Исследование антидепрессивных свойств дипептидных миметиков нейротрофинов NGF и BDNF

Экспериментальные животные
Исследование проводили на самцах мышей линии BALB/c массой 20–22 г и самцах мышей линии C57BL/6 массой 18–20 г. Также в работе использовали аутбредных мышей
ICR (CD-1). Все животные получены из сертифицированных питомников РАН. В работе использовано 698 мышей.
Препараты и вещества
Оригинальные димерные дипептидные миметики отдельных петель NGF: гексаме- тилендиамид бис-(6-аминокапроил-L-глицил-L-лизина) (ГК-6), гексаметилендиамид бис- (N-сукцинил-L-глутамил-L-лизина) (ГК-2); и BDNF: гептаметилендиамид бис-(N-моно- сукцинил-L-метионил-L-серина) (ГСБ-214), гексаметилендиамид бис-(N-гексаноил-L-се- рил-L-лизина) (ГТС-201), гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина) (ГСБ-106) были синтезированы в Отделе химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова». Для перорального введения использовали лекарственную форму ГСБ-106, разработанную Опытно-технологическим отделом ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова (Патент РФ No RU 2697254, 2019).
Использовался препарат сравнения амитриптилин (ФГУП «Московский эндокрин- ный завод», Россия), физиологический раствор (ООО «Мосфарм», Россия); диметилсуль- фоксид (ООО ТД «Химмед», Россия); липополисахарид E. coli (Sigma-Aldrich, США).
Для целей фармакологического ингибиторного анализа у Sigma-Aldrich, США были приобретены и использовались блокатор TrkB рецептора K252A (в дозе 25,0 мг/кг в/б), ингибитор PI3K LY294002 (в дозе 5,0 мг/кг, в/б), ингибитор MEK1/2 PD98059 (в дозе 2,5 мг/кг, в/б), ингибитор PLCg U73122 (в дозе 30,0 мг/кг, в/б).
Для вестерн-блот анализа использовались первичные антитела к синаптофизину (BD Bioscience, США), CREB, pCREB, BDNF (Cell Signaling technology, США) и бета- актину (Abcam, США) и вторичные козьи антитела против IgG кролика (Santa Cruz Bio- technology, США), конъюгированные с пероксидазой хрена.
Методы исследования
Поведенческие тесты
Изучение миметиков на антидепрессантоподобную активность проводили в тесте вынужденного плавания (Can A. et al. // J. Vis. Exp. 2012. No 58. P. 1–5). Миметики нейро- трофинов вводили в/б однократно или субхронически (5 дней).
Развитие ангедонии определяли с использованием теста предпочтения сахарозы (Strekalova T. et al. // Neuropsychopharmacology. 2004. Vol. 29, No 11. P. 2007–2017).
10

Тест двигательной активности проводили с помощью инфракрасного актиметра (Panlab, Испания) согласно инструкции к прибору и программы ActiTrack.
Для определения уровней белков использовали метод вестерн-блот анализа (Mahmood T. et al // N. Am. J. Med. Sci. 2012. Vol. 4, No 9. P. 429–434).
Модели экспериментального депрессивноподобного состояния
Модель социального стресса была поставлена, как описано в (Zhang J.C. et al. // Psychopharmacology. 2015. Vol. 232, No 23. P. 4325–4335; Avgustinovich D.F. et al // Neuro- sci. Behav. Physiol. 2005. Vol. 35, No 9. P. 917–924) с небольшими модификациями.
В качестве агрессоров использовали беспородных мышей-самцов в случае 10-днев- ного стресса и мышей-самцов C57BL/6 в случае 28-дневного стресса. Контрольные группы мышей не подвергались стрессу. На следующий день после стресса проводили тест двигательной активности, на основании которого отбирали мышей со сформирован- ным депрессивноподобным поведением и рассаживали их в индивидуальные клетки. На следующий день после отбора животных вводили п/о однократно либо хронически на протяжении 21 дня (ежедневно, в одно и то же время) ГСБ-106 в дозе 0,1 мг/кг, амит- риптилин в дозе 10,0 мг/кг или плацебо. Доза ГСБ-106 была выбрана на основании ранее проведенного исследования (Поварнина П.Ю. и др. // Acta Naturae 2018. Т. 3, No 38. С. 88– 92). На следующий день после введения веществ проводили поведенческие тесты (тест на двигательную активность, тест на ангедонию).
