Иммунотропные эффекты комплексного препарата на основе антител к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину при респираторных инфекциях, вызываемых РНК-содержащими вирусами (экспериментальное исследование)

Во введении обоснована актуальность темы диссертации,
сформулированы цели и задачи исследования, научная новизна, теоретическое
и практическое значение работы.
В первой главе проведен анализ отечественной и зарубежной научной
литературы по теме исследования: описаны эпидемиология и патогенез
инфекций РНК-содержащих вирусов, представлены основные принципы
противовирусной профилактики и терапии, рассмотрены роли системы ИФН,
Т-клеточного иммунитета и гистамина в ответе на инфекцию. Обоснована
целесообразностьиспользованияСВРАТк молекулам-мишеням,
принимающим участие в иммунном ответе на вирусную инфекцию, в качестве
перспективного подхода к фармакотерапии инфекций, вызванных РНК-
содержащими вирусами.
Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов
исследования. Во всех представленных исследованиях все экспериментальные
препараты на основе СВР АТ, а также контроли к ним предоставляла ООО
«НПФ «МАТЕРИА МЕДИКА ХОЛДИНГ» в зашифрованном виде, как водные
растворы, готовые к использованию. В качестве контролей использовали воду
очищенную,прошедшуютехнологическуюобработку, аналогичную
используемой для приготовления СВР АТ (технологический контроль), и воду
очищенную, соответствующую требованиям ОФС «Вода очищенная»
ФС.2.2.0020.15 (контроль введения).Препараты: R-альфаметилгистамина
дигидробромид, тиоперамид, осельтамивир и АТ к huICAM -1-рецептору
использовались в экспериментах незашифрованными и служили контролями
валидности соответствующих экспериментальных моделей. Данные препараты
были предоставлены лабораториями, на базе которых проводились
эксперименты.
1. Метод исследования влияния СВР АТ к ИФН-гамма на ИФН-гамма
В работе использовали рекомбинантный ИФН-гамма, меченый изотопом
N по протоколу, принятому в отделении Структурной биологии Университета
Питтсбурга, США (Протокол №1278) (Petty K.J., 1996). Для того, чтобы
определить потенциальное влияние СВР АТ к ИФН-гамма на конформацию
ИФН-гамма, снимали двумерные (2D) ЯМР-спектры 15N-меченого ИФН-гамма
в присутствии экспериментальных образцов. В исследованиях использовали
СВР АТ к ИФН-гамма, СВР АТ к рецептору ИФН-гамма в качестве контроля
тропности действия СВР АТ, а также технологический контроль. В каждом
случае экспериментальные образцы для ЯМР готовили одинаковом образом в
трѐх отдельных пробирках: 42 мкл каждого из экспериментальных образцов
добавляли к 50 мкМ раствору 15N-меченого ИФН-гамма в 20 мМ калиево-
фосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 20 мМ NaCl и 10% D2O.
2D-спектры 15N-меченого ИФН-гамма в присутствии экспериментальных
образцов получали методом HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation,
двумерная гетероядерная корреляционная спектроскопия), позволяющим
определить конформационные перестройки в молекуле изучаемого вещества на
основании корреляции между химическими сдвигами протонов и химическими
сдвигами ядер, снимая 2048 сканов спектра протона и 34 скана спектра азота с
D1 задержкой в 1 секунду. ЯМР эксперименты проводили при 25ºC на
спектрометре «Bruker Avance» 900 МГц (США), оснащенном 5 мм трех
резонансным вертикальным градиентным криогенным зондом. Для получения
данных использовали ПО Topspin, версия 3.0 («Bruker BioSpin Corp.», Billerica,
MA). Спектры обрабатывали и анализировали при помощи NMR View (Johnson
B.A., 2004) и ПО Sparky (Goddard T.D., Kneller D.G.). Все ЯМР эксперименты
проводились в одинаковых условиях с использованием буферных растворов с
постоянными значениями рН и ионной силы.
