «Современная химико-токсикологическая экспертиза» I
International scientific conference ACTE’2013 (Москва, 2013); на Всероссийской
конференции «Теория и практика хроматографии» с международным участием,
посвященной памяти проф. М.С. Вигдергауза (Самара, 2015); на научных
семинарах кафедры аналитической и органической химии ИЦМиМ СФУ
(Красноярск, 2008-2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных
работ, в том числе 5 – в изданиях, рекомендованные ВАК РФ.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись
на базе Центра коллективного пользования Сибирского федерального
университета (г. Красноярск) и в судебно-химическом отделении КГБУЗ
«Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (г.
Красноярск), а также в сотрудничестве с коллективами других научных
организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория
Красноярского государственного медицинского университета имени проф. В.Ф.
Войно-Ясенецкого Минздрава РФ (г. Красноярск), отделение острых
отравлений МБУЗ «Городская клиническая больница скорой медицинской
помощи №6 им. Н.С. Карповича» (г. Красноярск). Выражаем искреннюю
благодарность сотрудникам указанных учреждений.
Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты,
приведенные в диссертации, получены самим автором или при его
непосредственном участии. Автором выполнены исследования по изучению
спектроскопических и хроматографических характеристик баклофена, по
разработке методик качественного и количественного определения баклофена в
биологических жидкостях (крови, мочи), по оценке пригодности методик
химико-токсикологического и судебно-химического скрининга для
обнаружения баклофена, по применению разработанных методик для анализа
реальных образцов биологических объектов. Обсуждение полученных
результатов и подготовка материалов для публикаций проводилась совместно с
научным руководителем и соавторами.