Иммунологические показатели в прогнозировании течения и экспериментальной терапии низкодифференцированных глиальных опухолей

Характеристика клинического материала и методов исследования
В проведенном нами исследовании приняли участие 60 пациентов,
которые были разделены на 3 группы. В основную группу вошли 30 пациентов
с впервые выявленной супратенториальной HGG. Возраст варьировал в
интервале от 22 до 77 лет, медиана составила 56 лет. В исследование приняло
участие 17 мужчин и 13 женщин. В группу сравнения вошло 15 пациентов с
впервые выявленной супратенториальнойLGG. Возраст варьировал в
интервале от 38 до 69 лет, медиана составила 52 года. В исследовании приняло
участие 9 мужчин и 6 женщин. В контрольную группу вошло 15 пациентов с
впервые выявленной менингиомой супратенториальной локализации. Возраст
варьировал в интервале от 33 до 73 лет, медиана составила 57 лет. В
исследование приняло участие 5 мужчин и 10 женщин. При поступлении не
менее 80% пациентов во всех группах имели 70 и более баллов по шкале
Карновского. Сравнительная характеристика групп больных по возрасту, полу,
функциональному состоянию и сопутствующей патологии не выявила
значимых отличий между группами пациентов, что позволило нам проводить
исследование. Исследование одобрено этическим комитетом при ФГБУ
«РНИОИ» Минздрава России – протокол заседания совета по этике №28 от
20.11.2018г.Откаждогопациентабылополученодобровольное
информированное согласие на работу с образцами его тканей и использование
полученных результатов в научных целях.
Интраоперационно у пациентов основной группы и группы сравнения
проводился забор опухолевой ткани, у пациентов контрольной группы –
неизмененной нейроглии, прилежащей к менингиоме, в функционально
незначимых зонах под контролем нейрофизиологического мониторинга.
Нарастание неврологического дефицита в послеоперационном периоде у
пациентов контрольной группы не отмечено. В последующем проводилась
гистологическая и ИГХ верификация опухоли, методом PCR-RT определение
статуса мутации в генах IDH и уровня метилирования промотора MGMT у
пациентов основной группы. Методом ИФА определяли локальные уровни
цитокинов (IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-α, IFN-γ, TNF-α), а методом
проточной цитофлуориметрии – экспрессию маркеров ОСК (CD44+, CD133+) во
всех биоптатах. Таким образом, мы смогли проследить изменение локального
цитокинового статуса и экспрессии маркеров ОСК в последовательности:
неизмененная нейроглияLGGHGG.
Характеристика экспериментальной части исследования
Висследованиибылииспользованыштаммыротавируса,ранее
выделенные в Ростовском институте микробиологии и паразитологии,
получившие название ротавирус группы К штамм №100, №228. Штаммы были
охарактеризованы как ротавирус с помощью электронно-микроскопических,
серологических и генетических методов, аттенуированы и в настоящее время
являются апатогенными (Колпаков С.А. и соавт., 2014).
Оценка их природной онколитической активности проводилась на
клеточных линиях глиобластомы человека T98G и U87MG с помощью
колориметрического теста оценки метаболической активности (МТТ теста),
проточной цитофлуориметрии, изучения патоморфологических изменений в
культурах клеток.
Критерии включения:
1.Впервые выявленная HGG, LGG или менингиома головного мозга
супратенториальной локализации, при которой первым этапом показано
оперативное лечение – удаление опухоли.
2.Отсутствие предшествующих операций на головном мозге, химио-
и лучевой терапии.
3.ОтсутствиеинойпатологииЦНСподанныманамнеза и
нейровизуализации: нарушения мозгового кровообращения, средней степени и
тяжелой черепно-мозговой травмы, нейродегенеративных и инфекционных
заболеваний ЦНС.
4.Отсутствие иной онкопатологии.
5.Отсутствие сопутствующей патологии в стадии декомпенсации.
6.Пациенты старше 18 лет.
7.Информированное добровольное согласие пациента на участие в
исследовании.
Критерииисключения:несоответствиехотябыодногоиз
вышеперечисленных критериев.
Статистическая обработка
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета
STATISTICA13(StatSoftInc.,США).Принормальном(Гауссовом)
распределенииданныхиспользовалсякритерийСтьюдента.Вслучае
ненормального распределения достоверность отличий между выборками
оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.
Значения представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха – 25
и 75 процентили (Ме [LQ; UQ]). Результаты считались статистически