2. Метод исследования влияния СВР АТ к CD4-рецептору на передачу
активационного сигнала в CD4+ Т-лимфоцитах
В качестве маркѐра влияния на CD4-рецептор была выбрана молекула
активной Lck (дефософорилированной по С-концу), уровень которой может
свидетельствовать о передаче внутриклеточного активационного сигнала в
CD4+ Т-клетках (Courtney A.H. et al., 2017). В исследованиях использовали СВР
АТ к CD4 и технологический контроль. Эксперименты проводили на
мононуклеарных клетках крови (МНК) человека, полученных от пяти здоровых
доноров в возрасте от 25 до 40 лет, давших информированное согласие на
использование образцов их крови в экспериментах. Исследование было
одобрено этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА
России. Цельную кровь в объеме 15 мл разводили в бессывороточной среде
DMEM («Sigma-Aldrich», США) в соотношении 1:1, после чего проводили
выделение МНК на градиенте плотности фиколл-урографина («ПанЭко»,
Россия) по стандартной методике A. Böyum (1968). В исследовании
использовали метод детекции Lck, основанный на проведении клеточно-
ориентированного ИФА, с использованием коммерческого ИФА-набора LCK
(человеческий) Cell-Based ELISA Kit («Abnova», KA2966, Тайвань) в 5
повторах, анализ проводился в соответствии с инструкцией фирмы-
изготовителя. Клетки (по 20 000 кл/лунку в 200 мкл среды) высевали в 96-
луночный планшет, предварительно покрытый L-Lysine («Sigma-Aldrich»,
США), и культивировали 24 часа в CO2-инкубаторе (37°С, 5% CO2) с
последующим внесением исследуемых образцов (в объемном соотношении
препарат:среда = 1:4). Лунки, содержащие СВР АТ к CD4 и технологический
контроль, были равномерно распределены по всему планшету. Воздействие
образцов оценивали как в условиях стимуляции клеток фитогемагглютинином
(ФГА) в конечной концентрации 5 мкг/мл, так и без стимула. После внесения
тестируемых образцов клетки культивировали 24 часа в CO2-инкубаторе
(«Binder CB 210», Германия). Также определяли уровень внутриклеточного
содержания глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), экспрессия
которого в клетках стабильна, что позволяет использовать его для
нормализации показателей при обработке данных.
3. Метод исследования влияния СВР АТ к гистамину на систему гистамина
В работе оценивали влияние СВР АТ к гистамину на взаимодействие
гистамина с одним из его рецепторов (H4-рецептор гистамина). В
исследованиях использовали СВР АТ к гистамину, технологический контроль,
а также референсный агонист (R-альфаметилгистамин, «Tocris Bioscience»,
0569, Великобритания) и референсный антагонист (тиоперамид, «Tocris
Bioscience», 0644, Великобритания). Эксперименты проводили на мембранах
клеток CHO-K1, экспрессирующих рекомбинантный человеческий H4-рецептор
гистамина (FAST-0173G), полученных по протоколу, принятому в компании
Euroscreen FAST, Бельгия. В исследовании использовали метод
функциональногоанализа,основанныйнаизмерении количества
гуанозинтрифосфата, меченного по гамма-фосфатной группе с помощью 35S
(ГТФγ35S, «Perkin Elmer», NEG030X, США). Эксперимент проводили в
соответствии со стандартными операционными процедурами, используемыми
компанией Euroscreen S.A. (Брюссель, Бельгия) по методике, которая была
валидирована производителем.
Мембраны смешивали с гуанозиндифосфатом (ГДФ) в объемном
соотношении 1:1 и инкубировали 15 мин на льду. При тестировании в режиме
агониста в лунки планшета Optiplate («Perkin Elmer», США) добавляли 25 мкл
экспериментального образца и доводили буфером (20 мМ HEPES pH 7,4; 100
мМ NaCl, 10 мкг/мл сапонин, 3 мМ MgCl2) до объема 50 мкл, или 50 мкл
референсного агониста, разведѐнного в буфере, 20 мкл смеси «мембраны-
ГДФ», 10 мкл буфера и 20 мкл ГТФγ35S. При тестировании в режиме
антагониста в лунки планшета добавляли 25 мкл экспериментального образца и
доводили буфером до объема 50 мкл, или 50 мкл референсного антагониста, 20
мкл смеси «мембраны-ГДФ», 10 мкл буфера, и – через 15 минут инкубации – 10
мкл референсного агониста в финальной концентрации, соответствующей
ЕС80, а затем – 20 мкл ГТФγ35S. Планшеты накрывали, встряхивали на
орбитальном шейкере в течение 2 минут и инкубировали в течение 1 часа при
21°C. Затем планшеты центрифугировали в течение 10 минут при 2000
оборотов, инкубировали в течение 1 часа при 21°C. Количество связавшегося
ГТФγ35S оценивали по количеству импульсов в минуту (cpm)/лунка с помощью
сцинтилляционного счѐтчика «PerkinElmer TopCountTM» (США). Эксперименты
с СВР АТ к гистамину проводили в 3 повторах. Способность
экспериментальных образцов активировать рецептор H4 рассчитывали в % от
активности референсного агониста в концентрации ЕС100, определѐнной в ходе
предварительного эксперимента. Способность экспериментальных образцов
проявлять свойства антагонистов H4 выражали как % ингибирования
активности референсного агониста в концентрации ЕС80, рассчитанной в ходе
предварительного эксперимента.