После проведения поведенческих тестов мышей декапитировали, извлекали гиппо- камп и определяли уровни синаптофизина, BDNF, CREB и pCREB в случае 28-дневного стресса с хроническим введением или только синаптофизина в случае 10-дневного стресса.
Моделирование ЛПС-индуцированного депрессивноподобного состояния выпол- нялось в соответствии с (O’Connor J.C. et al. // Mol. Psychiatry. 2009. Vol. 14, No 5. P. 511– 522). Исследование проводилось на мышах-самцах C57Bl/6 массой 18-20 г. ЛПС суспен- дировали в физ. р-ре и вводили однократно в/б в дозе 0,5 мг/г. Контрольным животным однократно в/б вводили физ. р-р. Через 23 ч после введения ЛПС или физ. р-ра форми- ровали 5 экспериментальных групп по 8-9 животных: контрольной группе и группе «ЛПС» вводили однократно п/о 1% р-р крахмала, трем другим группам однократно п/о вводили ГСБ-106 в исследуемых дозах (0,5, 1,0 или 5.0 мг/кг). Спустя 2 ч проводили тест
11

предпочтения 1% раствору сахарозы с целью установления проявлений ангедонии у мы- шей и через 24 ч оценивали уровень потребления воды и сладкого раствора.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительное исследование миметиков NGF и BDNF на антидепрессантоподобную активность
В серии опытов на мышах-самцах линии BALB/c при однократном введении миме- тиков установлено, что среди исследуемых дипептидов время иммобильности достоверно снижал только миметик BDNF ГСБ-106 в дозах 0.1 мг/кг (p = 0.0050; однофакторный дис- персионный анализ ANOVA, тест Даннета) и 1.0 мг/кг (p = 0.0109; однофакторный дис- персионный анализ ANOVA, тест Даннета) на 23% и 20%, соответственно, что сопоста- вимо по выраженности с результатами для амитриптилина. Миметики ГК-2, ГК-6, ГСБ- 214 и ГТС-201 были неактивны.
Полученные результаты по отсутствию активности у миметиков NGF могут быть объяснены низкой экспрессией TrkA в структурах, вовлеченных в патогенез депрессии. Так, в гиппокампе преимущественно экспрессируется TrkB, а в коре мозга TrkA практи- чески отсутствует (Zhang H.T. et al. // J. Histochem. Cytochem. 2007. Vol. 55, No 1. P. 1–19). Это также согласуется с тем, что при однократном внутримозговом введении BDNF про- являет активность в тесте вынужденного плавания, в то время как NGF в этих условиях не активен (Shirayama Y. et al. // J. Neurosci. 2002. Vol. 22, No 8. P. 3251–3261).
Наличие антидепрессантоподобного эффекта в ряду миметиков BDNF при одно- кратном введении только у ГСБ-106, по-видимому, связано с его способностью к одно- временной активации как PI3K/AKT, так и MAPK/ERK каскада. Известно, что одним из компонентов PI3K/AKT каскада является mTOR, играющий важную роль в процессах си- наптогенеза и синаптической пластичности, которые, в свою очередь, способствуют быстрому устранению симптомов депрессии (Sarbassov D.D. et al. // Curr. Opin. Cell Biol. 2005. Vol. 17, No 6. P. 596–603). Одной из мишеней mTOR является эукариотический фак- тор инициации трансляции 4E, активация которого требует взаимодействия с MAP кина- зами (Aguilar-Valles A. et al. // Nat. Commun. 2018. Vol. 9, No 1. P. 1–14). Ингибирование MAPK/ERK приводит к устранению эффекта BDNF при его однократном введении кры- сам (Shirayama Y. et al. // J. Neurosci. 2002. Vol. 22, No 8. P. 3251–3261), а ингибирование PI3K/AKT предотвращает быстрые антидепрессивные эффекты кетамина (N. Li et al. //
Science. 2010. Vol. 329. P. 959–965). Таким образом, нами установлено, что антидепрес- сантоподобную активность при однократном введении проявляет миметик BDNF ГСБ- 106, для которого in vitro показана активация как PI3K/AKT, так и MAPK/ERK сигналь- ных путей.