достоверными при p<0,05. Поиск прогностических параметров (предикторов) прогрессирования HGG был осуществлен с помощью метода RОС-анализа (receiver operating characteristic). Результаты исследования Особенности содержания цитокинов в ткани низкодифференцированных глиальных опухолей При изучении локальных уровней цитокинов в неизмененной нейроглии и ткани высокодифференцированной глиальной опухоли статистически достоверных отличий не обнаружено, что может свидетельствовать о «невидимости» опухоли на данной стадии для иммунной системы и создании благоприятных условий для ее дальнейшего роста и прогрессирования. При сравнении цитокинового состава HGG и неизмененной нейроглии нами выявлены статистически значимые отличия в содержании IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α. Уровни IL-1β, IFN-α, IFN-γ не имели статистически достоверных отличий. Так, выявлено более низкое содержание IL-2 в супернатанте HGG: в 3,7 раза ниже, чем в ткани мозга – 8,1 (6,1; 12,4) против 30,2 (20,4; 49,5); IL-4 в 3,8 раза ниже: 0,8 (0,4; 1,5) против 3,0 (2,1; 7,4); IL-10 в 2,8 раза ниже: 2,7 (1,8; 3,9) против 7,6 (3,9; 8,7); TNF-α ниже в 2,2 раза: 2,9 (2,2; 5,0) против 6,3 (4,9; 9). Напротив, уровень IL-6 в супернатанте HGG оказался в 27,6 раза выше, чем в нормальной мозговой ткани: 27,6 (2,5; 51,6) против 1,6 (0,7; 3,7), а IL-8 в 44,4 раз выше: 71,1 (31,7; 122,8) против 1,6 (0,7; 3,7) (рисунок 1).Отмеченостатистическидостоверное,разнонаправленное изменениесодержанияпровоспалительныхцитокиновиснижение противовоспалительных цитокинов. 80пг/мл/г белкаp<0,05HGG 60Неизмененная нейроглия р<0,05p<0,05 p<0,05p<0,05 10p<0,05 IL-2IL-4IL-6IL-8IL-10TNF-α Рисунок 1. Сравнительная характеристика содержания цитокинов в супернатанте HGG и неизмененной нейроглии. Ось Y – медиана содержания (пг/мл/г белка) Как видно из графика (рисунок 1), основные изменения касаются повышения IL-6 и IL-8 и, по нашему мнению, это обусловлено их влиянием на ангиогенез. Среди множества функций IL-6 можно выделить способность активировать эпителиально-мезенхимальный переход, блокировать апоптоз опухолевых клеток (Kinoshita H. et al., 2013). Также в ряде работ in vitro отмечена его способность повышать устойчивость опухолевых стволовых клеток к радиохимиотерапии (Jin X. et al., 2012). Известно, что IL-8 способен стимулировать ангиогенез и поддерживать рост и инвазию HGG (Kosmopoulos M. et al., 2018). Отмечена его способность стимулировать ангиогенез опухоли, активируя рецепторы к VEGF, даже в отсутствии VEGF (Lai Y. et al., 2011). Также отмечена способность клеток глиобластомы продуцировать IL-8, являющегося для этих новообразований аутокринным фактором прогрессии (Zhang H. et al., 2011). Статистически достоверные изменения в локальном содержании цитокинов между высоко- и низкодифференцированными глиомами были аналогичны, но в меньшей степени выраженности. При изучении молекулярно-генетических аберраций в основной группе нами был сделан акцент на наиболее клинически значимые и доказанные, а именно: мутации в генах IDH, уровень метилирования промотора MGMT. Мутация гена IDH1 выявлена у 3 пациентов, что составило 10%. При оценки локального цитокинового состава нами выявлены статистически достоверные отличия в содержании IL-4, IL-6, IL-8. У больных с наличием мутации в генах IDH тканевой уровень IL-4 был в 32 раза выше, чем у больных без мутации: 25,3 (13,1; 28,2) против 0,8 (0,4; 1,3). При этом уровни IL-6 и IL-8 у этих больных, напротив, были ниже: IL-6 в 33 раз: 0 (0; 8,2) против 33,0 (4,4; 54,1); IL-8 в 249 раз: 0,35 (0,3; 19,6) против 87,3 (37,3; 125,2) (рисунок 2). p<0,05 пг/мл/г 90белка IDH wt 60 IDH mt p<0,05 p<0,05 20 IL-4IL-6IL-8 Рисунок 2. Содержание IL-4, IL-6, IL-8 в HGG в зависимости от статуса мутации гена IDH. Ось Y – пг/мл/г белка По результатам определения уровня метилирования промотора MGMT нами сформировано 2 группы: уровень метилирования ≤10% и более 10%. В первую группу вошло 9 пациентов, во вторую – 21. При анализе содержания цитокинов в данных группах обнаружена статистически достоверная разница по содержанию IL-1β (рисунок 3). Так, в опухолях с низким уровнем метилирования MGMT медиана значений IL-1β составила 2,8 (2,0; 4,5) против 5,1 (3,9; 12,1) при высоком уровне данного показателя (рисунок 3). На послеоперационном этапе пациентам было проведено полноценное комплексноелечение(ЛТ+ХТ).Приизученииихвыживаемости сформированы группы с летальным исходом до и более 18 месяцев от начала лечения. В первую группу вошло 16 пациентов, во вторую – 14. пг/мл/г белка p<0,05 4MGMT≤10% MGMT>10%
IL-1β
Рисунок 3. Содержание IL-1β в зависимости от уровня метилирования промотора MGMT.
Ось Y – пг/мл/г белка