4. Исследование противовирусной активности комбинации СВР АТ к ИФН-
гамма, рецептору CD4 и гистамину на экспериментальных моделях in vivo
Исследования проводили на мышах-самках линии Balb/c (n=196 в
экспериментах на модели противогриппозной активности, n=30 в
экспериментах на модели РСВ-инфекции), трансгенных по huICAM рецептору
мышах-самках линии Balb/c (n=112 в экспериментах на модели РВ-инфекции) в
возрасте 6-8 недель массой 16-20 г, полученных из питомников ФБУН ГНЦ ВБ
«Вектор», «Столбовая» ФГБУН «Научного центра биомедицинских технологий
ФМБА» и Госпиталя Святой Марии (St Mary’s Hospital, Норфолк,
Великобритания). Животные содержались в неполной барьерной системе в
соответствии с правилами, принятыми Директивой 2010/63/EU Европейского
парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране
животных, используемых в научных целях. Мыши находились по 5 особей, в
пластиковых клетках при температуре воздуха 20-260 С и 12-часовом цикле
день/ночь, при свободном доступе к воде и пище. Опыты проводили в осенне-
зимний период, а забор материала осуществляли в утренние часы.
В экспериментах использовали вирус гриппа штамма А/Aichi/2/68
(Н3N2), полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных
инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», РСВ штамм А2,
полученный из ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и
сывороток им. И.И. Мечникова» и РВ 16 (RV16), полученный из Американской
коллекции клеточных культур (ATCC) каталожный номер VR-283,
наименование 11757.
Экспериментальныхмышейинфицировалиоднократным
интраназальным введением вируса гриппа А в дозе LD90 (4,3 lg ТЦД50/мышь).
СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину вводили животным (n=40)
2 раза в сутки (в 10 и 17 часов) в виде водного раствора по лечебно-
профилактической схеме (в течение 5-ти суток до инфицирования и 16-ти суток
после инфицирования) внутрижелудочно в дозе 20 мл/кг/сут. Животные
контрольных групп получали воду очищенную (контроль введения) (n=40) по
схеме введения СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину или
осельтамивир (n=40) (Тамифлю®, F. Hoffmann La Roche, Ltd) по лечебной
схеме (в течение 5-ти суток после инфицирования 2 раза в сутки) в дозе 20
мг/кг/сут. Для обеспечения одинаковых условий введения препаратов
животные группы осельтамивира в течение 5-ти суток до инфицирования и 11-
ти суток после окончания его введения получали воду очищенную 2 раза в день
в дозе 20 мл/кг/сут. В данном эксперименте осельтамивир использовался для
подтверждения валидности полученных результатов, т.к. его эффективность в
доклинических исследованиях гриппа была показана ранее (Ward P. et al., 2005;
Mhamdi Z. et al., 2020). Кроме того, осельтамивир входит в «Типовой перечень
основных лекарственных средств» ВОЗ в качестве дополнительного препарата
для лечения тяжелых гриппозных инфекций у серьѐзно больных пациентов
(World Health Organization Model List of Essential Medicines, 21st List, 2019). В
качестве контроля инфицирования в исследование была включена группа
инфицированных животных (n=40), которым не вводили какие-либо препараты
(нелеченый контроль). В исследовании оценивали следующие показатели: 1)
выживаемость и среднюю продолжительность жизни экспериментальных
животных; 2) титр вируса гриппа А в легких животных, отобранных для
анализа случайным образом, через двое и четверо суток после заражения.
Исследование эффективности профилактического применения СВР АТ к
ИФН-гамма, рецептору CD4 и гистамину оценивали на модели РСВ-инфекции.
СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину вводили животным (n=10)
2 раза в сутки (в 10 и 17 часов) в виде водного раствора по профилактической
схеме (в течение 5-ти суток до инфицирования) внутрижелудочно в дозе 20
мл/кг/сут. Животные контрольной группы получали воду очищенную (контроль
введения) (n=10) по схеме введения СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и
гистамину. В качестве контроля инфицирования в исследование была включена
группа инфицированных животных (n=10), которым не вводили какие-либо
препараты (нелеченый контроль). Инфицирование мышей РСВ производили
интраназальным способом в дозе 5×106 ТЦД50/мышь в день 0 эксперимента. В
исследовании оценивали тяжесть развившейся инфекции по показателям: 1)
изменение относительной гиперреактивности бронхов через 5 дней после
инфицирования; 2) клеточный состав БАЛ на 6-й день после инфицирования.
Особенности влияния СВР АТ к ИФН-гамма, рецептору CD4 и гистамину
на течение воспалительных респираторных заболеваний было изучено на
модели РВ-индуцированных осложнений бронхиальной астмы у трансгенных
по huICAM-1 рецептору у мышей. Экспериментальная модель бронхиальной
астмы, осложненной РВ-инфекцией (серотип 16), была воспроизведена, как
описано ранее (Bartlett N.W. et al., 2008). СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору
и гистамину вводили животным (n=44) 2 раза в сутки (в 10 и 17 часов) в виде
водного раствора по лечебно-профилактической схеме (в течение 5-ти суток до
инфицирования и 4-х суток после инфицирования) внутрижелудочно в дозе 20
мл/кг/сут. Животные контрольных групп получали воду очищенную (контроль
введения) (n=24) по схеме введения СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и
гистамину или АТ к рецептору huICAM (препарат положительного контроля)
(«R&D Systems», Великобритания, MAB720, клон #14C11) (n=44)
интраназально в дозе 100 мкг/мышь за 2 часа до инфицирования (Traub S. et al.,
2013). В исследовании оценивали влияние препарата на тяжесть течения
осложнений по показателям: 1) экспрессия генов ИФН I, II и III типов; 2)
клеточный состав БАЛ; 3) уровень цитокинов и хемокинов в БАЛ.
6. Статистический анализ
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием
программы R (версия 4.0.2). Из элементов описательной статистики
вычислялись: среднее (М), стандартная ошибка среднего (SEM), стандартное
отклонение (SD), 95% доверительный интервал (95% ДИ), медиана (Me), 25-й и
75-й процентиль (квартили Q1 и Q3, соответственно). Для статистической
оценки данных применялся t-критерий Крамера-Уэлча, одно- и
многофакторный дисперсионный анализ или его непараметрические аналоги
(критерий Краскела-Уоллиса). Апостериорные сравнения проводили по
критериям Тьюки и Данна с применением поправок на множественность
сравнений. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Третья глава диссертации посвящена описанию результатов исследования влияния СВР АТ к ИФН-гамма на ИФН-гамма, СВР АТ к CD4 – на уровень Lck Т-лимфоцитов, СВР АТ к гистамину на рецептор гистамина H4. Получены результаты изучения фармакотерапевтических эффектов СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину на экспериментальных моделях гриппа А(H3N2), РСВ-инфекции и РВ-индуцированных осложнений экспериментальной бронхиальной астмы у мышей. Четвертая глава диссертационной работы посвящена обсуждению полученных результатов с привлечением данных литературы. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование влияния СВР АТ к ИФН-гамма на ИФН-гамма Рисунок 1 представляет собой двумерные спектры молекулы ИФН-гамма отдельно и в присутствии каждого из тестируемых образцов, наложенные друг на друга. По осям представлены значения химического сдвига для ядер водорода 1H (ось 0Х) и ядер азота 15N (ось 0Y), каждый сигнал на спектре соответствует одной химической связи между водородом и азотом. В результате исследования показано, что СВР АТ к ИФН-гамма вызывают существенные изменения 2D ЯМР-спектра ИФН-гамма. На Рисунке 1А видно, что при наложении спектров ИФН-гамма в присутствии СВР АТ к ИФН-гамма (синий) и в их отсутствие (красный) специфические химические сдвиги не совпадают. После добавления к ИФН-гамма СВР АТ к ИФН-гамма изменилось в общей сложности 13 