Как видно из Таблицы 1, в условиях субхронического введения активностью обла- дают и миметики NGF. Из неактивных при однократном введении миметиков BDNF ан- тидепрессантоподобное действие наблюдалось у ГСБ-214. Выраженность эффектов ми- метиков при этом была сопоставима с таковой для амитриптилина.
Таблица 1 Эффекты дипептидных миметиков NGF и BDNF при их субхроническом пятидневном в/б введении в тесте вынужденного плавания у мышей BALB/c
Группа
Контроль2 ГСБ-1062 Контроль ГСБ-214 ГТС-201
ГК-2
ГК-6 Амитриптилин
Доза, мг/кг в/б
1,0
1,0
1,0
0,5
1,0
5,0
2,0 10,0
Время иммобильности, с1
205.0 ± 9.1
172.7 ± 11.4#
242,6 ± 6,6
198,4 ± 8,1*
218,0 ± 7,7 225,5 ± 10,5 210,5 ± 4,4* 239,3 ± 6,8 207,0 ± 11,0* 205,2 ± 8,4*
Время иммобильности, % от контрольной группы 100
84.2
81,8
89,9
93,0
86,8
98,6
85,3
84,6
1 – данные представлены в виде средних значений со стандартной ошибкой среднего
2 – опубликованные результаты (Tallerova A. V. et al. // Pharmacokinet. Pharmacodyn. 2020. No 4. P. 24–27).
* – p < 0,05 по сравнению с контрольной группой (однофакторный дисперсионный ана- лиз ANOVA (тест Даннета)) Таким образом, при субхроническом введении активны миметики и NGF, и BDNF, в картину пострецепторного сигналинга которых включена активация PI3K/AKT каскада. Проявление активности миметиков NGF при субхроническом введении, по-видимому, объясняется их способностью, подобно нативному нейротрофину, стимулировать синтез BDNF (Tirasa P. // Arch. Ital. Biol. 2011. Vol. 149, No 2. P. 205–213) и согласуется с литера- турными данными о наличии антидепрессантоподобного эффекта самого NGF при субхроническом введении (Overstreet D.H. et al. // Pharmacol. Biochem. Behav. 2010. Vol. 94, No 4. P. 553–560). Антидепрессантоподобные эффекты у миметика 1-й петли BDNF ГСБ-214 объясняются вкладом активации PI3K/AKT в гиппокампальный нейрогенез за счет увеличения выживаемости постоянно образующихся там нейробластов (Koh S.H. et al. // J. Clin. Neurol. 2015. Vol. 11, No 4. P. 297–304). С этим согласуется тот факт, что миметик BDNF ГТС-201, не активирующий PI3K/AKT, активность не проявляет. В связи с тем, что ГСБ-106 проявляет антидепрессантоподобную активность уже при однократном введении, он был выбран в качестве соединения-лидера. Изучение антидепрессантоподобного действия соединения-лидера ГСБ-106 на моде- лях депрессивноподобного состояния На модели 10-дневного социального стресса при однократном п/о введении Установлено (совместно с с.н.с. к.б.н. Таллеровой А.В.), что в результате 10-днев- ного стресса у мышей сформировалась ангедония по уменьшению предпочтения сахара. ГСБ-106 и амитриптилин полностью ее устраняли, восстанавливая предпочтение саха- розы до уровня нестрессированного контроля (p < 0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, тест Fisher LSD). Кроме того, показано (совместно с заведующей лабораторией фармакологии нейропротекции к.б.н. Антиповой Т.А.), что ГСБ-106 вызывал статистически значимое увеличение содержания синаптофизина в гиппокампе нестрессированных животных (ри- сунок 1). У стрессированных животных содержание синаптофизина в гиппокампе было статистически значимо снижено примерно на 30% по сравнению с интактными. При вве- дении стрессированным животным как ГСБ-106, так и амитриптилина наблюдалась вы- раженная тенденция к восстановлению уровня синаптофизина (p = 0,08; U-тест Манна- Уитни). Таким образом, ГСБ-106 устранял проявления ангедонии у мышей со сформиро- ванным депрессивноподобным состоянием, вызванным 10-дневным социальным стрес- сом, а также имел тенденцию к восстановлению у них пониженного уровня синаптофи- зина в