При анализе цитокинового состава двух данных групп выявлена
статистически достоверная разница в содержании IL-10 (р=0,048), TNF-α
(р=0,034), а также тенденция в разнице содержания IL-2 (р=0,11).
В связи с бинарным исходом, для прогнозирования результата применен
ROC-анализ с последующим определением чувствительности, специфичности и
пороговых значений вышеуказанных цитокинов по отдельности и в комплексе
(рисунок 4).
Так, при комплексной величине указанных цитокинов, выше пороговых
значений: для IL-2 – 7,1 пг/мл/г белка, IL-10 – 2,22 пг/мл/г белка и ниже
2,53 пг/мл/г белка для TNF-α, прогнозируется выживаемость более 18 месяцев с
чувствительностью 95%. Чувствительность при одиночной оценке данных
цитокинов составляет 75%.
Таким образом, на основании оценки локального уровня цитокинов в
ткани HGG нам удалось выявить иммунологические факторы, которые с
высокойпрогностическойзначимостью,нарядусобщепринятыми
клиническими параметрами (возраст и функциональное состояние пациента) и
молекулярно-генетической характеристикой опухолевой ткани (статус мутации
гена IDH), определяют прогноз течения HGG. По способу прогнозирования
течениянизкодифференцированныхглиальныхопухолейнаоснове
цитокинового микроокружения получен патент на изобретение (№2741690 С1
от 28.01.2021).

Рисунок 4. ROC-кривая для расчета выживаемости больных низкодифференцированными
глиальными опухолями по результатам локального содержания IL-2, IL-10, TNF-α

Особенности содержания опухолевых стволовых клеток в
низкодифференцированных глиомах
Возможно, не только цитокины, но и клеточный состав опухоли может
влиять на клиническое течение опухоли. В связи с этим, нами изучены
особенности содержания мезенхимального (CD 44) и пронейрального (CD 133)
пулов ОСК в ткани HGG.
В проведенном нами исследовании экспрессия вышеуказанных маркеров
не обнаружена ни в одном из биоптатов контрольной группы (неповрежденная
нейроглия). В опухолевой ткани LGG и HGG также определяли клетки с
маркерами CD44+, CD133+ по отдельности и совместно. Результат выражали в
процентах от общего количества CD45–клеток. Так экспрессия маркера CD44+
обнаружена в 100% в основной и группе сравнения, а CD133+ и ко-экспрессия в
77,3% (в 22 образцах) в основной и в 73,3% (11 образцах) в группе сравнения.
При дальнейшем сравнении уровня клеток с маркером CD45- CD44+,
CD45- CD133+, CD45- CD44+133+ в зависимости от возраста, пола, индекса по
шкале Карновского при поступлении в стационар, локализации по отношению
к перивентрикулярной области, гистологического типа опухоли (АА, ГБ),
индекса пролиферативной активности ki67, наличия или отсутствия мутации в
генеIDH,уровняметилированияпромотораMGMT,статистически
достоверных отличий не обнаружено.
Полученные нами данные об отсутствии ОСК с маркерами CD44+,
CD133+ в неизмененной нейроглии указывают на их роль в формировании как
LGG, так и HGG. Наличие мезенхимального типа ОСК во всех образцах HGG,
внезависимостиотгистологическихимолекулярно-генетических
характеристик, указывает на его бо́льшую значимость и создает предпосылки
для дальнейшего изучения именно данного пула клеток на чувствительность к
различным режимам лучевой терапии, для поиска таргетных препаратов,
экспериментальных методов лечения.
Оценка онколитического действия ротавирусов группы К на культуре
клеток глиобластомы человека
Отсутствие значительных успехов в лечении злокачественных глиальных
опухолей повышает интерес к поиску новых методов, в том числе и
онколитической виротерапии.
Первымэтапомпроведеннойнамиэкспериментальнойчасти
исследования являлась оценка онколитической активности ротавирусов группы
К штаммов № 100 и № 228 на культуре клеток глиобластомы человека T98G,
U87MG с помощью колориметрического теста оценки метаболической
активности (МТТ теста). Нами установлен дозозависимый эффект, который
нарастал до достижения концентрации вирионов 108. При этом он более
выражен при сокультивировании с культурой U87MG. Так, после воздействия
штамма № 100, количество живых клеток снизилось до 60%, а после № 228 –
65% от контроля (рисунок 5). Хотя полный лизис при данных условиях опыта
не был отмечен, в литературе подобные цифры считаются приемлемыми для
того, чтобы рассматривать такое действие как усиление гибели клеток.