пиков: для остатков A9, E39, E40, D42, I45, Q47, I50, F82, F83, S85, а также для V117, A119, E120, расположенных на С-конце молекулы ИФН-гамма (7 из них располагаются на участке молекулы ИФН- гамма, ответственном за формирование димера). После добавления технологического контроля к ИФН-гамма в спектре не наблюдалось никаких изменений, а полученный спектр был идентичен спектру ИФН-гамма в качестве монопрепарата (Рисунок 1Б). Аналогично, на участках, где были видны изменения в ИФН-гамма после добавления к нему СВР АТ к ИФН- гамма, при добавлении к ИФН-гамма СВР АТ к рецептору ИФН-гамма изменений пиков не наблюдалось (Рисунок 1В). Полученные данные позволяют предположить, что при добавлении СВР АТ к ИФН-гамма изменяется структура ИФН-гамма в области контакта двух мономеров, что, вероятно, может оказывать влияние на равновесие мономер- димер в молекуле ИФН-гамма и влиять на стехиометрию его взаимодействия с рецептором. Рисунок 1 – 1H-15N 2D ЯМР-спектр ИФН-гамма в отсутствие СВР АТ к ИФН-гамма (красный) и в присутствии СВР АТ к ИФН-гамма (синий) (А); 1H- N 2D ЯМР-спектр ИФН-гамма в отсутствие технологического контроля (красный) и в присутствии технологического контроля (синий) (Б); 1H-15N 2D ЯМР-спектр ИФН-гамма в отсутствие СВР АТ к рецептору ИФН-гамма R1 (красный) и в присутствии СВР АТ к рецептору ИФН-гамма (синий) (В). Ось 0X: значения химического сдвига для ядер водорода 1H, ось 0Y – ядер азота N (ось 0Y) 2. Исследование влияния СВР АТ к CD4-корецептору на передачу сигнала в CD4+ Т-лимфоцитах Оценка экспрессии Lck в МНК периферической крови (Lck экспрессируется только в Т-клетках) с учетом эффекта донора, но без учета фактора стимуляции ФГА показала статистически значимое (p<0,05) снижение количества активной внутриклеточной Lck в группе СВР АТ к CD4, по сравнению с группой технологического контроля (Рисунок 2). Для того, чтобы определить, как фактор стимуляции влияет на внутриклеточный уровень белка Lck, была проведена также его оценка после внесения тестируемых образцов как без добавления ФГА (ФГА-), так и в его присутствии (ФГА+). Разница (и 95% доверительный интервал разницы) между внутриклеточным уровнем Lck в присутствии технологического контроля и тем же уровнем в присутствии СВР АТ к CD4 с учетом нормализации по GAPDH в группе ФГА+ составила 0,0230 (-0,0044; 0,0504), p=0,092, по сравнению с 0,0385 (0,0084; 0,0632), p<0,05 в группе ФГА-. Согласно данным литературы, взаимодействие с Т-клеточным CD4 молекул, влияющих на его функциональную активность, может вызывать диссоциацию от него активной Lck и еѐ последующую деградацию в протеасомах (Rao N. et al., 2002; Nakamura K. et al., 2003). Наблюдаемое снижение количества активнойLckможетбыть обусловлено фосфорилированием ITAM-участков Т-клеточного рецепторного комплекса в результате активации Т-клеток и разрушением активной Lck. Механизм этого действия, вероятно, связан со способностью СВР АТ к CD4 воздействовать на цитоплазматический домен рецептора CD4 в Т-клетках. Рисунок 2 – Внутриклеточный уровень Lck в присутствии тестируемых образцов (нормализация по GAPDH) в культуре мононуклеарных клеток периферической крови, полученной от здоровых доноров (n=5), без учета фактора стимуляции. Данные представлены в виде M±SD. М – среднее, SD – стандартное отклонение * – отличия препарата от технологического контроля статистически значимы (p<0,05) 3. Исследование влияния СВР АТ к гистамину на систему гистамина В рамках исследования влияния СВР АТ к гистамину на систему гистамина и его рецепторов, изучали эффекты данного экспериментального образца на H4 рецепторы гистамина. Этот подтип рецепторов был выбран в связи с тем, что они в большей степени представлены на клетках гематопоэтического происхождения, играющих важную роль в иммунном ответе (Thurmond R.L., Gelfand E.W., Dunford P.J., 2008). Изучение влияния СВР АТ к гистамину на функциональную активность связанного с G-белком Н4 рецептора проводили методом анализа связывания ГТФ. Известно, что при связывании лиганда с его рецептором происходит взаимодействие рецептора с G-белком, активация последнего и связывание с ГТФ, в обмен на ГДФ. Для того, чтобы определить степень активации рецептора, мы измеряли количество меченного ГТФ, связавшегося с G-белком. В результате процент ингибирования активности референсного агониста в присутствии СВР АТ к гистамину составил 27%, что статистически значимо отличалось от 7,8%, полученных для технологического контроля (p<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о наличии антагонистического эффекта у изучаемых СВР АТ к гистамину по отношению к Н4-рецепторам гистамина. 