гиппокампе. ** Рисунок 1. Содержание синаптофизина в гиппокампе мышей на 4 сут после введения ГСБ-106 или амитриптилина (данные вестерн-блот анализа) Данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего. Дорожки: 1 – «контроль без стресса», 2 – «ГСБ-106 без стресса», 3 – «амитриптилин без стресса», 4 – «контроль - стресс», 5 – «стресс + ГСБ-106», 6 – «стресс + амитриптилин». О. Д. Е. – относительные денситометрические единицы. * p < 0,05 по сравнению с группой «контроль без стресса» (U-критерий Манна-Уитни); ** p < 0,01 по сравнению с группой «контроль без стресса» (U-критерий Манна-Уитни); # p = 0,08 по сравнению с группой «контроль - стресс» (U-критерий Манна-Уитни). На модели 28-дневного социального стресса при однократном п/о введении Исследование, проведенное совместно с с.н.с. к.б.н. Таллеровой А.В., показало, что под влиянием 28-дневного стресса у мышей наблюдалось статистически значимое сниже- ние двигательной активности и предпочтения 1% раствору сахарозы по сравнению с кон- трольной группой нестрессированных животных (p < 0,05; U-тест Манна-Уитни). Одно- кратное введение ГСБ-106 не восстанавливало ни двигательную активность, ни предпо- чтение сахарозы у стрессированных животных. На модели 28-дневного социального стресса при хроническом п/о введении В результате исследования (совместно с с.н.с. к.б.н. Таллеровой А.В.) было уста- новлено, что двигательная активность и предпочтение раствору сахарозы у мышей, под- вергнутых 28-дневному социальному стрессу, статистически значимо снижена по сравне- нию с интактным контролем (p < 0,05; U-тест Манна-Уитни). Введение ГСБ-106 на про- тяжении 21 дня достоверно устраняло дефицит двигательной активности (p < 0,05; U-тест (10,0 мг/кг) Манна-Уитни) и восстанавливало потребление сладкого раствора до уровня нестрессиро- ванного контроля (p < 0,05; двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, Fisher LSD test). Также установлено (совместно с заведующей лабораторией фармакологии нейро- протекции к.б.н. Антиповой Т.А.), что под влиянием 28-дневного социального стресса снижаются уровни синаптофизина, BDNF, CREB и pCREB по сравнению с нестрессиро- ванными животными на 19,8%, 12,5%, 10,5% и 26,8%, соответственно. Из рисунка 2 видно, что хроническое введение ГСБ-106 статистически значимо восстанавливает уровни данных белков в гиппокампе. Рисунок 2. ГСБ-106 полностью восстанавливает сниженные уровни синаптофизина, BDNF, CREB и pCREB в гиппокампе мышей, подвергнутых 28-дневному социальному стрессу (данные вестерн-блот анализа) Данные представлены в виде средних значений со стандартной ошибкой среднего О. Д. Е. – относительные денситометрические единицы. * p < 0,05 – статистическая значимость различий (U-тест Манна-Уитни) 16 Таким образом, на модели депрессивноподобного состояния, вызванного социаль- ным стрессом, установлено, что антидепрессантоподобное действие ГСБ-106 проявляется при однократном введении в случае 10-дневного стресса и не проявляется в условиях 28- дневного стресса. Это может быть связано с тем, что 28-дневный социальный стресс фор- мирует более устойчивую депрессивную патологию, для устранения которой однократ- ного введения миметика недостаточно. При трехнедельном введении после 28-дневного социального стресса ГСБ-106 проявляет выраженный антидепрессантоподобный эф- фект, полностью снимая вызванную стрессом ангедонию и дефицит двигательной актив- ности, а также восстанавливая уровни маркеров синапто- и нейрогенеза. Полученный результат согласуется с литературными данными, согласно которым антидепрессанты не проявляют эффекта на модели хронического социального стресса при однократном вве- дении, но активны при хроническом введении (Willner P. // Neuropsychobiology. 