Рисунок 5. Дозозависимое цитотоксичное действие штаммов RVK на клеточные линии
глиальных опухолей

Учитываяболеевыраженныйцитолитическийэффект,
продемонстрированный на культуре U87MG, нами проведено дополнительное
исследование уровня апоптоза на проточном цитофлуориметре.
Результаты аннексинового теста показали, что при действии штамма
№ 100 в концентрации 108 на клетки глиомы U87MG количество погибших
клеток достигало 65%. Большая часть погибших клеток находилась в стадии
позднего апоптоза – 46,4%, в ранней стадии апоптоза – 19,6% (рисунок 6).

Рисунок 6. Жизнеспособность клеток и уровень апоптоза в культуре U87MG после
воздействия RVK штаммов № 100 и №228 в различных концентрациях
Показатели гибели клеток глиом, полученные с помощью аннексинового
теста, оказались выше, чем полученные с помощью МТТ-теста, что объяснимо,
учитывая их разные механизмы. При этом, если в МТТ-тесте учитываются
только погибшие клетки, то в аннексиновом тесте – также и те, в которых
процесс апоптоза только начинается.
При морфологическом исследовании также показан более выраженный
эффект при воздействии штамма № 100 на культуру U87MG. Отмечены
признаки гибели клеток, наблюдалась рыхлость, «сморщивание» клеточных
кластеров, разрушение межклеточных связей (рисунок 7).

Рисунок 7. Влияние штамма № 100 и штамма № 228 на морфологию клеточной линии
U87MG (окрашивание гематоксилином, увеличение х100)

Такимобразом,вэкспериментальнойчастиисследования
продемонстрирована высокая онколитическая активность штамма № 100 на
клетки культуры глиобластомы человека, что может стать основой для
дальнейших доклинических и клинических исследований.

ВЫВОДЫ
1.Низкодифференцированные глиальные опухоли, в отличие от
высокодифференцированныхглиоминеизмененнойнейроглии,
характеризуются низким содержанием IL-2 (8,1 против 22,4 и 30,2 пг/мл/г
белка), IL-4 (0,8 против 4,7 и 3 пг/мл/г белка), IL-10 (2,7 против 5,3 и 7,6 пг/мл/г
белка), TNF-α (2,9 против 6,0 и 6,3 пг/мл/г белка) и высоким содержанием IL-6
(27,6 против 0 и 0 пг/мл/г белка), IL-8 (71,1 против 0,16 и 1,6 пг/мл/г белка)
соответственно (p<0,05). 2.Низкодифференцированные глиальные опухоли с наличием мутации в гене IDH1, в отличие от IDH wild type, характеризуются более высоким уровнем IL-4 (25,3 против 0,8 пг/мл/г белка) и низким уровнем IL-6 (0 против 33 пг/мл/г белка) и IL-8 (0,35 против 87,3 пг/мл/г белка) (p<0,05). 3.Низкодифференцированныеглиальныеопухолиприналичии уровня метилирования промотора MGMT>10%, имеют повышенный уровень
IL-1β: 5,1 против 2,8 пг/мл/г белка при уровне метилирования <10% (p<0,05). 4.Комплексная оценка локального уровня цитокинов IL-2 (более 7,1 пг/мл/г белка), IL-10 (более 2,22 пг/мл/г белка) и TNF-α (менее 2,53 пг/мл/г белка) повышает чувствительность до 95% по сравнению с раздельным определением и является предиктором выживания более 18 месяцев больных низкодифференцированнымиглиальнымиопухолямиприкомплексном лечении. 5.Низкодифференцированные глиальные опухоли характеризуются наличием пула опухолевых стволовых клеток с фенотипом CD45- CD44+ в 100%случаев(вотличииотCD45-CD133+)внезависимостиот гистологической природы и молекулярно-генетических характеристик. 6.Ротавирусы группы К штамма № 100 продемонстрировали более выраженную онколитическую активность в отношении культуры клеток глиобластомы человека U87MG in vitro в отличие от штамма № 228, что делает возможнымдальнейшееизучениеегоцитолитическойактивностив экспериментах in vivo. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1.Дляпрогнозированияклиническоготечения низкодифференцированных глиальных опухолей при комплексном лечении следует определять локальный уровень IL-2, IL-10, TNF-α. 2.Послехирургическоголеченияупациентовс низкодифференцированными глиальными опухолями в качестве фактора прогнозирования статуса мутации в гене IDH и уровня метилирования промотора MGMT следует определять в опухолевой ткани уровень IL-4, IL-6, IL-8 и IL-1β соответственно.