4. Исследования противовирусной активности комбинации СВР АТ к ИФН-гамма, рецептору CD4 и гистамину на экспериментальных моделях in vivo В экспериментальной модели гриппа А применение СВР АТ к ИФН- гамма, рецептору CD4 и гистамину увеличило выживаемость животных в 3 раза, а их среднюю продолжительность жизни – в 1,4 раза по сравнению с группой воды очищенной (p<0,05). Осельтамивир оказывал более выраженное влияние на показатели выживаемости и средней продолжительности жизни инфицированных мышей. Противовирусное действие СВР АТ проявлялось также в значимом подавлении репликации вируса в легких животных почти в 10 раз (на 0,80 и 0,93 lg TCID50/мл), как через 2, так и через 4 суток по сравнению с группой воды очищенной. Статистически значимых отличий данного показателя от такового в группе осельтамивира обнаружено не было (Таблица 1). Таблица 1 – Доля выживших, средняя продолжительность жизни и титры вируса в легких в экспериментальных группах мышей, а также нелеченого контроля при заражении вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (Н3N2) Титры вируса гриппа в легких у мышей на соответствующие сутки ГруппыВыживае-СПЖ, сутки после заражения, lg животныхмость, %M±SD TCID50/мл (n=30)(n=30) 2 сутки,4 сутки, M±SDM±SD (n=5)(n=5) СВР АТ к ИФН-гамма, 60% *# $12,30±4,71 *# $6,57±0,52 *#6,30±0,74 * рецептору CD4 и гистамину Осельтамивир96,7% *#15,73±1,46 *#6,33±0,48 *#6,07±0,52 *# Вода 20%8,90±3,757,37±0,147,23±0,19 очищенная Нелеченый 10%7,50±3,307,47±0,147,43±0,09 контроль Примечание: данные представлены в виде M±SD. M – среднее, SD – стандартное отклонение, n – число животных в группе. СПЖ – средняя продолжительность жизни. * – отличия от воды очищенной статистически значимы (p<0,05); # – отличия от нелеченого контроля статистически значимы (p<0,05); $ – отличия от осельтамивира статистически значимы (p<0,05). Таким образом, несмотря на то, что по способности увеличивать выживаемость и продолжительность жизни животных, инфицированных вирусом гриппа А штамма H3N2, СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину уступают осельтамивиру, препараты сходным образом влияют на количество вируса в легких животных, что говорит о сравнимости их эффектов. Показанные на общеизвестной и валидной экспериментальной модели (Sidwell R.W. et al., 2001) эффекты СВР АТ говорят о возможности изучения данного комплекса в терапии гриппа в дальнейших исследованиях, особенно в тех случаях, когда применение осельтамивира ограничено или противопоказано. В экспериментальной модели профилактики РСВ-инфекции СВР АТ к ИФН-гамма, рецептору CD4 и гистамину показали статистически значимое снижение воспаления дыхательных путей, которое проявлялось в снижении общей инфильтрации воспалительными клетками, а также макрофагами и незначительно – лимфоцитами в легкие по сравнению с группой воды очищенной и нелеченого контроля (Рисунок 3А, Б, В). Известно, что именно макрофаги, а также секретируемые ими ФНО-альфа и МСР-1 являются основной причиной осложнений атопических заболеваний, вызванных РСВ- инфекцией, а также усиливают дыхательную резистентность, как у мышей, так и у человека (Nguyen T.H. et al., 2016; Morris D.R. et al., 2020). Тот факт, что введение СВР АТ не оказывало влияния на специфическую резистентность дыхательных путей (Рисунок 3Г), может говорить о недостаточной длительности проводимой терапии и необходимости изучить эффективность СВР АТ при их введении в лечебно-профилактическом режиме, поскольку известно, что у мышей признаки гиперрезистентности дыхательных путей при РСВ-инфекции сохраняются достаточно долго (Bem R.A., Domachowske J.B., Rosenberg H.F., 2011). Тем не менее, именно направленное воздействие на макрофаги может быть перспективным для терапии вызванных РСВ осложнений астмы (Bem R.A., Domachowske J.B., Rosenberg H.F., 2011). Таким образом, на модели РСВ- инфекции