2005. Vol. 52, No 2. P. 90–110). Кроме того, эффект ГСБ-106 может реализовываться по аналогии с полноразмерным нейротрофином за счет процессов нейрогенеза, для полного разворачи- вания которых требуется не менее трех недель (Гудашева Т.А. и др. // ДАН. 2018. Т. 481, No 6. С. 691–693). На модели ЛПС-индуцированного депрессивноподобного состояния при однократном п/о введении Установлено (совместно с с.н.с. к.б.н. Таллеровой А.В.), что в результате введения ЛПС у мышей регистрировалось снижение потребления 1% раствора сахарозы на 43,4% по сравнению с контрольной группой (p<0,01; t-критерий Стьюдента), что свидетель- ствует о развитии ангедонии и соответствует литературным данным (O’Connor J.C. et al. // Mol. Psychiatry. 2009. Vol. 14, No 5. P. 511–522). ГСБ-106 в дозе 0,5 мг/кг статистически значимо (p ≤ 0,05; t-критерий Стьюдента) восстанавливал потребление сладкого раствора, сниженное на фоне введения ЛПС, на 38,8% по сравнению с группой, которой вводили только ЛПС. В дозах 1,0 и 5,0 мг/кг миметик не оказывал влияния на предпочтение саха- розы. Изучение ГСБ-106 в дозах 0,5, 1,0 и 5,0 мг/кг показало, что миметик восстанавли- вает предпочтение сахарозы в дозе 0,5 мг/кг. Таким образом, антидепрессантоподобная активность ГСБ-106 подтверждена и в воспалительной модели депрессии. Изучение вклада активации TrkB, PI3K/AKT, MAPK/ERK и PLCg в антидепрессан- топодобное действие ГСБ-106 Предполагаемый механизм антидепрессантоподобного действия дипептидного ми- метика BDNF ГСБ-106 базируется на полученных in vitro данных о его способности ак- тивировать TrkB и три основных пострецепторных сигнальных каскада: PI3K/AKT, MAPK/ERK и PLCg. Как видно из рисунка 3, блокада TrkB, а также ингибирование PI3K, или MEK1/2, или PLCg предотвращало антидепрессантоподобное действие ГСБ-106: устранялись ста- тистически значимые различия по сравнению с контрольной группой. Таким образом, фармакологический ингибиторный анализ показал, что антиде- прессантоподобный эффект ГСБ-106 зависит как от активации TrkB, так и от активации всех трех ассоциированных с ним сигнальных путей. Данные результаты согласуются с экспериментами in vitro и свидетельствуют в пользу полной вовлеченности TrkB сигна- линга в действие ГСБ-106. p<0,0001 p = 0,0179 p<0,0001 p<0,0001 p<0.0001 p < 0,0019 p=0.0005 p<0,0001 300 200 100 300 200 100 p=0.0387 p<0.0001 p<0.0001 p=0.0016 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 300 200 100 200 100 50 00 Рисунок 3. Блокатор TrkB (K252A; 25,0 мг/кг в/б) и ингибиторы PI3K (LY294002; 5,0 мг/кг, в/б), MEK1/2 (PD98059; 2,5 мг/кг, в/б), PLC (U73122; 30,0 мг/кг, в/б) предотвращают антидепрессантоподобный эффект ГСБ-106 (0,1 мг/кг в/б) в тесте вынужденного плавания Величины представляют собой средние значения со стандартной ошибкой среднего Достоверность различий оценивалась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA, тест Тьюки Контроль PD98059 GSB-106 GSB-106 + LY294002 ГСБ-106 ГСБ-106 + PD98059 Amitriptyline Amitriptyline + LY294002 Амитриптилин Амитриптилин + PD98059 Контроль K252A ГСБ-106 ГСБ-106 + K252A Амитриптилин Амитриптилин + K252A Control LY294002 Время иммобильности, с Время иммобильности,с Время иммобильности, с Время иммобильности,с Контроль U73122 ГСБ-106 ГСБ-106 + U73122 Амитриптилин Амитриптилин + U73122 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сравнительное исследование дипептидных миметиков нейротрофинов NGF и BDNF выявило антидепрессантоподобную активность у миметика 4-й петли BDNF