нам удалось показать снижение одного из основных проявлений воспаления, характерных для мышей с данной инфекцией, в группе, получавшей СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину. В экспериментальной модели осложнений бронхиальной астмы, вызванной РВ-инфекцией, СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину демонстрировали выраженную индукцию ИФН I, II и III типа, что проявлялось в статистически значимом по сравнению с группой воды очищенной увеличении экспрессии генов ИФН-бета через 48 часов после инфицирования, ИФН-гамма через 24 и 48 часов после инфицирования и ИФН-лямбда через 24 часа после инфицирования, измеренных относительно фоновых значений у животных, которым вместо вируса вводили фосфатный буфер (Рисунок 4А, Б, В). Увеличение экспрессии генов ИФН в группе, получавшей СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину, может способствовать меньшему проявлению осложнений атопических заболеваний в период РВ-инфекции (Rohde G. et al., 2014), обеспечивать еѐ более лѐгкое течение и защиту от вируса (Message S.D. et al., 2008). Отсутствие стимуляции генов ИФН в группе положительного контроля (АТ к рецептору huICAM) свидетельствует об отсутствии заражения животных данной группы за счет блокады мишеней, используемых вирусом для инфицирования. Рисунок 3 – Общая инфильтрация воспалительными клетками (А), макрофагами (Б) и лимфоцитами (В) в бронхоальвеолярной жидкости экспериментальных мышей, а также влияние экспериментальных препаратов на специфическую резистентность дыхательных путей (sRaw) мышей, зараженных РСВ А2, усл.ед. в зависимости от концентрации метахолина (ось 0Х, мг/мл) (Г) (n=10). Данные представлены в виде M±SD. М – среднее, SD – стандартное отклонение. * – отличия от воды очищенной статистически значимы (p<0,05); # – отличия от нелеченого контроля статистически значимы (p<0,05); n – число животных в группе Кроме того, в данной экспериментальной модели СВР АТ продемонстрировали противовоспалительный эффект, который выражался в статистически значимом снижении уровня лимфоцитов, измеренном с учетом фоновых значений уровня лимфоцитов у животных, которым вместо вируса вводили фосфатный буфер, через 144 часа после инфицирования по сравнению с группой воды очищенной (p<0,05), Ме (Q1; Q3): 1,49 (1,36; 2,01) клеток×105 против4,20 (3,79; 4,47)клеток×105 в бронхо-альвеолярной жидкости, соответственно. Несмотря на то, что медианные значения уровня нейтрофилов (также измеренные относительно фонового уровня) на ранних этапах инфекции – в течение первых суток после инфицирования – были ниже в группе, получавшей СВР АТ, по сравнению с группой воды очищенной, Ме (Q1; Q3): 0,24 (0,17; 0,54) против 0,40 (0,32; 0,56), статистически значимых различий при Рисунок 4 – Влияние экспериментальных препаратов на экспрессию генов ИФН-бета (А), ИФН-гамма (Б) и ИФН-лямбда (В) через 0 (n=4, фоновые значения, измеренные у неинфицированных животных), 1, 8, 24, 48 часов после инфицирования (n=8 на каждую временную точку). Ось 0X: количество часов после инфицирования, ось 0Y: усредненное количество копий кДНК/мкл за вычетом значения этого показателя в нулевой точке, а также стандартные отклонения от среднего (M±SD). М – среднее, SD – стандартное отклонение от среднего. * – отличия от воды очищенной статистически значимы (p<0,05); n – число животных в группе пост-хок сравнении нам выявить не удалось. Возможно, увеличение количестваживотных в группе в последующих экспериментах позволит более точно выявить степень эффективности по данному критерию. Вероятнее всего, под действием СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину снижался уровень именно лимфоцитов Тh2, поскольку одновременно мы наблюдали некоторое сокращение (не достигшее уровня статистической значимости) уровня вырабатываемых при Тh2-опосредованном иммунном ответе ИЛ-4 и ИЛ-6 приблизительно в 4 раза относительно контрольной группы, получавшей воду очищенную, Ме (Q1; Q3): 71,50 (43,92; 168,37) против 312,63 (237,53; 435,17) для ИЛ-4 и 52,83 (28,58; 115,71) против 199,56 (113,5; 318,83) для ИЛ-6. Известно, что высокий уровень Тh2 и секретируемых ими цитокинов ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13 характеризует более тяжелое течение