ГСБ- 106 при однократном введении в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг. Статистически значимый эффект при субхроническом введении оказывали все исследованные дипептиды, за исключением миметика 2-й петли BDNF ГТС-201. В качестве соединения-лидера был выбран ГСБ-106, активный как при однократном, так и при субхроническом введении. Антидепрессанто- подобная активность ГСБ-106 была подтверждена на двух принципиально разных моде- лях депрессивноподобного состояния – вызванной социальным стрессом и вызванной ин- дуктором воспаления – липополисахаридом. В случае 10-дневного стресса активность миметика проявлялась уже при однократ- ном п/о введении в дозе 1,0 мг/кг, а при 28-дневном социальном стрессе потребовалось хроническое трехнедельное п/о введение миметика в той же дозе для устранения прояв- лений ангедонии и дефицита двигательной активности. В последнем случае эффект ми- метика сопровождался восстановлением уровней маркеров пластичности мозга (синапто- физина, CREB, pCREB и BDNF). Методом фармакологического ингибиторного анализа было подтверждено, что ме- ханизм действия ГСБ-106 подобен BDNF и включает в себя активацию TrkB и трех ос- новных пострецепторных сигнальных каскада PI3/AKT, MAPK/ERK и PLCg. ВЫВОДЫ 1. В ряду димерных дипептидных миметиков отдельных петель NGF и BDNF антидепрес- сантоподобной активностью при однократном в/б введении обладает миметик 4-й петли BDNF ГСБ-106, активирующий in vitro все три основные ассоциированные с TrkB сиг- нальные пути: ГСБ-106 снижает время иммобильности в тесте вынужденного плавания в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг в/б сопоставимо с амитриптилином. При субхроническом введении антидепрессантоподобной активностью обладают все исследуемые дипептидные миме- тики, для которых in vitro показана активация PI3K/AKT пути. 2. При однократном п/о введении в дозе 0,1 мг/кг ГСБ-106 в лекарственной форме обладает антидепрессантоподобной активностью в условиях 10-дневного социального стресса, устраняя проявления ангедонии у мышей. 3. В условиях 28-дневного социального стресса ГСБ-106 в лекарственной форме при одно- кратном п/о введении в дозе 0,1 мг/кг не оказывает антидепрессивного эффекта на мышах. 4. На модели 28-дневного социального стресса ГСБ-106 в лекарственной форме проявляет антидепрессантоподобное действие при хроническом (0,1 мг/кг 21 день) п/о введении: устраняет проявления ангедонии, восстанавливает двигательную активность мышей, а также восстанавливет сниженные на фоне стресса уровни синаптофизина, BDNF, CREB и pCREB. 5. На модели депрессивноподобного состояния, вызванного введением липополисахарида ГСБ-106 оказывает антидепрессивное действие при однократном п/о введении в дозе 0,5 мг/кг, устраняя проявления ангедонии у мышей. 6. Антидепрессантоподобный эффект ГСБ-106 зависит от активации TrkB рецептора и трех основных ассоциированных с ним сигнальных каскада PI3K/AKT, MAPK/ERK и PLCg: при блокаде рецептора и ингибировании соответствующих киназ эффект ГСБ-106 в тесте вынужденного плавания предотвращается. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Результаты выполненных исследований позволяют сделать заключение о целесо- образности дальнейшего изучения соединения-лидера – миметика 4-й петли BDNF ГСБ- 106 в качестве потенциального антидепрессанта принципиально нового механизма дей- ствия. Соединение имеет перспективу дальнейшего исследования и разработки в качестве лекарственного препарата для лечения депрессивных расстройств, биполярного аффек- тивного расстройства и других заболеваний, сопровождающихся депрессивной симпто- матикой.