РВ-индуцированной астмы, тогда как повышение секретируемого Тh1 ИФН-гамма, а также ИЛ-10 ассоциированы с меньшим сокращением дыхательной функции и защитой от вируса (Message S.D. et al., 2008). Сдвиг равновесия в сторону Тh1-опосредованного иммунного ответа при применении СВР АТ может быть достигнут за счет непосредственной индукции ИФН-гамма, снижения продукции ИЛ-4 и ИЛ-6, нейтрофильной и лимфоцитарной инфильтрации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В работе были изучены механизмы фармакологического действия СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину, а также эффективность их комплексного применения для терапии респираторных инфекций, вызываемых некоторыми РНК-содержащими вирусами. Проведенные эксперименты продемонстрировали иммунотропные эффекты СВР АТ к ИФН-гамма, СВР АТ к рецептору CD4 и СВР АТ к гистамину. В частности, СВР АТ к ИФН-гамма вызывают конформационные перестройки в димере ИФН-гамма; при этом изменения затрагивают конформацию С-концевого участка молекулы ИФН-гамма, а также области контакта двух мономеров. СВР АТ к CD4-рецептору снижают количество активного белка Lck в Т-лимфоцитах, вероятно, усиливая передачу сигнала от Т-клеточного рецептора; СВР АТ к гистамину являются антагонистами гистамина при его взаимодействии с рецептором Н4. Для исследованного комплекса СВР АТ в работе показаны их фармакотерапевтические эффекты в отношении инфекции, вызванной вирусом гриппа. Применение комплекса СВР АТ способствовало увеличению выживаемости, средней продолжительности жизни и уменьшению титра вируса в легких инфицированных животных. Кроме того, продемонстрировано, что комплексныйпрепаратСВРАТобладаетивыраженным противовоспалительным действием, снижая инфильтрацию воспалительных клеток в дыхательных путях животных, зараженных РСВ и РВ. Таким образом, экспериментальные исследования комплексного препарата, содержащего СВР АТ к ИФН-гамма, CD4-рецептору и гистамину, подтверждают действие каждого из компонентов препарата на свою мишень. Например,противовоспалительныеэффектыкомплексаСВРАТ, продемонстрированные на моделях РСВ- и РВ-инфекций in vivo, согласуются с выявленными антагонистическими эффектами СВР АТ к гистамину на взаимодействие гистамина с его рецептором Н4. Увеличение выживаемости, средней продолжительности жизни, сокращение вирусной нагрузки в легких животных, зараженных гриппом, а также увеличение экспрессии генов ИФН- бета, ИФН-гамма и ИФН-лямбда при РВ-инфекции, наиболее вероятно, обусловлены усилением всех иммунных реакций организма, вызванных как активацией ИФН-гамма-зависимых путей, так и более эффективным вовлечением Т-клеточного звена в борьбу с инфекцией, а также сокращением воспалительных реакций. В исследовании впервые изучены механизм действия СВР АТ к ИФН- гамма на молекулярном уровне, механизм действия СВР АТ к рецептору СD4, влияние СВР АТ к гистамину на рецептор гистамина Н4. Полученные для комплексного препарата СВР АТ к ИФН-гамма, CD4 рецептору и гистамину данные позволяют сделать вывод о перспективности его применения для фармакотерапии инфекций, вызванных представленными в работе РНК- содержащими респираторными вирусами. ВЫВОДЫ 1. Сверхвысокие разведения антител к ИФН-гамма изменяют конформацию С-концевого участка молекулы ИФН-гамма, а также участков, ответственных за формирование димера ИФН-гамма, что может облегчать взаимодействие ИФН-гамма со своим рецептором. 2. Сверхвысокие разведения антител к рецептору CD4 усиливают передачу сигнала с Т-клеточного рецептора, о чем свидетельствует снижение внутриклеточного уровня Lck, которая, являясь адаптерной молекулой CD4, участвует в активации Т-лимфоцитов. 3. Сверхвысокие разведения антител к гистамину проявляют свойства антагониста по отношению к взаимодействию гистамина с рецептором гистамина H4, тем самым способствуя снижению воспалительной реакции, обусловленной влиянием гистамина. 4. Сверхвысокие разведения антител к ИФН-гамма, рецептору CD4 и гистамину увеличивают выживаемость животных при гриппозной инфекции, повышают экспрессию генов ИФН-бета, ИФН-гамма и ИФН-лямбда при риновирусной инфекции, а также сокращают инфильтрацию воспалительных клеток в лѐгкие при респираторно-синцитиальной и риновирусной инфекции in vivo.